JP2019198259A - １ステップｒｔ−ｐｃｒ法 - Google Patents
１ステップｒｔ−ｐｃｒ法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019198259A JP2019198259A JP2018094038A JP2018094038A JP2019198259A JP 2019198259 A JP2019198259 A JP 2019198259A JP 2018094038 A JP2018094038 A JP 2018094038A JP 2018094038 A JP2018094038 A JP 2018094038A JP 2019198259 A JP2019198259 A JP 2019198259A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pcr
- stranded dna
- double
- reverse transcriptase
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 63
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims abstract description 42
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 36
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 claims description 8
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 6
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 6
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 claims description 5
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 claims description 4
- 108010055863 gene b exonuclease Proteins 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 88
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 40
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 13
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010049152 Cold Shock Proteins and Peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000369757 Sapovirus Species 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000011410 subtraction method Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】プライマーダイマーの合成を抑制し、目的遺伝子のみを効率よく増幅することのできる１ステップＲＴ−ＰＣＲ法ＰＣＲ法、及びそれに用いる１ステップＲＴ−ＰＣＲ用組成物を提供する。【解決手段】鋳型となるＲＮＡ、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、少なくとも２種のプライマー、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む溶液を調製する工程と、前記溶液をインキュベーションする工程と、を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応用キット。逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応用組成物。【選択図】図３
Description
本発明は、遺伝子増幅技術に関し、遺伝子検査、微生物検査、健康診断、及び疫学調査等に適用される。より詳しくは、本発明は、プライマーダイマー生成を抑制する１ステップＲＴ−ＰＣＲ法、及びそれに用いる１ステップＲＴ−ＰＣＲ用組成物に関する。また、プライマーダイマー生成を抑制する１ステップＲＴ−ＰＣＲ法用成分を含むキットにも関する。
ＲＴ−ＰＣＲ［逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）法は、逆転写酵素（Reverse Transcriptase）を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換した後に、ＰＣＲ法でｃＤＮＡを増幅する方法である。ＲＴ−ＰＣＲ法は、微量のＲＮＡでも定量的に解析できるため、今日最も検出感度の高い定量性に優れた解析法の１つとして用いられている。例えば、ＲＮＡを遺伝子として保有しているウイルスの検出、ｍＲＮＡの定量的検出、ｍＲＮＡの塩基配列決定による発現遺伝子の解析、さらにはｃＤＮＡのクローニングによる発現産物の解析及び生産等には欠かせない技術になっている。
遺伝子増幅技術において、逆転写反応とＰＣＲとを１つの反応系で同時に行う１ステップＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写反応とＰＣＲとを別々に行う２ステップＲＴ−ＰＣＲ法に比べ、簡便で高感度な検出方法であり、特に多検体のハイスループット解析に適している。
１ステップＲＴ−ＰＣＲ法において、逆転写反応とＰＣＲとを１つの反応系で同時に行うので、鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡに転写する逆転写反応中に、副反応として複数種類のプライマー同士が非特異的にミスアニールすることにより、目的ＤＮＡの増幅以外にプライマーダイマーの増幅が起こることが問題となる。
特許第５２７９３３９号公報（及び特開２００９−２７３４３２号公報）には、このような非特異的増幅を抑制するために、逆転写酵素と共にコールドショックタンパク質を逆転写反応に用いることが開示されている。しかしながら、この方法は、コールドショックタンパク質により鋳型ＲＮＡに対してプライマーを特異的にアニールすることを促進することで、非特異的なｃＤＮＡ合成を抑制するものであって、プライマーダイマーの合成を抑制するものではない。プライマーダイマーについては何らの言及もなされていない。
１ステップＲＴ−ＰＣＲ法では、逆転写反応とＰＣＲとを１つの反応系で同時に行い、目的とするＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、それを鋳型としてＰＣＲで増幅させる。１ステップＲＴ−ＰＣＲ法において、プライマーダイマーは、逆転写酵素により複数種類のプライマー同士が非特異的にミスアニールして、エクステンションを起こすことにより合成される。プライマーダイマーの影響は特に、ＲＮＡが微量の時、プライマーダイマーが優先的に増幅されることで、ｃＤＮＡの増幅効率が低下し、目的ＤＮＡが得られなかったり、目的ＤＮＡの収量が減少したりすることである。１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応後に融解曲線解析を行う場合、目的遺伝子のピークとは別に低温側にプライマーダイマー由来の非特異的なピークが出現することによって解析が困難となる。
２ステップＲＴ−ＰＣＲ法では、逆転写反応とＰＣＲとを別々に行う。最初のステップの逆転写反応でｃＤＮＡを合成するためにリバースプライマーのみしか必要としないので、仮にリバースプライマー同士がプライマーダイマーを形成したとしても該プライマーダイマーはヘアピン構造をとるため、ＰＣＲのステップで該プライマーダイマーの増幅は起こらない。また、逆転写反応後に逆転写酵素を熱失活させるため、次のＰＣＲステップで必要なフォワードプライマーがリバースプライマーと混在しても、プライマーダイマーの合成は起きない。
しかしながら、図１に示されるように、従来の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法では、逆転写反応時にフォワード（Ｆｗ）プライマーとリバース（Ｒｖ）プライマーとが混在するため、原理的にプライマーダイマーの合成は避けられない。プライマーを設計する際に、プライマー同士がミスアニールしないようにプライマー配列を設計するのであるが、増幅したい場所が決まっている場合でミスアニールするようなプライマーを使わざるを得ない場合もある。また、たとえ設計上はミスアニールしないプライマー配列でも、実際に逆転写反応を行うと、プライマーダイマーの合成が起こることも少なくない。
逆転写反応とＰＣＲとを１つの反応系で同時に行う１ステップＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写反応とＰＣＲとを別々に行う２ステップＲＴ−ＰＣＲ法に比べ、簡便で高感度な検出方法であり、特に多検体のハイスループット解析に適している等のメリットがある。一方で、１ステップＲＴ−ＰＣＲ法には、上述したようなプライマーダイマーの生成という問題がある。
そこで、本発明の目的は、プライマーダイマーの合成を抑制し、目的遺伝子のみを効率よく増幅することのできる１ステップＲＴ−ＰＣＲ法、及びそれに用いる１ステップＲＴ−ＰＣＲ用組成物を提供することにある。
本発明者らは鋭意検討し、１ステップＲＴ−ＰＣＲ法において、最初の逆転写反応で生じたプライマーダイマーを直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素により分解する方法を考えた。すなわち、逆転写反応やＰＣＲ反応に必要なプライマーは一本鎖ＤＮＡであるが、ミスアニールにより合成されたプライマーダイマーは直鎖状二本鎖ＤＮＡである。逆転写反応やＰＣＲ反応に必要な一本鎖ＤＮＡプライマーは分解させずに、不要なプライマーダイマーだけを分解するために、プライマーダイマーが直鎖状二本鎖ＤＮＡであることに着目し、直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素を用いて、逆転写反応で生じたプライマーダイマーを分解する。
本発明は、以下の発明を含む。
（１）鋳型となるＲＮＡ、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、少なくとも２種のプライマー、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む溶液を調製する工程と、
前記溶液をインキュベーションする工程と、
を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。
（１）鋳型となるＲＮＡ、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、少なくとも２種のプライマー、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む溶液を調製する工程と、
前記溶液をインキュベーションする工程と、
を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。
（２）前記二本鎖ＤＮＡ分解酵素が、直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素である、上記（１）に記載の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。
（３）前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素が、エキソヌクレアーゼである、上記（２）に記載の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。
（４）前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素が、エキソヌクレアーゼIII、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、及びランダムエキソヌクレアーゼからなる群から選ばれる、上記（２）又は（３）に記載の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。
（５）逆転写酵素が、Avian Myeloblastosis Virus由来の逆転写酵素、Moloney Murine Leukemia Virus由来の逆転写酵素、及びそれらの遺伝子改変型逆転写酵素からなる群から選ばれる、上記（１）〜（４）のうちのいずれかに記載の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。
（６）逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応用キット。
（７）逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応用組成物。
（８）鋳型となるＲＮＡ、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、少なくとも２種のプライマー、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む溶液を調製する工程と、
前記溶液をインキュベーションする工程と、
を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ法におけるプライマーダイマーの抑制方法。
前記溶液をインキュベーションする工程と、
を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ法におけるプライマーダイマーの抑制方法。
本発明において、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、鋳型となるＲＮＡ、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、少なくとも２種のプライマー、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素が含まれる。二本鎖ＤＮＡ分解酵素の存在により、通常の１ステップＲＴ−ＰＣＲではプライマーダイマーが合成されてしまうようなプライマーを用いても、プライマーダイマーの合成を抑制して、目的のＤＮＡのみを効率良く増幅することができる。
このことにより、ＲＴ−ＰＣＲ反応後の融解曲線解析において、低温側のプライマーダイマー由来のピークが減少し、目的ＤＮＡのピークを的確に検出することができる。
このようにして、本発明によれば、プライマーダイマー生成を抑制する１ステップＲＴ−ＰＣＲ法、及びそれに用いる１ステップＲＴ−ＰＣＲ用組成物が提供され、遺伝子検査、微生物検査、健康診断、及び疫学調査等に好適に適用される。また、本発明によれば、プライマーダイマー生成を抑制する１ステップＲＴ−ＰＣＲ法用成分を含むキットが提供される。
本発明は、鋳型となるＲＮＡ、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、少なくとも２種のプライマー、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む溶液を調製する工程と、
前記溶液をインキュベーションする工程と、
を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ法である。図２は、本発明の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法を模式的に表す図である。
前記溶液をインキュベーションする工程と、
を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ法である。図２は、本発明の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法を模式的に表す図である。
本発明において、鋳型となるＲＮＡを含む試料を１ステップＲＴ−ＰＣＲ法による核酸増幅法に適用することができる。試料としては、特に限定されることなく、例えば、細胞、組織、血液（全血、血漿、血清）、尿、体分泌液、及び糞便などの生体由来試料が挙げられる。また、食品、各種ふき取りサンプルなどの衛生管理に供される試料や、河川水、海水、土壌、空気からの捕集物などの環境測定に供される試料等も挙げられる。
鋳型となるＲＮＡは、プライマーがハイブリダイズした場合に、プライマーからの逆転写反応の鋳型として働くことができるＲＮＡである。本発明において、上記試料中に１種類の鋳型ＲＮＡが含まれていても良く、あるいは異なるヌクレオチド配列を有する複数種の鋳型ＲＮＡが含まれていてもよい。複数の鋳型ＲＮＡは、異なる核酸内に存在しても、同一の核酸内に存在してもよい。
鋳型となるＲＮＡとしては、特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子群（例えば、共通の塩基配列モチーフを有するＲＮＡ分子群、ＲＮＡポリメラーゼによる転写物、サブトラクション法によって濃縮されたＲＮＡ分子群）が挙げられる。
鋳型となるＲＮＡとしては、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡの全部又はその一部であってもよい。ＲＮＡウイルスとはゲノムをＲＮＡとして持つウイルスであり、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、腸管病原性ウイルス（ノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルスなど）、インフルエンザウイルスなど病原性を持つものが数多く含まれる。従って、これらを病原因子として含んでいる疑いがある試料の場合、短時間に簡便に逆転写反応及び核酸増幅反応を行い、分析する必要がある。このような場合に、本発明の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法は特に有効である。
逆転写反応は逆転写酵素によって行われる。逆転写酵素としては、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素［Avian Myeloblastosis Virus（ＡＭＶ）由来逆転写酵素］、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素［Moloney Murine Leukemia Virus（ＭＭＬＶ）由来逆転写酵素］等のウイルス由来の逆転写酵素、及びそれらの遺伝子改変型逆転写酵素が挙げられる。また、サーマス（Thermus）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ等）や好熱性バチルス（Bacillus）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の耐熱性の逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されることはない。
逆転写反応のプライマーは、鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、使用される反応条件において鋳型となるＲＮＡに対して特異的にアニールするものであれば特に限定されることはなく、鋳型ＲＮＡに特異的なプライマー、ランダムプライマー、ｄＴプライマーなどが挙げられる。特異的プライマーはＰＣＲのプライマーと共通とすることもできる。また、これらのプライマーを２種以上混合して使用することもできる。特定の鋳型ＲＮＡに特異的なプライマーを設計して使用することが好ましい。
本発明の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法による核酸増幅法において、前記逆転写反応によって得られたｃＤＮＡの少なくとも一部の配列部分をＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲ増幅酵素としては、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されることなく、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｂｓｔなどが例示される。
前記ＰＣＲにおけるプライマーは、標的となるｃＤＮＡに特異的なプライマーが使用される。これは上記逆転写反応に用いた特異的プライマーと同一であってもよい。また、これらのプライマーは、標的となる核酸の数に応じて２種以上混合して使用することもできる。また、フォワードプライマー又はリバースプライマーのいずれかのプライマーを共通のものとしてもよい。
本発明の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法において、反応系中に二本鎖ＤＮＡ分解酵素を存在させる。二本鎖ＤＮＡ分解酵素とは、二本鎖ＤＮＡに特異的な分解酵素である。
図２を参照して、１ステップＲＴ−ＰＣＲ法では、逆転写反応とＰＣＲとを１つの反応系で同時に行い、目的とするＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、それを鋳型としてＰＣＲで増幅させる。１ステップＲＴ−ＰＣＲ法では、リバース（Ｒｖ）プライマーとフォワード（Ｆｗ）プライマーとが同時に反応系中に存在するので、逆転写酵素により複数種類のプライマー同士が非特異的にミスアニールして、エクステンションを起こすことにより、プライマーダイマーが合成されてしまうことは原理的に避けられない。
ＲＮＡが微量の時、プライマーダイマーが優先的に増幅されると、ｃＤＮＡの増幅効率が低下し、目的ＤＮＡが得られなかったり、目的ＤＮＡの収量が減少したりする。また、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応後に融解曲線解析を行う場合、目的遺伝子のピークとは別に低温側にプライマーダイマー由来の非特異的なピークが出現することによって解析が困難となる。
本発明の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法において、反応系中に二本鎖ＤＮＡ分解酵素を存在させ、プライマー同士の非特異的ミスアニールにより生成したプライマーダイマーを二本鎖ＤＮＡ分解酵素により分解させる。逆転写反応に必要なリバースプライマーや、ＰＣＲ反応に必要なフォワードプライマーは一本鎖ＤＮＡであるが、ミスアニールにより合成されたプライマーダイマーは直鎖状二本鎖ＤＮＡである。二本鎖ＤＮＡ分解酵素は、逆転写反応やＰＣＲ反応に必要な一本鎖ＤＮＡプライマーは分解させずに、不要なプライマーダイマーだけを特異的に分解する。このことにより、プライマーダイマーの合成が抑制され、目的遺伝子のみを効率よく増幅することができる。
ミスアニールにより合成されたプライマーダイマーは直鎖状二本鎖ＤＮＡであるので、前記二本鎖ＤＮＡ分解酵素は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素であるとよい。また、ミスアニールにより合成されたプライマーダイマーの端部から分解するために、前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素は、エキソヌクレアーゼであるとよい。
前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素としては、例えば、エキソヌクレアーゼIII、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ランダムエキソヌクレアーゼなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。エキソヌクレアーゼIIIは、二本鎖ＤＮＡの３’−ＯＨ末端から５’−モノヌクレオチドを遊離させる３’→５’exonucleaseである。Ｔ７エキソヌクレアーゼは、５’→３’の方向に二本鎖ＤＮＡから５’−モノヌクレオチドを遊離させる。
本発明の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法において、上記各成分を含む反応溶液を調製する。反応溶液は、反応緩衝液を含むことができる。反応溶液をインキュベートする。
本発明の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法における逆転写反応の反応温度は特に限定されない。好ましい温度範囲は用いられる逆転写酵素とプライマーに依存し、例えば２０℃から６５℃の間で行うとよい。逆転写反応の時間は１分以上であり、例えば、２分以上３０分以下、好ましくは２分以上２０分以下である。これらの条件は、当業者が適宜決定することができる。ＰＣＲ反応サイクルの条件についても、当業者が適宜決定することができる。
本発明において、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、プライマー、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素の使用量は、試料液中の鋳型となるＲＮＡの量、濃度を考慮して、当業者が適宜決定することができる。
本発明においてＰＣＲにより得られた増幅産物の解析は、電気泳動法、蛍光融解曲線法、各種プローブ法（Ｑプローブ、スコーピオンプローブ、ハイブリプローブなど）などにより行うことができる。また、反応中にリアルタイムに増幅生成したＤＮＡ断片を検出識別するために、反応溶液中に、蛍光色素や蛍光標識プローブを含ませても良い。蛍光色素とは蛍光融解曲線解析を行うためのインターカレーター色素であり、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎなどが例示される。
本発明によれば、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応用キットが提供される。
本発明によれば、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応用組成物が提供される。
また、上述の記載から明らかなように、本発明によれば、鋳型となるＲＮＡ、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、少なくとも２種のプライマー、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む溶液を調製する工程と、前記溶液をインキュベーションする工程と、を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ法におけるプライマーダイマーの抑制方法が提供される。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。
［実施例１］
プライマーとして、次のものを用いた。
配列番号１（COG1F）：CGYTGGATGCGNTTYCATGA
配列番号２（COG1R）：CTTAGACGCCATCATCATTYAC
配列番号３（COG2F）：CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG
配列番号４（COG2R）：TCGACGCCATCTTCATTCACA
配列番号１（COG1F）：CGYTGGATGCGNTTYCATGA
配列番号２（COG1R）：CTTAGACGCCATCATCATTYAC
配列番号３（COG2F）：CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG
配列番号４（COG2R）：TCGACGCCATCTTCATTCACA
直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素によるプライマーダイマーの合成抑制を調べるために、インターカレーター蛍光色素の存在下でノロウイルスＲＮＡの約１００ｂｐの領域の１ｓｔｅｐ−ＲＴ−ＰＣＲを行い、その後、ＰＣＲの増幅産物の融解温度をSYBR Green Iの蛍光を指標として測定した。
具体的には、１ｓｔｅｐ−ＲＴ−ＰＣＲノロウイルスＧ１＆Ｇ２検出試薬キット（島津製作所製）に、エキソヌクレアーゼIIIを１Ｕ添加して、ノロウイルスＲＮＡを標的とした１ｓｔｅｐ−ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲはフォーワードプライマー（配列番号１，３）とリバースプライマー（配列番号２，４）をそれぞれ最終濃度０．２５μＭで添加してある５０μＬの反応液量で、鋳型として、１００コピーの人工合成ＲＮＡを用いた。鋳型としたノロウイルスＲＮＡは配列番号３と４で挟み込まれるＧ２型の配列を含み、上流にＴ７プロモーター配列を連結したプラスミドからRiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7（プロメガ社製）を用いて添付の取扱説明書に記載の方法に従って合成した。
ＰＣＲは、島津製作所製ＧＶＰ９６００を用い、逆転写反応５０℃１５分、初期変性９５℃１０分、ＰＣＲサイクル９５℃１０秒及び５６℃３０秒及び７２℃３０秒で４５サイクル行った。その後に、融解曲線解析を行った。 融解曲線解析は、９５℃１分、７０℃１分、９５℃５秒、最終段の９５℃までの温度ステップを０．５℃で実施した。
［比較例１］
実施例１において、エキソヌクレアーゼIII（１Ｕ）を添加しなかった以外は、実施例１と同様に１ｓｔｅｐ−ＲＴ−ＰＣＲを行い、その後に、融解曲線解析を行った。
実施例１において、エキソヌクレアーゼIII（１Ｕ）を添加しなかった以外は、実施例１と同様に１ｓｔｅｐ−ＲＴ−ＰＣＲを行い、その後に、融解曲線解析を行った。
実施例１及び比較例１における融解曲線解析結果のグラフを図３に示す。図３より、エキソヌクレアーゼIIIを添加した実施例１では、プライマーダイマーの生成を抑制し、目的ＤＮＡを増幅できた。エキソヌクレアーゼIIIを添加しなかった比較例１では、プライマーダイマーの生成が多く、その増幅物が多く生成しており、目的ＤＮＡの増幅は非常に僅かであった。
Claims (8)
- 鋳型となるＲＮＡ、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、少なくとも２種のプライマー、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む溶液を調製する工程と、
前記溶液をインキュベーションする工程と、
を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。 - 前記二本鎖ＤＮＡ分解酵素が、直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素である、請求項１に記載の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。
- 前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素が、エキソヌクレアーゼである、請求項２に記載の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。
- 前記直鎖状二本鎖ＤＮＡ分解酵素が、エキソヌクレアーゼIII、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、及びランダムエキソヌクレアーゼからなる群から選ばれる、請求項２又は３に記載の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。
- 逆転写酵素が、Avian Myeloblastosis Virus由来の逆転写酵素、Moloney Murine Leukemia Virus由来の逆転写酵素、及びそれらの遺伝子改変型逆転写酵素からなる群から選ばれる、請求項１〜４のうちのいずれかに記載の１ステップＲＴ−ＰＣＲ法。
- 逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応用キット。
- 逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応用組成物。
- 鋳型となるＲＮＡ、逆転写酵素、ＰＣＲ増幅酵素、少なくとも２種のプライマー、及び二本鎖ＤＮＡ分解酵素を含む溶液を調製する工程と、
前記溶液をインキュベーションする工程と、
を含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ法におけるプライマーダイマーの抑制方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018094038A JP2019198259A (ja) | 2018-05-15 | 2018-05-15 | １ステップｒｔ−ｐｃｒ法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018094038A JP2019198259A (ja) | 2018-05-15 | 2018-05-15 | １ステップｒｔ−ｐｃｒ法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019198259A true JP2019198259A (ja) | 2019-11-21 |
Family
ID=68611123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018094038A Pending JP2019198259A (ja) | 2018-05-15 | 2018-05-15 | １ステップｒｔ−ｐｃｒ法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2019198259A (ja) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5985619A (en) * | 1995-02-07 | 1999-11-16 | Clinical Diagnostic Systems, Inc. | Use of exonuclease and/or glycosylase as supplements to anti-polymerase antibody to increase specificity in polymerase chain reaction |
| JP2009225796A (ja) * | 2008-03-19 | 2009-10-08 | F Hoffmann La Roche Ag | 修飾されたランダマーの存在下での核酸増幅 |
| JP2011019505A (ja) * | 2009-01-29 | 2011-02-03 | Mukogawa Gakuin | 特定遺伝子を検出する方法 |
| JP2011078389A (ja) * | 2009-10-09 | 2011-04-21 | Tosoh Corp | サポウイルスｒｎａの検出方法および検出試薬 |
| JP2013528384A (ja) * | 2010-05-25 | 2013-07-11 | サムスン・テクウィン・カンパニー・リミテッド | 変形されたＲＮａｓｅＨ及び核酸増幅の検出 |
| JP2016036304A (ja) * | 2014-08-08 | 2016-03-22 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅の非特異反応を抑制する新規の方法 |
| JP2018000138A (ja) * | 2016-07-06 | 2018-01-11 | 東洋紡株式会社 | 改良されたウイルス検出方法 |
-
2018
- 2018-05-15 JP JP2018094038A patent/JP2019198259A/ja active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5985619A (en) * | 1995-02-07 | 1999-11-16 | Clinical Diagnostic Systems, Inc. | Use of exonuclease and/or glycosylase as supplements to anti-polymerase antibody to increase specificity in polymerase chain reaction |
| JP2009225796A (ja) * | 2008-03-19 | 2009-10-08 | F Hoffmann La Roche Ag | 修飾されたランダマーの存在下での核酸増幅 |
| JP2011019505A (ja) * | 2009-01-29 | 2011-02-03 | Mukogawa Gakuin | 特定遺伝子を検出する方法 |
| JP2011078389A (ja) * | 2009-10-09 | 2011-04-21 | Tosoh Corp | サポウイルスｒｎａの検出方法および検出試薬 |
| JP2013528384A (ja) * | 2010-05-25 | 2013-07-11 | サムスン・テクウィン・カンパニー・リミテッド | 変形されたＲＮａｓｅＨ及び核酸増幅の検出 |
| JP2016036304A (ja) * | 2014-08-08 | 2016-03-22 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅の非特異反応を抑制する新規の方法 |
| JP2018000138A (ja) * | 2016-07-06 | 2018-01-11 | 東洋紡株式会社 | 改良されたウイルス検出方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6480511B2 (ja) | 試料中の核酸配列を定量するための組成物および方法 | |
| JP2019528726A (ja) | マルチプレックスリアルタイムｐｃｒを実施する方法 | |
| EP2310527B1 (en) | Improved lysis and reverse transcription for mrna quantification | |
| JP6126381B2 (ja) | 標的核酸の検出方法及びキット | |
| JP6029636B2 (ja) | Ｒｎａの検出方法 | |
| KR102323375B1 (ko) | 다중 프로브 | |
| JP6074036B2 (ja) | 拡大された基質範囲を有する新規のｄｎａポリメラーゼ | |
| JP2016019495A (ja) | 核酸増幅法 | |
| KR20060041664A (ko) | 노로바이러스 검출 시약 | |
| CN103154270B (zh) | 用于rt‑pcr反应缓冲液中的细胞裂解的方法 | |
| JP6733215B2 (ja) | プライマー及びマイコプラズマ・ニューモニエの検出方法 | |
| JP2019198259A (ja) | １ステップｒｔ−ｐｃｒ法 | |
| JP5887078B2 (ja) | 合成ｓｉＲＮＡ検出方法 | |
| CA3009716C (en) | Generic method for the stabilization of specific rna | |
| CN116348614A (zh) | 开关寡核苷酸 | |
| JP2011078389A (ja) | サポウイルスｒｎａの検出方法および検出試薬 | |
| US9914962B2 (en) | Quantification of RNA | |
| JP7472476B2 (ja) | プライマー及び百日咳菌 ｒＲＮＡの検出方法 | |
| JP4658660B2 (ja) | 核酸検出法 | |
| JP2005245434A (ja) | ノロウイルスの検出試薬 | |
| JP2005176767A (ja) | ホットスタートリアルタイムｐｃｒ方法 | |
| JP2002125688A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスの高感度検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200916 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210630 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210713 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210907 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211108 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220322 |