JP7472476B2 - プライマー及び百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、試料中に含まれる百日咳菌ｒＲＮＡを迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いた百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法に関する。
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は人に感染すると、特有の痙攣性咳発作を伴う急性気道感染症を引き起こす。罹患者の多くは小児であるが、成人が罹患した際の百日咳は典型症状を示さないため、診断が見落とされ小児への感染源となるケースがある。百日咳菌には通常外来で使用されるβ－ラクタム系の抗菌薬が効かないため、適切かつ迅速な菌同定が必要になる。菌同定検査には、培養検査や遺伝子検査などが用いられるが、培養検査は菌分離率が著しく低く、また培養に７日を要するため、感度、特異性、迅速性に劣る（非特許文献１）。
一方、遺伝子検査は最も感度が高い検査法であり、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法（非特許文献２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）法（非特許文献３）、Ｔｒａｃｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）法（非特許文献４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＴＲＣ）法（非特許文献５）がある。
遺伝子検査のなかでもＬＡＭＰ法は、臨床的に用いられる百日咳菌の検査法（特許文献１、非特許文献６）であり、百日咳菌特異的な塩基配列を増幅して検出する。ＬＡＭＰ法による百日咳菌同定検査は、感度、特異性に優れているものの、結果が出るまで３時間程度（成人では１日以上）かかり、迅速性に関して改善の余地がある。一方、ＴＲＣ法（特許文献２、特許文献３）は、比較的低温の一定温度（例えば、４０℃から５０℃）条件下でＲＮＡの増幅を行う方法である。１時間程度で結果を得ることができるうえ、操作が簡便である。また、感度、特異度ともに他の核酸増幅による検出法と同等である（非特許文献７）。
百日咳菌２３Ｓ ｒＲＮＡは他の菌の２３Ｓ ｒＲＮＡとの間で塩基配列の相同性が高いものが多数存在する。特に、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）とは２３Ｓ ｒＲＮＡの相同性が９９％であるため、当該プライマーやオリゴヌクレオチドプローブの設計は困難であった。
ＴＨＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＴＩＭＥＳ２０１１ Ｎｏ．１（通巻２１９号）
日本臨床微生物学雑誌Ｖｏｌ．１８ Ｎｏ．３ ２００８．１３
ウイルス４９（１），２７－３２，１９９９
モダンメディア ５２巻９ 号２００６［新しい検査法］
日本臨床微生物学会雑誌Ｖｏｌ．１８ Ｎｏ．１ ２００８．１９
モダンメディア６２巻９号２０１６［臨床検査アップデート］
医学検査Ｖｏｌ．６４ Ｎｏ．４ ２０１５
本発明の目的は、試料中に存在する百日咳菌 ｒＲＮＡに由来する核酸を高感度、迅速かつ特異的に増幅し得るプライマー、および、当該プライマーを用いた百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下のとおりである。
（１） 試料中に含まれる百日咳菌 ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーであり、配列番号２、６、１０、１４、２５、２９、３６、４４、４８のいずれかに記載の配列の少なくとも１５塩基からなる配列、もしくはその相補配列の少なくとも１つ以上から選ばれてなることを特徴とするプライマー。
（２） 前記プライマーが少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーからなり、第一のプライマーが配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５～２３、２６、２７のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号３０～３４、３７～４２、４５、４６、４９～５１、５４～５６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載のプライマー。
（３） 前記（１）（２）のいずれかに記載のプライマーを用いて、前記百日咳菌 ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの特定塩基配列あるいは／および前記特定塩基配列の相補配列からなる核酸を増幅し、検出することを特徴とする、 百日咳菌ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの検出方法。
（４） 前記百日咳ｒＲＮＡの特定塩基配列の検出方法であって、特定塩基配列を含む試料中の標的ＲＮＡを鋳型として、プロモーター配列を有し前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列と相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメレースによって前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列に相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物を生成し、更に、該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程を、ＲＮＡ転写産物に相補的な配列を有し、ＲＮＡ転写産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するよう設計されたプローブ存在下で実施し、該蛍光特性の変化を測定することで、百日咳菌ｒＲＮＡを検出することを特徴とする前記（３）に記載の、百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法。
（５） 前記プローブが配列番号４７、４８、４９の少なくとも１４塩基からなることを特徴とする前記（４）に記載の検出方法。
（６） 前記プローブが転写産物と相補的な配列を有し相補的なハイブリッドを形成すると蛍光特性が変化するインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブであることを特徴とする前記（５）に記載の検出方法。
（７） 前記（６）の検出方法を実施するための前記プライマーおよび前記プローブを少なくとも含むことを特徴とする百日咳菌ｒＲＮＡの検出試薬。試料中に含まれる百日咳菌 ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーであり、第一のプライマーが配列番号１、５、９、１３、２４、２８のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが３５、４３、４７、５２のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであることを特徴とするプライマー。
なお、本発明の前記オリゴヌクレオチドとしては標的となる相補的配列に対してストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、あるいは前記オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドも使用可能であることは言うまでもない。
すなわち、本発明の別の形態としては、
すなわち、本発明の別の形態としては、
（８） 試料中に含まれる百日咳菌 ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーであり、第一のプライマーが（１）のいずれかに記載のプライマーの少なくとも１５塩基からなり、第二のプライマーが（１）のいずれかに記載のプライマーの少なくとも１６塩基からなる配列、もしくはその相補配列の少なくとも１つ以上から選ばれてなることを特徴とするプライマー。
（９） 試料中に含まれる百日咳菌 ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーであり、第一のプライマーが配列番号２、６、１０、１４、２５のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号２９、３６、４４、４８、５３のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する１６塩基からなるオリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とするプライマー。
（１０） 試料中に含まれる百日咳菌 ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第一のプライマーまたは前記特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーであり、前記プライマーが少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーからなり、
第一のプライマーが配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５～２３、２６、２７のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが配列番号３０～３４、３７～４２、４５、４６、４９～５１、５４～５６の何れかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである
ことを特徴とするプライマー。
第一のプライマーが配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５～２３、２６、２７のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが配列番号３０～３４、３７～４２、４５、４６、４９～５１、５４～５６の何れかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである
ことを特徴とするプライマー。
（１１） 試料中に含まれる百日咳菌 ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第一のプライマーまたは前記特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーであり、前記プライマーが少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーからなり、
第一のプライマーが配列番号１５～２３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが配列番号３７～４２の何れかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである
ことを特徴とするプライマー。
第一のプライマーが配列番号１５～２３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが配列番号３７～４２の何れかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである
ことを特徴とするプライマー。
（１２） 試料中に含まれる百日咳菌 ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第一のプライマーまたは前記特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーであり、前記プライマーが少なくとも第一のプライマーおよび第二のプライマーからなり、
第一のプライマーが配列番号１７、２１、２３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが配列番号３８、４０、４１、４２の何れかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである
ことを特徴とするプライマー。
第一のプライマーが配列番号１７、２１、２３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが配列番号３８、４０、４１、４２の何れかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは、同オリゴヌクレオチドにおいて１もしくは数個の塩基置換、欠失、挿入および／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである
ことを特徴とするプライマー。
（１３） （１）～（１２）のいずれかに記載のプライマーを用いて、前記百日咳菌 ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの特定塩基配列あるいは／および前記特定塩基配列の相補配列からなる核酸を増幅し、検出することを特徴とする、 百日咳菌ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの検出方法。
（１４） 前記百日咳ｒＲＮＡの特定塩基配列の検出方法であって、
特定塩基配列を含む試料中の標的ＲＮＡを鋳型として、プロモーター配列を有し前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列と相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメレースによって前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列に相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物を生成し、更に、該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程を、ＲＮＡ転写産物に相補的な配列を有し、ＲＮＡ転写産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するよう設計されたプローブ存在下で実施し、該蛍光特性の変化を測定することで、百日咳菌ｒＲＮＡを検出することを特徴とする請求項３に記載の、百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法。
特定塩基配列を含む試料中の標的ＲＮＡを鋳型として、プロモーター配列を有し前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列と相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメレースによって前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列に相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物を生成し、更に、該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程を、ＲＮＡ転写産物に相補的な配列を有し、ＲＮＡ転写産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するよう設計されたプローブ存在下で実施し、該蛍光特性の変化を測定することで、百日咳菌ｒＲＮＡを検出することを特徴とする請求項３に記載の、百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法。
（１５） 前記プローブが配列番号４７、４８、４９の少なくとも１４塩基からなり、前記ＲＮＡ転写産物にストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、（８）に記載の検出方法。
（１６） 前記プローブが転写産物と相補的な配列を有し相補的なハイブリッドを形成すると蛍光特性が変化するインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブであることを特徴とする（９）に記載の検出方法。
（１７）（１０）の検出方法を実施するための前記プライマーおよび前記プローブを少なくとも含むことを特徴とする百日咳菌ｒＲＮＡの検出試薬。
本発明のプライマーは百日咳菌 ｒＲＮＡに特異的な塩基配列を含む配列（特定塩基配列）およびその相補配列の一部にそれぞれハイブリダイズすることより、百日咳菌 ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を特異的に増幅させることができる。
本発明のプライマーを用いた百日咳菌 ｒＲＮＡ検出法は、試料中に含まれる百
日咳菌 ｒＲＮＡを迅速、高感度に検出できる。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となる。
本発明のプライマーを用いた百日咳菌 ｒＲＮＡ検出法は、試料中に含まれる百
日咳菌 ｒＲＮＡを迅速、高感度に検出できる。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となる。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のプライマーは、試料中に含まれる百日咳菌 ｒＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第一のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーであって、第一のプライマーが、配列番号１、５、９、１３および２４のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号２８、３５、４３、４７または５２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、プライマーである。
本発明のプライマーは、試料中に含まれる百日咳菌 ｒＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第一のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーであって、第一のプライマーが、配列番号１、５、９、１３および２４のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号２８、３５、４３、４７または５２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、プライマーである。
なお、本発明において、「相補的な配列を有する」とは対象核酸に対しストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいい、「相同的な配列を有する」とは対象核酸の相補鎖に対しストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいう。
（試料）
本発明において「試料」とは、検出対象である百日咳菌 ｒＲＮＡを含む可能性のある限り限定されないが、例えば後鼻腔ぬぐい液、培養液が挙げられる。百日咳菌 ｒＲＮＡを含有する可能性のある試料から公知の方法で処理することで得られるＲＮＡ、あるいはｒＲＮＡを富化した試料等も使用できる。試料中のＲＮＡ量としては、限定されないが、例えば、反応液１００μｌ当り０．０１ｎｇ～１０μｇ程度である。
本発明において「試料」とは、検出対象である百日咳菌 ｒＲＮＡを含む可能性のある限り限定されないが、例えば後鼻腔ぬぐい液、培養液が挙げられる。百日咳菌 ｒＲＮＡを含有する可能性のある試料から公知の方法で処理することで得られるＲＮＡ、あるいはｒＲＮＡを富化した試料等も使用できる。試料中のＲＮＡ量としては、限定されないが、例えば、反応液１００μｌ当り０．０１ｎｇ～１０μｇ程度である。
（対象遺伝子）
本発明のプライマーおよび方法は、百日咳菌遺伝子を検出対象とする。より具体的には、本発明のプライマーおよび方法は、百日咳菌 ｒＲＮＡを検出対象とする。百日咳菌 ｒＲＮＡとしては、百日咳菌 ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５）等がＮＣＢＩに登録されている。
本発明のプライマーおよび方法は、百日咳菌遺伝子を検出対象とする。より具体的には、本発明のプライマーおよび方法は、百日咳菌 ｒＲＮＡを検出対象とする。百日咳菌 ｒＲＮＡとしては、百日咳菌 ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５）等がＮＣＢＩに登録されている。
本発明において「特定塩基配列」とは、百日咳菌 ｒＲＮＡに特異的な塩基配列を含む配列であって、百日咳菌 ｒＲＮＡのうち、本発明の第一のプライマーとの相同領域の５’末端から本発明の第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。すなわち、本発明では前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が増幅されることになる。
（プライマー）
本発明のプライマーは、百日咳菌 ｒＲＮＡにおける特定塩基配列または特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅し得るプライマーである。
より具体的には、本発明のプライマーにおける第一のプライマーは、配列番号１、５、９、１３、２４のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーは、配列番号２８、３５、４３、４７、５２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。
本発明のプライマーは、百日咳菌 ｒＲＮＡにおける特定塩基配列または特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅し得るプライマーである。
より具体的には、本発明のプライマーにおける第一のプライマーは、配列番号１、５、９、１３、２４のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーは、配列番号２８、３５、４３、４７、５２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。
本発明における「ストリンジェントな条件」の例としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性（例えば、同一性や類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。限定されないが、具体的には、ハイブリダイゼーション条件として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。また、洗浄条件として、６０℃、１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ等のストリンジェントな条件に相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件等が挙げられる。さらに、当業者であれば、本明細書の記載、および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｗｏｏｄｂｕｒｙ， ＮＹ （２００１））等を参照し、本発明の第一のプライマー（配列番号１、５、９、１３、２４に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）、および、本発明の第二のプライマー（配列番号２８、３５、４３、４７、５２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）を容易に取得することができる。
また、前述したストリンジェントな条件下で、前記特定塩基配列またはその相補配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であり、かつ、前記特定塩基配列またはその相補配列を増幅可能であれば、第一および第二のプライマーの塩基配列は、前記特定塩基配列またはその相補配列と比較して、１または数個程度（例えば、プライマー配列の塩基数の１０％以下程度）の置換、欠失、挿入、付加および／または修飾があってもよい。なお、プライマーの３’末端に相当する塩基配列には、置換、欠失、挿入および付加はないことが好ましい。
すなわち、第一および第二のプライマーは、特定塩基配列の５’末端部の配列番号１、５、９、１３、２４のいずれかに記載の塩基配列の相補配列の一部もしくは全長、または、前記特定塩基配列の３’末端部の配列番号２８、３５、４３、４７、５２に記載の塩基配列の一部もしくは全長と、７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつプライマーとしての機能を有するオリゴヌクレオチドであってよい。第一および第二のプライマーは、好ましくは、配列番号１、５、９、１３および２４のいずれかに記載の塩基配列の相補配列の一部もしくは全長、または、配列番号２８、３５、４３、４７および５２に記載の塩基配列の一部もしくは全長と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有する。
本明細書における塩基配列の相同性（同一性または類似性ともいう）は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて計算することができる。
第一および第二のプライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基、さらに好ましくは１５塩基～４０塩基、より好ましくは１６塩基～２３塩基までの範囲である。なお、もっとも好ましい態様では、ストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとは、対象塩基配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
プライマーは１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。プライマーの反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定することができる。プライマーは、本明細書の記載および公知技術に基づいて、製造することができる。
本発明は、百日咳菌 ｒＲＮＡの特定塩基配列の５’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９１２番目から９３７番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９９６番目から１０１７番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１０９３番目から１１１２番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号１３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１８番目から１１４９番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号２４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２０５番目から１２３５番目までの塩基配列の相補配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、また百日咳菌 ｒＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号２８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１９２番目から１２３１番目までの塩基配列）または配列番号３５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２３９番目から１２６２番目までの塩基配列）または配列番号４３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１３８３番目から１４０５番目までの塩基配列）または配列番号４７に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４３８番目から１４７５番目までの塩基配列）または配列番号５２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１２番目から１１４３番目までの塩基配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。
その中でも第一のプライマーが好ましくは少なくとも１３塩基、より好ましくは少なくとも１５塩基からなり、第二のプライマーが好ましくは少なくとも１３塩基、より好ましくは少なくとも１５塩基からなってよい。
第一のプライマーの一例として、配列番号１に記載の塩基配列の相補配列である配列番号２に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２１塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９１７番目から９３７番目までの塩基配列）、配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９１２番目から９３２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第一のプライマーの一例として、配列番号５に記載の塩基配列の相補配列である配列番号６に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９９８番目から１０１７番目までの塩基配列）または配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９９６番目から１０１６番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第一のプライマーの一例として、配列番号９に記載の塩基配列の相補配列である配列番号１０に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１０９８番目から１１１２番目までの塩基配列）、配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１０９３番目から１１０９番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第一のプライマーの一例として、配列番号１３に記載の塩基配列の相補配列である配列番号１４に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４３番目までの塩基配列）、配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４６番目までの塩基配列）、配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２７番目から１１４３番目までの塩基配列）、配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４０番目までの塩基配列）、配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２１番目から１１４０番目までの塩基配列）、配列番号２０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１８番目から１１３７番目までの塩基配列）、配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２７番目から１１４６番目までの塩基配列）、配列番号２２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１３０番目から１１４９番目までの塩基配列）、配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２８番目から１１４６番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
第二のプライマーの一例として、配列番号２８に記載の塩基配列の相補配列である配列番号２９に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１９塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号３０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１９２番目から１２１１番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２１２番目から１２３１番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２１１番目から１２２９番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２０８番目から１２２７番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号３４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２１０番目から１２２９番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第二のプライマーの一例として、配列番号３５に記載の塩基配列の相補配列である配列番号３６に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１６塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号３７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４４番目から１２６２番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４４番目から１２５９番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号３９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４７番目から１２６２番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４１番目から１２５９番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４４番目から１２５９番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２３９番目から１２５７番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第二のプライマーの一例として、配列番号４３に記載の塩基配列の相補配列である配列番号４４に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１６塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号４５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１３８３番目から１４５３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１３９０番目から１４０５番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第二のプライマーの一例として、配列番号４７に記載の塩基配列の相補配列である配列番号４８に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号４９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４２８番目から１４５３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号５０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４４８番目から１４６２番目までの塩基配列の相補配列）もしくは配列番号５１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４５６番目から１４７５番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
また第二のプライマーの一例として、配列番号５２に記載の塩基配列の相補配列である配列番号５３に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１８塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号５４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号５５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２０番目から１１３９番目までの塩基配列の相補配列）もしくは配列番号５６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１２番目から１１２９番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
中でも百日咳菌 ｒＲＮＡを迅速かつ特異的に検出可能であるという点で、第一のプライマーが配列番号１５～２３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号３７～４２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、または前記プライマーのうち、任意の組み合わせからなるプライマーセットが好ましい。その中でも第一のプライマーが配列番号１５、１７、２１、２３のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号３８、４０、４１、４２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記プライマーのうち、任意の組み合わせからなるプライマーセットが好ましい。その中でも第一のプライマーと第二のプライマーの組み合わせが、配列番号１７と４０、１７と４２、２１と４０、２３と４２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットがさらに好ましい。
本発明のプライマーもしくは、プライマーのうち任意の組み合わせであるプライマーセットは、ＲＴ－ＰＣＲ法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、百日咳菌 ｒＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーとして有用である。なお、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号６１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
本発明のプライマーもしくは、プライマーのうち任意の組み合わせであるプライマーセットを用いて増幅した百日咳菌 ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。
具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた方法、
等があげられる。
前記（Ｃ）の蛍光色素標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。
具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた方法、
等があげられる。
前記（Ｃ）の蛍光色素標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。
（検出試薬）
本発明の検出試薬は、百日咳菌 ｒＲＮＡの検出に用いられる試薬であって、本発明のプライマー、および、増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを含む、百日咳菌 ｒＲＮＡ検出試薬である。オリゴヌクレオチドプローブの反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。
本発明の検出試薬は、百日咳菌 ｒＲＮＡの検出に用いられる試薬であって、本発明のプライマー、および、増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを含む、百日咳菌 ｒＲＮＡ検出試薬である。オリゴヌクレオチドプローブの反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。
本発明の検出試薬は、試料中に含まれる百日咳菌 ｒＲＮＡの発現量を迅速、高感度に検出できる。そのため、種々の検査、特に臨床診断用試薬として有用であり、百日咳の検査に用いることができる。
本発明の検出試薬には、本発明の効果を妨げない限り、上記成分以外に、さらに任意の反応、検出等に用いられる成分、例えば、ｐＨ緩衝剤、２価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド等から選択される少なくとも１種を含んでもよい。
（プローブ）
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの一例として、百日咳菌 ｒＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブがある。前記プローブは百日咳菌 ｒＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸等の適当な修飾がされているとよい。
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの一例として、百日咳菌 ｒＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブがある。前記プローブは百日咳菌 ｒＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸等の適当な修飾がされているとよい。
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号５７に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１６４番目から１１７７番目までの塩基配列の相補配列）またはその相補配列、配列番号５８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１６４番目から１１７８番目までの塩基配列の相補配列）またはその相補配列、配列番号５９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１６４番目から１１７９番目までの塩基配列の相補配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
（検出方法）
本発明のプライマーを用いて百日咳菌 ｒＲＮＡを検出するには、例えば以下の（１）から（６）に示す工程により実施すればよい。
本発明のプライマーを用いて百日咳菌 ｒＲＮＡを検出するには、例えば以下の（１）から（６）に示す工程により実施すればよい。
（１）配列番号１、５、９、１３、２４のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーが百日咳菌 ｒＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号２８、３５、４３、４７、５２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号５７、５８または５９またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程。
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号２８、３５、４３、４７、５２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号５７、５８または５９またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程。
前記（１）の工程で用いるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（２）の工程で用いるＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、および前記（３）の工程で用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素等が使用できる。各酵素の反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。
前述した態様において、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを第一のプライマーの５’末端側に付加した場合は、前記（１）の工程を実施する前に、百日咳菌２３Ｓ ｒＲＮＡのうち特定塩基配列の５’末端部位があらかじめ切断されていると好ましい。特定塩基配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果としてＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成することができる。前記切断方法の好ましい例として、百日咳菌 ｒＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（当該特定塩基配列内で５’末端を含む部分配列）に重複して５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分をＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素などにより切断する方法があげられる。なお当該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は、伸長反応を防止するために適当な修飾（例えばアミノ化）がされていると好ましい。
前記切断用オリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号６０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１７番目から１１３５番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
前述した態様による百日咳菌 ｒＲＮＡ検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマー／プローブの長さが１５から３０塩基の範囲である場合は、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。反応時間は、必要な目的物量等に応じて、適宜設定可能である。
前述した態様による百日咳菌 ｒＲＮＡ検出方法は、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例２０分以内で終了することが可能である。
前述した態様による百日咳菌 ｒＲＮＡ検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、切断用オリゴヌクレオチド、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む百日咳菌 ｒＲＮＡ試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な温調ブロックに載置することで、自動的に百日咳菌 ｒＲＮＡを増幅し検出することができる。本発明の百日咳菌 ｒＲＮＡ検出試薬において、オリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドは、配列番号５７、５８および５９に記載の塩基配列からなるものが好ましい。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
＜実施例１＞ 標準ＲＮＡ調製
後述の実施例で使用する、百日咳菌 ｒＲＮＡ標準ＲＮＡ、パラ百日咳菌 ｒＲＮＡ標準ＲＮＡを以下に示す方法でそれぞれ調製した。なお調製した各標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。
後述の実施例で使用する、百日咳菌 ｒＲＮＡ標準ＲＮＡ、パラ百日咳菌 ｒＲＮＡ標準ＲＮＡを以下に示す方法でそれぞれ調製した。なお調製した各標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。
（１）百日咳菌 ｒＲＮＡ
百日咳菌 ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１）に基づき、人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、百日咳菌 ｒＲＮＡ標準ＲＮＡを調製した。
（２）パラ百日咳菌 ｒＲＮＡ
パラ百日咳菌 ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＰ０１９９３２．１）に基づき、人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、パラ百日咳菌 ｒＲＮＡ標準ＲＮＡを調製した。
百日咳菌 ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１）に基づき、人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、百日咳菌 ｒＲＮＡ標準ＲＮＡを調製した。
（２）パラ百日咳菌 ｒＲＮＡ
パラ百日咳菌 ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＰ０１９９３２．１）に基づき、人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、パラ百日咳菌 ｒＲＮＡ標準ＲＮＡを調製した。
＜実施例２＞ インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００－３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００－３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマー、切断用オリゴヌクレオチドおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で百日咳菌２３Ｓ ｒＲＮＡの検出を試みた。
＜実施例３＞ 百日咳菌 ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの検討
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマー、切断用オリゴヌクレオチドおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で評価した。
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマー、切断用オリゴヌクレオチドおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で評価した。
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡのうち、百日咳菌 ｒＲＮＡ（実施例１（１））は、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ コール酸ナトリウム）を用いて１０００コピー／１５μＬになるように、パラ百日咳菌 ｒＲＮＡ（実施例１（２））は、前記ＲＮＡ希釈液を用いて１０８コピー／１５μＬになるように、それぞれ希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
１２９．２ｍＭ トレハロース
各０．４８ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．６ｍＭ ＧＴＰ
３．５２ｍＭ ＩＴＰ
０．２μＭ 第一のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモーター（配列番号６１）を付加したもの）
０．２２μＭ 第二のプライマー
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（３‘末端の水酸基をアミノ基で修飾）
３５ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
２８４Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
１２．８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
１２９．２ｍＭ トレハロース
各０．４８ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．６ｍＭ ＧＴＰ
３．５２ｍＭ ＩＴＰ
０．２μＭ 第一のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモーター（配列番号６１）を付加したもの）
０．２２μＭ 第二のプライマー
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（３‘末端の水酸基をアミノ基で修飾）
３５ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
２８４Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
１２．８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
（３）上記の蒸発乾燥後にＲＮＡ試料を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。
開始液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
１０．０７％ ジメチルスルホキシド
２１．５ｍＭ 塩化マグネシウム
１４２．７ｍＭ 塩化カリウム
開始液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
１０．０７％ ジメチルスルホキシド
２１．５ｍＭ 塩化マグネシウム
１４２．７ｍＭ 塩化カリウム
（４）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。
開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．３を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１、２に示す。実験は表１、２に記載された回数実施した。表２の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．３以下（陰性判定）であったことを意味する。
百日咳菌 ｒＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ａ０１からＡ１４）いずれもが１０００コピー／ｔｅｓｔの百日咳菌 ｒＲＮＡを２０分以内に検出した。特に、オリゴヌクレオチドの組み合わせＡ０５、Ａ０６、Ａ０８は１０００コピー／ｔｅｓｔの百日咳菌 ｒＲＮＡを６分以内に検出しており、百日咳菌 ｒＲＮＡを高感度、迅速かつ特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
交差反応性（表２）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、Ａ０２、Ａ０５、Ａ０６、Ａ０７、Ａ０８、Ａ０９、Ａ１３が１０８コピー／ｔｅｓｔのパラ百日咳菌 ｒＲＮＡを検出せず、百日咳菌 ｒＲＮＡに対して高い特異性を有しており、百日咳菌 ｒＲＮＡを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
本発明は、試薬等に適用できる。
＜配列の説明＞
配列番号１ ： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相同配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９１２番目から９３７番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号２ ： 配列番号１の相同配列
配列番号３ ： 配列番号２の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９１７番目から９３７番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号４ ： 配列番号２の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９１２番目から９３２番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号５ ： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相同配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９９６番目から１０１７番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号６ ： 配列番号５の相同配列
配列番号７ ： 配列番号６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９９８番目から１０１７番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号８ ： 配列番号６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９９８番目から１０１６番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号９ ： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相同配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１０９３番目から１１１２番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号１０： 配列番号９の相同配列
配列番号１１： 配列番号１０の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１０９８番目から１１１２番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１２： 配列番号１０の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１０９３番目から１１０９番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１３： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相同配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１８番目から１１４９番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号１４： 配列番号１３の相同配列
配列番号１５： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４３番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１６： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４６番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１７： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２７番目から１１４３番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１８： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４０番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１９： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２１番目から１１４０番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２０： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１８番目から１１３７番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２１： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２７番目から１１４６番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２２： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１３０番目から１１４９番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２３： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２８番目から１１４６番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２４： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相同配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２０５番目から１２３５番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号２５： 配列番号２４の相同配列
配列番号２６： 配列番号２５の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２１６番目から１２３５番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２７： 配列番号２５の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２０５番目から１２２５番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２８： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２０５番目から１２３５番目までの塩基配列）
配列番号２９： 配列番号２８の相補配列
配列番号３０： 配列番号２８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１９２番目から１２１１番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３１： 配列番号２８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２１２番目から１２３１番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３２： 配列番号２８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２１１番目から１２２９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３３： 配列番号２８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２０８番目から１２２７番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３４： 配列番号２８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２１０番目から１２２９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３５： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２３９番目から１２６２番目までの塩基配列）
配列番号３６： 配列番号３５の相補配列
配列番号３７： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４４番目から１２６２番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３８： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４４番目から１２５９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３９： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４７番目から１２６２番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４０： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４１番目から１２５９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４１： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４４番目から１２５９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４２： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２３９番目から１２５７番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４３： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１３８３番目から１４０５番目までの塩基配列）
配列番号４４： 配列番号４３の相補配列
配列番号４５： 配列番号４４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１３８３番目から１４０５番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４６： 配列番号４４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１３９０番目から１４０５番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４７： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４３８番目から１４７５番目までの塩基配列）
配列番号４８： 配列番号４７の相補配列
配列番号４９： 配列番号４８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４２８番目から１４５３番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５０： 配列番号４８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４４８番目から１４６２番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５１： 配列番号４８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４５６番目から１４７５番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５２： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１２番目から１１４３番目までの塩基配列）
配列番号５３： 配列番号５２の相補配列
配列番号５４： 配列番号５３の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４３番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５５： 配列番号５３の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２０番目から１１３９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５６： 配列番号５３の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１２番目から１１２９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５７： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１６４番目から１１７７番目までの塩基配列の相補配列）（オリゴヌクレオチドプローブの一例）
配列番号５８： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１６４番目から１１７８番目までの塩基配列の相補配列）（オリゴヌクレオチドプローブの一例）
配列番号５９： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１６４番目から１１７９番目までの塩基配列の相補配列）（オリゴヌクレオチドプローブの一例
配列番号６０： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１７番目から１１３５番目までの塩基配列の相補配列）（切断用オリゴヌクレオチドの一例）
配列番号６１： Ｔ７プロモーター
配列番号１ ： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相同配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９１２番目から９３７番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号２ ： 配列番号１の相同配列
配列番号３ ： 配列番号２の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９１７番目から９３７番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号４ ： 配列番号２の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９１２番目から９３２番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号５ ： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相同配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９９６番目から１０１７番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号６ ： 配列番号５の相同配列
配列番号７ ： 配列番号６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９９８番目から１０１７番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号８ ： 配列番号６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の９９８番目から１０１６番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号９ ： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相同配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１０９３番目から１１１２番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号１０： 配列番号９の相同配列
配列番号１１： 配列番号１０の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１０９８番目から１１１２番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１２： 配列番号１０の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１０９３番目から１１０９番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１３： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相同配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１８番目から１１４９番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号１４： 配列番号１３の相同配列
配列番号１５： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４３番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１６： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４６番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１７： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２７番目から１１４３番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１８： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４０番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号１９： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２１番目から１１４０番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２０： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１８番目から１１３７番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２１： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２７番目から１１４６番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２２： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１３０番目から１１４９番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２３： 配列番号１４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２８番目から１１４６番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２４： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相同配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２０５番目から１２３５番目までの塩基配列の相補配列）
配列番号２５： 配列番号２４の相同配列
配列番号２６： 配列番号２５の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２１６番目から１２３５番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２７： 配列番号２５の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２０５番目から１２２５番目までの塩基配列）（第一のプライマーの一例）
配列番号２８： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２０５番目から１２３５番目までの塩基配列）
配列番号２９： 配列番号２８の相補配列
配列番号３０： 配列番号２８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１９２番目から１２１１番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３１： 配列番号２８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２１２番目から１２３１番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３２： 配列番号２８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２１１番目から１２２９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３３： 配列番号２８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２０８番目から１２２７番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３４： 配列番号２８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２１０番目から１２２９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３５： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２３９番目から１２６２番目までの塩基配列）
配列番号３６： 配列番号３５の相補配列
配列番号３７： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４４番目から１２６２番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３８： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４４番目から１２５９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号３９： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４７番目から１２６２番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４０： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４１番目から１２５９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４１： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２４４番目から１２５９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４２： 配列番号３６の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１２３９番目から１２５７番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４３： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１３８３番目から１４０５番目までの塩基配列）
配列番号４４： 配列番号４３の相補配列
配列番号４５： 配列番号４４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１３８３番目から１４０５番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４６： 配列番号４４の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１３９０番目から１４０５番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号４７： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４３８番目から１４７５番目までの塩基配列）
配列番号４８： 配列番号４７の相補配列
配列番号４９： 配列番号４８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４２８番目から１４５３番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５０： 配列番号４８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４４８番目から１４６２番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５１： 配列番号４８の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１４５６番目から１４７５番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５２： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１２番目から１１４３番目までの塩基配列）
配列番号５３： 配列番号５２の相補配列
配列番号５４： 配列番号５３の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２４番目から１１４３番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５５： 配列番号５３の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１２０番目から１１３９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５６： 配列番号５３の部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１２番目から１１２９番目までの塩基配列）（第二のプライマーの一例）
配列番号５７： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１６４番目から１１７７番目までの塩基配列の相補配列）（オリゴヌクレオチドプローブの一例）
配列番号５８： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１６４番目から１１７８番目までの塩基配列の相補配列）（オリゴヌクレオチドプローブの一例）
配列番号５９： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１６４番目から１１７９番目までの塩基配列の相補配列）（オリゴヌクレオチドプローブの一例
配列番号６０： 百日咳菌 ｒＲＮＡの部分配列の相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＬＳ３９８６０５．１の１１１７番目から１１３５番目までの塩基配列の相補配列）（切断用オリゴヌクレオチドの一例）
配列番号６１： Ｔ７プロモーター
Claims (3)
- 試料中に含まれる百日咳菌ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を増幅するための第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いて、前記百日咳菌ｒＲＮＡの特定塩基配列あるいは／および前記特定塩基配列の相補配列からなる核酸を増幅し、検出する、百日咳菌ｒＲＮＡの検出方法において、
第一のプライマーおよび第二のプライマーとして以下の組合わせのいずれかを用い、
第一のプライマー／第二のプライマー：
配列番号１７のオリゴヌクレオチド／配列番号４０のオリゴヌクレオチド
配列番号２１のオリゴヌクレオチド／配列番号３７のオリゴヌクレオチド
配列番号２１のオリゴヌクレオチド／配列番号４０のオリゴヌクレオチド
配列番号２１のオリゴヌクレオチド／配列番号４１のオリゴヌクレオチド
配列番号２１のオリゴヌクレオチド／配列番号４２のオリゴヌクレオチド
配列番号２３のオリゴヌクレオチド／配列番号４０のオリゴヌクレオチド
配列番号１５のオリゴヌクレオチド／配列番号４０のオリゴヌクレオチド
かつ、以下の（１）から（６）に示す工程により、反応温度３５～６５℃で行うことを特徴とする方法。
（１）第一のプライマーが百日咳菌ｒＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解し１本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（３）生成した１本鎖ＤＮＡに、第二のプライマーがハイブリダイズし、ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加され、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）当該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号５７のオリゴヌクレオチドを標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程。 - 前記プローブが転写産物と相補的な配列を有し相補的なハイブリッドを形成すると蛍光特性が変化するインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブであることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
- 第一のプライマー、第二のプライマーおよびプローブの組合わせとして、以下のＡ０２、Ａ０５、Ａ０６、Ａ０７、Ａ０８、Ａ０９またはＡ１３
Ｎｏ．：第一のプライマー／第二のプライマー／プローブ
Ａ０２：配列番号１７のオリゴヌクレオチド／配列番号４０のオリゴヌクレオチド／配列番号５７のオリゴヌクレオチド
Ａ０５：配列番号２１のオリゴヌクレオチド／配列番号３７のオリゴヌクレオチド／配列番号５７のオリゴヌクレオチド
Ａ０６：配列番号２１のオリゴヌクレオチド／配列番号４０のオリゴヌクレオチド／配列番号５７のオリゴヌクレオチド
Ａ０７：配列番号２１のオリゴヌクレオチド／配列番号４１のオリゴヌクレオチド／配列番号５７のオリゴヌクレオチド
Ａ０８：配列番号２１のオリゴヌクレオチド／配列番号４２のオリゴヌクレオチド／配列番号５７のオリゴヌクレオチド
Ａ０９：配列番号２３のオリゴヌクレオチド／配列番号４０のオリゴヌクレオチド／配列番号５７のオリゴヌクレオチド
Ａ１３：配列番号１５のオリゴヌクレオチド／配列番号４０のオリゴヌクレオチド／配列番号５７のオリゴヌクレオチド
を含有することを特徴とする、請求項１または２の検出方法を実施するための百日咳菌ｒＲＮＡの検出試薬。
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| JP2019218224A JP7472476B2 (ja) | 2019-12-02 | 2019-12-02 | プライマー及び百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法 |
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| JP2011500085A (ja) | 2007-10-26 | 2011-01-06 | クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド | ボルデテラの検出アッセイ |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Infect Chemother.，Vol.40, No.1，2008年，pp.24-31，DOI : 10.3947/ic.2008.40.1.24 |
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| Publication number | Publication date |
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