WO2021020380A1 - 改良されたウイルス検出方法 - Google Patents

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WO2021020380A1
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dna polymerase
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謙太 寺内
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東洋紡株式会社
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting RNA virus by nucleic acid amplification. More specifically, detection of RNA virus by mixing a sample containing an insoluble substance with a reaction solution of a monoenzyme-based real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) without performing a prior centrifugation operation. Regarding.
  • the method of the present invention can detect RNA virus in, for example, a fecal sample, a blood sample, an environmental wiping sample, and the like.
  • the present invention can also be used for life science research, clinical diagnosis, food hygiene inspection, environmental inspection, and the like.
  • Nucleic acid amplification is a technology that amplifies several copies of a target nucleic acid to a level that can be visualized, that is, to hundreds of millions of copies or more. It is also widely used in the microbiological examination of.
  • a typical nucleic acid amplification method is PCR (Polymerase Chain Reaction).
  • PCR includes (1) DNA denaturation by heat treatment (dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA), (2) annealing of primers to template single-stranded DNA, and (3) the primers using DNA polymerase. This is a method in which the target nucleic acid in the sample is amplified by repeating the three steps of extension as one cycle. Annealing and elongation may be performed in two steps at the same temperature.
  • RT reverse transcription
  • This RT-PCR is a one-enzyme system one-step RT in which (1) RT and PCR are carried out discontinuously, two-step RT-PCR, and (2) RT and PCR are carried out continuously using a single enzyme.
  • -PCR (3) Using two types of enzymes, reverse transcriptase and DNA polymerase, RT and PCR are roughly divided into three types: two-enzyme system 1-step RT-PCR.
  • one-step RT-PCR is preferred because of its high processing capacity and avoiding contamination due to opening and closing of the reaction vessel during the reaction.
  • Two-enzyme system In one-step RT-PCR, at least two types of enzymes, reverse transcriptase and DNA polymerase, are used.
  • a DNA polymerase having reverse transcription activity such as Tth DNA polymerase is used.
  • the reverse transcriptase activity of DNA polymerase is generally inferior to the reverse transcription efficiency of reverse transcriptase derived from retrovirus
  • the two-enzyme system one-step RT-PCR is superior to the one-enzyme system RT-PCR. It is said to have high sensitivity (Non-Patent Document 1). Therefore, it has been considered that one-enzyme-based one-step RT-PCR is more difficult to increase in sensitivity than two-enzyme-based RT-PCR.
  • Norovirus which is one of the pathogenic RNA viruses, is a typical example of virus testing.
  • Norovirus is a single-strand RNA virus that causes acute gastroenteritis. It is a virus of great public health concern because it is highly infectious and causes mass food poisoning and mass infection.
  • Norovirus is classified into two gene groups, Genogroup I (GI) and Genogroup II (GII).
  • GI Genogroup I
  • GII Genogroup II
  • GI Genogroup I
  • GII Genogroup II
  • GI Genogroup II
  • a tissue culture method has not been established, and a method for detecting a viral gene using electron microscopy, an immunological antigen detection method by ELISA, or a nucleic acid amplification technique has been developed.
  • the RT-PCR method based on the notification of the Monitoring and Safety Division, Safety Department, Pharmaceutical and Food Safety Bureau, Ministry of Health, Labor and Welfare (Food Safety Supervisor No. 1105001) is widely used as an official method.
  • norovirus infection is eating and drinking foods contaminated with norovirus, but since infection is often caused by human hands, regular stool tests are performed at cooking facilities, medical sites, elderly care facilities, and nursery schools. Is required.
  • the mass cooking facility hygiene management manual adds that the stool test for cooks, etc. should include a norovirus test at least once a month or, if necessary, from October to March, which is the epidemic season of norovirus. .. This is because there are quite a few people (health carriers) who are infected with the virus but have no symptoms, and these people may unknowingly spread the infection.
  • cooks with symptoms such as diarrhea and vomiting should consult a medical institution, and if they are found to be infected with norovirus, perform high-sensitivity tests such as real-time PCR and do not have norovirus. It is desirable to take appropriate measures such as refraining from cooking work that comes into direct contact with food until it is confirmed.
  • Norovirus has a capsid structure in which the viral RNA genome is encapsulated inside an icosahedron consisting of a capsid protein of about 30 nm.
  • the capsid structure is resistant to inactivation by gastric acid and the surface-active action of bile acids so that the virus can survive in harsh environments such as the digestive tract.
  • a normal surfactant or a virus inactivating agent typified by 70% ethanol cannot destroy this capsid structure, and the infectivity of the virus is maintained.
  • heat treatment under harsh conditions of at least 85 ° C. or higher and 1 minute or longer is required (Non-Patent Document 2).
  • RNA extraction work is complicated in order to test a large number of samples in a short time.
  • Patent Document 1 a method of detecting the presence or absence of a virus by destroying the capsid of norovirus in a stool sample by pretreatment including heat treatment and subjecting a treatment solution in which viral RNA is exposed to RT-PCR.
  • Patent Document 1 a method of detecting the presence or absence of a virus by destroying the capsid of norovirus in a stool sample by pretreatment including heat treatment and subjecting a treatment solution in which viral RNA is exposed to RT-PCR.
  • Non-Patent Document 3 A method for detecting the presence or absence of a virus is known (Non-Patent Document 3).
  • a PCR reaction inhibitor such as a polysaccharide contained in the stool sample is brought in.
  • the PCR reaction solution has been devised to reduce these effects. It has been reported that PCR inhibition in detecting spiked DNA in stool samples is improved by the use of rTth DNA polymerase having contamination resistance in the presence of magnesium (Non-Patent Document 4).
  • the rTth DNA polymerase is used to utilize a two-enzyme system 1-step RT-PCR system in which contamination resistance is enhanced.
  • the retrovirus-derived reverse transcriptase used in the two-enzyme system 1-step RT-PCR is significantly inferior in heat resistance to the thermophile-derived DNA polymerase (Non-Patent Document 5). ). Therefore, in the two-enzyme system 1-step RT-PCR, heat treatment for virus disruption cannot be performed on the reaction solution containing reverse transcriptase at a high temperature. Therefore, the untreated sample cannot be directly added to the RT-PCR reaction solution and heat-treated to destroy the capsid structure of the virus to detect RNA.
  • an RT-PCR reaction solution is added to the pretreated sample in order to avoid inactivation of reverse transcriptase.
  • This method requires two steps, one is to add a pretreatment solution to the sample and perform heat treatment, and the other is to add a new RT-PCR reaction solution. Therefore, the pretreatment step to destroy the virus capsid is somewhat involved. It takes time and effort.
  • a stool sample is prepared as a sample to be subjected to RT-PCR, for example, as a 10% suspension, and then centrifuged in advance and the recovered supernatant is used. There is. The work of preparing a suspension of a stool sample and centrifuging it requires labor and labor, especially in the field of measuring a large number of samples.
  • the stool sample contains a large amount of insoluble solids
  • a 10% stool suspension that has not been centrifuged or a stool sample as it is is added directly to the RT-PCR reaction solution, it will be added to the reaction solution.
  • a large amount of insoluble substance is brought in, and the reaction solution becomes highly turbid.
  • a highly turbid RT-PCR reaction solution containing a large amount of such an insoluble substance is used, light scattering or absorption by the insoluble substance in the reaction solution, the influence of autofluorescence, etc. causes a significant decrease in the intensity of the fluorescence wavelength obtained as a result of RT-PCR, resulting in a significant decrease in sensitivity.
  • An object of the present invention is the presence or absence of viral RNA with sufficient sensitivity by one-enzyme system 1-step RT-PCR even when a sample containing an insoluble substance is used without prior centrifugation of the sample. Is to be possible to detect.
  • the present inventors mixed a sample containing an insoluble substance with a one-enzyme-based 1-step RT-PCR reaction solution without removing the insoluble substance by a prior centrifugation operation. Later, it was found that viral RNA can be detected with high sensitivity by coexisting with a specific polypeptide and / or using a specific heat-resistant DNA polymerase when directly performing 1-step RT-PCR. .. Conventionally, when a large amount of insoluble substances are mixed in the RT-PCR reaction solution to form a highly turbid reaction solution, the insoluble substances contained in the reaction solution are affected by light scattering and absorption, autofluorescence, etc. in real time.
  • Typical inventions of the present application are as follows.
  • a method for examining the presence of RNA virus in a sample which comprises the following steps: (1) A sample containing an insoluble substance without prior centrifugation and a one-enzyme 1-step RT-PCR reaction solution containing a polypeptide having a molecular weight of 5 to 500 kDa and a heat-resistant DNA polymerase having reverse transcription activity are mixed. The process of preparing the mixed solution, and (2) A step of carrying out a one-step RT-PCR reaction after sealing the reaction vessel.
  • the turbidity of the insoluble substance in the mixed solution is 0.01 Abs / ⁇ L or more at OD660.
  • a polypeptide having a molecular weight of 5 to 500 kDa contained in the one-enzyme system 1-step RT-PCR reaction solution is selected from the group consisting of bovine serum albumin, gelatin, Blocking peptide fragment (hereinafter referred to as BPF), and sericin.
  • BPF Blocking peptide fragment
  • Item 2 The method according to Item 1 or 2, which comprises at least one.
  • Bovine serum albumin of 0.5 mg / mL or more, gelatin of 5 mg / mL or more, and Blocking of 5 mg / mL or more as the polypeptide having a molecular weight of 5 to 500 kDa at the final concentration in the mixed solution.
  • BPF peptide fragment
  • sericin 5 mg / mL or more.
  • the sample containing the insoluble substance used in the step (1) is a sample that has not been subjected to nucleic acid isolation treatment or heat treatment.
  • the steps (1) and (2) are performed in the same container.
  • the hot start enzyme is activated in order to disrupt the virus to expose the nucleic acid in the virus and / or in the nucleic acid amplification reaction before and / or during the cycle reaction.
  • the sample is a blood sample, a stool sample, and / or a wiping test sample.
  • the sample is a suspension suspended in water, physiological saline or a buffer solution.
  • Item 12. The method according to any one of Items 1 to 11, wherein the virus is an RNA virus having no envelope.
  • the RNA virus having no envelope is a Reoviridae virus or a Caliciviridae virus.
  • the Reoviridae virus is rotavirus.
  • the Caliciviridae virus is a norovirus. Item 16.
  • thermostable DNA polymerase is a DNA polymerase belonging to Family A.
  • thermostable DNA polymerase is at least one selected from the group consisting of Tth polymerase, Hawk Z05 polymerase, and variants thereof.
  • Method is at least one selected from the group consisting of Tth polymerase, Hawk Z05 polymerase, and variants thereof.
  • Item 19 The method according to any one of Items 1 to 18, wherein the one-enzyme system 1-step RT-PCR reaction solution further contains 1 mM or more of divalent cations.
  • a method for examining the presence of RNA virus in a sample which comprises the following steps: (1) A mixed solution obtained by mixing a sample containing an insoluble substance without performing a prior centrifugation operation and a one-enzyme system 1-step RT-PCR reaction solution containing a heat-resistant DNA polymerase belonging to Family A having reverse transcription activity. Preparation process and (2) A step of carrying out a one-step RT-PCR reaction after sealing the reaction vessel.
  • the heat-resistant DNA polymerase belonging to the family A having reverse transcription activity is selected from the group consisting of Tth polymerase, Hawk Z05 polymerase, and variants thereof, and is at least one type of heat-resistant DNA having reverse transcription activity.
  • the variant comprises an amino acid sequence showing 90% or more identity with the amino acid sequence of Tth polymerase (SEQ ID NO: 10) or Hawk Z05 polymerase (SEQ ID NO: 11), and has reverse transcription activity and heat resistance.
  • Item 2. The method according to Item 21, which exhibits DNA polymerase activity.
  • the mutant comprises an amino acid sequence having one or several amino acid deletions, substitutions and / or additions in the amino acid sequence of Tth polymerase (SEQ ID NO: 10) or Hawk Z05 polymerase (SEQ ID NO: 11).
  • a polypeptide having a molecular weight of 5 to 500 kDa contained in the one-enzyme system 1-step RT-PCR reaction solution is selected from the group consisting of bovine serum albumin, gelatin, Blocking peptide fragment (hereinafter referred to as BPF), and sericin.
  • BPF Blocking peptide fragment
  • Item 4 The composition according to Item 24 or 25, which comprises at least one.
  • BPF Blocking peptide fragment
  • thermostable DNA polymerase is at least one selected from the group consisting of Tth polymerase, Hawk Z05 polymerase, and variants thereof.
  • Composition [Item 31] The composition according to any one of Items 24 to 30, wherein the one-enzyme system 1-step RT-PCR reaction solution further contains 1 mM or more of divalent cations.
  • composition according to Item 33 wherein the Reoviridae virus is rotavirus.
  • Item 35 The composition according to Item 33, wherein the Caliciviridae virus is a norovirus.
  • Item 36 The composition according to any one of Items 24 to 35, wherein it is possible to determine whether the norovirus is GI type or GII type.
  • Item 37 A one-enzyme system one-step RT-PCR reaction from a sample containing an insoluble substance without performing a prior centrifugation operation, which comprises a heat-resistant DNA polymerase belonging to Family A having reverse transcription activity. A composition for testing RNA viruses.
  • the heat-resistant DNA polymerase belonging to the family A having reverse transcription activity is selected from the group consisting of Tth polymerase, Hawk Z05 polymerase, and variants thereof, and is at least one type of heat-resistant DNA having reverse transcription activity.
  • Item 38. The composition according to Item 37, which is a polymerase.
  • the variant comprises an amino acid sequence showing 90% or more identity with the amino acid sequence of Tth polymerase (SEQ ID NO: 10) or Hawk Z05 polymerase (SEQ ID NO: 11), and has reverse transcription activity and heat resistance.
  • Item 3. The composition according to Item 38, which exhibits DNA polymerase activity.
  • the mutant comprises an amino acid sequence having one or several amino acid deletions, substitutions and / or additions in the amino acid sequence of Tth polymerase (SEQ ID NO: 10) or Hawk Z05 polymerase (SEQ ID NO: 11).
  • the composition according to Item 38 or 39 which exhibits reverse transcription activity and heat-resistant DNA polymerase activity.
  • the present invention it is not necessary to remove insoluble substances in a sample by centrifugation, and after adding the sample to a 1-step RT-PCR reaction solution, viral RNA is detected by a 1-step RT-PCR reaction as it is. Is possible. Further, in one embodiment of the present invention, RT-PCR including a heat treatment step is also possible. Therefore, the present invention is also useful in certain embodiments for detecting the presence or absence of a virus in a sample containing an insoluble substance, particularly a non-enveloped virus that is difficult to disrupt.
  • the inspection work becomes more efficient, so that the amount of inspection of subjects who have no symptoms even if infected with a virus can be increased, and infectious diseases. It can also greatly contribute to prevention. Further, by omitting the pretreatment step, it is possible to omit the work of opening and closing the lid of the reaction vessel. As a result, the risk of contamination with other samples can be reduced. As a result, the risk of false positives can be suppressed, and the accuracy of inspection work can be further improved.
  • RNA viruses such as norovirus in a sample, which is a heat-resistant DNA having a specific polypeptide and reverse transcription activity without removing the insoluble substance by pre-centrifuging the sample.
  • a monoenzyme-based 1-step RT-PCR reagent containing a polymerase or a monoenzyme-based 1-step RT-PCR reagent containing a heat-resistant DNA polymerase having a specific reverse transcription activity and a sample containing an insoluble substance are mixed and RT-PCR. It is a method for examining the presence or absence of RNA virus that comprises reacting.
  • the RNA virus may be a non-enveloped RNA virus, or may be an RNA virus in which RNA is retained in a hard capsid structure.
  • the method for examining the presence of RNA virus in a sample of the present invention is characterized by including at least the following steps. (1) A sample containing an insoluble substance without prior centrifugation is mixed with a one-enzyme 1-step RT-PCR reaction solution containing a polypeptide having a molecular weight of 5 to 500 kDa and a heat-resistant DNA polymerase having reverse transcription activity. Steps to prepare the mixed solution; (2) A step of carrying out a one-step RT-PCR reaction after sealing the reaction vessel.
  • the method for examining the presence of RNA virus in a sample of the present invention is characterized by including at least the following steps. (1) A mixed solution obtained by mixing a sample containing an insoluble substance without performing a prior centrifugation operation and a one-enzyme system 1-step RT-PCR reaction solution containing a thermostable DNA polymerase belonging to Family A having reverse transcription activity. Step to prepare; (2) A step of carrying out a one-step RT-PCR reaction after sealing the reaction vessel.
  • a polypeptide having a molecular weight of 5 to 500 kDa and reverse transcription activity are applied to a sample from which an insoluble substance has not been removed by a prior centrifugation operation.
  • This is performed by adding a one-enzyme system one-step RT-PCR reaction solution containing a heat-resistant DNA polymerase having a heat-resistant DNA polymerase or a one-enzyme system one-step RT-PCR reaction solution containing a heat-resistant DNA polymerase belonging to Family A.
  • the steps (1) and (2) are preferably performed in the same container.
  • the sample containing the insoluble substance used in the step (1) may be a suspension suspended in water or a buffer solution in advance, and a sample such as a fecal sample is subjected to a one-step RT-PCR reaction. It may be added directly to the liquid.
  • the test target in the present invention is an RNA virus, and is not particularly limited. Among them, it is a non-enveloped RNA virus that does not have an envelope derived from a lipid bilayer membrane.
  • Such non-enveloped RNA viruses include astroviruses (eg, astroviruses); caliciviridae viruses (eg, sapovirus, norovirus); picornaviruses (eg, hepatitis A virus, echovirus, etc.). Enterovirus, coxsackie virus, poliovirus, rhinovirus); Hepeviridae virus (eg, hepatitis E virus); Leovirus family virus (eg, rotavirus), and the like, but not limited to, preferably.
  • astroviruses eg, astroviruses
  • caliciviridae viruses eg, sapovirus, norovirus
  • picornaviruses eg, hepatitis A virus, echovirus, etc
  • Caliciviridae virus and Leovirus family virus more preferably for detecting norovirus, sapovirus, and rotavirus, and more preferably for detecting norovirus and rotavirus, especially for norovirus.
  • Most non-enveloped viruses can infect the gastrointestinal tract due to fecal-oral infection, etc., and RNA is retained in a rigid capsid structure that is resistant to inactivation by gastric acid and the surface-active action of bile acids.
  • Norovirus is widely known to be classified by the genotypes of GI type norovirus and GII type norovirus. Then, it is desired to discriminate between GI type norovirus and GII type norovirus from the viewpoint of collecting epidemiological data such as estimation of infection route. In the RNA virus test method of the present invention, not only can the presence or absence of norovirus be confirmed, but it is also possible to determine (differentiate) whether the infecting norovirus is GI type or GII type. It is beneficial.
  • sample used in the present invention examples include stool (excretion stool, rectal stool), vomit, saliva, etc. It is useful for detection from feces (excretion, rectal stool).
  • One of the features of the present invention is that it is not necessary to subject these samples to a centrifugation step to remove insoluble substances.
  • the sample may be subjected to direct detection, or the sample may be suspended in water, saline or buffer in order to reduce the effect of contaminants on the reaction and obtain more stable test results. There may be.
  • the buffer solution is not particularly limited, and examples thereof include Hanks buffer solution, Tris buffer solution, phosphate buffer solution, glycine buffer solution, HEPES buffer solution, and tricine buffer solution.
  • the sample used in the present invention is not only pre-centrifuged, but also pre-isolated from the sample using, for example, a commercially available RNA purification kit and / or pre-heated. It may be a sample that has not been processed to expose RNA from the viral structure. In the method of the present invention, even in a sample without such prior RNA isolation and heat treatment, heat treatment is included before and / or during the cycle reaction of the one-step RT-PCR reaction. RNA can be exposed from the viral structure and subjected to RT-PCR reactions.
  • the wiping test is not particularly limited, but is a sample obtained by wiping the relevant section or equipment with a cotton swab or the like, eluting it in water or a buffer solution, and concentrating it with polyethylene glycol (PEG) precipitate or the like. ..
  • PEG polyethylene glycol
  • wipes include cutting boards, kitchen knives, towels, tableware and other cooking utensils, refrigerator handles and toilets, bathroom door knobs, washrooms, kitchens, toilets, bathroom faucets, cookers' hands and fingers, bathrooms, etc. , Toilets, washbasins, handrails, living rooms and other facilities.
  • wipes include cutting boards, kitchen knives, towels, tableware and other cooking utensils, refrigerator handles and toilets, bathroom door knobs, washrooms, kitchens, toilets, bathroom faucets, cookers' hands and fingers, bathrooms, etc. , Toilets, washbasins, handrails, living rooms and other facilities.
  • insoluble substances examples include those derived from feces (excretion stool, rectal stool), vomit, saliva, blood, and wiping test sample, but are limited. It is not something that is done.
  • any insoluble substance that can affect the fluorescence intensity when measuring the RT-PCR reaction such as those derived from living organisms (including secretions and excrement from living organisms) and those derived from environmental test samples. possible. It is particularly useful for detection from samples containing insoluble substances contained in feces (excreted feces, rectal feces).
  • the turbidity of the insoluble substance that can be measured by the method of the present invention varies depending on the test sample, the degree of desired effect, etc., but for example, in the turbidity OD660, the RT-PCR reaction solution is 0.01 Abs / ⁇ L or more. In some cases, etc. can be mentioned. As a matter of course, as the turbidity increases, the possibility that the test sensitivity is affected increases. For example, the turbidity due to the insoluble substance in the RT-PCR reaction solution is 0.1 Abs / ⁇ L or more at OD660, and further.
  • the upper limit of the turbidity due to the insoluble substance in the RT-PCR reaction solution is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but as an example, 5.0 Abs / ⁇ L or less, preferably 4.0 Abs / ⁇ L or less, for example, 3Abs. It can be less than / ⁇ L.
  • a device such as a centrifuge is required, and opening and closing of the reaction vessel is also required, which causes the work to be complicated and the work time to be extended. Become.
  • opening and closing the reaction vessel containing the virus-containing sample poses a risk of scattering of the virus and virus-derived RNA.
  • the spread of the virus threatens the safety and health of workers and at the same time means pollution of the inspection work environment. Since the scattered RNA virus is aerosolized in the workplace, the risk of contamination of other samples being tested at the same time is a problem. Therefore, the method of inspecting the presence or absence of a virus using RT-PCR without the step of opening and closing the lid has more significance than simplification of the work.
  • the method for examining the presence of RNA virus in a sample of the present invention is characterized in that a polypeptide having a molecular weight of 5 to 500 kDa coexists in a one-enzyme system one-step RT-PCR reaction. And. By coexisting a relatively high molecular weight polypeptide in this way, viral RNA can be detected with high sensitivity even in a highly turbid reaction solution in which a large amount of insoluble substances are present in the RT-PCR reaction solution. It becomes possible.
  • the polypeptide used in the present invention is not particularly limited as long as it has a molecular weight of 5 to 500 kDa, but is preferably 6 to 400 kDa.
  • molecular weight when indicating the molecular weight, it means a value determined by using SDS-PAGE unless it is clear that it has another meaning.
  • the measurement of the molecular weight by SDS-PAGE can be performed by using a method and an apparatus common in the art and using a commercially available molecular weight marker or the like.
  • “molecular weight 50 kDa” means that when the molecular weight is measured by SDS-PAGE, those skilled in the art usually determine that there is a band at the position of 50 kDa.
  • the polypeptide used in the present invention may be a mixture of polypeptides within the above molecular weight range.
  • the polypeptide used in the present invention is not particularly limited as long as it exerts the effect of the present invention, and refers to a protein formed by connecting a plurality of amino acids by peptide bonds.
  • the polypeptide used in the present invention is, for example, a heat-denatured polypeptide (for example, gelatin) whose three-dimensional structure is solved by heat denaturation or the like as long as it has a polypeptide structure in which amino acids are linked. You may.
  • polypeptides that can be used in the present invention for example, albumin (eg, bovine serum albumin, lactoalbumin, human serum albumin, egg-derived albumin), gelatin (eg, fish gelatin, pig gelatin), sericin, etc.
  • Naturally-derived proteins such as casein and fibroin (naturally-derived polypeptides); artificially produced by synthesis / degradation of Blocking peptide fragment (hereinafter also referred to as BPF), collagen hydrolyzate, polypeptone, yeast extract, beef extract, etc.
  • BPF Blocking peptide fragment
  • Polypeptides and the like can be used.
  • the polypeptides used in the present invention are bovine serum albumin, gelatin, Blocking peptide fragment (hereinafter referred to as BPF), and / or sericin. From the viewpoint that even a small amount can exert a high effect, it is more preferable to use bovine serum albumin and gelatin (particularly fish gelatin). Only one type of these polypeptides may be used, or two or more types may be used in combination. Further, these polypeptides may be prepared by means such as extraction from nature or synthesis, and commercially available products can also be preferably used.
  • the amount of the polypeptide used is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited, but for example, in a mixed solution of a sample containing the insoluble substance and a one-enzyme system 1-step RT-PCR reaction solution.
  • the final concentration is 0.0001 to 200 mg / mL, preferably 0.01 to 150 mg / mL, more preferably 0.1 to 130 mg / mL, and further preferably 0.5 to 100 mg / mL. can do.
  • the preferred amount for exerting a better effect may vary depending on the type of polypeptide used, the degree of desired effect, etc., and for example, the following amounts can be exemplified: -When bovine serum albumin is used:
  • the final concentration in the RT-PCR reaction solution is, for example, 0.5 mg / mL or more, preferably 1 mg / mL or more, more preferably 2 mg / mL or more, still more preferably 3 mg / mL or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but can be, for example, 10 mg / mL or less.
  • the final concentration in the RT-PCR reaction solution is, for example, 0.1 mg / mL or more, preferably 1 mg / mL or more, more preferably 5 mg / mL or more, still more preferably 7.5 mg / mL or more, and further. More preferably, 15 mg / mL or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but may be, for example, 50 mg / mL or less, or 30 mg / ml or less.
  • the final concentration in the RT-PCR reaction solution is, for example, 1 mg / mL or more, preferably 5 mg / mL or more, more preferably 10 mg / mL or more, still more preferably 20 mg / mL or more, still more preferably 50 mg. / ML or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but can be, for example, 100 mg / mL or less.
  • the final concentration in the RT-PCR reaction solution is, for example, 1 mg / mL or more, preferably 5 mg / mL or more, more preferably 10 mg / mL or more, still more preferably 20 mg / mL or more, still more preferably 30 mg. / ML or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but can be, for example, 50 mg / mL or less.
  • the RT-PCR cycle in step (2) is 1. Heat treatment, 2. Reverse transcription reaction, 3. It consists of 3 steps of PCR. Before and after each step, a heat treatment step for activating the hot start enzyme may be included.
  • the heat treatment step 1 includes a step of crushing the virus to expose the nucleic acid in the virus and / or activating the hot start enzyme in the nucleic acid amplification reaction. By including these heat treatment steps, RNA can be exposed (eluted) from the capsid structure of the virus.
  • the temperature and time of the heat treatment step may be 60 ° C. or higher and 1 second or longer, preferably 70 ° C. and 30 seconds or longer, more preferably 80 ° C. and 30 seconds or longer, and particularly preferably 85 ° C. and 30 seconds.
  • the temperature of the reverse transcription reaction of 2 is determined by the reverse transcription activity of the thermostable DNA polymerase and the Tm values of the primers and probes, and may be at least 25 ° C. or higher. More preferably, it is 37 ° C. or higher.
  • PCR of 3 [1] DNA denaturation by heat treatment (dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA), [2] annealing of primers to template single-stranded DNA, and [3] the above using DNA polymerase. It suffices to include three steps of extension of the primer, and [2] and [3] may be carried out at the same temperature to make two steps.
  • the thermal cycler used for the RT-PCR reaction has a total extension time of steps [2] and [3] of 15 seconds or less, more preferably 10 seconds or less. It is desirable to set up a measurement program for.
  • the “PCR extension time” refers to the set temperature in the thermal cycler.
  • the one-step RT-PCR solution added to the mixture is characterized by containing a thermostable DNA polymerase having reverse transcription activity.
  • a DNA polymerase having reverse transcription activity is a DNA polymerase having both the ability to convert RNA into cDNA and the ability to amplify DNA.
  • heat resistance means that the enzyme activity does not decrease by more than half even if the heat treatment is performed at 70 ° C. for 1 minute or more.
  • the origin is not particularly limited, and examples thereof include Taq, Tth, Bst, Bca, KOD, Pfu, Pwo, Tbr, Tfi, Tfl, Tma, Tne, Vent, DEEPVENT, and mutants thereof.
  • DNA polymerase derived from Thermus aquaticus (Taq), DNA polymerase derived from Thermus thermophilus HB8 (Tth), DNA polymerase derived from Thermus sp Z05 (Z05), and DNA polymerase derived from Thermus sp Z05. (Tma), DNA polymerase derived from Bacillus caldoteneax (Bca), DNA polymerase derived from Bacillus thermus (Bst), etc., even if these variants do not lose their reverse transcription activity and heat resistant DNA polymerase activity. Good.
  • DNA polymerase derived from Thermococcus kodakaraensis
  • reverse transcriptase activity for example, RTX: reverse transcriptase xenopolymerase
  • the heat-resistant DNA polymerase that also has the above is not limited. Particularly preferred are DNA polymerases belonging to Family A, and preferred are DNA polymerases having reverse transcription activity selected from the group consisting of Taq, Tth, Z05 and variants thereof. Of these, at least one selected from the group consisting of Tth polymerase, Hawk Z05 polymerase, and variants thereof.
  • the method for examining the presence of RNA virus in a sample of the present invention is heat resistant, which has reverse transcription activity belonging to Family A as a DNA polymerase in a one-enzyme system one-step RT-PCR reaction.
  • One of the features is the use of DNA polymerase.
  • DNA polymerases used for PCR DNA polymerases belonging to family A derived from thermophiles (also called polI type) and DNA polymerases belonging to family B derived from hyperthermophilic archaea (also called ⁇ type) have been conventionally used. Etc. are known. Of these, DNA polymerases belonging to Family A are generally susceptible to PCR inhibitors, and it has been considered difficult to amplify them from unpurified samples. However, in the present invention, a centrifuge operation is performed by performing a one-enzyme system 1-step RT-PCR reaction using a heat-resistant DNA polymerase that belongs to Family A, which is susceptible to such inhibitory substances, and has reverse transcription activity. This is based on the unexpected result that RNA virus can be detected with high sensitivity even in a sample containing a large amount of impurities such as insoluble substances.
  • the heat-resistant polymerase belonging to Family A that can be used in the present invention and having reverse transcription activity is not particularly limited, but for example, a DNA polymerase (Tth polymerase) derived from Thermus thermophilus HB8, Thermus sp. Z05-derived DNA polymerase (Hawk Z05 polymerase), Thermotoga maritima-derived DNA polymerase (Tma polymerase), Bacillus caldotenex-derived DNA polymerase (Bca polymerase), Bacillus theatermorphis-derived DNA polymerase (Bst polymerase), etc. It may be a variant in which the reverse transcription activity and the heat-resistant DNA polymerase activity are not lost.
  • Tth polymerase derived from Thermus thermophilus HB8, Thermus sp. Z05-derived DNA polymerase
  • Tma polymerase Thermotoga maritima-derived DNA polymerase
  • Bca polymerase Bacillus caldotenex-derived DNA polymerase
  • a DNA polymerase having reverse transcription activity selected from the group consisting of Tth, Z05 and variants thereof can be mentioned.
  • at least one selected from the group consisting of Tth polymerase, Hawk Z05 polymerase, and variants thereof is preferable, and by using these, even when a sample containing a large amount of insoluble substance is used. , It is possible to detect RNA virus with even higher sensitivity.
  • the amino acid sequence of Tth polymerase (SEQ ID NO: 10) and the amino acid sequence of Hawk Z05 polymerase (SEQ ID NO: 11), which can be particularly preferably used in the present invention, are shown in the sequence listing.
  • a mutant DNA polymerase (DNA polymerase variant) in which some amino acids are modified based on these amino acid sequences without losing the effect can also be preferably used.
  • the variant of the heat-resistant DNA polymerase having reverse transcription activity is, for example, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, based on the amino acid sequence of the wild-type DNA polymerase from which it is derived. % Or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more, and having an activity of converting RNA into cDNA and an activity of amplifying DNA like wild-type DNA polymerase.
  • a method for calculating the identity of the amino acid sequence any means known in the art can be used.
  • It may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence (also referred to as "mutation"), and may have an activity of converting RNA into DNA and an activity of amplifying DNA as in the case of wild-type DNA polymerase.
  • 1 or several may be, for example, 1 to 80, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 5, but the number is not particularly limited.
  • the total amount of the heat-resistant DNA polymerase contained in the one-enzyme system one-step RT-PCR reaction solution is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited, but as an example, at least 4.2 ng / ⁇ L.
  • the above is sufficient, preferably 5.0 ng / ⁇ L or more, and more preferably 5.8 ng / ⁇ L or more. Of these, it is preferably 8.3 ng / ⁇ L or more.
  • the upper limit of the total amount of the heat-resistant DNA polymerase contained in the one-enzyme system one-step RT-PCR reaction solution is not particularly limited, but as an example, it can be 20 ng / ⁇ L or less, and 16.7 ng / ⁇ L or less.
  • the effect of the present invention can be sufficiently obtained.
  • the amount of polymerase is a value quantified by the Bradford method or Nanodrop (Thermo Fisher), and may be estimated from the safety data sheet (SDS). When a protein such as BSA is contained, it is desirable to calculate by the latter method.
  • the 1-step RT-PCR reaction solution used in the present invention can be introduced into a thermally unstable block group DNA polymerase in combination with an anti-DNA polymerase antibody or by chemical modification in order to enhance the effect of suppressing non-specific reaction.
  • the 1-step RT-PCR reaction solution used in the present invention includes a heat-resistant DNA polymerase, a buffer, an appropriate salt, a magnesium salt or a manganese salt, a deoxynucleotide triphosphate, and a detection target region of the virus RNA to be detected.
  • the corresponding primer pair and, if necessary, an additive may be included.
  • the buffer used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include Tris, Tricine, Bis-Tricine, and Bicine.
  • the pH was adjusted to 6 to 9, more preferably pH 7 to 9, with sulfuric acid, hydrochloric acid, acetic acid, phosphoric acid, or the like.
  • the concentration of the buffer to be added is 10 to 200 mM, more preferably 20 to 150 mM.
  • a salt solution is added in order to obtain ionic conditions suitable for the reaction.
  • the salt solution include potassium chloride, potassium acetate, potassium sulfate, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate and the like.
  • dNTP As the dNTP used in the present invention, dATP, dCTP, dGTP, and dTTP are added at 0.1 to 0.5 mM, respectively, and most generally about 0.2 mM. Prophylactic measures against cross-contamination may be taken by using dUTP as an alternative and / or as part of dTTP. When taking preventive measures against cross-contamination, it is preferable to include Uracil-N-glycosylase (UNG).
  • UNG Uracil-N-glycosylase
  • the monoenzyme-based 1-step RT-PCT reaction solution contains divalent cations.
  • divalent cations include magnesium ion, manganese ion, calcium ion, copper ion, iron ion, nickel ion, and zinc ion.
  • the divalent cation preferably contains magnesium ion and manganese ion.
  • magnesium or manganese when magnesium ions, manganese ions, or the like are added to the one-enzyme system 1-step RT-PCR reaction solution, magnesium or manganese may be added, or salts thereof may be added.
  • magnesium or a salt thereof include magnesium, magnesium chloride, magnesium sulfate, magnesium acetate and the like, and examples of manganese or a salt thereof include manganese, manganese chloride, manganese sulfate, manganese acetate and the like.
  • Such magnesium, manganese, or salts thereof are preferably added to the RT-PCR reaction solution in an amount of about 1 to 10 mM.
  • the RT-PCR reaction solution preferably contains 1 mM or more of manganese or a salt thereof, preferably 1.5 mM or more of manganese or a salt thereof, and 2.0 mM or more of manganese or a salt thereof. It is more preferable to include it.
  • albumin a quaternary ammonium salt having a structure in which three methyl groups are added to an amino group in an amino acid
  • albumin may contain at least one selected from the group consisting of (eg, bovine serum albumin, etc.), sericin, BPF, glycerol, glycol, gelatin (eg, fish gelatin, pig gelatin, etc.) and surfactants.
  • albumin and / or gelatin is preferably contained, both albumin and gelatin are preferably contained, and bovine serum albumin and fish gelatin and / or porcine gelatin are particularly preferable.
  • albumin or gelatin having a molecular weight of about 1 to 1000 kDa (for example, about 5 to 500 kDa) when measured by SDS-PAGE according to a conventional method, but are not particularly limited.
  • Examples of the surfactant contained in the one-step RT-PCR reaction solution include Triton X-100 (Triton X-100), Triton X-114 (Triton X-114), Tween 20 (Tween 20), Nonidet P40, Briji35, and Briji58. Examples thereof include SDS, CHAPS, CHASPO, and Emulgen 420, but the present invention is not particularly limited.
  • the concentration of the surfactant in the RT-PCR reaction solution is also not particularly limited, but is preferably 0.0001% or more, more preferably 0.002% or more, still more preferably 0.005% or more, and good detection is achieved. Is possible.
  • the upper limit is not particularly limited, but as an example, it can be 0.1% or less.
  • betaine-like quaternary ammonium contained in the 1-step RT-PCR reaction solution examples include betaine (trimethylglycine) and carnitine, but are not particularly limited.
  • the betaine structure is a compound having both positive and negative charges that is stable in the molecule, exhibits surfactant-like properties, and is thought to cause destabilization of the viral structure. Furthermore, it is known to promote nucleic acid amplification of DNA polymerase.
  • the preferred betaine-like quaternary ammonium concentration is 0.1M to 2M, more preferably 0.2M to 1.2M.
  • Accelerators useful in the present invention include, for example, glycerol, polyols, protease inhibitors, single strand binding proteins (SSBs), T4 gene 32 proteins, tRNA, sulfur or acetamide-containing compounds, dimethylsulfommonium (DMSO), glycerol, ethylene.
  • Glycerol Propylene Glycol, Trimethylene Glycol, Formamide, Acetamide, Ectoin, Trehalose, Dextran, Polyvinylpyrrolidone (PVP), Tetramethylammonium Chloride (TMC), Tetramethylammonium Hydroxide (TMAH), Tetramethylammonium Acetate (TMAA), Examples thereof include, but are not limited to, polyethylene glycol.
  • EGTA Ethyleneglycol-bis (2-aminoethyl ether) -N, N, N', N'-tetraacetic acid
  • BAPTA a chelating agent
  • Primer pairs used in the present invention include two pairs of primers in which one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer. Further, as another embodiment, so-called multiplex PCR in which two or more pairs of the above primers are contained can be mentioned. In addition, degenerate primers may be included if the target nucleic acid consists of subtypes.
  • detecting norovirus which is one of the RNA viruses having no envelope in the present invention
  • a primer pair as a primer for detecting norovirus, a notification from the Monitoring and Safety Division, Safety Department, Pharmaceutical and Food Safety Bureau, Ministry of Health, Labor and Welfare (food safety).
  • the primers (SEQ ID NOs: 1 to 5) described in the primers described in the envelope No.
  • Norovirus G1 type is detected by SEQ ID NOs: 1 and 2
  • Norovirus G2 type is detected by SEQ ID NOs: 3 to 5.
  • the primer concentration to be detected is not particularly limited, but the concentration of the forward primer is 0.1 ⁇ M or more and 3 ⁇ M or less and the concentration of the reverse primer is 0.1 ⁇ M or more and 3 ⁇ M with respect to the entire RT-PCR reaction solution. The following is preferable. More preferably, the concentration of the forward primer is 0.1 ⁇ M or more and 2 ⁇ M or less, and the concentration of the reverse primer is 0.5 ⁇ M or more and 2 ⁇ M or less.
  • Another aspect of the invention is a detection method that further comprises at least one labeled hybridization probe or double-stranded DNA-bound fluorescent compound.
  • the analysis of the amplified product can be monitored by monitoring the fluorescent signal instead of the usual electrophoresis, and the analysis effort is reduced. Furthermore, it is not necessary to open the reaction vessel, and the risk of contamination can be reduced. It is also possible to identify viral subtypes by labeling each hybridization probe with a different fluorescent dye, which corresponds to the viral subtype.
  • Examples of the double-stranded DNA-bound fluorescent compound include SYBR (registered trademark) Green I, SYBR (registered trademark) Gold, SYTO-9, SYTP-13, SYTO-82 (Life Technologies), and EvaGreen (registered trademark; Biotium). , LCGreen (Idaho), LightCycler (registered trademark) 480 ResoLight (Roche Applied Science) and the like.
  • hybridization probe used in the present invention examples include TaqMan hydrolysis probe (US Pat. No. 5,210,015, US Pat. No. 5,538,848, US Pat. No. 5,487,972). , US Pat. No. 5,804,375), Molecular Beacon (US Pat. No. 5,118,801), FRET Hybridization Probe (International Publication No. 97/46707, International Publication No. 97/46712) , International Publication No. 97/46714 Pamphlet).
  • the nucleotide sequence of the probe for detecting norovirus includes, but is limited to, the sequence (SEQ ID NO: 6-9) described in the notification (Food Safety Supervisor No.
  • the target nucleic acid consists of subtypes, it may contain degenerate sequences.
  • the concentration of the fluorescently labeled probe is preferably 0.01 ⁇ M or more and 1.0 ⁇ M or less. More preferably, it is 0.013 ⁇ M or more and 0.75 ⁇ M or less, and even more preferably 0.02 ⁇ M or more and 0.5 ⁇ M or less.
  • kits or compositions for testing viral RNA in a sample which comprises a polypeptide having a molecular weight of 5 to 500 kDa and a heat-resistant DNA polymerase having reverse transcription activity.
  • This is a test kit or composition for testing RNA virus from a sample containing an insoluble substance by a one-enzyme system 1-step RT-PCR reaction without performing a prior centrifugation operation.
  • the type and amount of polypeptide having a molecular weight of 5 to 500 kDa, the type and amount of heat-resistant DNA polymerase having reverse transcription activity, the type and amount of primer or probe, the RNA virus to be tested, and the like used in this embodiment. Can be similar to that detailed in the RNA testing method described above.
  • the inspection kit of the present invention can include, for example, an instruction manual for explaining the usage method of the present invention.
  • a polypeptide having a molecular weight of 5 to 500 kDa and a thermostable DNA polymerase having reverse transcription activity are encapsulated in the same container or in separate containers, for example, in one package. It can be packed in a body and provided in a manner that includes information on how to use the kit.
  • Another aspect of the invention is a pre-centrifugation kit or composition for testing viral RNA in a sample, comprising a heat resistant DNA polymerase belonging to Family A having reverse transcription activity.
  • a test kit or composition for testing RNA virus from a sample containing an insoluble substance by a one-enzyme system one-step RT-PCR reaction without performing a separation operation.
  • the type and amount of heat-resistant DNA polymerase belonging to Family A having reverse transcription activity, the type and amount of primer or probe, the RNA virus to be tested, and the like used in this embodiment are described in detail in the above RNA testing method. It can be similar to that described.
  • the inspection kit of the present invention can include, for example, an instruction manual for explaining the usage method of the present invention.
  • the test kit of the present invention comprises a thermostable DNA polymerase belonging to Family A having reverse transcription activity and other components enclosed in the same container or in separate containers, for example, in one package. It can be packed in and provided in a manner that includes information on how to use the kit.
  • Test example 1 Preparation of fecal suspension
  • sample Norovirus-negative human fecal specimens were suspended in sterile water to a concentration of 50% (% by weight). This suspension was diluted 200-fold with water.
  • Measurement of turbidity (OD660) The OD660 of the stool suspension diluted 200-fold was measured. The turbidity of the prepared stool suspension was determined by multiplying the measurement result by the dilution ratio.
  • Test example 2 1-step RT-PCR on samples containing insoluble material (1-1) Preparation of norovirus solution As a sample of norovirus, norovirus samples Norovirus GI and GII Positive Control (ZeptoMetrix, intact) were used. 250, 50, and 10 copies of each sample of G1 type and G2 type norovirus were added per reaction. (1-2) Addition of fecal suspension The norovirus-negative fecal suspension prepared in Test Example 1 was added to the following reaction solution so that the turbidity OD660 of the RT-PCR reaction solution was 0, 0.1, 1.0 Abs / ⁇ L.
  • reaction solution Using the reaction solution having the composition shown below as the basic composition, norovirus in the reaction solution was detected by 1-enzyme system 1-step RT-PCR.
  • Reaction solution RTaq DNA Polymerase 10xBuffer (Toyobo) attachment) 10x primer solution (Norovirus detection kit G1 / G2-high-speed probe detection- (Toyobo) attachment) 10x probe solution (Norovirus detection kit G1 / G2-high-speed probe detection- (Toyobo) attachment) 0.2 mM sNTPs Mixture (Toyobo) 2 mM Mn (OAc) 2 (Toyobo) 4.2 ng / ⁇ l rTth DNA polymerase (Toyobo) 0.01 ⁇ g / ⁇ l anti-Tth antibody Each of the above reagents was mixed to prepare an RT-PCR reaction solution so that the final volume was 49 ⁇ L.
  • Test Example 3.1 Examination of Additives in Step RT-PCR 1 (1-1) Preparation of norovirus solution As a sample of norovirus, norovirus samples Norovirus GI and GII Positive Control (ZeptoMetrix, intact) were used. 250 and 50 copies of each sample of G1 type and G2 type norovirus were added per reaction. (1-2) Addition of fecal suspension The norovirus-negative fecal suspension prepared in Test Example 1 was added to the following reaction solution so that the turbidity OD660 of the RT-PCR reaction solution was 1.0 Abs / ⁇ L. (2) Reaction solution Using the reaction solution having the composition shown below as the basic composition, norovirus in the reaction solution was detected by 1-enzyme system 1-step RT-PCR.
  • the composition of the reaction solution used is 100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl.
  • Reaction solution RTaq DNA Polymerase 10xBuffer (Toyobo) attachment
  • 10x primer solution Norovirus detection kit G1 / G2-high-speed probe detection- (Toyobo) attachment
  • 10x probe solution Norovirus detection kit G1 / G2-high-speed probe detection- (Toyobo) attachment
  • 0.2 mM sNTPs Mixture Toyobo) 2 mM Mn (OAc) 2 (Toyobo) 4.2 ng / ⁇ l rTth DNA polymerase (Toyobo) 0.01 ⁇ g / ⁇ l anti-Tth antibody
  • Each of the above reagents was mixed, and an RT-PCR reaction solution was prepared so that the final solution volume was 49 ⁇ L including the following additives.
  • the stool suspension was added to the RT-PCR reaction solution in an amount of 1 ⁇ L so that the final concentration was as follows, and RT-PCR was carried out as a 50 ⁇ L reaction system including the following additives.
  • (3) Additives The following additives were added to the RT-PCR reaction solution at the final concentrations shown in Table 2.
  • BSA -Bovine serum albumin
  • BPF Bovine serum albumin
  • BPF and sericin made it possible to detect low copy samples (50 copies / reaction) at 10 mg / mL or higher
  • BSA was effective at 1 mg / mL or higher and effective at low concentrations. It was confirmed.
  • porcine gelatin had the same effect at 15 mg / mL or more
  • fish gelatin confirmed the same effect at 5 mg / mL or more.
  • Test Example 4.1 Examination of Additives in Step RT-PCR 2
  • (1-1) Preparation of norovirus solution
  • norovirus samples Norovirus GI and GII Positive Control (ZeptoMetrix, intact) were used. 250 and 50 copies of each sample of G1 type and G2 type norovirus were added per reaction.
  • (1-2) Addition of fecal suspension
  • the norovirus-negative fecal suspension prepared in Test Example 1 was added to the following reaction solution so that the turbidity OD660 of the RT-PCR reaction solution was 1.0 Abs / ⁇ L.
  • (2) Reaction solution Using the reaction solution having the composition shown below as the basic composition, norovirus in the reaction solution was detected by 1-enzyme system 1-step RT-PCR.
  • the composition of the reaction solution used is 100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl.
  • Reaction solution RTaq DNA Polymerase 10xBuffer (Toyobo) attachment
  • 10x primer solution Norovirus detection kit G1 / G2-high-speed probe detection- (Toyobo) attachment
  • 10x probe solution Norovirus detection kit G1 / G2-high-speed probe detection- (Toyobo) attachment
  • 0.2 mM sNTPs Mixture Toyobo) 2 mM Mn (OAc) 2 (Toyobo) 4.2 ng / ⁇ l rTth DNA polymerase (Toyobo) 0.01 ⁇ g / ⁇ l anti-Tth antibody
  • Each of the above reagents was mixed, and an RT-PCR reaction solution was prepared so that the final solution volume was 49 ⁇ L including the following additives.
  • the stool suspension was added to the RT-PCR reaction solution in an amount of 1 ⁇ L so that the final concentration was as follows, and RT-PCR was carried out as a 50 ⁇ L reaction system including the following additives.
  • Additives BSA (molecular weight: about 60 kDa) and fish gelatin (molecular weight: about 20 to 25 kDa) were added to the RT-PCR reaction solution at the final concentrations shown in Table 4 below.
  • Test example 4 Examination of turbidity of insoluble substances (examination of inhibitory effect by concentration of insoluble substances using TthDNA polymerase)
  • (1-1) Preparation of norovirus solution
  • norovirus samples Norovirus GI and GII Positive Control (ZeptoMetrix, intact) were used. 250, 50, and 10 copies of each sample of G1 type and G2 type norovirus were added per reaction.
  • (11-2) Addition of fecal suspension The norovirus-negative fecal suspension prepared in Test Example 1 was added to the reaction solution so that the turbidity OD660 of the RT-PCR reaction solution had the following conditions.
  • the stool suspension was added to the RT-PCR reaction solution in an amount of 1 ⁇ L so that the turbidity was as follows, and RT-PCR was carried out as a 50 ⁇ L reaction system including the following additives.
  • (3) Result When the turbidity of the insoluble substance in the fecal suspension was up to 1 Abs / ⁇ L, detection of up to 10 copies of both norovirus G1 and G2 was confirmed. Further, at 3 Abs / ⁇ L, detection of up to 10 copies was confirmed only in G1, and detection of up to 50 copies was confirmed in G2. At turbidity of 5 Abs / ⁇ L or higher, a significant decrease in fluorescence intensity was confirmed, and neither G1 nor G2 could be detected.
  • Test example 5 1-step RT-PCR using thermostable DNA polymerase mutant (1-1) Preparation of norovirus solution As a sample of norovirus, norovirus samples Norovirus GI and GII Positive Control (ZeptoMetrix, intact) were used. Each sample of G1 type and G2 type norovirus was added corresponding to 250 copies per reaction. (1-2) Addition of fecal suspension The norovirus-negative fecal suspension prepared in Test Example 1 was added to the following reaction solution so that the turbidity OD660 of the RT-PCR reaction solution was 1.0 Abs / ⁇ L. (2) Reaction solution Using the reaction solution having the composition shown below as the basic composition, norovirus in the reaction solution was detected by 1-enzyme system 1-step RT-PCR.
  • thermostable polymerase belonging to Family A was changed under each condition.
  • Reaction solution RTaq DNA Polymerase 10xBuffer (Toyobo) attachment
  • 10x primer solution Norovirus detection kit G1 / G2-high-speed probe detection- (Toyobo) attachment
  • 10x probe solution Norovirus detection kit G1 / G2-high-speed probe detection- (Toyobo) attachment
  • 0.2 mM sNTPs Mixture Toyobo) 2 mM Mn (OAc) 2 (Toyobo) 4.2 ng / ⁇ l
  • Each thermostable DNA polymerase mutant 0.01 ⁇ g / ⁇ l
  • Each anti-thermostatic DNA polymerase antibody 3 mg / ml BSA 5 mg / ml fish gelatin
  • Each of the above reagents was mixed to prepare an RT-PCR reaction solution so that the final volume was 49 ⁇ L.
  • the stool suspension was added to the RT-PCR reaction solution in an amount of 1 ⁇ L so that the final concentration was as follows, and RT-PCR was carried out as a 50 ⁇ L reaction system. This was subjected to a real-time PCR reaction using CFX96WELL DEEP manufactured by BioRad in the following temperature cycle. The fluorescence value was read in an extension step of 50 cycles at 52 ° C.
  • thermostable polymerases and variants thereof shown below were used in the reactions at the concentrations listed below.
  • the notation for mutants follows the one-letter abbreviation notation for amino acids.
  • the numbers are included in the name of the enzyme, and the amino acid before the change is shown on the left and the amino acid after the change is shown on the right.
  • Tth mutant (E628K) means that E (glutamic acid) at position 628 of Tth DNA polymerase (SEQ ID NO: 10) is mutated to K (lysine).
  • Enzyme used ⁇ Enzyme 1: Tth DNA polymerase (wild type) (Toyobo) -Enzyme 2: Tth mutant (E628K) -Enzyme 3: Tth mutant (Q509R) Enzyme 4: Tth mutant (D549G) ⁇ Enzyme 5: Taq DNA polymerase (wild type) (Toyobo) Enzyme 6: Taq mutant (E507R) (4) Result In TthDNA polymerase and its mutants, which belong to Family A and correspond to heat-resistant DNA polymerase having reverse transcription activity, detection of both G1 and G2 norovirus was confirmed even under the condition that the concentration of the insoluble substance was 1 Abs / ⁇ L. ..
  • RT-PCR was performed using 50 ⁇ L. Turbidity measurements were performed on the remaining 50 ⁇ L. This was subjected to a real-time PCR reaction using CFX96WELL DEEP manufactured by BioRad in the following temperature cycle. The fluorescence value was read in an extension step of 50 cycles at 52 ° C.
  • the present invention is suitably used in molecular biology research, and in tests for the purpose of clinical tests, food hygiene control, and the like.

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Abstract

遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料から、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ法でＲＮＡウイルスの存在を検査する手段を提供することを目的とする。一つの実施形態において、本発明は、以下の工程：（１）事前の遠心分離操作をおこなわず不溶性物質を含む試料と、分子量５～５００ｋＤａのポリペプチド及び逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程、並びに、（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程、を含むことを特徴とする、試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法を提供する。本発明は更に、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を用いることを特徴とする。

Description

改良されたウイルス検出方法

　本発明は、核酸増幅によるＲＮＡウイルスの検出法に関する。より具体的には、事前の遠心分離操作を実施せず不溶性物質を含む試料と、一酵素系のリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）の反応液とを混合することによるＲＮＡウイルスの検出に関する。本発明の方法は、例えば、糞便試料、血液試料、環境拭き取り試料等におけるＲＮＡウイルスを検出することが可能である。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。

　核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。

　ＲＮＡを分析する場合、このＰＣＲの前段として、鋳型ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を実施する。これをＲＴ－ＰＣＲという。このＲＴ－ＰＣＲは、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ－ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを、単一酵素を利用して連続して実施する一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ、（３）逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの２種類の酵素を利用して、ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲの３つに大別される。

　ＲＴ－ＰＣＲのうち、遺伝子検査やウイルス検査では、処理能力の高さや、反応途中での反応容器の開閉によるコンタミネーションを回避するため、１ステップＲＴ－ＰＣＲが好まれる。二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲでは、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの少なくとも２種類の酵素が使用される。一方で、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲでは、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが利用される。しかし、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性は一般に、レトロウイルス由来の逆転写酵素の逆転写効率には劣ることから、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲの方が、一酵素系ＲＴ－ＰＣＲに比べて感度が高いとされている（非特許文献１）。従って、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲは、二酵素系ＲＴ－ＰＣＲに比べて高感度化が難しいと考えられてきた。

　ウイルス検査の代表例として、病原性ＲＮＡウイルスの一つであるノロウイルスが挙げられる。ノロウイルスは、急性胃腸炎の原因となる１本鎖ＲＮＡウイルスである。感染力が強く、集団食中毒や集団感染を引き起こすことから、公衆衛生上関心の高いウイルスである。ノロウイルスはＧｅｎｏｇｒｏｕｐI（ＧI）及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐII（ＧII）の２つの遺伝子群に分類される。ノロウイルスの病原体検査では、組織培養法が確立できておらず、電子顕微鏡法、ＥＬＩＳＡによる免疫学的抗原検出法、または核酸増幅技術を利用したウイルス遺伝子の検出法が開発されてきた。このうち、日本においては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に基づくＲＴ－ＰＣＲ法が公定法として普及している。

　ノロウイルスの感染の原因として主にノロウイルスに汚染された食品を飲食することによるが、ヒトの手を介した感染が多いため、調理施設、医療現場、老人介護施設及び保育園などでは定期的な検便検査が求められている。大量調理施設衛生管理マニュアルには、調理従事者等の検便検査に、月に１回以上又は必要に応じノロウイルスの流行期である１０月から３月についてノロウイルスの検査を含めることが追加されている。これはウイルスに感染していても症状がでない人（健康保因者）が少なからず存在し、これらの人たちが知らず知らずのうちに感染を広げる可能性があるためである。さらに、下痢や嘔吐などの症状がある調理従事者は医療機関を受診し、ノロウイルスに感染していることが判明した場合はリアルタイムＰＣＲ等の高感度検査を実施し、ノロウイルスを保有していないことが確認されるまでは食品に直接触れる調理作業を控えるなどの適切な処置をとることが望まれている。

　ノロウイルスは、ウイルスＲＮＡゲノムが約３０ｎｍのキャプシドタンパク質からなる正二十面体の内部に封入された、キャプシド構造を有する。キャプシド構造は、ウイルスが消化管などの過酷な環境でも生存できるように、胃酸による不活性化や胆汁酸の界面活性作用等に耐性を持つ。通常の界面活性剤や７０％エタノールに代表されるウイルス不活化剤では、このキャプシド構造を破壊できず、ウイルスの感染能が維持される。キャプシド構造を破壊するには、少なくとも８５℃以上、１分以上の過酷な条件での熱処理が必要とされている（非特許文献２）。

　従来、糞便試料からのノロウイルスの検出は、例えば糞便の１０％懸濁液を作製し、遠心上清から市販のウイルスＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出・精製し、このＲＮＡ抽出液を用いてノロウイルスの検出が行われてきた（食安監１１０５００１号）。しかし、短時間で多数の検体を検査するには、このＲＮＡ抽出作業は煩雑である。

　そこで、近年、糞便試料中のノロウイルスのキャプシドを、加熱処理を含む前処理によって破壊し、ウイルスＲＮＡを露出させた処理液をＲＴ－ＰＣＲに供することでウイルスの有無を検出する手法が知られる（特許文献１）。この手法では、試料に前処理液を添加後、熱処理を加えることで、糞便試料や拭き取り検査の濃縮試料から事前にＲＮＡの単離を実施せずにウイルスキャプシドを破壊し、ウイルスＲＮＡの有無を検出できる。さらにウイルスＲＮＡの検出までの作業を簡略化するため、加熱処理をおこなわず、糞便試料を前処理液に添加するだけでウイルスＲＮＡを露出させ、処理液をＲＴ－ＰＣＲに供することでさらに効率よくウイルスの有無を検出する手法が知られる（非特許文献３）。

　この際、ＲＮＡの抽出を省略することで、糞便試料中に含まれる、多糖類などのＰＣＲ反応阻害物質が持ち込まれる。これらの影響を低減するような工夫がＰＣＲ反応液になされている。便試料にスパイクされたＤＮＡを検出する際のＰＣＲ阻害は、マグネシウム存在下で夾雑耐性を持つｒＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼの使用によって、改善されることが報告されている（非特許文献４）。特許文献１に記載の方法では、前記ｒＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼを使用して、夾雑耐性を強化した二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ系を利用している。

　しかしながら、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲに用いられるレトロウイルス由来の逆転写酵素は、好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼに比べ、耐熱性の面で大幅に劣るとも言われている(非特許文献５)。このため、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲでは、逆転写酵素を含む反応液に対して、ウイルス破砕のための熱処理を高温で実施することができない。従って、未処理の試料を直接ＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加し、熱処理によってウイルスのキャプシド構造を破壊してＲＮＡを検出することができない。

　特許文献１、非特許文献３に記載の方法では、逆転写酵素の失活を避けるために、前処理を施した試料に対して、ＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する。この手法では、試料に前処理液を加えて熱処理を実施する作業と、その後のＲＴ－ＰＣＲ反応液を新たに添加する作業の２ステップを要することとなり、ウイルスキャプシドを破壊する前処理ステップに多少の手間と労力を要する。また、これらの文献において具体的に行われた方法では、ＲＴ－ＰＣＲに供する試料として、糞便試料を例えば１０％懸濁液として調製した後、あらかじめ遠心分離し、回収した上清を使用している。このような糞便試料の懸濁液の調製および遠心分離の作業は、特に多検体を測定する現場において、手間と労力を要している。

　とりわけ糞便検体は不溶性の固形物を多量に含んでいるため、遠心分離を実施していない１０％糞便懸濁液や、そのままの糞便試料をＲＴ－ＰＣＲ反応液へ直接添加すると、反応液中に不溶性物質が多量に持ち込まれ、反応液が高濁度になる。そしてリアルタイムＰＣＲ機による測定の際、このような不溶性物質を多量に含む高濁度のＲＴ－ＰＣＲ反応液を用いると、反応液中の不溶性物質による光の散乱または吸収や、自家蛍光の影響等が起こり、ＲＴ－ＰＣＲの結果によって得られる蛍光波長の強度の大幅な低下を招き、著しい感度低下を引き起こす。

　そこで、事前の遠心分離処理が行われておらず、夾雑物質等の不溶性物質を含む試料（いわゆるクルードサンプル）を、直接ＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加してＲＴ－ＰＣＲを行う場合の不溶性物質の影響を抑制し、迅速で簡便なウイルスＲＮＡの検出法が求められている。

特開２０１８－０００１３８号公報

ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２５巻，１９９８年、第２３０－２３４頁 食品衛生学雑誌、第４６巻、２００５年、第２３５－２４５頁 食品微生物学会誌、第３５ 巻、２０１８年、第１９３－１９８頁 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第３８巻、２０００年、第４４６３－４４７０頁 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第３７巻、２００９年、第４７３－４８１頁

試験例４において、糞便試料由来の不溶性物質を含む各濁度（Ａｂｓ／μＬ）のＲＴ－ＰＣＲ反応液におけるノロウイルスの検出結果を示す図である。 試験例６において、糞便試料を直接添加した条件でのノロウイルス検出結果を示す図である。

　本発明の目的は、事前に試料の遠心分離操作を行うことなく、不溶性物質を含む試料を使用する場合であっても、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにより、十分な感度でウイルスＲＮＡの有無の検出を可能とすることである。

　本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、事前の遠心分離操作による不溶性物質の除去を行なわず不溶性物質を含む試料を一酵素系の１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液と混合後、直接１ステップＲＴ－ＰＣＲを行う際に、特定のポリペプチドを共存させること及び／又は特定の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることで、高感度にウイルスＲＮＡの検出が可能であることを見出した。従来、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に不溶性物質が多量に混在して濁度の高い反応液となると、反応液中に含まれる不溶性物質が光の散乱や吸収、自家蛍光による影響等を与え、リアルタイムＰＣＲ機での測定時に検出できる蛍光強度が大幅に低下し、著しい感度低下を引き起こすとされてきた。しかしながら、全く予想外のことに、ＲＴ－ＰＣＲ反応液に特定のポリペプチドを添加する及び／又は特定の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いると、十分に検出可能な強い蛍光強度が得られ、検出感度の低下を克服できることを見出した。その結果、不溶性物質を含みうる糞便試料をＲＴ－ＰＣＲ反応液へ添加し、反応容器を密閉後、ＲＴ－ＰＣＲのための温度サイクルで反応を行うだけで、ウイルスＲＮＡを直接検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

　代表的な本願発明は、以下の通りである。

　［項１］　以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法：

（１）事前の遠心分離操作をおこなわず不溶性物質を含む試料と、分子量５～５００ｋＤａのポリペプチド及び逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程、並びに、

（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。

　［項２］　前記混合液中における不溶性物質の濁度がＯＤ６６０にて０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である項１に記載の方法。

　［項３］　前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる分子量５～５００ｋＤａのポリペプチドが、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及びセリシンよりなる群から選択される少なくとも１つを含む、項１又は２に記載の方法。

　［項４］　前記混合液が、該混合液中終濃度で前記分子量５～５００ｋＤａのポリペプチドとして、０．５ｍｇ／ｍＬ以上のウシ血清アルブミン、５ｍｇ／ｍＬ以上のゼラチン、５ｍｇ／ｍＬ以上のＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及び５ｍｇ／ｍＬ以上のセリシンよりなる群から選択される少なくとも１つを含む、項１から３いずれかに記載の方法。

　［項５］　前記工程（１）において使用する不溶性物質を含む試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、項１から４のいずれかに記載の方法。

　［項６］　前記工程（１）及び（２）が同一容器で行われることを特徴とする項１から５のいずれかに記載の方法。

　［項７］　前記工程（２）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする項１から６のいずれかに記載の方法。

　［項８］　前記工程（２）において、サイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させるため及び／又は核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させるために熱処理を実施することを含む項１から７のいずれかに記載の方法。

　［項９］　前記試料が血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料である項１から８のいずれかに記載の方法。

　［項１０］　前記試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である項１から９のいずれかに記載の方法。

　［項１１］　前記不溶性物質が、血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料に由来する項１から１０のいずれかに記載の方法。

　［項１２］　前記ウイルスがエンベロープをもたないＲＮＡウイルスである項１から１１のいずれかに記載の方法。

　［項１３］　エンベロープをもたないＲＮＡウイルスがレオウイルス科ウイルスまたはカリシウイルス科ウイルスである項１から１２のいずれかに記載の方法。

　［項１４］　レオウイルス科ウイルスがロタウイルスである項１３に記載の方法。

　［項１５］　カリシウイルス科ウイルスがノロウイルスである項１３に記載の方法。

　［項１６］　ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする項１５に記載の方法。

　［項１７］　前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項１から１６のいずれかに記載の方法。



　［項１８］　前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする項１から１７のいずれかに記載の方法。

　［項１９］　前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項１から１８のいずれかに記載の方法。

　［項２０］　以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法：

（１）事前の遠心分離操作をおこなわず不溶性物質を含む試料と、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程、及び、

（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。

　［項２１］　前記ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項２０に記載の方法。

　［項２２］　前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項２１に記載の方法。

　［項２３］　前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項２１又は２２に記載の方法。

　［項２４］　分子量５～５００ｋＤａであるポリペプチド及び逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料から一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でＲＮＡウイルスの検査を行うための組成物。

　［項２５］　前記組成物と前記試料との混合液における不溶性物質の濁度がＯＤ６６０にて０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である項２４に記載の組成物。

　［項２６］　前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる分子量５～５００ｋＤａのポリペプチドが、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及びセリシンよりなる群から選択される少なくとも１つを含む、項２４又は２５に記載の組成物。

　［項２７］　前記組成物と前記試料との混合液が、該混合液中終濃度で前記分子量５～５００ｋＤａのポリペプチドとして、０．５ｍｇ／ｍＬ以上のウシ血清アルブミン、５ｍｇ／ｍＬ以上のゼラチン、５ｍｇ／ｍＬ以上のＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及び５ｍｇ／ｍＬ以上のセリシンよりなる群から選択される少なくとも１つを含むように調整して配合されている、項２４から２６のいずれかに記載の組成物。

　［項２８］　前記不溶性物質を含む試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、項２４から２７のいずれかに記載の組成物。

　［項２９］　前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項２４から２８のいずれかに記載の組成物。

　［項３０］　前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする項２４から２９のいずれかに記載の組成物。

　［項３１］　前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項２４から３０のいずれかに記載の組成物。

　［項３２］　ウイルスがエンベロープをもたないＲＮＡウイルスである項２４から３１のいずれかに記載の組成物。

　［項３３］　エンベロープをもたないＲＮＡウイルスがレオウイルス科ウイルスまたはカリシウイルス科ウイルスである項３２のいずれかに記載の組成物。

　［項３４］　レオウイルス科ウイルスがロタウイルスである項３３に記載の組成物。

　［項３５］　カリシウイルス科ウイルスがノロウイルスである項３３に記載の組成物。

　［項３６］　ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする項２４から３５のいずれかに記載の組成物。

　［項３７］　ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料から一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でＲＮＡウイルスの検査を行うための組成物。

　［項３８］　前記ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項３７に記載の組成物。

　［項３９］　前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項３８に記載の組成物。

　［項４０］　前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項３８又は３９に記載の組成物。

　［項４１］　項２４から４０のいずれかに記載の組成物を含む、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料においてＲＮＡウイルスの存在を検査するためのキット。

　本発明によって、遠心分離作業により試料中の不溶性物質を除去することを必要とせず、当該試料を１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加後、そのまま１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でウイルスＲＮＡを検出することが可能となる。更に本発明の一つの実施形態では、熱処理ステップを内包したＲＴ－ＰＣＲも可能である。従って、本発明は特定の実施態様において、不溶性物質を含む試料中のウイルス、中でもウイルスの破砕が難しい非エンベロープウイルスの有無を検出するのにも有用である。さらに、遠心分離による不溶性物質の除去工程を含む前処理工程の省略化により、検査業務がさらに効率化することから、ウイルス感染しても症状のない被験者の検査量を増やすことができ、感染症予防にも大きく寄与し得る。また、前処理工程の省略化により反応容器の蓋の開閉作業も省略が可能となる。この結果、試他のサンプルへのコンタミネーションリスクも低減することができる。これにより、偽陽性発生リスクも抑えることができ、検査業務の精度を更に高めることができる。

　以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されない。

　本発明の一実施態様は、試料中のノロウイルスなどのＲＮＡウイルスの検査であって、試料を予め遠心分離して不溶性物質を除去することなく、特定のポリペプチド及び逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬又は特定の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬と、不溶性物質を含む試料とを混合してＲＴ－ＰＣＲ反応させることからなるＲＮＡウイルスの存在の有無を検査するための方法である。ここで、ＲＮＡウイルスは、非エンベロープＲＮＡウイルスであってもよく、更に、硬いキャプシド構造にＲＮＡが保持されているＲＮＡウイルスであってもよい。

　一つの実施形態において、本発明の試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法は、少なくとも以下の工程が含まれることを特徴とする方法である。

（１）事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料と、分子量５～５００ｋＤａのポリペプチド及び逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程；

　（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。

　更なる実施形態において、本発明の試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法は、少なくとも以下の工程が含まれることを特徴とする方法である。

（１）事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料と、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程；

（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。

　これらの実施形態において、前記工程（１）における混合液を調製する工程は、例えば、事前の遠心分離操作により不溶性物質を除去していない試料に、分子量５～５００ｋＤａのポリペプチド及び逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液又はファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加することによって行うことができる。前記工程（１）および（２）は、同一容器で行われることが好ましい。すなわち、工程（１）および（２）の間においては、混合液の全部または一部を別容器へ移し替えないことが好ましい。更には、工程（２）においては、反応容器を密閉後、反応容器の蓋の開閉を行わないことが好ましい。また、前記工程（１）で使用する不溶性物質を含む試料は、事前に水または緩衝液等にて懸濁した懸濁液であってもよく、糞便試料等の試料を１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に直接添加してもよい。

　本発明における検査対象はＲＮＡウイルスであり、特に限定されるものではない。なかでも、脂質二重膜に由来するエンベロープを持たない、非エンベロープ性のＲＮＡウイルスである。このような非エンベロープＲＮＡウイルスとしては、アストロウイルス科ウイルス（例えば、アストロウイルス）；カリシウイルス科ウイルス（例えば、サポウイルス、ノロウイルス）；ピコルナウイルス科ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス）；へぺウイルス科ウイルス（例えば、Ｅ型肝炎ウイルス）；レオウイルス科ウイルス（例えば、ロタウイルス）などが挙げられ、限定されるものではないが、好ましくはカリシウイルス科ウイルス及びレオウイルス科ウイルスの検出に有用であり、より好ましくはノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルスの検出に有用であり、更に好ましくはノロウイルス、ロタウイルスの検出に有用であり、特にノロウイルスの検出に有用である。非エンベロープウイルスの多くが糞口感染などによって消化管に感染可能で、胃酸による不活性化や胆汁酸の界面活性作用等に耐性のある、堅いキャプシド構造にＲＮＡが保持されている。

　ノロウイルスは、大きく、ＧＩ型ノロウイルス及びＧＩＩ型ノロウイルスの遺伝子型で分類されることが知られている。そして、ＧＩ型ノロウイルスとＧＩＩ型ノロウイルスを判別することが、感染経路の推定などの疫学的データを収集する観点から望まれている。本発明のＲＮＡウイルス検査法では、ノロウイルスの存在の有無を確認できるだけでなく、感染しているノロウイルスがＧＩ型であるかＧＩＩ型であるかの判別（鑑別）も可能であるという点で非常に有益である。

　本発明において用いられる試料として、例えば糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液などが挙げられるが、限定されるものではなく、生体に由来するもの全般に用いることが可能であり、特に糞便（排泄便、直腸便）からの検出に有用である。本発明においては、これら試料を遠心分離工程に供して不溶性物質の除去を行う必要がないことを一つの特徴とするものである。前記試料は直接検出に供してもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であってもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。

　特定の好ましい実施形態では、本発明において用いられる試料は、事前の遠心分離工程のみならず、例えば事前に市販のＲＮＡ精製キット等を用いて試料からＲＮＡを単離する操作及び／又は事前に加熱処理してＲＮＡをウイルス構造から露出させる操作を実施していない試料であってもよい。本発明の方法では、このような事前のＲＮＡ単離も加熱処理も省いた試料であっても、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応のサイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に熱処理を内包させて、ウイルス構造からＲＮＡを露出させ、ＲＴ－ＰＣＲ反応に供することができる。このようにして事前の核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料を用いることで、より一層簡便に短時間でウイルスＲＮＡの検査が行えるだけでなく、試料のロスやキャリーオーバーによる他のサンプルへの汚染の危険性を低減することができる。特に糞便を試料とする多数の検体を処理するような検査において、その効果は顕著となる。

　本発明における別の態様の試料としては、拭き取り検査試料である。汚染経路の解明や施設環境等の汚染状況の把握には、ふき取り検査が有用である。本発明において、拭き取り検査とは、特に限定されるものでないが、例えば綿棒等で該当区画や設備等を拭き取り、水や緩衝液に溶出し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱などで濃縮した試料である。具体的な拭き取り検査の要領としては、「ふきとり検体のノロウイルス検査法の改良」（ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｉａｓｒ／３２／３８２／ｄｊ３８２４．ｈｔｍｌ）などが例示されるが、特に限定はされるものではなく、これに準ずる方法が広く含まれる。拭き取り箇所の例としては、まな板や包丁、ふきん、食器などの調理器具類、冷蔵庫の取手やトイレ、浴室のドアノブ、洗面所、厨房、トイレ、浴室などの蛇口、調理者の手や指、浴室、トイレ、洗面、手すり、居室などの施設などが挙げられる。また、拭き取り検査ではないが、環境検査として、下水試料の濃縮試料にも適用できる。これらの検査試料は、検査場所の汚れやほこりを多量含むことから、不溶性物質を含みうる試料において夾雑耐性を強化した本手法は、これらの検査に対して有益である。

　前記工程（１）においてＲＴ－ＰＣＲに供される試料が含みうる不溶性物質は、糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液、血液、拭き取り検査試料に由来するものが挙げられるが、限定されるものではない。例えば、生体に由来するもの（生体からの分泌物や排泄物等を含む）や、環境検査試料に由来するものなど、ＲＴ－ＰＣＲ反応の測定時の蛍光強度に影響し得る任意の不溶性物質であり得る。特に糞便（排泄便、直腸便）に含まれる不溶性物質を含む試料からの検出に有用である。本発明の方法により測定可能な不溶性物質の濁度は、検査試料や所望される効果の程度等によっても異なるが、例えば、濁度ＯＤ６６０において、ＲＴ－ＰＣＲ反応液が０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である場合等を挙げることができる。当然のことながら濁度が高くなるにつれて、検査感度が影響を受ける可能性が高まるが、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中における不溶性物質による濁度がＯＤ６６０にて０．１Ａｂｓ／μＬ以上、更には、０．５Ａｂｓ／μＬ以上、更には０．８Ａｂｓ／μＬ以上、更には１．０Ａｂｓ／μＬ以上、更には２．０Ａｂｓ／μＬ以上、例えば３Ａｂｓ／μＬ以上であっても、本発明によれば高感度な検出が可能であり好適である。ＲＴ－ＰＣＲ反応液中における不溶性物質による濁度の上限値は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、一例として、５．０Ａｂｓ／μＬ以下、好ましくは４．０Ａｂｓ／μＬ以下、例えば３Ａｂｓ／μＬ以下とすることができる。

　水または緩衝液にて懸濁した試料の遠心分離操作の際には、遠心分離機等の装置を必要とし、反応容器の開閉作業も伴うことから、作業の煩雑化かつ作業時間を延ばす原因となる。作業現場での作業を簡略化し、迅速に検査を実施することで、さらなる感染拡大を未然に防ぐことにつながる。これに加えて、ウイルス含有検体の入った反応容器の開閉には、ウイルス及びウイルス由来ＲＮＡの飛散リスクが生じる。ウイルスの飛散は作業者の安全及び健康を脅かすものであると同時に、検査作業環境の汚染を意味する。飛散したＲＮＡウイルスは作業場においてエアロゾル化するため、同時に検査している他のサンプルの汚染リスクが問題となっている。このため、蓋の開閉工程のないＲＴ－ＰＣＲを用いたウイルスの存在の有無を検査方法は、作業の単純化以上の意義を持っている。

　一つの実施形態において、本発明の試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法は、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応において、分子量５～５００ｋＤａのポリペプチドを共存させることを一つの特徴とする。このように比較的高分子のポリペプチドを共存させることによって、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に多量の不溶性物質が存在する濁度が高い反応液中であっても、高感度にウイルスＲＮＡを検出することが可能となる。

　本発明に用いられる前記ポリペプチドは、分子量が５～５００ｋＤａである限り、特に限定されないが、好ましくは、６～４００ｋＤａである。本明細書において、分子量を示すときは、他の意味であることが明らかでない限り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて決定した値をいう。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの分子量の測定は、当該分野で一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカー等を用いて行うことができる。例えば、「分子量５０ｋＤａ」とは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常５０ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲にあることをいう。また、本発明に用いられるポリペプチドは、上記分子量の範囲内のポリペプチドの混合物であってもよい。

　一つの実施形態において、本発明に用いられる前記ポリペプチドは、本発明の効果を奏する限り特に限定されず、複数のアミノ酸がペプチド結合で連なって形成されたタンパク質をいう。また、本発明に用いられるポリペプチドは、アミノ酸が連結されたポリペプチド構造を有する限り、例えば、熱変性等により三次元構造が解かれたような熱変性ポリペプチド（例えば、ゼラチン）等であってもよい。具体的には、本発明に使用され得るポリペプチドとして、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン、ラクトアルブミン、ヒト血清アルブミン、卵由来アルブミン）、ゼラチン（例えば、魚ゼラチン、豚ゼラチン）、セリシン、カゼイン、フィブロイン等の天然由来タンパク質（天然由来ポリペプチド）；Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦともいう）、コラーゲン加水分解物、ポリペプトン、酵母エキス、ビーフエキストラクト等の合成・分解等により人為的に製造されたポリペプチド等を用いることができる。より一層優れた本発明の効果が奏されるという観点から、好ましくは、本発明に用いられるポリペプチドは、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及び／又はセリシンである。少量でも高い効果が発揮され得るという観点から、より好ましくは、ウシ血清アルブミン、ゼラチン（なかでも魚ゼラチン）を用いるのが好適である。これらのポリペプチドは、１種類だけ使用してもよいし、２種類以上を組合わせて使用してもよい。また、これらのポリペプチドは、天然からの抽出や合成等の手段により調製してもよく、また市販品も好適に使用することができる。

　本発明において、前記ポリペプチドの使用量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、前記不溶性物質を含む試料と一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液中において、終濃度０．０００１～２００ｍｇ／ｍＬとなるような量、好ましくは０．０１～１５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１～１３０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０．５～１００ｍｇ／ｍＬで使用することができる。より優れた効果を発揮させるために好ましい量は、使用するポリペプチドの種類や所望される効果の程度等によって変動し得るが、例えば、以下のような使用量を例示することができる：

　・ウシ血清アルブミンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは３ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。

　・ゼラチンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは７．５ｍｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下、又は３０ｍｇ／ｍｌ以下とすることができる。

　・セリシンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。

　・ＢＰＦを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。

　前記工程（２）におけるＲＴ－ＰＣＲサイクルは、１．熱処理、２．逆転写反応、３．ＰＣＲの３ステップから成る。各ステップの前後に、ホットスタート酵素を活性化させるための熱処理工程を含んでもよい。１の熱処理工程では、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させる、及び／もしくは核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させる工程を含む。これらの熱処理工程を含むことにより、ウイルスのキャプシド構造からＲＮＡを露出（溶出）させることが可能となる。前記熱処理工程の温度及び時間は、６０℃以上であり、かつ１秒以上であればよく、好ましくは７０℃、３０秒以上、より好ましくは８０℃、３０秒以上、特に好ましくは８５℃、３０秒以上である。２の逆転写反応の温度は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性と、プライマー及びプローブのＴｍ値によって決定され、少なくとも２５℃以上であればよい。より好ましくは３７℃以上である。３のＰＣＲでは、［１］熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、［２］鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、［３］ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、の３ステップを含んでいればよく、［２］と［３］を同一の温度で実施して、２ステップとしてもよい。迅速なＲＴ－ＰＣＲを実施するためには、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応に使用するサーマルサイクラーは、前記［２］と［３］のステップの伸長時間を合わせて１５秒以下、より好ましくは１０秒以下の測定プログラムを設定することが望ましい。なお、本明細書において「ＰＣＲの伸長時間」とは、サーマルサイクラーでの設定温度を指す。

　前記混合液に添加される１ステップＲＴ－ＰＣＲ溶液は、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする。逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとは、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する能力とＤＮＡを増幅する能力を兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼである。また、耐熱性とは、７０℃で１分以上の熱処理を実施しても、酵素活性が半分以上低下しないことをいう。由来は特に限定されるものではないが、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，Ｂｃａ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられる。これまでに逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）やＴｈｅｒｍｕｓ　ｓｐ　Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）などが挙げられ、これらの逆転写活性と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性が失われていない変異体であってもよい。また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ）の変異体であって、逆転写活性を有するものが知られており（例えば、ＲＴＸ：ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｘｅｎｏｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、本発明にはこのような逆転写酵素活性を併せ持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであれば、限定されるものではない。特に好ましくは、Ｆａｍｉｌｙ　Ａに属するＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｚ０５及びこれらの変異体からなる群より選択される逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。なかでも好ましくは、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つである。

　特定の実施形態において、本発明の試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法は、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応において、ＤＮＡポリメラーゼとして、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることを一つの特徴とする。このように特定の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることによって、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に多量の不溶性物質が存在する濁度が高い反応液中であっても、高感度にウイルスＲＮＡを検出することが可能となる。ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼとしては、従来、好熱細菌に由来するファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌＩ型とも呼ばれる）、超好熱古細菌に由来するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ（α型とも呼ばれる）などが知られている。このうちファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼは、一般に、ＰＣＲ阻害物質に影響を受けやすく、未精製サンプルからの増幅は困難であるとされてきた。しかしながら、本発明では、このような阻害物質の影響を受けやすいファミリーＡに属し、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行うことにより、遠心分離操作を行わず不溶性物質等の夾雑物を多量に含む試料においても高感度にＲＮＡウイルスの検出ができるという予想外の結果に基づく。

　具体的に、本発明に用いられ得るファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ポリメラーゼとしては、特に限定はされないが、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｓｐ．　Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）などが挙げられ、これらの逆転写活性と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性が失われていない変異体であってもよい。好ましくは、Ｔｔｈ、Ｚ０５及びこれらの変異体からなる群より選択される逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。なかでも好ましくは、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであり、これらを用いることによって、不溶性物質を多量に含む試料を用いる場合であっても、より一層高感度なＲＮＡウイルスの検出が可能となる。このような本発明に特に好適に用いられ得るＴｔｈポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１０）と、Ｈａｗｋ　Ｚ０５ポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１１）を配列表に示す。本発明には、これらのアミノ酸配列に基づき、効果を失わない範囲で一部のアミノ酸を改変した変異型ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼ変異体）も好適に使用することができる。

　本明細書において、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの変異体とは、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、なかでも好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性を有するものをいう。ここで、アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、当該分野で公知の任意の手段で行うことができる。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。また、本発明に用いられ得る変異体は、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」ともいう）したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性を有するものであってもよい。ここで１又は数個とは、例えば、１～８０個、好ましくは１～４０個、よりこのましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個であり得るが、特に限定されない。

　特定の実施形態において、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量は、本発明の効果を奏する限りにおいて特に限定されないが、一例として、少なくとも４．２ｎｇ／μＬ以上あればよく、５．０ｎｇ／μＬ以上であることが好ましく、５．８ｎｇ／μＬ以上であることがより好ましい。なかでも好ましくは、８．３ｎｇ／μＬ以上である。一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量の上限は特に限定されないが、一例として、２０ｎｇ／μＬ以下とすることができ、１６．７ｎｇ／μＬ以下であっても十分に本発明の効果を得ることができる。ポリメラーゼの量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法もしくはＮａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャー社）により定量した値であり、安全データシート（ＳＤＳ）から概算してもよい。ＢＳＡなどのタンパク質を含む場合は、後者の方法で算出することが望ましい。

　本発明に用いられる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する前に、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲへの適用ができることが好ましい。

　本発明に用いられる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの他、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、検出対象のウイルスＲＮＡの検出対象領域に対応するプライマー対、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。

　本発明で使用される緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６～９、より好ましくはｐＨ７～９に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、１０～２００ｍＭ，より好ましくは２０～１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが挙げられる。

　本発明で使用されるｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１～０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ程度加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションに対する予防処置をとってもよい。クロスコンタミネーションに対する予防処置を講じる場合、Ｕｒａｃｉｌ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）を含むことが好ましい。

　更に、本発明では、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＴ反応液に、２価陽イオンを含むことが好ましい。このように２価陽イオンを含むことで、より安定して高い夾雑耐性が得られ高感度な検出が可能となる。２価陽イオンとしては、特に限定されないが、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、銅イオン、鉄イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン等を挙げることができる。好ましくは、２価陽イオンとして、マグネシウムイオン、マンガンイオンを含むことが好ましい。本発明において、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液にマグネシウムイオンやマンガンイオン等を添加する場合は、マグネシウムやマンガンを添加してもよいし、これらの塩を添加してもよい。マグネシウム又はその塩としては、マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等が例示され、マンガン又はその塩としては、マンガン、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示される。このようなマグネシウム、マンガン、又はこれらの塩は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に１～１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。本発明のＲＮＡウイルス検査方法において安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マンガン又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において１ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、１．５ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、２．０ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことがより好ましい。

　さらに１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる添加剤として、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン等）、セリシン、ＢＰＦ、グリセロール、グリコール、ゼラチン（例えば、魚ゼラチン、豚ゼラチン等）及び界面活性剤よりなる群から選択された少なくとも１つを含んでいてもよい。なかでも、アルブミン及び／又はゼラチンを含有することが好ましく、アルブミン及びゼラチンを両方を含有することが好ましく、とりわけ、ウシ血清アルブミンと、魚ゼラチン及び／又は豚ゼラチンとを含有することが好ましい。これらは例えば、常法に従いＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した場合に、分子量が約１～１０００ｋＤａ（一例として、約５～５００ｋＤａ）のアルブミンやゼラチンであり得るが、特に限定されない。

　前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる界面活性剤としては、トリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、トリトンＸ－１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊｉ３５、Ｂｒｉｊｉ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｅｍｕｌｇｅｎ４２０などが挙げられるが、特に限定されない。ＲＴ－ＰＣＲ反応液中の前記界面活性剤の濃度も特に限定はされないが、好ましくは０．０００１％以上、より好ましくは０．００２％以上、さらに好ましくは０．００５％以上で、良好な検出が可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、０．１％以下とすることができる。

　前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるベタイン様４級アンモニウムとしては、ベタイン（トリメチルグリシン）、カルニチンなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。ベタイン構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、界面活性剤のような性質を示し、ウイルス構造の不安定化を引き起こすと考えられる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの核酸増幅を促進することが知られる。好ましい前記ベタイン様４級アンモニウム濃度は、０．１Ｍ～２Ｍ、より好ましくは０．２Ｍ～１．２Ｍである。

　さらには、当該技術分野でＲＴ－ＰＣＲを促進することが知られる物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用な促進物質とは、例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール-ビス(２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでいてもよい。

　本発明に用いられるプライマー対としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが挙げられる。また、別の態様として、上記プライマーが２対以上含まれる、いわゆるマルチプレックスＰＣＲも挙げられる。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。本発明でエンベロープを持たないＲＮＡウイルスの１種であるノロウイルスを検出する場合、プライマー対の例としては、ノロウイルス検出用のプライマーとしては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマー記載のプライマー（配列番号１～５）が挙げられるが、これに限るものではない。前記記載のプライマーでは、配列番号１、２によりノロウイルスＧ１型、配列番号３～５によりノロウイルスＧ２型を検出する。検出対象のプライマー濃度としては、特に限定はされないが、ＲＴ－ＰＣＲ反応液全体に対して、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上２μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．５μＭ以上２μＭ以下である。

　本発明は、別の態様としては、さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含む検出方法である。これによって、増幅産物の分析を通常の電気泳動ではなく、蛍光シグナルのモニタリングで監視することができ、解析労力が低減される。さらには、反応容器を開放する必要がなく、コンタミネーションのリスク低減が可能である。ウイルスのサブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、ウイルスのサブタイプを識別することも可能である。

　２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ，ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ－９、ＳＹＴＰ－１３、ＳＹＴＯ－８２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標；Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）　４８０　ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられる。

　本発明において用いられるハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられる。ノロウイルス検出用のプローブの塩基配列としては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載の配列（配列番号６～９）が挙げられるが、これに限るものではない。前記記載のプローブ配列では、配列番号６または７によりノロウイルスＧ１型、配列番号８または９によりノロウイルスＧ２型を検出する。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重配列を含んでもよい。蛍光標識プローブの濃度としては、０．０１μＭ以上１．０μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、０．０１３μＭ以上０．７５μＭ以下であり、更に好ましくは、０．０２μＭ以上０．５μＭ以下である。

　本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査用キットまたは組成物であって、分子量５～５００ｋＤａであるポリペプチド及び逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料から一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でＲＮＡウイルスの検査を行うための検査用キットまたは組成物である。

　この実施態様において使用される、分子量５～５００ｋＤａであるポリペプチドの種類や量、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの種類や量、プライマー又はプローブの種類や量、検査対象となるＲＮＡウイルス等は、前記のＲＮＡ検査方法において詳述したものと同様であり得る。本発明の検査用キットは、例えば、本発明の使用方法を説明する使用説明書等を含むことができる。例えば、本発明の検査用キットは、分子量５～５００ｋＤａのポリペプチドと、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法に関する情報を含む態様で提供することができる。

　本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査用キットまたは組成物であって、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料から一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でＲＮＡウイルスの検査を行うための検査用キットまたは組成物である。

　この実施態様において使用される、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの種類や量、プライマー又はプローブの種類や量、検査対象となるＲＮＡウイルス等は、前記のＲＮＡ検査方法において詳述したものと同様であり得る。本発明の検査用キットは、例えば、本発明の使用方法を説明する使用説明書等を含むことができる。例えば、本発明の検査用キットはファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、他の成分とを同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法に関する情報を含む態様で提供することができる。

　以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

試験例１．糞便懸濁液の調製

（１）試料の調製

　ノロウイルス陰性のヒト糞便検体を５０％（重量％）となるように滅菌水にて懸濁した。この懸濁液を水にて２００倍希釈した。

（２）濁度（ＯＤ６６０）の測定

　２００倍に希釈した糞便懸濁液のＯＤ６６０を測定した。測定結果に希釈倍率を掛け合わせ、調製した糞便懸濁液の濁度を決定した。

（３）結果

　調製した糞便懸濁液の濁度は４１．８Ａｂｓであることを確認した。糞便懸濁液を利用した以後の検討は、該糞便懸濁液を用いた。

試験例２．不溶性物質を含んだ試料における１ステップＲＴ－ＰＣＲ

（１－１）ノロウイルス液の調製

　ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり２５０、５０、１０コピー相当添加した。

（１－２）糞便懸濁液の添加

　試験例１にて調製したノロウイルス陰性の糞便懸濁液を、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度ＯＤ６６０が０、０．１、１．０Ａｂｓ/μＬになるように以下の反応液に添加した。

（２）反応液

　以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。

反応液

　（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プライマー液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プローブ液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)

２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２　（東洋紡）

４．２ｎｇ／μｌ　ｒＴｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）

０．０１μｇ／μｌ　抗Ｔｔｈ　抗体

　前記各試薬を混合して、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便懸濁液は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度が以下の条件になるように１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。

条件１　０Ａｂｓ/μＬ

条件２　０．１Ａｂｓ/μＬ

条件３　１　Ａｂｓ/μＬ

　これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ　ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。

　９０℃　１分（熱処理条件）

　５８℃　５分（逆転写条件）

　９５℃　１秒－５２℃　１０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）

　９５℃　１秒－５２℃　１０秒  ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）

（４）結果

　糞便懸濁液を添加した条件では、ノロウイルスの検検出感度が低下した。条件２では低コピーである１０コピーの検出が確認できなくなり、条件３では内部標準（ＩＣ）の検出も確認できなった。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

試験例３．１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける添加剤の検討１

（１－１）ノロウイルス液の調製

　ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり２５０、５０コピー相当添加した。

（１－２）糞便懸濁液の添加

　試験例１にて調製したノロウイルス陰性の糞便懸濁液を、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度ＯＤ６６０が１．０Ａｂｓ/μＬになるように以下の反応液に添加した。

（２）反応液

　以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。使用した反応液（ｒＴａｑＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡））の組成は１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ　ＫＣｌである。

反応液

　（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プライマー液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プローブ液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)

２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２　（東洋紡）

４．２ｎｇ／μｌ　ｒＴｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）

０．０１μｇ／μｌ　抗Ｔｔｈ　抗体

　前記各試薬を混合し、以下の添加剤を含めて最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便懸濁液は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、終濃度が以下の条件になるように１μＬずつ添加し、以下の添加剤を含めて５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。

（３）添加剤

　以下の添加剤を表２に記載の終濃度でＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加した。

・ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ）（分子量：約６０ｋＤａ、ナカライテスク）

・魚ゼラチン（分子量：約２０～２５ｋＤａ、メルク）

・Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）（分子量：約２２ｋＤａ、東洋紡）

・セリシン（分子量：約６５～４００ｋＤａ、メルク）

・豚ゼラチン（分子量：約５０～１００ｋＤａ、メルク）

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

　これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ　ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。

　９０℃　１分（熱処理条件）

　５８℃　５分（逆転写条件）

　９５℃　１秒－５２℃　１０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）

　９５℃　１秒－５２℃　１０秒  ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）

（４）結果

　添加剤無添加の条件１（ＮＴＣ）においては、糞便懸濁液の濁度が１．０Ａｂｓ/μＬの条件下ではＧ１よびＧ２のノロウイルスの検出が不可能であったのに対し、各添加剤の添加を実施することで、それぞれ検出感度の向上効果を確認した。ＢＰＦおよびセリシンが１０ｍｇ/ｍＬ以上にて低コピー検体（５０コピー/反応）の検出が可能になったのに対し、ＢＳＡでは１ｍｇ/ｍＬ以上にて効果が認められ、低濃度にて効果があることを確認した。また、豚ゼラチンが１５ｍｇ／ｍＬ以上にて同様の効果があるのに対し、魚ゼラチンでは５ｍｇ／ｍＬ以上で同様の効果を確認した。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

試験例４．１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける添加剤の検討２

（１－１）ノロウイルス液の調製

　ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり２５０、５０コピー相当添加した。

（１－２）糞便懸濁液の添加

　試験例１にて調製したノロウイルス陰性の糞便懸濁液を、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度ＯＤ６６０が１．０Ａｂｓ/μＬになるように以下の反応液に添加した。

（２）反応液

　以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。使用した反応液（ｒＴａｑＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡））の組成は１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ　ＫＣｌである。

反応液

　（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プライマー液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プローブ液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)

２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２　（東洋紡）　　　

４．２ｎｇ／μｌ　ｒＴｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）

０．０１μｇ／μｌ　抗Ｔｔｈ　抗体

　前記各試薬を混合し、以下の添加剤を含めて最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便懸濁液は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、終濃度が以下の条件になるように１μＬずつ添加し、以下の添加剤を含めて５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。

（３）添加剤

　以下の表４に記載の終濃度でＢＳＡ（分子量：約６０ｋＤａ）および魚ゼラチン（分子量：約２０～２５ｋＤａ）をＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加した。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

　これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ　ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。

　９０℃　１分（熱処理条件）

　５８℃　５分（逆転写条件）

　９５℃　１秒－５２℃　１０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）

　９５℃　１秒－５２℃　１０秒  ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）

（４）結果

　ＢＳＡおよび魚ゼラチンが無添加である条件１では、Ｇ１およびＧ２ともにノロウイルスの検出が不可能であった。これに対し、ＢＳＡを１ｍｇ/ｍＬ以上および魚ゼラチン００００５ｍｇ／ｍＬ以上を併せて添加した条件では、反応性が向上し、不溶性物質が１Ａｂｓ/μＬ存在する状況下であっても、Ｇ１，Ｇ２ともに１０コピー/反応まで検出可能になることを確認した。　

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

試験例４．不溶性物質の濁度の検討（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを利用した不溶性物質濃度による阻害効果の検討）

（１－１）ノロウイルス液の調製

　ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり２５０、５０、１０コピー相当添加した。

（１－２）糞便懸濁液の添加

　試験例１にて調製したノロウイルス陰性の糞便懸濁液を、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度ＯＤ６６０が以下の条件となるように反応液に添加した。

　条件１　０　　Ａｂｓ/μＬ

　条件２　０．１Ａｂｓ/μＬ

　条件３　０．５Ａｂｓ/μＬ

　条件４　１．０Ａｂｓ/μＬ

　条件５　３．０Ａｂｓ/μＬ

　条件６　５．０Ａｂｓ/μＬ

（２）反応液

　以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。本試験例で使用したｒＴｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。

反応液

　（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プライマー液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プローブ液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)

２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２　（東洋紡）

４．２ｎｇ／μｌ　ｒＴｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）

０．０１μｇ／μｌ　抗Ｔｔｈ　抗体

３ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（分子量：約６０ｋＤａ）

５ｍｇ／ｍＬ　　魚ゼラチン（分子量：約２０～２５ｋＤａ）

　前記各試薬を混合して、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便懸濁液は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、濁度が以下の条件になるように１μＬずつ添加し、以下の添加剤を含めて５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。

（３）結果

　糞便懸濁液の不溶性物質の濁度が１Ａｂｓ/μＬまでの場合において、ノロウイルスＧ１、Ｇ２ともに１０コピーまでの検出を確認した。また、３Ａｂｓ/μＬにおいて、Ｇ１でのみ１０コピーまでの検出を確認し、Ｇ２では５０コピーまでの検出を確認した。濁度５Ａｂｓ/μＬ以上では著しく蛍光強度の低下が確認され、Ｇ１、Ｇ２ともに検出をすることができなかった。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006

試験例５．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いた１ステップＲＴ－ＰＣＲ

（１－１）ノロウイルス液の調製

　ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり２５０コピー相当添加した。

（１－２）糞便懸濁液の添加

　試験例１にて調製したノロウイルス陰性の糞便懸濁液を、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度ＯＤ６６０が１．０Ａｂｓ/μＬになるように以下の反応液に添加した。

（２）反応液

　以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。ファミリーＡに属する耐熱性ポリメラーゼは各条件において、変更した。

反応液

　（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プライマー液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プローブ液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)

２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２　（東洋紡）

４．２ｎｇ／μｌ　各耐熱性ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ変異体

０．０１μｇ／μｌ　各抗耐熱性ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ抗体

３ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ

５ｍｇ／ｍｌ　魚ゼラチン

　前記各試薬を混合して、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便懸濁液は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、終濃度が以下の条件になるように１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ　ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。

　９０℃　１分（熱処理条件）

　５８℃　５分（逆転写条件）

　９５℃　１秒－５２℃　１０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）

　９５℃　１秒－５２℃　１０秒  ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）

（３）使用した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体

　以下に示される耐熱性ポリメラーゼおよびその変異体を、記載の濃度にてそれぞれ反応に使用した。変異体に関する表記は、アミノ酸の１文字略語表記に従う。変異導入部位に関しては酵素の名称に含む数字となっており、左に変更前のアミノ酸、右に変更後のアミノ酸を記載した。例えば、「Ｔｔｈ変異体（Ｅ６２８Ｋ）」は、Ｔｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（配列番号１０）の６２８位のＥ（グルタミン酸）をＫ（リシン）に変異させていることを意味する。

（使用酵素）

・酵素１：Ｔｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（野生型）（東洋紡）

・酵素２：Ｔｔｈ変異体（Ｅ６２８Ｋ）

・酵素３：Ｔｔｈ変異体（Ｑ５０９Ｒ）

・酵素４：Ｔｔｈ変異体（Ｄ５４９Ｇ）

・酵素５：Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（野生型）（東洋紡）

・酵素６：Ｔａｑ変異体（Ｅ５０７Ｒ）

（４）結果

　ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに該当するＴｔｈＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびその変異体においては、不溶性物質の濃度が１Ａｂｓ/μＬの条件下においても、Ｇ１およびＧ２両者のノロウイルスの検出を確認した。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

試験例６．糞便試料を直接添加した条件での１ステップＲＴ－ＰＣＲ

（１－１）ノロウイルス液の調製

　ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり５０コピー相当添加した。

（１－２）糞便試料の添加

　ノロウイルス陰性の糞便試料（２検体）を、竹串を使って採取し、以下の方法で調製したＲＴ－ＰＣＲ反応液に直接添加し、懸濁した。一部を分取し、濁度（ＯＤ６６０）が１．０Ａｂｓ/μＬ前後であることを確認した。また、試料の採取量にばらつきが出るため、Ｎ＝３にて実施した。

（２）ＲＴ－ＰＣＲ反応液調製

　以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。

反応液

　（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　１０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プライマー液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

１０ｘ　プローブ液

　（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）

０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)

２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２　（東洋紡）

４．２ｎｇ／μｌ　ｒＴｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）

０．０１μｇ／μｌ　抗Ｔｔｈ　抗体

３ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（分子量：約６０ｋＤａ）

５ｍｇ／ｍＬ　魚ゼラチン(分子量：約２０～２５ｋＤａ）

　前記各試薬を混合して、最終液量が１００μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便試料を混合後、５０μＬを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。残りの５０μＬにて濁度測定を実施した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ　ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。

　９０℃　１分（熱処理条件）

　５８℃　５分（逆転写条件）

　９５℃　１秒－５２℃　１０秒  １０サイクル（ＰＣＲ）

　９５℃　１秒－５２℃　１０秒  ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）

（４）結果

　糞便検体を直接添加した条件において、不溶性物質の濁度が０．８～１．２５Ａｂｓ/μＬの範囲において、Ｇ１およびＧ２のノロウイルス５０コピーの検出が可能であることを確認した。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008

　本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理などを目的とした検査において、好適に用いられる。

Claims (41)


  1. 　以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法：

    （１）事前の遠心分離操作をおこなわず不溶性物質を含む試料と、分子量５～５００ｋＤａのポリペプチド及び逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程、並びに、

    （２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。

  2. 　前記混合液中における不溶性物質の濁度がＯＤ６６０にて０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である請求項１に記載の方法。

  3. 　前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる分子量５～５００ｋＤａのポリペプチドが、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及びセリシンよりなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１又は２に記載の方法。

  4. 　前記混合液が、該混合液中終濃度で前記分子量５～５００ｋＤａのポリペプチドとして、０．５ｍｇ／ｍＬ以上のウシ血清アルブミン、５ｍｇ／ｍＬ以上のゼラチン、５ｍｇ／ｍＬ以上のＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及び５ｍｇ／ｍＬ以上のセリシンよりなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１から３いずれかに記載の方法。

  5. 　前記工程（１）において使用する不溶性物質を含む試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。

  6. 　前記工程（１）及び（２）が同一容器で行われることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。

  7. 　前記工程（２）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。

  8. 　前記工程（２）において、サイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させるため及び／又は核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させるために熱処理を実施することを含む請求項１から７のいずれかに記載の方法。

  9. 　前記試料が血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料である請求項１から８のいずれかに記載の方法。

  10. 　前記試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である請求項１から９のいずれかに記載の方法。

  11. 　前記不溶性物質が、血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料に由来する請求項１から１０のいずれかに記載の方法。

  12. 　前記ウイルスがエンベロープをもたないＲＮＡウイルスである請求項１から１１のいずれかに記載の方法。

  13. 　エンベロープをもたないＲＮＡウイルスがレオウイルス科ウイルスまたはカリシウイルス科ウイルスである請求項１から１２のいずれかに記載の方法。

  14. 　レオウイルス科ウイルスがロタウイルスである請求項１３に記載の方法。

  15. 　カリシウイルス科ウイルスがノロウイルスである請求項１３に記載の方法。

  16. 　ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。

  17. 　前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１から１６のいずれかに記載の方法。

  18. 　前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１から１７のいずれかに記載の方法。

  19. 　前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。

  20. 　以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法：

    （１）事前の遠心分離操作をおこなわず不溶性物質を含む試料と、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程、及び、

    （２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。

  21. 　前記ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。

  22. 　前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、請求項２１に記載の方法。

  23. 　前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、請求項２１又は２２に記載の方法。

  24. 　分子量５～５００ｋＤａであるポリペプチド及び逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料から一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でＲＮＡウイルスの検査を行うための組成物。

  25. 　前記組成物と前記試料との混合液における不溶性物質の濁度がＯＤ６６０にて０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である請求項２４に記載の組成物。

  26. 　前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる分子量５～５００ｋＤａのポリペプチドが、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及びセリシンよりなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２４又は２５に記載の組成物。

  27. 　前記組成物と前記試料との混合液が、該混合液中終濃度で前記分子量５～５００ｋＤａのポリペプチドとして、０．５ｍｇ／ｍＬ以上のウシ血清アルブミン、５ｍｇ／ｍＬ以上のゼラチン、５ｍｇ／ｍＬ以上のＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及び５ｍｇ／ｍＬ以上のセリシンよりなる群から選択される少なくとも１つを含むように調整して配合されている、請求項２４から２６のいずれかに記載の組成物。

  28. 　前記不溶性物質を含む試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、請求項２４から２７のいずれかに記載の組成物。

  29. 　前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２４から２８のいずれかに記載の組成物。

  30. 　前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項２４から２９のいずれかに記載の組成物。

  31. 　前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、請求項２４から３０のいずれかに記載の組成物。

  32. 　ウイルスがエンベロープをもたないＲＮＡウイルスである請求項２４から３１のいずれかに記載の組成物。

  33. 　エンベロープをもたないＲＮＡウイルスがレオウイルス科ウイルスまたはカリシウイルス科ウイルスである請求項３２のいずれかに記載の組成物。

  34. 　レオウイルス科ウイルスがロタウイルスである請求項３３に記載の組成物。

  35. 　カリシウイルス科ウイルスがノロウイルスである請求項３３に記載の組成物。

  36. 　ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする請求項２４から３５のいずれかに記載の組成物。

  37. 　ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料から一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でＲＮＡウイルスの検査を行うための組成物。

  38. 　前記ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項３７に記載の組成物。

  39. 　前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、請求項３８に記載の組成物。

  40. 　前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、請求項３８又は３９に記載の組成物。

  41. 　請求項２４から４０のいずれかに記載の組成物を含む、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料においてＲＮＡウイルスの存在を検査するためのキット。
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