JP2018000138A - 改良されたウイルス検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料中のカリシウイルス科ウイルスの検査方法であって、ＲＴ−ＰＣＲ反応が1時間以内に終了することを目的とする。
【解決手段】逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応による試料中のカリシウイルス科ウイルスの検査方法であって、ＲＴ−ＰＣＲ反応が1時間以内に終了することを特徴とするカリシウイルス科ウイルスの存在の有無を検査するための方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸増幅によるウイルスの検出法に関する。より具体的には、試料から核酸の単離や加熱処理することなく、試料をリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の反応液に加え、糞便試料または環境拭き取り試料中のカリシウイルス科ウイルスの検出に関する。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。

核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。
ＲＮＡを分析する場合、このＰＣＲの前段として、鋳型ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を実施する。これをＲＴ−ＰＣＲという。このＲＴ−ＰＣＲは、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ−ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを、単一酵素を利用する一酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲ、（３）逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを利用する二酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲの３つに大別される。

ＲＴ−ＰＣＲのうち、遺伝子検査では、処理能力の高さや、反応途中での反応容器の開閉によるコンタミネーションを回避するため、１ステップＲＴ−ＰＣＲが好まれる。一酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲでは、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼやＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが利用される。一方、二酵素１ステップＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの少なくとも２種類の酵素が使用される。

逆転写酵素としては、レトロウイルスあるいは細菌由来の逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ；モロニーマウス白血病ウイルス）−ＲＴ （Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ；トリ骨髄芽球症ウイルス）−ＲＴ、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）２−ＲＴ、ＥＩＡＶ（Ｅｑｕｉｎｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｎｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼなど）やこれらの変異体が利用される。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては。Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体などが利用される。

一酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲ法は、２ステップＲＴ−ＰＣＲよりも感度が低いことが知られる（非特許文献１）。これに対し、二酵素１ステップＲＴ−ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性と比べ、レトロウイルス由来の逆転写酵素の逆転写効率が高いことから、単一酵素共役ＲＴ−ＰＣＲよりも感度が高いとされる（非特許文献２）。しかし、二酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲは、２ステップＲＴ−ＰＣＲよりも感度が高いが、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼが干渉し、反応効率を低下させることが報告されている（非特許文献３）。この干渉を抑えるため、鋳型ＲＮＡの増加、非ホモログｔＲＮＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、あるいは逆転写酵素に対するＤＮＡポリメラーゼ比率の増加などの使用が行われてきた。

病原性ＲＮＡウイルスの一つであるノロウイルスは、急性胃腸炎の原因となる１本鎖ＲＮＡウイルスである。感染力が強く、集団食中毒や集団感染を引き起こすことから、公衆衛生上関心の高いウイルスである。ノロウイルスはＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩ（Ｇ１）及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ（Ｇ２）の２つの遺伝子群に分類される。ノロウイルスの病原体検査では、組織培養法が確立できておらず、電子顕微鏡法、ＥＬＩＳＡによる免疫学的抗原検出法、または核酸増幅技術を利用したウイルス遺伝子の検出法が開発されてきた。このうち、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に基づくＲＴ−ＰＣＲ法が公定法として普及している。

ノロウイルスの感染の原因として主にノロウイルスに汚染された食品を飲食することによるが、ヒトの手を介した感染が多いため、調理施設、医療現場、老人介護施設及び保育園などでは定期的な検便検査が求められている。大量調理施設衛生管理マニュアルには、調理従事者等の検便検査に、必要に応じてノロウイルスの流行期である１０月から３月についてノロウイルスの検査を含めることが追加されている。これはウイルスに感染していても症状がでない人（健康保因者）が少なからず存在し、これらの人たちが知らず知らずのうちに感染を広げる可能性があるためである。さらに、下痢や嘔吐などの症状がある調理従事者は医療機関を受診し、ノロウイルスに感染していることが判明した場合はリアルタイムＰＣＲ等の高感度検査を実施し、ノロウイルスを保有していないことが確認されるまでは食品に直接触れる調理作業を控えるなどの適切な処置をとることが望まれている。

ノロウイルスは、約３０ｎｍのキャプシドタンパク質からなる正二十面体構造を持ったウイルスである。その中にウイルスＲＮＡゲノムが封入される。そこで、従来、糞便試料からのノロウイルスの検出は、例えば糞便の１０％乳剤を作製し、遠心上清から市販のウイルスＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出・精製し、このＲＮＡ抽出液を用いてノロウイルスの検出が行われてきた。しかし、短時間で多数の検体を検査するには、このＲＮＡ抽出作業は煩雑である。そこで、近年、糞便試料から熱処理でキャプシドを破壊し、ウイルスＲＮＡを露出させた処理液をＲＴ−ＰＣＲに供することでウイルスの有無を検出する手法がとられるようになった。この際、ＲＮＡの抽出を省略することで、糞便試料中には含まれる、多糖類などのＰＣＲ反応阻害物質が持ち込まれる。そこで、これらの影響を低減するような工夫が前処理剤やＰＣＲ反応液になされている（特許文献１）。

ノロウイルスを対象としたＲＴ−ＰＣＲによる検便検査のための試薬としては、島津社製「１ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ノロウイルスＧ１＆Ｇ２検出試薬キットシリーズ」、タカラバイオ社製「ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キット」、東洋紡製「ノロウイルス検出キット―プローブ検出―」などが市販される。しかしながら、糞便試料中のＰＣＲ反応阻害物質の影響が完全に解消されず、感度よくウイルスＲＮＡを検出するのにＲＴ−ＰＣＲ反応に１時間半〜２時間の時間を要していた。そのため、効率よく多数の試料を検査するために、さらに短時間でウイルスＲＮＡの有無を検出する方法が望まれていた。

特開２０１５―１１９６５６号公報

ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第１７巻，１９９４年、第１０３４−１０３６頁 ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２５巻，１９９８年、第２３０−２３４頁 Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第２０巻，１９９２年、第１４８７−１４９０頁 Ｊ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第５巻、２０１４年、第４５頁

本発明の目的は、１時間以内で１ステップＲＴ−ＰＣＲにより、試料からカリシウイルス科ウイルスＲＮＡの有無の検出を可能とすることである。

本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、１ステップＲＴ−ＰＣＲの糞便耐性を高めることにより１時間以内の１ステップＲＴ−ＰＣＲに供することで、カリシウイルス科ウイルスＲＮＡの検出が可能であることを見出した。
特に本発明者らは、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩、の少なくとも１つを１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を用いることにより、より効率よく検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

代表的な本願発明は、以下の通りである。
[項１]逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応による試料中のカリシウイルス科ウイルスの検査方法であって、ＲＴ−ＰＣＲ反応が1時間以内に終了することを特徴とするカリシウイルス科ウイルスの存在の有無を検査するための方法。
[項２]カリシウイルスがノロウイルスである項１に記載の方法。
[項３]ノロウイルスがＧ１型であるかＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする項２に記載の方法。
[項４]配列番号１〜５のいずれかに記載される塩基配列を含む少なくとも１つのプライマーを含む項１に記載の方法。
[項５]配列番号６〜９のいずれかに記載される塩基配列を含む少なくとも１つの標識プローブを含む項１に記載の方法。
[項６]試料が糞便である項１〜５のいずれかに記載の方法。
[項７]試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である項１〜５のいずれかに記載の方法。
[項８]試料が懸濁液の遠心上清である、項１〜５のいずれかに記載の方法
[項９]試料が環境中の拭き取り検査試料を水、生理食塩水または緩衝液に懸濁し、かつ、懸濁液を濃縮した試料であることを特徴とする項１〜５のいずれかに記載の方法。
[項１０]試料が８５℃以上で加熱処理されたサンプルである、項１〜９のいずれかに記載の方法。
[項１１]１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンの少なくとも１つを含むことを特徴とする項１から１０のいずれかに記載の方法。
[項１２]ベタイン様４級アンモニウム塩が、ベタインまたはＬ−カルニチンである項１１に記載の方法。
[項１３]耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈまたはそれらの変異体から選択されることを特徴とする請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
[項１４]逆転写酵素の由来が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）またはこれらの変異体から選択されることを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載の方法。

本発明によって、従来１．５時間から２時間かけて実施されていた１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を１時間以内に終了することができ、試料中のカリシウイルス科ウイルスの有無を検出することが可能になる。この結果、検査業務がさらに効率化することから、ウイルス感染しても症状のない被験者の検査量を増やすことができ、また、より早く健康保因者の就業を中止させることが可能となり、感染症予防にも寄与する。

１ｍｇ／ｍＬ以上のＢＳＡの添加によりＲＴ−ＰＣＲ反応が改善することを示す１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応の増幅曲線の図である。 １．５ｍｇ／ｍＬ以上のＢＳＡ、Ｌ−カルニチンの添加によりＲＴ−ＰＣＲ反応が改善することを示す１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応の増幅曲線の図である。

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。

本発明の一態様は、試料中のカリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科ＲＮＡウイルスの検査方法であって、糞便等の試料から７５℃〜１００℃、より好ましくは８０℃〜９５℃で、３０秒〜１０分、より好ましくは１〜５分の熱処理を行い、キャプシドを破壊し、ウイルスＲＮＡを露出させた処理液をＲＴ−ＰＣＲに供する。

検査対象となるＲＮＡウイルスは、ゲノムとしてＲＮＡを持つカリシウイルス科ウイルスである。ＲＮＡウイルスの例としては特に限定されるものではないが、ノロウイルス属ノーウォークウイルス、サポウイルス属サッポロウイルス、ラゴウイルス属兎出血病ウイルス、ヨーロッパ褐色野兎症候群ウイルス、ベシウイルス属猫カリシウイルス、豚水疱疹ウイルス、ネボウイルス属ニューバリー１ウイルス、レコウイルス属Ｔｕｌａｎｅウイルスなどが挙げられる。

本発明の試料として、糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液などが挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明におけるこれら試料は、市販のＲＮＡ精製キットでＲＮＡを単離するような処理を行う必要が一切ないことを特徴とするものである。前記試料は直接熱処理してもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料を熱処理したものであってもよい。さらに、糞便など夾雑物の多い試料では、遠心分離し、その上清を使用してもよい。あるいは、フィルターろ過を実施してもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。さらに塩やキレート剤を含んでもよい。

本発明における別の態様の試料としては、拭き取り検査試料である。汚染経路の解明や施設環境等の汚染状況の把握には、ふき取り検査が有用である。本発明において、拭き取り検査とは、特に限定されるものでないが、例えば綿棒等で該当区画や設備等を拭き取り、水や緩衝液に溶出し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱などで濃縮した試料である。具体的な拭き取り検査の要領としては、「ふきとり検体のノロウイルス検査法の改良」（_{ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｉａｓｒ／３２／３８２／ｄｊ３８２４．ｈｔｍｌ}）などが例示されるが、特に限定はされるものはなく、これに準ずる方法が広く含まれる。拭き取り箇所の例としては、まな板や包丁、ふきん、食器などの調理器具類、冷蔵庫の取手やトイレ、浴室のドアノブ、洗面所、厨房、トイレ、浴室などの蛇口、調理者の手や指、浴室、トイレ、洗面、手すり、居室などの施設などが挙げられる。また、拭き取り検査ではないが、環境検査として、下水試料の濃縮試料にも適用できる。

本発明の１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、の少なくとも１つを含む。前記ベタイン様４級アンモニウム塩としては、ベタイン（トリメチルグリシン）、Ｌ−カルニチンなどが挙げられるが、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩であれば、特に限定されるものではない。ベタイン様４級アンモニウム塩が有する構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、ＤＮＡポリメラーゼの核酸増幅を促進する。好ましい前記ベタイン様４級アンモニウム塩濃度は０．０５Ｍ〜２Ｍであり、より好ましくは０．１Ｍ〜１．２Ｍである。

前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれるウシ血清アルブミンとしては、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ以上である。夾雑物の多い試料では、ウシ血清アルブミンの濃度が好ましくは１．１ｍｇ／ｍｌ以上でさらに好ましくは１．５ｍｇ／ｍＬ以上で良好な検出が可能となる。

さらに前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、ＤＮＡポリメラーゼの安定化のため、ゼラチンを含んでもよい。ゼラチンは、ウシや豚などの動物の皮膚や骨、腱、あるいは魚の鱗や皮に由来し、ＰＣＲ酵素の安定化に寄与すると考えられている。使用濃度としては、ＰＣＲ増幅を安定化する一方で、蛍光検出を妨げない程度が好ましい。好ましくは０．１〜５％、さらに好ましくは０．５〜２％である。特にゼラチンの由来については限定されるものではないが、ウシや豚由来よりも魚由来のものの方が、ゼリー強度が低く、反応液のハンドリングがよい点で好ましい。

前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素の由来としては、ＲＮＡをＤＮＡに変換できれば特に限定されないが、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、ＡＭＶ−ＲＴ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、ＥＩＡＶ−ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼ）やその変異体が例示される。特に好ましい例としては、ＭＭＬＶ−ＲＴ、ＡＭＶ−ＲＴ、またはそれらの変異体が挙げられる。

本発明における逆転写反応温度は、３０℃以上、７５℃未満であり、好ましくは３５℃から６５℃、より好ましくは３７℃から５５℃である。逆転写反応時間は、１分から１０分程度で行うことが好ましい。

前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられるが、特に限定されない。より好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｔｈ又はこれらの変異体の使用である。特に好ましくはＴｔｈ又はその変異体の使用である。さらに、非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、逆転写反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲへの適用ができることが好ましい。

本発明の好ましいＲＴ−ＰＣＲ反応時間は、１時間以内、より好ましくは５５分以内、
さらに好ましくは５２分以内である。

本発明に用いられる１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、検出対象のウイルスＲＮＡの検出対象領域に対応するプライマー対、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。

本発明に用いられるプライマー対としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが挙げられる。また、別の態様として、上記プライマーが２対以上含まれる、いわゆるマルチプレックスＰＣＲも挙げられる。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。ノロウイルス検出用のプライマーとしては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマー（配列番号１〜５）が挙げられるが、これに限るものではない。前記記載のプライマーでは、配列番号１、２によりノロウイルスＧ１型、配列番号３〜５によりノロウイルスＧ２型を検出する。

本発明で使用される緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６〜９、より好ましくはｐＨ７〜８に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、１０〜２００ｍＭ，より好ましくは２０〜１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが加えられる。

この反応液には、さらにｄＮＴＰ、マグネシウム塩またはマンガン塩、プライマーなどが含まれる。ｄＮＴＰとしてはｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１〜０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ程度加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションの予防処置をとってもよい。マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、マンガン塩としては、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示され、１〜１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。

さらには、当該分野で知られるＲＴ−ＰＣＲを促進するような物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用な促進物質とは、例えば、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、トリトンＸ−１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊｉ５８などが挙げられるが、これに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール-ビス(２-アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでもよい。

本発明は、別の態様としては、さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含む検出方法である。これによって、増幅産物の分析を通常の電気泳動ではなく、蛍光シグナルのモニタリングで監視することができ、解析労力が低減される。さらには、反応容器を開放する必要がなく、コンタミネーションのリスク低減が可能である。ウイルスのサブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、ウイルスのサブタイプを識別することも可能である。

ハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられる。ノロウイルス検出のプローブの配列としては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマー（配列番号６〜９）が挙げられるが、これに限るものではない。前記記載のプローブ配列では、配列番号６または７によりノロウイルスＧ１型、配列番号８または９によりノロウイルスＧ２型を検出する。

２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ，ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＰ−１３、ＳＹＴＯ−８２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標；Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられる。

本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査キットであって、試料からウイルスＲＮＡの精製や単離を行うことなく、ベタイン様４級アンモニウム塩、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試料を加え、１時間以内のＲＴ−ＰＣＲ反応を行う、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットである。

本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査キットであって、試料からウイルスＲＮＡの精製や単離を行うことなく、ベタインまたはＬ−カルニチン、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試料を加え、１時間以内のＲＴ−ＰＣＲ反応を行う、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットである。

本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査キットであって、試料からウイルスＲＮＡの精製や単離を行うことなく、ベタイン様４級アンモニウム塩、逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試料を加え、１時間以内のＲＴ−ＰＣＲ反応を行う、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットである。

本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査キットであって、試料からウイルスＲＮＡの精製や単離を行うことなく、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試料を加え、１時間以内のＲＴ−ＰＣＲ反応を行う、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットである。

本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査方法であって、試料からウイルスＲＮＡの精製や単離を行うことなく、ベタイン様４級アンモニウム塩、逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試験試料を加え、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットであって、検出対象のウイルスＲＮＡの検出領域に対応するプライマー対を含むキットである。

本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査方法であって、試料からウイルスＲＮＡの精製や単離を行うことなく、ベタイン様４級アンモニウム塩、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試料を加え、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットであって、検出対象のウイルスＲＮＡの検出領域に対応するプライマー対および検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応する蛍光プローブを含むキットである。

以下、実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１．糞便試料からのノロウイルスの迅速検出（１）
・ 糞便懸濁処理液の調製
ヒト糞便６検体滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清１μＬに前処理液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付）４μＬを加え、８５℃、１分間熱処理を行った。ノロウイルスＧ１、Ｇ２合成ＲＮＡ １２５０、２５０、５０、２５コピー、０コピー（Ｎ＝２）をスパイクした。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、（２−２）に示す添加剤の検出への影響を評価した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（Ｒ）添付バッファー（東洋紡））
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
０．２Ｍ Ｌ−カルニチン
プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２−２）添加剤、ＤＮＡポリメラーゼ
条件１ １ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，
条件２ １．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、
条件３ ２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，
条件４ ３ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，
（３）反応
前記反応液４５μｌを（１）で調製した各試料５μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。５４℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
５０℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒−５４℃ ２２秒 ４０サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
上記ＲＴ−ＰＣＲ反応時間は６０分であった。増幅曲線を図１に示す。この結果、条件１の１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む場合、内部コントロール（ＩＣ）の増幅にバラツキが発生した。条件２以降の１．５ｍｇ／ｍＬ以上のＢＳＡを添加することでＩＣの増幅が安定化した。

実施例２．糞便試料からのノロウイルスの迅速検出（２）
（１）糞便懸濁処理液の調製
ヒト糞便１２検体滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清１μＬに前処理液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付）４μＬを加え、８５℃、１分間熱処理を行った。また、ポジティブコントロールとして、陰性試料にスパイクしたノロウイルスＧ１、Ｇ２合成ＲＮＡ １２５０、２５０、５０、２５コピーの検出も実施した。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、（２−２）に示す添加剤の検出への影響を評価した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（Ｒ）添付バッファー（東洋紡））
２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
１．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２−２）添加剤、ＤＮＡポリメラーゼ
条件１ 添加なし
条件２ ０．１Ｍ Ｌ−カルニチン、
条件３ ０．２Ｍ Ｌ−カルニチン、
条件４ ０．３Ｍ Ｌ−カルニチン、
条件５ ０．４Ｍ Ｌ−カルニチン、
条件６ ０．５Ｍ Ｌ−カルニチン、
（３）反応
前記反応液４５μｌを（１）で調製した各試料５μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。５４℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
５０℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒−５４℃ ２２秒 ４０サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
上記ＲＴ−ＰＣＲ反応時間は６０分であった。Ｃｔ値を表１に示す。表中の空欄は陽性シグナルが検出されなかったことを示す。この結果、条件１のＬ−カルニチンを含まない場合、内部コントロール（ＩＣ）の増幅が遅く、バラツキも発生した。条件２以降の０．１Ｍ以上のＬ−カルニチンを添加することでＩＣの増幅が安定化し、検体７のＧ２陽性の検出も可能となった。

実施例３．糞便試料からのノロウイルスの迅速検出（３）
・ 糞便懸濁処理液の調製
ヒト糞便１２検体滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清１μＬに前処理液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付）４μＬを加え、８５℃、１分間熱処理を行った。また、ポジティブコントロールとして、陰性試料にスパイクしたノロウイルスＧ１、Ｇ２合成ＲＮＡ １２５０、２５０、５０、２５コピーの検出も実施した。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、（２−２）に示す添加剤の検出への影響を評価した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（Ｒ）添付バッファー（東洋紡））
１．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２−２）添加剤、ＤＮＡポリメラーゼ
条件１ 添加なし
条件２ ０．３Ｍ Ｌ−カルニチン、
条件３ ０．３Ｍ ベタイン、
（３）反応
前記反応液４５μｌを（１）で調製した各試料５μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。５４℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
５０℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒−５４℃ ２２秒 ４０サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
上記ＲＴ−ＰＣＲ反応時間は６０分であった。Ｃｔ値を表２に示す。表中の空欄は陽性シグナルが検出されなかったことを示す。この結果、条件１のＬ−カルニチンやベタインを含まない場合、内部コントロール（ＩＣ）の増幅が遅く、バラツキも発生した。条件２以降のＬ−カルニチンやベタインを添加することでＩＣの増幅が安定化し、検体７のＧ２陽性も検出可能となった。

実施例４．糞便試料からのノロウイルスの迅速検出（４）
（１）糞便懸濁処理液の調製
ヒト糞便２０検体滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清１μＬに前処理液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付）４μＬを加え、８５℃、１分間熱処理を行った。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、（２−２）に示す添加剤の検出への影響を評価した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（Ｒ）添付バッファー（東洋紡））
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
１％ゼラチン
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２−２）添加剤、ＤＮＡポリメラーゼ
条件１ １．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，０．２Ｍ Ｌ−カルニチン
条件２ １．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
条件３ １ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，０．２Ｍ Ｌ−カルニチン
（３）反応
前記反応液４５μｌを（１）で調製した各試料５μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。５４℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
５０℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒−５４℃ ２２秒 ４０サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
上記ＲＴ−ＰＣＲ反応時間は６０分であった。増幅曲線を図２に、Ｃｑ値を表３に示す。表中の空欄は陽性シグナルが検出されなかったことを示す。この結果、Ｌ−カルニチンを含まない条件２では内部コントロール（ＩＣ）のＣｑ値が遅れた。また、条件３の１ｍｇ／ｍＬＢＳＡの存在下ではＩＣの増幅にバラツキが認められたのに対し１．５ｍｇ／ｍＬを添加した条件１では増幅のバラツキは抑制された。また、条件３は表１の網掛けにした偽陽性シグナルが発生した。

実施例５．糞便試料からのノロウイルスの検出（５）
（１）糞便懸濁処理液の調製
ヒト糞便４４検体滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清１μＬに前処理液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付）４μＬを加え、８５℃、１分間熱処理を行った。（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）従来組成の反応液
ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付の反応液、酵素液、プライマー液、プローブ液を取扱説明書に従い、混合して調整した。
（２−２）迅速検出
以下に示される組成の反応液を調製した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
０．２Ｍ Ｌ−カルニチン
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（３）反応
前記反応液４５μｌに（１）で調製した各試料５μｌを添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。５６℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
５０℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ ２０秒、
９５℃ １秒−５６℃ ３５秒 ４０サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
ＲＴ−ＰＣＲ反応時間は６９分であった。Ｇ１、Ｇ２ウイルス、内部コントロールについて増幅曲線の立ち上がりを示すＣｑ値を表４に示す。表中の空欄は陽性シグナルが検出されなかったことを示す。この結果、通常１．５時間のＲＴ−ＰＣＲサイクルで行う従来組成品では、２つの試料で陰性となり、本発明の迅速組成の方が感度の高い検出が可能であった。

実施例６．糞便試料からのノロウイルス検査の改善検討（６）
（１）糞便懸濁処理液の調製
ヒト糞便４８検体滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清１μＬに前処理液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付）４μＬを加え、８５℃、１分間熱処理を行った。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
以下に示される組成の反応液を調製した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
０．１Ｍ Ｌ−カルニチン
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（３）反応
前記反応液４５μｌを、（１）で調製した各試料５μｌを添加した。これを以下のリアルタイムＰＣＲ装置及び温度サイクルで反応した。５４℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
＜ＣＦＸ９６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）＞
４２℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒−５６℃ ２０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ）
＜ＬＣ９６（Ｒｏｃｈｅ社製）＞
４２℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒−５６℃ ３０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
ＲＴ−ＰＣＲ反応時間はＣＦＸ９６で５８分、ＬＣ９６で５２分であった。Ｇ１、Ｇ２ウイルス、内部コントロールのＣｑ値を表５、表６に示す。表中の空欄、又はーは陽性シグナルが検出されなかったことを示す。この結果、６０分未満の反応サイクルでもノロウイルスの検出が可能であった。

本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理などを目的とした検査において、好適に用いられる。

Claims (14)

1. 逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応による試料中のカリシウイルス科ウイルスの検査方法であって、ＲＴ−ＰＣＲ反応が1時間以内に終了することを特徴とするカリシウイルス科ウイルスの存在の有無を検査するための方法。
2. カリシウイルスがノロウイルスである請求項１に記載の方法。
3. ノロウイルスがＧ１型であるかＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 配列番号１〜５のいずれかに記載される塩基配列を含む少なくとも１つのプライマーを含む請求項１に記載の方法。
5. 配列番号６〜９のいずれかに記載される塩基配列を含む少なくとも１つの標識プローブを含む請求項１に記載の方法。
6. 試料が糞便である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
8. 試料が懸濁液の遠心上清である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
9. 試料が環境中の拭き取り検査試料を水、生理食塩水または緩衝液に懸濁し、かつ、懸濁液を濃縮した試料であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
10. 試料が８５℃以上で加熱処理されたサンプルである、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
11. １ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
12. ベタイン様４級アンモニウム塩が、ベタインまたはＬ−カルニチンである請求項１１に記載の方法。
13. 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈまたはそれらの変異体から選択されることを特徴とする請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
14. 逆転写酵素の由来が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＲＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）またはこれらの変異体から選択されることを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載の方法。