JP2024026545A - 改良された核酸検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 生体試料に含まれる核酸増幅反応を経時的に阻害する物質による影響を低減し、特に糞便を試料した場合に、核酸の単離精製処理等を行っていない試料であってもＲＴ－ＰＣＲ効率低下を抑制することを目的とする。【解決手段】 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法：（１）核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料に対して、反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整された２価の陽イオンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する工程、及び、（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応によって試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する工程。【選択図】 なし
Description
本発明は、核酸増幅によるＲＮＡの検出法に関する。より具体的には、試料からの核酸の単離（分離精製）や試料の加熱を含む前処理をすることなく、試料に一酵素系の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）の反応液を加えることによるＲＮＡの検出に関する。本発明の方法は、例えば、糞便試料、血液試料、環境拭き取り試料等におけるＲＮＡを検出することが可能である。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。
核酸増幅法は、数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。
代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。
核酸増幅法を利用した検査の対象となる試料は、目的に応じて様々である。ゲノムＤＮＡを対象とした遺伝子診断であれば、侵襲性が低く採取が容易な試料、例えば、口腔内粘膜細胞や血液である。感染症の原因菌やウイルス等のＤＮＡ又はＲＮＡの検出であれば、原因微生物が存在しうる試料、すなわち尿、喀痰、糞便、血液、鼻腔液、膣分泌液などである。食品衛生検査であれば、食品、あるいは食品取扱者から採取された糞便や尿、環境衛生検査であれば土壌や河川水、雨水、海水などの環境水、製造設備等の拭き取り物などである。
このような試料は多くの核酸以外の物質も多量に含んでおり、ＰＣＲを効率的に行うには通常は試料中の核酸の分離精製が必要とされている。核酸の分離精製には様々な手法があるが、基本的には核酸と他の物質を固体相と液体相に分けて固液分離する工程から構成される。例えば、エタノール沈殿で核酸を固体相とし遠心分離で分離する方法、固相ビーズに核酸をハイブリダイズし、遠心分離や磁性化体で分離する方法がある。しかし、試料の分離をともなうこれらの精製法は、操作が煩雑で、かつ時間を要し、操作中に分解やコンタミネーションを生じる危険性がある。また、試料中の核酸含量が少ない場合には、増幅反応に必要な量を回収することができない場合もある。これらの理由から、試料の分離をともなう精製工程を経ることなく反応液へ試料を持込み、標的核酸を増幅する方法が求められていた。
そこで、近年、糞便を始めとする生体試料から前処理によって標的核酸を抽出しただけで、その後に試料を分離精製せず、ＰＣＲ法によって検出する手法が検討されている（非特許文献１）。しかしながら、この際、試料の分離を伴う核酸の精製を省略するために、糞便試料中に含まれる多糖類などのＰＣＲ反応阻害物質が持ち込まれ、ＰＣＲ反応が少なからず影響を受けることとなる。
これらの影響を低減するような工夫が、これまでに前処理剤やＰＣＲ反応液の組成等に対して検討されている（特許文献１）。例えば、糞便試料にスパイクされたＤＮＡを検出する際のＰＣＲ阻害は、ベタイン、ＢＳＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、タンパク質分解酵素阻害剤の添加により改善されることが報告されている（非特許文献２）。さらに、ＲＴ－ＰＣＲによるＲＮＡ検出の際には、アミノ酸に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（ベタイン、Ｌ－カルニチン、など）、ウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコール、及びゼラチンの全部または一部を組み合わせることによって、糞便によるＰＣＲ阻害を解消できることが見出されている（特許文献２）。
しかしながら、試料にこのような処理を施しても、なお、ＰＣＲが効率よく進まないケースが散見され、さらなる改良が要望されていた。
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，第１６３巻，２０１０年、第２８２－２８６頁
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第３８巻、２０００年、第４４６３－４４７０頁
本発明者は種々検討を行った結果、核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない未処理の試料にＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加した後、一定時間経過後にＲＴ－ＰＣＲ反応を開始するとＰＣＲ効率が著しく低下するという、これまでに知られていない新たな知見を得た。そして、本発明者はこのＰＣＲ効率の低下について更に検討を重ね、生体試料の一例として糞便を用いた場合に、経時的に糞便が反応液中の２価陽イオン（特に、マンガンイオン）に影響することにより核酸増幅反応が効率よく進まない可能性があることを初めて見出した。本発明は、かかる課題を解決するものであり、一定時間経過後（例えば、核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない未処理の試料にＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加してから約１５分程度経過後）であっても、未処理の試料を供して行うＲＴ－ＰＣＲ反応で効率よく核酸検出を行うことができる方法等を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決する方法を検討した結果、未処理の試料に添加するＲＴ－ＰＣＲ反応液中の２価陽イオン濃度を所定濃度以上にすることで、試料に対して分離をともなう核酸精製や事前の加熱処理を行わずに増幅反応に供することができることを見出し、本発明を完成した。
代表的な本願発明は、以下の通りである。
［項１］ 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法：
（１）核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料に対して、反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整された２価の陽イオンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する工程、及び、
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応によって試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する工程。
［項２］ 前記２価の陽イオンがマンガンイオンであることを特徴とする項１に記載の方法。
［項３］ 前記２価の陽イオンの反応液中終濃度が３ｍＭ以上となるように調整されていることを特徴とする項１または項２に記載の方法。
［項４］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの反応液中終濃度が４．２ｎｇ/μＬ以下であることを特徴とする項１から３のいずれかに記載の方法。
［項５］ 前記工程（１）及び（２）が同一容器で行われることを特徴とする項１から４のいずれかに記載の方法。
［項６］ 工程（２）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする項１から５のいずれかに記載の方法。
［項７］ 工程（２）において、ＰＣＲサイクル反応の前及び／又はＰＣＲサイクル反応中に、試料中で核酸を露出させるため及び／又はＰＣＲ反応においてホットスタートＰＣＲを行うために熱処理を実施することを含む項１から６のいずれかに記載の方法。
［項８］ 前記熱処理が、６０℃以上であり、かつ１秒以上の加熱を行うことを特徴とする項７に記載の方法。
［項９］ 試料が糞便試料である項１から８のいずれかに記載の方法。
［項１０］ 試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された試料懸濁液である項１から９のいずれかに記載の方法。
［項１１］ 試料が試料懸濁液の遠心上清である項１から１０のいずれかに記載の方法。
［項１２］ 前記標的ＲＮＡがエンベロープをもたないＲＮＡウイルス由来の核酸であることを特徴とする項１から１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］ ＲＮＡウイルスがノロウイルスである項１２に記載の方法。
［項１４］ ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする項１３に記載の方法。
［項１５］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項１から１４のいずれかに記載の方法。
［項１６］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｚ０５およびそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項１から１５のいずれかに記載の方法。
［項１７］ ＲＴ－ＰＣＲ反応液が、検出対象の標的ＲＮＡの検出領域に対応するプライマー対をさらに含む項１から１６のいずれかに記載の方法。
［項１８］ ＲＴ－ＰＣＲ反応液が、検出対象の標的ＲＮＡの検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブをさらに含む項１から１７のいずれかに記載の方法。
［項１９］ 核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料を供して行う一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応において、試料中の夾雑物質の影響を緩和することにより経時的なＲＴ－ＰＣＲ反応安定性を高める方法であって、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において終濃度が２．５ｍＭ以上の２価の陽イオンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを共存させることを特徴とする、方法。
［項２０］ 項１～１９のいずれかに記載の方法に用いるための一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物であって、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整された２価の陽イオン、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、を含むことを特徴とする、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物。
［項２１］ 項２０に記載の一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物を含むことを特徴とする、試料中の標的ＲＮＡの有無を検査するためのキット
［項１］ 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法：
（１）核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料に対して、反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整された２価の陽イオンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する工程、及び、
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応によって試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する工程。
［項２］ 前記２価の陽イオンがマンガンイオンであることを特徴とする項１に記載の方法。
［項３］ 前記２価の陽イオンの反応液中終濃度が３ｍＭ以上となるように調整されていることを特徴とする項１または項２に記載の方法。
［項４］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの反応液中終濃度が４．２ｎｇ/μＬ以下であることを特徴とする項１から３のいずれかに記載の方法。
［項５］ 前記工程（１）及び（２）が同一容器で行われることを特徴とする項１から４のいずれかに記載の方法。
［項６］ 工程（２）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする項１から５のいずれかに記載の方法。
［項７］ 工程（２）において、ＰＣＲサイクル反応の前及び／又はＰＣＲサイクル反応中に、試料中で核酸を露出させるため及び／又はＰＣＲ反応においてホットスタートＰＣＲを行うために熱処理を実施することを含む項１から６のいずれかに記載の方法。
［項８］ 前記熱処理が、６０℃以上であり、かつ１秒以上の加熱を行うことを特徴とする項７に記載の方法。
［項９］ 試料が糞便試料である項１から８のいずれかに記載の方法。
［項１０］ 試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された試料懸濁液である項１から９のいずれかに記載の方法。
［項１１］ 試料が試料懸濁液の遠心上清である項１から１０のいずれかに記載の方法。
［項１２］ 前記標的ＲＮＡがエンベロープをもたないＲＮＡウイルス由来の核酸であることを特徴とする項１から１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］ ＲＮＡウイルスがノロウイルスである項１２に記載の方法。
［項１４］ ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする項１３に記載の方法。
［項１５］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項１から１４のいずれかに記載の方法。
［項１６］ 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｚ０５およびそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項１から１５のいずれかに記載の方法。
［項１７］ ＲＴ－ＰＣＲ反応液が、検出対象の標的ＲＮＡの検出領域に対応するプライマー対をさらに含む項１から１６のいずれかに記載の方法。
［項１８］ ＲＴ－ＰＣＲ反応液が、検出対象の標的ＲＮＡの検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブをさらに含む項１から１７のいずれかに記載の方法。
［項１９］ 核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料を供して行う一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応において、試料中の夾雑物質の影響を緩和することにより経時的なＲＴ－ＰＣＲ反応安定性を高める方法であって、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において終濃度が２．５ｍＭ以上の２価の陽イオンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを共存させることを特徴とする、方法。
［項２０］ 項１～１９のいずれかに記載の方法に用いるための一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物であって、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整された２価の陽イオン、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、を含むことを特徴とする、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物。
［項２１］ 項２０に記載の一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物を含むことを特徴とする、試料中の標的ＲＮＡの有無を検査するためのキット
本発明によって、核酸増幅反応に先立って核酸を分離精製したり、試料を加熱処理したりするための時間・コストを削減することができる。さらに、核酸を分離精製や試料の加熱処理を事前に実施する際に生じる可能性のあるリスク、すなわち試料のロスやキャリーオーバーによる他のサンプルへの汚染の危険性を低減することができる。特に糞便を試料とする多数の検体を処理するような検査において、その効果は顕著となる。
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本発明の試料中の標的ＲＮＡの有無を検査するための方法は、少なくとも以下の工程を含むことを特徴とする：
（１）核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料に対して、反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整された２価の陽イオンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する工程、及び、
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応によって試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する工程。
本発明の上記検査方法によれば、前処理として核酸の分離精製処理及び／又は加熱処理を行っていない試料（本明細書では、特に他を意味することが明らかである場合を除き、これを「未処理試料」又は「前処理を行っていない試料」等ということがある）を供して行うＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する際に、当該試料とＲＴ－ＰＣＲ反応液を混合後に一定時間経過した後であってもＰＣＲ効率の低下が抑えられ、安定した検査結果を得ることが可能となる。これにより、例えば、多量の試料を一気に纏めて処理することが望まれるような検査（例えば、ノロウイルス等の食品衛生管理検査等）で、各被験者由来の試料とＲＴ－ＰＣＲ反応液の混合処理を行った後に、各混合液のＲＴ－ＰＣＲ反応までに多少時間が経過したとしても安定して検査結果を得ることができるという利点がある。
（１）核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料に対して、反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整された２価の陽イオンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する工程、及び、
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応によって試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する工程。
本発明の上記検査方法によれば、前処理として核酸の分離精製処理及び／又は加熱処理を行っていない試料（本明細書では、特に他を意味することが明らかである場合を除き、これを「未処理試料」又は「前処理を行っていない試料」等ということがある）を供して行うＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する際に、当該試料とＲＴ－ＰＣＲ反応液を混合後に一定時間経過した後であってもＰＣＲ効率の低下が抑えられ、安定した検査結果を得ることが可能となる。これにより、例えば、多量の試料を一気に纏めて処理することが望まれるような検査（例えば、ノロウイルス等の食品衛生管理検査等）で、各被験者由来の試料とＲＴ－ＰＣＲ反応液の混合処理を行った後に、各混合液のＲＴ－ＰＣＲ反応までに多少時間が経過したとしても安定して検査結果を得ることができるという利点がある。
本発明の上記検査方法では、ＲＴ－ＰＣＲ反応を、逆転写反応とＰＣＲ反応とを別々の工程で行う２ステップ法ではなく、逆転写反応とＰＣＲ反応とを連続又は並行して一工程で行う１ステップ法で行うことを特徴とする。本発明の検査方法において、前記工程（１）および（２）は、同一容器で行うこともできるし、前記工程（１）と（２）とを別々の容器において行うこともできる。容器の移し替えに伴う反応混合液のロスやコンタミネーションのリスクを低減でき、更にはより簡便に実施することが可能になるという観点から、前記工程（１）および（２）は、同一容器で行われることが好ましい。すなわち、工程（１）および（２）の間においては、混合液の全部または一部を別容器へ移し替えないことが好ましい。更には、工程（２）においては、反応容器を密閉後、反応容器の蓋の開閉を行わないことが好ましい。このように密閉後に蓋の開閉を行わないようにすることで、コンタミネーションのリスクを更に効果的に低減でき、より正確な検査結果を得ることが可能となる。
本発明の検査方法は、前記工程（１）において使用する一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が２．５ｍＭ以上の２価陽イオンを含むことを大きな特徴とする。２価陽イオンとしては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、代表的なイオンとして、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオンが挙げられ、マンガンイオンが特に好ましい。マグネシウム塩を用いる場合は、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウムなどのマグネシウム塩をＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加すればよい。マンガン塩を用いる場合は、例えば、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどのマンガン塩をＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加すればよい。マグネシウム塩やマンガン塩等の塩の形態でマグネシウムイオン、マンガンイオンを添加する場合、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上のイオン濃度となるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加される。好ましくは、反応液中終濃度が３ｍＭ以上となるように、より好ましくは反応液中終濃度が３～１０ｍＭとなるように、更に好ましくは反応液中終濃度が３～５ｍＭとなるように、なかでも好ましくは反応液中終濃度が３～３．５ｍＭとなるように調整された濃度で加えられることが好ましい。このような終濃度となるように一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が２価陽イオンを含有することで、未処理試料を一定時間共存させた場合であっても、安定して高いＰＣＲ効率で検査を行うことが可能となる。
本発明において用いられる生体試料として、例えば糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液、血液などが挙げられるが、特に限定されるものではなく、生体に由来するもの全般を用いることが可能である。なかでも、夾雑物質を非常に多く含むためにＲＴ－ＰＣＲ反応液と混合後に経時的にＰＣＲ反応性の低下を招きやすい傾向が高いことから、本発明は特に、糞便（排泄便、直腸便）からのＲＮＡの検出に有用である。
本発明においては、生体試料をそのまま、又は生体試料から核酸を抽出後に試料の分離を伴う精製を行うことなく、ＲＮＡを検出することを特徴とするものである。即ち、本発明は、これら生体試料から市販のＲＮＡ精製キットでＲＮＡを単離したり、あるいはＲＮＡをウイルス構造から露出させるための事前の熱処理をしたりする必要がないことを特徴とするものである。言い換えれば、本発明に用いられる未処理試料は、加熱処理を行っていない限り、分離精製を伴わない核酸抽出を行った試料であってもよい。ここで、分離精製を伴わない核酸抽出を行った試料とは、試料中で核酸を露出させた状態にすることを意味し、例えば、試料中でカプシドやエンベロープ等を破壊し、これらに内包されていた核酸を抽出して露出させること（但し、破壊後に残存するカプシドやエンベロープの断片等は除去しないこと）をいう。本発明では、このような単離精製の手間を省いて用意した試料であっても良好なＰＣＲ効率を維持し、安定して検査結果を得ることが可能となる。このような分離精製を伴わない核酸抽出処理は、前記工程（１）に先立って行うことができる。
特定の実施態様では、前記工程（２）において、ＰＣＲサイクル反応の前及び／又はＰＣＲサイクル反応中に熱処理を実施することにより、試料中で核酸を露出させたり、及び／又はＰＣＲ反応においてホットスタートＰＣＲを行ったりすることができる。工程（２）において熱処理を行うことにより、具体的には、検出を意図する病原性微生物（例えばウイルス）を破砕し、その病原性微生物（例えば、ウイルス）の核酸を試料中に露出させることができる。また、このように工程（２）で熱処理を行うことにより、ＲＴ－ＰＣＲ反応液がホットスタートＰＣＲ法で機能し得る酵素等を含む場合には、そのようなホットスタート酵素を活性化させることが可能となる。このような熱処理は、所期の目的を達成できるような熱処理である限り、加熱温度も加熱時間も特に限定されないが、６０℃以上であり、かつ１秒以上であればよく、好ましくは７０℃、３０秒以上、より好ましくは８０℃、３０秒以上、特に好ましくは８５℃、３０秒以上である。
本発明の検査方法では、前記生体試料は直接検出に供してもよいが、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得やすいという観点から、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であることが好ましい。さらに、糞便など特に夾雑物の多い試料では、遠心分離し、その上清を使用してもよい。あるいは、フィルターろ過を実施してもよい。上記懸濁に際して用いられる緩衝液としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。緩衝液のｐＨもまた、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より一層確実に本発明の効果が得られ易いという観点から、好ましくは中性からアルカリ性であり、より好ましくはｐＨ＝７～１１、さらに好ましくはｐＨ＝９～１１である。
本発明における別の態様の試料としては、拭き取り検査試料が挙げられる。汚染経路の解明や施設環境等の汚染状況の把握には、ふき取り検査が有用である。本発明において、拭き取り検査とは、特に限定されるものでないが、例えば綿棒等で該当区画や設備等を拭き取り、水や緩衝液に溶出し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱などで濃縮した試料である。具体的な拭き取り検査の要領としては、「ふきとり検体のノロウイルス検査法の改良」（ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｉａｓｒ／３２／３８２／ｄｊ３８２４．ｈｔｍｌ）などが例示されるが、特に限定されるものではなく、これに準ずる方法が広く含まれる。拭き取り箇所の例としては、まな板や包丁、ふきん、食器などの調理器具類、冷蔵庫の取手やトイレ、浴室のドアノブ、洗面所、厨房、トイレ、浴室などの蛇口、調理者の手や指、浴室、トイレ、洗面、手すり、居室などの施設などが挙げられる。また、拭き取り検査ではないが、環境検査として、下水試料の濃縮試料にも適用できる。
生体試料は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加される前に核酸増幅反応を阻害しうる物質、例えばタンパク質を不活化する工程を含んでもよい。このようにタンパク質を不活化する場合、本発明では、不活化後のタンパク質を試料から分離精製せずにＲＴ－ＰＣＲ反応に供する。不活化する工程としては、例えばアルカリ処理、有機溶媒による処理または、これらの処理を複数組み合わせた処理などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一方、これらの処理は、核酸が増幅の鋳型としての機能を保持されるような条件において行われなければならない。具体的には、アルカリ処理に際したｐＨは９～１１、より好ましくは１０～１１の範囲が好ましい。
上記の処理を終えた試料は、試料の分離を伴うような精製を経ることなくＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加される。前記処理により沈殿物などが生じた場合は遠心分離を行ってもよい。この場合、遠心分離に適用できる容器を用いて前記処理を行えば、試料の分離をともなう必要がないというメリットがある。
本発明の検査方法で検出対象とする標的ＲＮＡ（これを、ターゲットＲＮＡ等ということがある）は特に限定されない。一般に、感染性微生物（感染症の原因となる菌又はウイルス等）に由来するＲＮＡ等を糞便等の生体試料から検出する検査は、食中毒の原因の特定、感染経路の特定、またその予防のために幅広く行われている。例えば、ノロウイルスの検査は糞便を試料とし、ＲＴ－ＰＣＲ法により遺伝子を検出する方法で行われることが多い。糞便は腸内細菌、腸管上皮細胞、食物由来物質などから構成されており、多糖類をはじめとする夾雑物質が多量に含まれることが知られている。本発明はこのような夾雑物質を多量に含み、ＲＴ－ＰＣＲ反応の阻害が懸念される試料であっても、ＰＣＲ効率の低下が抑制され、良好な検査結果を得ることが可能となる。
より具体的に、糞便中のＲＮＡを検査する検査対象例として、病原性ウイルス由来のＲＮＡが挙げられるが、特に限定されるものではない。これらのウイルスの例として、脂質二重膜に由来するエンベロープを持たない、非エンベロープ性のＲＮＡウイルスが挙げられる。このような非エンベロープＲＮＡウイルスとしては、アストロウイルス科ウイルス（例えば、アストロウイルス）；カリシウイルス科ウイルス（例えば、サポウイルス、ノロウイルス）；ピコルナウイルス科ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス）；へぺウイルス科ウイルス（例えば、Ｅ型肝炎ウイルス）；レオウイルス科ウイルス（例えば、ロタウイルス）などが挙げられる。限定されるものではないが、本発明の検出方法は、好ましくはカリシウイルス科ウイルス及びレオウイルス科ウイルスの検出に有用であり、より好ましくはノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルスの検出に有用であり、特にノロウイルスの検出に有用である。なかでも、本発明の検査方法は、ＧＩＩ型ノロウイルスの検査において高い効果を発揮し得るので好ましい。また、ノロウイルスである場合においては、ＧＩ型かＧＩＩ型かを判別するための手段としても適用することができる。
本発明に用いられ得るＲＴ－ＰＣＲの反応液の組成の一例としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマー、ｄＮＴＰ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整された２価の陽イオン、１価イオン、及び緩衝液等を含み得る。さらに具体的には、本発明に用いられ得るＲＴ－ＰＣＲ反応液の組成の例としては、一方のプライマーが他方のプライマーＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種一対のプライマー、ｄＮＴＰ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整されたマグネシウムイオン、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤及び緩衝液等を含み得る。
本発明の検査方法において、２種一対のプライマーは、標的ＲＮＡに応じて適宜選択・設計して用いることができ、特に限定されない。さらに、ターゲットとする標的ＲＮＡが亜型であることが想定される場合、縮重プライマーであってもよい。本発明に用いられ得る２種一対のプライマーとしては、例えば、エンベロープを持たないＲＮＡウイルスの１種であるノロウイルスＲＮＡを検出できるように設計された２種一対のプライマー、サポウイルスＲＮＡを検出できるように設計された２種一対のプライマー、ロタウイルスＲＮＡを検出できるように設計された２種一対のプライマー等であり得る。ノロウイルスＲＮＡ検出用のプライマーとしては、例えば、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマー（配列番号１～５；配列番号１、２がノロウイルスＧ１型、配列番号３～５がノロウイルスＧ２型を検出するプライマー）が挙げられるが、これに限るものではない。
また、別の態様として、本発明は、上記プライマーが２対以上含まれる、いわゆるマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ反応液を用いてもよい。マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ反応液である場合に含まれ得る２対以上のプライマーは、任意のプライマー対のセットであり得るが、例えば、ノロウイルスＲＮＡを検出するためのプライマー対とロタウイルスＲＮＡを検出するためのプライマー対のセット、ノロウイルスＲＮＡを検出するためのプライマー対とサポウイルスＲＮＡを検出するためのプライマー対のセット、また、ＧＩ型ノロウイルスＲＮＡを検出するためのプライマー対とＧＩＩ型ノロウイルスＲＮＡを検出するためのプライマー対のセット等を好ましい例として挙げることができる。更に、マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ反応を行う場合には、必ずしも全ての検出対象がＲＮＡである必要はなく、例えば、ターゲットとして標的ＲＮＡ及び標的ＤＮＡを検出することを目的とするマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ反応であってもよい。この場合、マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ反応液は、標的ＲＮＡを検出するためのプライマー対（例えば、ノロウイルスＲＮＡを検出するためのプライマー対）と標的ＤＮＡを検出するためのプライマー対（例えば、ＤＮＡウイルスや腸内細菌由来のＤＮＡを検出するためのプライマー対）のセットを目的に応じて含有すればよい。
増幅反応の一例としては、上記のような反応組成に、生体試料を試料の分離をともなう精製を行うことなく添加し、ＰＣＲサイクル反応として、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを行う方法、あるいは（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリングおよびプライマーの伸長を同時に行う熱サイクル（シャトルＰＣＲ）を行う方法が挙げられるが、これに限定されない。
前記混合液に添加される１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｆａｍｉｌｙ ＡのＤＮＡポリメラーゼに属するＴａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられるが、特に限定されない。本発明では、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行うために、逆転写酵素活性を併せ持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることを特徴とする。ここで逆転写酵素活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼとは、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する能力とＤＮＡを増幅する能力を兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼをいう。これまでに逆転写酵素活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼとして、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）やＴｈｅｒｍｕｓ ｓｐ Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）などが挙げられ、これらの逆転写活性と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性が失われていない変異体であってもよい。また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ）の変異体であって、逆転写活性を有するものが知られており（例えば、ＲＴＸ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｘｅｎｏｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、本発明にはこのような逆転写酵素活性を併せ持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであれば、限定されるものではない。特に好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｚ０５及びこれらの変異体からなる群より選択される逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、なかでも高い逆転写酵素活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼであるＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
本発明に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ反応サイクルの高温下でも十分に機能し得る程度の耐熱性を備えている限り特に限定されないが、例えば８５℃で１分以上の熱処理を実施しても、酵素活性が半分以上低下しないレベルの耐熱性を有するものが好ましい。特定の実施態様では、本発明に用いる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を更に含むことが好ましい。更なる特定の実施態様では、酵素の活性部位に対し、熱感受性化学修飾を施した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることもできる。このように抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を更に含ませたり、熱感受性の化学修飾を施した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたりすることで、逆転写反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲへの適用ができるので、より特異性の高い検出が可能となり好ましい。
本発明に用いる一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液中の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されない。本発明では高いＰＣＲ効率を発揮することができることから、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量は少なくてもよく、一例として、反応液中終濃度で１０ｎｇ／μＬ以下、好ましくは５ｎｇ／μＬ以下、より好ましくは４．２ｎｇ／μＬ以下とすることができ、例えば４．２ｎｇ／μＬ未満であっても良好な検査結果を得ることが可能であり得る。反応液中終濃度の下限値は特に限定されないが、一例として０．０１ｎｇ／μＬ以上とすることができる。このような濃度で耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることで非特異的な核酸増幅も抑制することが可能である。なお、ＤＮＡポリメラーゼの量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法もしくはＮａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャー社）により定量した値であり、安全データシート（ＳＤＳ）から概算してもよい。ＢＳＡなどのタンパク質を含む場合は、後者の方法で算出することが望ましい。
特定の実施態様では、本発明に用いられる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、上記のような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの他、緩衝剤、適当な塩、反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上となるように調整された２価の陽イオンを発生させる成分（例えば、マグネシウム塩又はマンガン塩）、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、検出対象のウイルスＲＮＡの検出対象領域に対応するプライマー対、逆転写反応中の反応阻害を抑える等の目的でＲＮＡ分解酵素阻害剤、さらに必要に応じて添加剤等を含んでいてもよい。
本発明で使用され得る緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられ、例えば、硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６～９、より好ましくはｐＨ７～８に調整された緩衝液であり得る。また、添加する緩衝剤の濃度としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば１０～２００ｍＭ程度、より好ましくは２０～１５０ｍＭ程度で使用され得る。
本発明に用いられる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、ＲＴ－ＰＣＲ反応に適当なイオン条件とするために、塩（例えば、塩溶液）が加えられることが好ましい。適当な塩としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの適当な塩は、水等の溶媒に溶かした塩溶液の形態で、本発明に用いる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加されていてもよい。
本発明で使用され得るｄＮＴＰとしては、特に限定されないが、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰをそれぞれ等量含むｄＮＴＰ等であり得、例えば、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを０．１～０．５ｍＭの範囲内でそれぞれ等量含むｄＮＴＰ、好ましくはｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰをそれぞれ０．２ｍＭ程度含むｄＮＴＰであり得る。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションに対する予防処置をとることも可能である。
さらに本発明に用いられる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる添加剤としては、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、０．５ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含むことが好ましい。
前記ベタイン様４級アンモニウム塩としては、ベタイン（トリメチルグリシン）、Ｌ－カルニチンなどが挙げられるが、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩であれば、特に限定されるものではない。ベタイン様４級アンモニウム塩が有する構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、界面活性剤のような性質を示し、ウイルス構造の不安定化を引き起こすものと考えられる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの核酸増幅を促進することが可能となり得る。好ましい前記ベタイン様４級アンモニウム塩濃度は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度が好ましくは０．１Ｍ～２Ｍ、より好ましくは０．２Ｍ～１．２Ｍとなるような濃度である。
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれ得るウシ血清アルブミンは、反応液中終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ以上となるように調整され得る。糞便等の夾雑物の多い試料では、ウシ血清アルブミンの反応液中終濃度が好ましくは１ｍｇ／ｍｌ以上となるように調整して用いることで、より良好な検出が可能となる。
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれ得るゼラチンは、ウシや豚などの動物の皮膚や骨、腱、あるいは魚の鱗や皮に由来し、ＰＣＲ酵素の安定化に寄与すると考えられている。使用濃度としては、ＰＣＲ増幅を安定化する一方で、蛍光検出を妨げない程度が好ましい。好ましくは反応液中終濃度が０．１～５％となるように、さらに好ましくは反応液中終濃度が０．５～２％となるように調整されて用いることができる。特にゼラチンの由来については限定されるものではないが、ウシや豚由来よりも魚由来のものの方が、ゼリー強度が低く、反応液のハンドリングがよい点で好ましい。
さらには、本発明に用いる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、当該技術分野でＲＴ－ＰＣＲを促進することが知られる物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用なＲＴ－ＰＣＲ促進物質としては、例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、トリトンＸ－１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデット（登録商標）Ｐ４０、Ｂｒｉｊｉ５８などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール-ビス(２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでいてもよい。
特定の実施形態において、本発明の検出方法は、さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を用いてもよい。このようなプローブを用いることによって、核酸増幅産物の分析を通常の電気泳動ではなく、蛍光シグナルのモニタリングで監視することができ、解析労力が低減される。さらには、反応容器を開放する必要がなく、より一層のコンタミネーションのリスク低減が可能である。例えば、検出対象とする標的ウイルスＲＮＡのサブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、ウイルスのサブタイプを識別することも可能である。
２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ，ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ－９、ＳＹＴＰ－１３、ＳＹＴＯ－８２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標；Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において用いられるハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられる。ノロウイルス検出用のプローブの塩基配列としては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載の配列（配列番号６～９；配列番号６、７がノロウイルスＧ１型、配列番号８、９がノロウイルスＧ２型を検出するプローブ）が挙げられるが、これに限るものではない。さらに、ターゲットとする標的ＲＮＡが亜型であることが予想される場合、縮重配列を含んでもよい。
上述のように本発明者は、核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料を供して行う一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応において、反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上となるように２価の陽イオンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを共存させることで、未処理試料とＲＴ－ＰＣＲ反応液を共存させて一定時間経過させた後でもＰＣＲ効率が低下せず、安定した検査結果が得られることを見出している。
従って、本発明は更に別の観点から、核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料を供して行う一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応において、試料中の夾雑物質の影響を緩和することにより経時的なＲＴ－ＰＣＲ反応安定性を高める方法であって、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において終濃度が２．５ｍＭ以上の２価の陽イオンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを共存させることを特徴とする方法をも提供する。
上記の安定性を高める方法において用いられる、２価の陽イオン及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、試料等の種類や濃度等は、上述した試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法と同様である。
上記の安定性を高める方法において用いられる、２価の陽イオン及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、試料等の種類や濃度等は、上述した試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法と同様である。
更に本発明は別の観点から、上記のような試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法に用いるための一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物であって、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整された２価の陽イオン、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、を含むことを特徴とする一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物をも提供する。
上記の組成物において用いられる、２価の陽イオン及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、試料等の種類や濃度等もまた、上述した試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法と同様である。
上記の組成物において用いられる、２価の陽イオン及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、試料等の種類や濃度等もまた、上述した試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法と同様である。
本発明の更なる別の一態様は、上記のような試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法に用いるためのキットであり得る。具体的には、本キットは、上記のような一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物を含むことを特徴とする。当該キットには、本発明の検査方法の手順を記載した添付文書等が含まれていてもよい。
上記の試料中の標的ＲＮＡの有無を検査するためのキットにおいて用いられる、２価の陽イオン及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、試料等の種類や濃度等もまた、上述した試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法と同様である。
上記の試料中の標的ＲＮＡの有無を検査するためのキットにおいて用いられる、２価の陽イオン及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、試料等の種類や濃度等もまた、上述した試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法と同様である。
以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
試験例１．糞便と反応液の混合後、時間が経過した場合の影響
（１）試料
ノロウイルスＧ１、Ｇ２ともに陰性のヒト糞便１検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、未処理の便懸濁液として使用した。また、前記未処理の便懸濁液を一部取り、９８℃、５分間加熱して、熱処理を加えた便懸濁液として使用した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、核酸増幅反応に対する糞便の影響を評価した。
反応液 （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
Ｍｎ（マンガンイオン）の終濃度が２．６３ｍＭとなるように上記反応液を混合して、１９μｌずつに分注した。これらの反応液に対し、（ａ）純水、（ｂ）未処理の便懸濁液、（ｃ）熱処理を加えた便懸濁液をそれぞれ１μｌ加えた。その後、室温で１５分放置した後、ノロウイルスＧ１、Ｇ２の合成ＲＮＡ １２５０コピー（各Ｎ＝４）を添加した。これをＲｏｃｈｅ製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）に記載の温度サイクルで、リアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
（４）結果
プローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）ではＦＡＭチャネルで内部コントロール遺伝子、Ｃｙ５チャネルでノロウイルスＧ１、ＲＯＸチャネルでノロウイルスＧ２を検出する。ここでは、Ｇ１、Ｇ２ ＲＮＡのＣｑ値を表１に示す。また、ｎ．ｄ．は核酸を検出できなかったことを示す。糞便の存在下では、糞便の非存在下に比べて、ノロウイルスＧ１では４程度、ノロウイルスＧ２では８程度のＣｑ値の遅れが確認された。従って、糞便が存在する場合では、同じ量の核酸を検出する場合、それぞれ２４＝１６、２８＝２５６倍検出が難しくなることになる。また、未処理の便懸濁液に対して、熱処理を加えた便懸濁液では、ノロウイルスＧ２のＣｑ値が２程度、すなわち２２＝４倍程度検出が容易になることが確認された。この結果を踏まえると、室温で１５分放置後の便懸濁液はＲＴ－ＰＣＲ反応を阻害することは明らかであり、熱処理を加えた便懸濁液に比べて、未処理の便懸濁液の方がその阻害の影響は大きいことが判明した。
（１）試料
ノロウイルスＧ１、Ｇ２ともに陰性のヒト糞便１検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、未処理の便懸濁液として使用した。また、前記未処理の便懸濁液を一部取り、９８℃、５分間加熱して、熱処理を加えた便懸濁液として使用した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、核酸増幅反応に対する糞便の影響を評価した。
反応液 （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
Ｍｎ（マンガンイオン）の終濃度が２．６３ｍＭとなるように上記反応液を混合して、１９μｌずつに分注した。これらの反応液に対し、（ａ）純水、（ｂ）未処理の便懸濁液、（ｃ）熱処理を加えた便懸濁液をそれぞれ１μｌ加えた。その後、室温で１５分放置した後、ノロウイルスＧ１、Ｇ２の合成ＲＮＡ １２５０コピー（各Ｎ＝４）を添加した。これをＲｏｃｈｅ製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）に記載の温度サイクルで、リアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
（４）結果
プローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）ではＦＡＭチャネルで内部コントロール遺伝子、Ｃｙ５チャネルでノロウイルスＧ１、ＲＯＸチャネルでノロウイルスＧ２を検出する。ここでは、Ｇ１、Ｇ２ ＲＮＡのＣｑ値を表１に示す。また、ｎ．ｄ．は核酸を検出できなかったことを示す。糞便の存在下では、糞便の非存在下に比べて、ノロウイルスＧ１では４程度、ノロウイルスＧ２では８程度のＣｑ値の遅れが確認された。従って、糞便が存在する場合では、同じ量の核酸を検出する場合、それぞれ２４＝１６、２８＝２５６倍検出が難しくなることになる。また、未処理の便懸濁液に対して、熱処理を加えた便懸濁液では、ノロウイルスＧ２のＣｑ値が２程度、すなわち２２＝４倍程度検出が容易になることが確認された。この結果を踏まえると、室温で１５分放置後の便懸濁液はＲＴ－ＰＣＲ反応を阻害することは明らかであり、熱処理を加えた便懸濁液に比べて、未処理の便懸濁液の方がその阻害の影響は大きいことが判明した。
試験例２．糞便と反応液の混合後、即座に反応を開始した場合の影響
（１）試料
ノロウイルスＧ１、Ｇ２ともに陰性のヒト糞便１検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。この上清を純水にて１、２．５、５、１０倍となるように希釈した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、核酸増幅反応に対する糞便の影響を評価した。
反応液 （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
Ｍｎの終濃度が２．６３ｍＭとなるように上記反応液を混合して、１９μｌずつに分注した。これらの反応液に対し、ノロウイルスＧ１、Ｇ２の合成ＲＮＡ １２５０コピー（Ｎ＝４）又は純水１μｌを添加した。この反応液を８連チューブに移した後、未処理の便懸濁液の希釈系列（１、２．５、５、１０倍）をそれぞれ１μｌを８連チューブの壁面につけ（各Ｎ＝２）、ＲＴ－ＰＣＲの直前に遠心によって混合した。また、これをＲｏｃｈｅ製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）に記載の温度サイクルで、リアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ ＲＮＡのＣｑ値を表２に示す。この結果、便懸濁液の原液を添加後に１５分放置した試験例１と比べて、反応の直前に便懸濁液の原液を混合した反応液では、ノロウイルスＧ１では２程度、ノロウイルスＧ２では６程度小さくなった。従って、同じ量の核酸を検出する場合、便懸濁液を反応液に添加後の時間経過によって、それぞれ２２＝４、２６＝６４倍検出が難しくなることになる。また、便懸濁液の希釈倍率を大きくするとＣｑ値の遅れが減少したことから、糞便には反応を阻害する成分が含まれることは明らかである。この結果から、便懸濁液と反応液を混合後、時間が経過すると阻害が大きくなる糞便が存在することが判明した。
（１）試料
ノロウイルスＧ１、Ｇ２ともに陰性のヒト糞便１検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。この上清を純水にて１、２．５、５、１０倍となるように希釈した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、核酸増幅反応に対する糞便の影響を評価した。
反応液 （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
Ｍｎの終濃度が２．６３ｍＭとなるように上記反応液を混合して、１９μｌずつに分注した。これらの反応液に対し、ノロウイルスＧ１、Ｇ２の合成ＲＮＡ １２５０コピー（Ｎ＝４）又は純水１μｌを添加した。この反応液を８連チューブに移した後、未処理の便懸濁液の希釈系列（１、２．５、５、１０倍）をそれぞれ１μｌを８連チューブの壁面につけ（各Ｎ＝２）、ＲＴ－ＰＣＲの直前に遠心によって混合した。また、これをＲｏｃｈｅ製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）に記載の温度サイクルで、リアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ ＲＮＡのＣｑ値を表２に示す。この結果、便懸濁液の原液を添加後に１５分放置した試験例１と比べて、反応の直前に便懸濁液の原液を混合した反応液では、ノロウイルスＧ１では２程度、ノロウイルスＧ２では６程度小さくなった。従って、同じ量の核酸を検出する場合、便懸濁液を反応液に添加後の時間経過によって、それぞれ２２＝４、２６＝６４倍検出が難しくなることになる。また、便懸濁液の希釈倍率を大きくするとＣｑ値の遅れが減少したことから、糞便には反応を阻害する成分が含まれることは明らかである。この結果から、便懸濁液と反応液を混合後、時間が経過すると阻害が大きくなる糞便が存在することが判明した。
試験例３．糞便による影響を受ける反応液の成分の特定
（１）試料
以下の試料を調製した。
（糞便の試料懸濁液）
ノロウイルスＧ１、Ｇ２ともに陰性のヒト糞便１検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、核酸増幅反応に対する糞便の影響を評価した。
反応液 （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
終濃度２．６３ｍＭのＭｎを含む反応液１９μＬ（反応液Ａ）と、Ｍｎを含まない反応液１８μＬ（反応液Ｂ）を調製し、便懸濁液１μｌを加え、室温で１５分放置した。その後、反応液Ｂに対して、Ｍｎの終濃度が２．６３ｍＭとなるように、５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２１μＬを添加した。さらに、計２０μＬとなった反応液に対し、ノロウイルスＧ１、Ｇ２の合成ＲＮＡ １２５０コピー（各Ｎ＝２）を添加した。Ｍｎ及びＲＮＡの添加後、直ちにＲｏｃｈｅ製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）に記載の温度サイクルで、リアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ ＲＮＡのＣｑ値を表３に示す。また、ｎ．ｄ．は核酸を検出できなかったことを示す。反応液Ａと反応液Ｂを比較すると、ノロウイルスＧ１とＧ２共に反応液Ｂの方がＣｑ値が１～２程度小さくなった。従って、同じ量の核酸を検出する場合、反応液Ｂの方が２１～２２＝２～４倍程度検出が容易になっていると考えられる。反応液ＡではＭｎと糞便を共存させた状態で１５分放置し、反応液ＢではＭｎ添加後にただちにリアルタイムＰＣＲ反応を実施している。従って、反応液中のＭｎと糞便を一定時間共存させた場合に核酸の検出が難しくなっていることから、糞便によって影響を受ける反応液の成分がＭｎであることが判明した。
（１）試料
以下の試料を調製した。
（糞便の試料懸濁液）
ノロウイルスＧ１、Ｇ２ともに陰性のヒト糞便１検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、核酸増幅反応に対する糞便の影響を評価した。
反応液 （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
終濃度２．６３ｍＭのＭｎを含む反応液１９μＬ（反応液Ａ）と、Ｍｎを含まない反応液１８μＬ（反応液Ｂ）を調製し、便懸濁液１μｌを加え、室温で１５分放置した。その後、反応液Ｂに対して、Ｍｎの終濃度が２．６３ｍＭとなるように、５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２１μＬを添加した。さらに、計２０μＬとなった反応液に対し、ノロウイルスＧ１、Ｇ２の合成ＲＮＡ １２５０コピー（各Ｎ＝２）を添加した。Ｍｎ及びＲＮＡの添加後、直ちにＲｏｃｈｅ製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）に記載の温度サイクルで、リアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ ＲＮＡのＣｑ値を表３に示す。また、ｎ．ｄ．は核酸を検出できなかったことを示す。反応液Ａと反応液Ｂを比較すると、ノロウイルスＧ１とＧ２共に反応液Ｂの方がＣｑ値が１～２程度小さくなった。従って、同じ量の核酸を検出する場合、反応液Ｂの方が２１～２２＝２～４倍程度検出が容易になっていると考えられる。反応液ＡではＭｎと糞便を共存させた状態で１５分放置し、反応液ＢではＭｎ添加後にただちにリアルタイムＰＣＲ反応を実施している。従って、反応液中のＭｎと糞便を一定時間共存させた場合に核酸の検出が難しくなっていることから、糞便によって影響を受ける反応液の成分がＭｎであることが判明した。
試験例４．糞便を含む系でのＭｎ濃度の最適化
（１）試料
以下の試料を調製した。
（糞便の試料懸濁液）
ノロウイルスＧ１、Ｇ２ともに陰性のヒト糞便１検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、核酸増幅反応に対する糞便の影響を評価した。
反応液 （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
Ｍｎの終濃度が１．５８、２．６３、３．１６、３．６８、４．７４ｍＭとなるように上記反応液を混合して、１９μｌずつに分注した。これらの反応液に対し、便懸濁液１μｌを加え、室温で１５分放置した。計２０μＬとなった反応液に対し、ノロウイルスＧ１、Ｇ２の合成ＲＮＡ １２５０コピー（各Ｎ＝４）を添加した。ノロウイルスＧ１、Ｇ２の合成ＲＮＡ ６２５０（Ｎ＝１）、１２５０（Ｎ＝１）、２５０（Ｎ＝１）、５０（Ｎ＝２）、２５（Ｎ＝２）、０（Ｎ＝１）コピーを添加した。これをＲｏｃｈｅ製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）に記載の温度サイクルで、リアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ ＲＮＡのＣｑ値を表３に示す。また、ｎ．ｄ．は核酸を検出できなかったことを示す。ノロウイルスＧ１においては、Ｍｎ濃度の上昇に伴って糞便存在下のＣｑ値が１～２程度小さくなった。従って、同じ量の核酸を検出する場合、２１～２２＝２～４倍程度検出が容易になっていると考えられる。一方、ノロウイルスＧ２においては、Ｍｎ濃度２．５ｍＭに比べて、３ｍＭではＣｑ値が１～２程度、すなわち２１～２２＝２～４倍程度検出が容易になっているといえる。また、検出感度の向上は、２．５ｍＭでは２５０コピー、３ｍＭでは５０コピーと５倍程度向上していることから、Ｍｎ濃度の上昇によって糞便存在下での検出が容易になっていると結論付けられる。本試験例では、便懸濁液を反応液に添加後、１５分が経過しているにもかかわらず、Ｍｎ濃度を上昇させることでＣｑ値の遅れは確認されなかった。これらの結果を踏まえると、Ｍｎ濃度を上昇させることによって、糞便の阻害を顕著に緩和することができ、糞便と反応液を混合後の時間経過による影響を十分に抑制できることが判明した。
以上の結果から、糞便を含む系では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中のＭｎ終濃度は２．５ｍＭ以上、好ましくは３ｍＭ以上で、糞便を含まない系と同等のＣｑ値の改善が認められた。
（１）試料
以下の試料を調製した。
（糞便の試料懸濁液）
ノロウイルスＧ１、Ｇ２ともに陰性のヒト糞便１検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、核酸増幅反応に対する糞便の影響を評価した。
反応液 （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
Ｍｎの終濃度が１．５８、２．６３、３．１６、３．６８、４．７４ｍＭとなるように上記反応液を混合して、１９μｌずつに分注した。これらの反応液に対し、便懸濁液１μｌを加え、室温で１５分放置した。計２０μＬとなった反応液に対し、ノロウイルスＧ１、Ｇ２の合成ＲＮＡ １２５０コピー（各Ｎ＝４）を添加した。ノロウイルスＧ１、Ｇ２の合成ＲＮＡ ６２５０（Ｎ＝１）、１２５０（Ｎ＝１）、２５０（Ｎ＝１）、５０（Ｎ＝２）、２５（Ｎ＝２）、０（Ｎ＝１）コピーを添加した。これをＲｏｃｈｅ製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）に記載の温度サイクルで、リアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ ＲＮＡのＣｑ値を表３に示す。また、ｎ．ｄ．は核酸を検出できなかったことを示す。ノロウイルスＧ１においては、Ｍｎ濃度の上昇に伴って糞便存在下のＣｑ値が１～２程度小さくなった。従って、同じ量の核酸を検出する場合、２１～２２＝２～４倍程度検出が容易になっていると考えられる。一方、ノロウイルスＧ２においては、Ｍｎ濃度２．５ｍＭに比べて、３ｍＭではＣｑ値が１～２程度、すなわち２１～２２＝２～４倍程度検出が容易になっているといえる。また、検出感度の向上は、２．５ｍＭでは２５０コピー、３ｍＭでは５０コピーと５倍程度向上していることから、Ｍｎ濃度の上昇によって糞便存在下での検出が容易になっていると結論付けられる。本試験例では、便懸濁液を反応液に添加後、１５分が経過しているにもかかわらず、Ｍｎ濃度を上昇させることでＣｑ値の遅れは確認されなかった。これらの結果を踏まえると、Ｍｎ濃度を上昇させることによって、糞便の阻害を顕著に緩和することができ、糞便と反応液を混合後の時間経過による影響を十分に抑制できることが判明した。
以上の結果から、糞便を含む系では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中のＭｎ終濃度は２．５ｍＭ以上、好ましくは３ｍＭ以上で、糞便を含まない系と同等のＣｑ値の改善が認められた。
試験例５．一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲによる検体の検出
（１）試料の調製
ヒト糞便３検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、核酸増幅反応に対する糞便の影響を評価した。
反応液 （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
Ｍｎの終濃度が２．６３、３．１６、３．６８ｍＭとなるように上記反応液を混合して、１９μｌずつに分注し、便懸濁液１μｌを添加した。これを以下の温度サイクルで、Ｒｏｃｈｅ製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍを用いてリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
９０℃ １分
６０℃ ５分（逆転写反応）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ 糞便中のノロウイルスのＣｑ値を表５に示す。また、ｎ．ｄ．は核酸を検出できなかったことを示す。今回使用した検体１～３は、全てノロウイルスＧ２が陽性となった。Ｍｎ濃度を増加させるとＣｑ値が小さくなっていることから、検体の検出が容易になっていると判断できる。これらの結果から、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液中のＭｎ濃度を増加させることによって、糞便中のノロウイルスの検出が容易になることが確認された。
（１）試料の調製
ヒト糞便３検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、核酸増幅反応に対する糞便の影響を評価した。
反応液 （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液 （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
Ｍｎの終濃度が２．６３、３．１６、３．６８ｍＭとなるように上記反応液を混合して、１９μｌずつに分注し、便懸濁液１μｌを添加した。これを以下の温度サイクルで、Ｒｏｃｈｅ製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍを用いてリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。
９０℃ １分
６０℃ ５分（逆転写反応）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ 糞便中のノロウイルスのＣｑ値を表５に示す。また、ｎ．ｄ．は核酸を検出できなかったことを示す。今回使用した検体１～３は、全てノロウイルスＧ２が陽性となった。Ｍｎ濃度を増加させるとＣｑ値が小さくなっていることから、検体の検出が容易になっていると判断できる。これらの結果から、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液中のＭｎ濃度を増加させることによって、糞便中のノロウイルスの検出が容易になることが確認された。
本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理などを目的とした検査の分野において、好適に用いられる。とりわけ本発明は、例えば、多量の試料を一気に纏めて処理することが望まれるような検査（例えば、ノロウイルス等の食品衛生管理検査等）において、核酸の単離精製処理等の手間を省くことができるだけでなく、そのような未処理試料とＲＴ－ＰＣＲ反応液混合後に多少時間が経過しても安定して検査結果を得ることができるので非常に有益である。
Claims (21)
- 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する方法：
（１）核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料に対して、反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整された２価の陽イオンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する工程、及び、
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応によって試料中の標的ＲＮＡの有無を検査する工程。 - 前記２価の陽イオンがマンガンイオンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記２価の陽イオンの反応液中終濃度が３ｍＭ以上となるように調整されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの反応液中終濃度が４．２ｎｇ/μＬ以下であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
- 前記工程（１）及び（２）が同一容器で行われることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
- 工程（２）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
- 工程（２）において、ＰＣＲサイクル反応の前及び／又はＰＣＲサイクル反応中に、試料中で核酸を露出させるため及び／又はＰＣＲ反応においてホットスタートＰＣＲを行うために熱処理を実施することを含む請求項１から６のいずれかに記載の方法。
- 前記熱処理が、６０℃以上であり、かつ１秒以上の加熱を行うことを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 試料が糞便試料である請求項１から８のいずれかに記載の方法。
- 試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された試料懸濁液である請求項１から９のいずれかに記載の方法。
- 試料が試料懸濁液の遠心上清である請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
- 前記標的ＲＮＡがエンベロープをもたないＲＮＡウイルス由来の核酸であることを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
- ＲＮＡウイルスがノロウイルスである請求項１２に記載の方法。
- ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
- 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
- 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｚ０５およびそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
- ＲＴ－ＰＣＲ反応液が、検出対象の標的ＲＮＡの検出領域に対応するプライマー対をさらに含む請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
- ＲＴ－ＰＣＲ反応液が、検出対象の標的ＲＮＡの検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブをさらに含む請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
- 核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料を供して行う一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応において、試料中の夾雑物質の影響を緩和することにより経時的なＲＴ－ＰＣＲ反応安定性を高める方法であって、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において終濃度が２．５ｍＭ以上の２価の陽イオンと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを共存させることを特徴とする、方法。
- 請求項１～１９のいずれかに記載の方法に用いるための一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物であって、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度が２．５ｍＭ以上になるように調整された２価の陽イオン、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、を含むことを特徴とする、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物。
- 請求項２０に記載の一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物を含むことを特徴とする、試料中の標的ＲＮＡの有無を検査するためのキット。
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