JP7516731B2 - 改良されたウイルス検出方法 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
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本発明は、核酸増幅によるＲＮＡウイルスの検出法に関する。より具体的には、事前の試料の遠心分離操作を実施せず不溶性物質を含む試料と、一酵素系のリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）の反応液とを混合することによるＲＮＡウイルスの検出に関する。本発明の方法は、例えば、糞便試料、血液試料、環境拭き取り試料等におけるＲＮＡウイルスを検出することが可能である。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。
ＲＮＡを分析する場合、このＰＣＲの前段として、鋳型ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を実施する。これをＲＴ－ＰＣＲという。このＲＴ－ＰＣＲは、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ－ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを、単一酵素を利用して連続して実施する一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ、（３）逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの２種類の酵素を利用して、ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲの３つに大別される。
ＲＴ－ＰＣＲのうち、遺伝子検査やウイルス検査では、処理能力の高さや、反応途中での反応容器の開閉によるコンタミネーションを回避するため、１ステップＲＴ－ＰＣＲが好まれる。二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲでは、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの少なくとも２種類の酵素が使用される。一方で、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲでは、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが利用される。しかし、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性は一般に、レトロウイルス由来の逆転写酵素の逆転写効率には劣ることから、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲの方が、一酵素系ＲＴ－ＰＣＲに比べて感度が高いとされている（非特許文献１）。従って、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲは、二酵素系ＲＴ－ＰＣＲに比べて高感度化が難しいと考えられてきた。
ウイルス検査の代表例として、病原性ＲＮＡウイルスの一つであるノロウイルスが挙げられる。ノロウイルスは、急性胃腸炎の原因となる１本鎖ＲＮＡウイルスである。感染力が強く、集団食中毒や集団感染を引き起こすことから、公衆衛生上関心の高いウイルスである。ノロウイルスはＧｅｎｏｇｒｏｕｐI（ＧI）及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐII（ＧII）の２つの遺伝子群に分類される。ノロウイルスの病原体検査では、組織培養法が確立できておらず、電子顕微鏡法、ＥＬＩＳＡによる免疫学的抗原検出法、または核酸増幅技術を利用したウイルス遺伝子の検出法が開発されてきた。このうち、日本においては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に基づくＲＴ－ＰＣＲ法が公定法として普及している。
ノロウイルスの感染の原因として主にノロウイルスに汚染された食品を飲食することによるが、ヒトの手を介した感染が多いため、調理施設、医療現場、老人介護施設及び保育園などでは定期的な検便検査が求められている。大量調理施設衛生管理マニュアルには、調理従事者等の検便検査に、月に１回以上又は必要に応じノロウイルスの流行期である１０月から３月についてノロウイルスの検査を含めることが追加されている。これはウイルスに感染していても症状がでない人（健康保因者）が少なからず存在し、これらの人たちが知らず知らずのうちに感染を広げる可能性があるためである。さらに、下痢や嘔吐などの症状がある調理従事者は医療機関を受診し、ノロウイルスに感染していることが判明した場合はリアルタイムＰＣＲ等の高感度検査を実施し、ノロウイルスを保有していないことが確認されるまでは食品に直接触れる調理作業を控えるなどの適切な処置をとることが望まれている。
ノロウイルスは、ウイルスＲＮＡゲノムが約３０ｎｍのキャプシドタンパク質からなる正二十面体の内部に封入された、キャプシド構造を有する。キャプシド構造は、ウイルスが消化管などの過酷な環境でも生存できるように、胃酸による不活性化や胆汁酸の界面活性作用等に耐性を持つ。通常の界面活性剤や７０％エタノールに代表されるウイルス不活化剤では、このキャプシド構造を破壊できず、ウイルスの感染能が維持される。キャプシド構造を破壊するには、少なくとも８５℃以上、１分以上の過酷な条件での熱処理が必要とされている（非特許文献２）。
従来、糞便試料からのノロウイルスの検出は、例えば糞便の１０％懸濁液を作製し、遠心上清から市販のウイルスＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出・精製し、このＲＮＡ抽出液を用いてノロウイルスの検出が行われてきた（食安監１１０５００１号）。しかし、短時間で多数の検体を検査するには、このＲＮＡ抽出作業は煩雑である。
そこで、近年、糞便試料中のノロウイルスのキャプシドを、加熱処理を含む前処理によって破壊し、ウイルスＲＮＡを露出させた処理液をＲＴ－ＰＣＲに供することでウイルスの有無を検出する手法が知られる（特許文献１）。この手法では、試料に前処理液を添加後、熱処理を加えることで、糞便試料や拭き取り検査の濃縮試料から事前にＲＮＡの単離を実施せずにウイルスキャプシドを破壊し、ウイルスＲＮＡの有無を検出できる。さらにウイルスＲＮＡの検出までの作業を簡略化するため、加熱処理をおこなわず、糞便試料を前処理液に添加するだけでウイルスＲＮＡを露出させ、処理液をＲＴ－ＰＣＲに供することでさらに効率よくウイルスの有無を検出する手法が知られる（非特許文献３）。
この際、ＲＮＡの抽出を省略することで、糞便試料中に含まれる、多糖類などのＰＣＲ反応阻害物質が持ち込まれる。これらの影響を低減するような工夫がＰＣＲ反応液になされている。便試料にスパイクされたＤＮＡを検出する際のＰＣＲ阻害は、マグネシウム存在下で夾雑耐性を持つｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの使用によって、改善されることが報告されている（非特許文献４）。特許文献１に記載の方法では、前記ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、夾雑耐性を強化した二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ系を利用している。
しかしながら、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲに用いられるレトロウイルス由来の逆転写酵素は、好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼに比べ、耐熱性の面で大幅に劣るとも言われている(非特許文献５)。このため、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲでは、逆転写酵素を含む反応液に対して、ウイルス破砕のための熱処理を高温で実施することができない。従って、未処理の試料を直接ＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加し、熱処理によってウイルスのキャプシド構造を破壊してＲＮＡを検出することができない。
特許文献１、非特許文献３に記載の方法では、逆転写酵素の失活を避けるために、前処理を施した試料に対して、ＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する。この手法では、試料に前処理液を加えて熱処理を実施する作業と、その後のＲＴ－ＰＣＲ反応液を新たに添加する作業の２ステップを要することとなり、ウイルスキャプシドを破壊する前処理ステップに多少の手間と労力を要する。また、これらの文献において具体的に行われた方法では、ＲＴ－ＰＣＲに供する試料として、糞便試料を例えば１０％懸濁液として調製した後、あらかじめ遠心分離し、回収した上清を使用している。このような糞便試料の懸濁液の調製および遠心分離の作業は、特に多検体を測定する現場において、手間と労力を要している。
とりわけ糞便検体は不溶性の固形物を多量に含んでいるため、遠心分離を実施していない１０％糞便懸濁液や、そのままの糞便試料をＲＴ－ＰＣＲ反応液へ直接添加すると、反応液中に不溶性物質が多量に持ち込まれ、反応液が高濁度になる。そしてリアルタイムＰＣＲ機による測定の際、このような不溶性物質を多量に含む高濁度のＲＴ－ＰＣＲ反応液を用いると、反応液中の不溶性物質による光の散乱または吸収や、自家蛍光の影響等が起こり、ＲＴ－ＰＣＲの結果によって得られる蛍光波長の強度の大幅な低下を招き、著しい感度低下を引き起こす。
そこで、事前の遠心分離処理が行われておらず、夾雑物質等の不溶性物質を含む試料（いわゆるクルードサンプル）を、直接ＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加してＲＴ－ＰＣＲを行う場合の不溶性物質の影響を抑制し、迅速で簡便なウイルスＲＮＡの検出法が求められている。
ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２５巻，１９９８年、第２３０－２３４頁
食品衛生学雑誌、第４６巻、２００５年、第２３５－２４５頁
食品微生物学会誌、第３５ 巻、２０１８ 年 、第１９３－１９８頁
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第３８巻、２０００年、第４４６３－４４７０頁
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第３７巻、２００９年、第４７３－４８１頁
本発明の目的は、事前に試料の遠心分離操作を行うことなく、不溶性物質を含む試料を使用する場合であっても、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにより、十分な感度でウイルスＲＮＡの有無の検出を可能とすることである。
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、事前の遠心分離操作による不溶性物質の除去を行なわず不溶性物質を含む試料を一酵素系の１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液と混合後、直接１ステップＲＴ－ＰＣＲを行う際に、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、高感度にウイルスＲＮＡの検出が可能であることを見出した。
従来、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に不溶性物質が多量に混在して濁度の高い反応液となると、反応液中に含まれる不溶性物質が光の散乱や吸収、自家蛍光による影響等を与え、リアルタイムＰＣＲ機での測定時に検出できる蛍光強度が大幅に低下し、著しい感度低下を引き起こすとされてきた。しかしながら、全く予想外のことに、特定の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いると、十分に検出可能な強い蛍光強度が得られ、検出感度の低下を克服できることを見出した。その結果、不溶性物質を含みうる糞便試料をＲＴ－ＰＣＲ反応液へ添加し、反応容器を密閉後、ＲＴ－ＰＣＲのための温度サイクルで反応を行うだけで、ウイルスＲＮＡを直接検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
従来、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に不溶性物質が多量に混在して濁度の高い反応液となると、反応液中に含まれる不溶性物質が光の散乱や吸収、自家蛍光による影響等を与え、リアルタイムＰＣＲ機での測定時に検出できる蛍光強度が大幅に低下し、著しい感度低下を引き起こすとされてきた。しかしながら、全く予想外のことに、特定の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いると、十分に検出可能な強い蛍光強度が得られ、検出感度の低下を克服できることを見出した。その結果、不溶性物質を含みうる糞便試料をＲＴ－ＰＣＲ反応液へ添加し、反応容器を密閉後、ＲＴ－ＰＣＲのための温度サイクルで反応を行うだけで、ウイルスＲＮＡを直接検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
代表的な本願発明は、以下の通りである。
［項１］ 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法：
（１）事前の遠心分離操作をおこなわず不溶性物質を含む試料と、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程、及び、
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項２］ 前記混合液中における不溶性物質の濁度がＯＤ６６０にて０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である項１に記載の方法。
［項３］ 前記ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項１又は２に記載の方法。
［項４］ 前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項３に記載の方法。
［項５］ 前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項３又は４に記載の方法。
［項６］ 前記工程（１）において使用する不溶性物質を含む試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、項１から５のいずれかに記載の方法。
［項７］ 前記工程（１）及び（２）が同一容器で行われることを特徴とする項１から６のいずれかに記載の方法。
［項８］ 工程（２）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする項１から７のいずれかに記載の方法。
［項９］ 前記工程（２）において、サイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させるため及び／又は核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させるために熱処理を実施することを含む項１から８のいずれかに記載の方法。
［項１０］ 前記試料が血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料 である項１から９のいずれかに記載の方法。
［項１１］ 前記試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である項１から１０のいずれかに記載の方法。
［項１２］ 前記不溶性物質が、血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料に由来する項１から１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］ 前記ウイルスがエンベロープをもたないＲＮＡウイルスである項１から１２のいずれかに記載の方法。
［項１４］ エンベロープをもたないＲＮＡウイルスがレオウイルス科ウイルスまたはカリシウイルス科ウイルスである項１から１３のいずれかに記載の方法。
［項１５］ レオウイルス科ウイルスがロタウイルスである項１４に記載の方法。
［項１６］ カリシウイルス科ウイルスがノロウイルスである項１４に記載の方法。
［項１７］ ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする項１６に記載の方法。
［項１８］ 前記混合液が、混合液中終濃度として、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、及び１ｍｇ／ｍｌ以上のゼラチンよりなる群から選択される少なくとも１つを含む、項１から１７のいずれかに記載の方法。
［項１９］ 前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項１から１８のいずれかに記載の方法。
［項２０］ ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料から一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でＲＮＡウイルスの検査を行うための組成物。
［項２１］ 前記組成物と前記試料との混合液における不溶性物質の濁度がＯＤ６６０にて０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である項２０に記載の組成物。
［項２２］ 前記ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項２０又は２１に記載の組成物。
［項２３］ 前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項２２に記載の組成物。
［項２４］ 前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項２２又は２３に記載の組成物。
［項２５］ 前記不溶性物質を含む試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、項２０から２４のいずれかに記載の組成物。
［項２６］ 前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項２０から２５のいずれかに記載の組成物。
［項２７］ 前記組成物と前記試料との混合液が、混合液中終濃度として、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、及び１ｍｇ／ｍｌ以上のゼラチンよりなる群から選択される少なくとも１つを含むように調整して配合されている、項２０から２６のいずれかに記載の組成物。
［項２８］ ウイルスがエンベロープをもたないＲＮＡウイルスである項２０から２７のいずれかに記載の組成物。
［項２９］ エンベロープをもたないＲＮＡウイルスがレオウイルス科ウイルスまたはカリシウイルス科ウイルスである項２０から２８のいずれかに記載の組成物。
［項３０］ レオウイルス科ウイルスがロタウイルスである項２９に記載の組成物。
［項３１］ カリシウイルス科ウイルスがノロウイルスであ項２９に記載の組成物。
［項３２］ ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする項２０から３１のいずれかに記載の組成物。
［項３３］ 項２０から３２のいずれかに記載の組成物を含む、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料においてＲＮＡウイルスの存在を検査するためのキット。
［項１］ 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法：
（１）事前の遠心分離操作をおこなわず不溶性物質を含む試料と、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程、及び、
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項２］ 前記混合液中における不溶性物質の濁度がＯＤ６６０にて０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である項１に記載の方法。
［項３］ 前記ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項１又は２に記載の方法。
［項４］ 前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項３に記載の方法。
［項５］ 前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項３又は４に記載の方法。
［項６］ 前記工程（１）において使用する不溶性物質を含む試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、項１から５のいずれかに記載の方法。
［項７］ 前記工程（１）及び（２）が同一容器で行われることを特徴とする項１から６のいずれかに記載の方法。
［項８］ 工程（２）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする項１から７のいずれかに記載の方法。
［項９］ 前記工程（２）において、サイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させるため及び／又は核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させるために熱処理を実施することを含む項１から８のいずれかに記載の方法。
［項１０］ 前記試料が血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料 である項１から９のいずれかに記載の方法。
［項１１］ 前記試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である項１から１０のいずれかに記載の方法。
［項１２］ 前記不溶性物質が、血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料に由来する項１から１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］ 前記ウイルスがエンベロープをもたないＲＮＡウイルスである項１から１２のいずれかに記載の方法。
［項１４］ エンベロープをもたないＲＮＡウイルスがレオウイルス科ウイルスまたはカリシウイルス科ウイルスである項１から１３のいずれかに記載の方法。
［項１５］ レオウイルス科ウイルスがロタウイルスである項１４に記載の方法。
［項１６］ カリシウイルス科ウイルスがノロウイルスである項１４に記載の方法。
［項１７］ ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする項１６に記載の方法。
［項１８］ 前記混合液が、混合液中終濃度として、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、及び１ｍｇ／ｍｌ以上のゼラチンよりなる群から選択される少なくとも１つを含む、項１から１７のいずれかに記載の方法。
［項１９］ 前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項１から１８のいずれかに記載の方法。
［項２０］ ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料から一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でＲＮＡウイルスの検査を行うための組成物。
［項２１］ 前記組成物と前記試料との混合液における不溶性物質の濁度がＯＤ６６０にて０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である項２０に記載の組成物。
［項２２］ 前記ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項２０又は２１に記載の組成物。
［項２３］ 前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項２２に記載の組成物。
［項２４］ 前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、項２２又は２３に記載の組成物。
［項２５］ 前記不溶性物質を含む試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、項２０から２４のいずれかに記載の組成物。
［項２６］ 前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項２０から２５のいずれかに記載の組成物。
［項２７］ 前記組成物と前記試料との混合液が、混合液中終濃度として、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、及び１ｍｇ／ｍｌ以上のゼラチンよりなる群から選択される少なくとも１つを含むように調整して配合されている、項２０から２６のいずれかに記載の組成物。
［項２８］ ウイルスがエンベロープをもたないＲＮＡウイルスである項２０から２７のいずれかに記載の組成物。
［項２９］ エンベロープをもたないＲＮＡウイルスがレオウイルス科ウイルスまたはカリシウイルス科ウイルスである項２０から２８のいずれかに記載の組成物。
［項３０］ レオウイルス科ウイルスがロタウイルスである項２９に記載の組成物。
［項３１］ カリシウイルス科ウイルスがノロウイルスであ項２９に記載の組成物。
［項３２］ ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする項２０から３１のいずれかに記載の組成物。
［項３３］ 項２０から３２のいずれかに記載の組成物を含む、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料においてＲＮＡウイルスの存在を検査するためのキット。
本発明によって、遠心分離作業により試料中の不溶性物質を除去することを必要とせず、当該試料を１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加後、そのまま１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でウイルスＲＮＡを検出することが可能となる。更に本発明の一つの実施形態では、熱処理ステップを内包したＲＴ－ＰＣＲも可能である。従って、本発明は特定の実施態様において、不溶性物質を含む試料中のウイルス、中でもウイルスの破砕が難しい非エンベロープウイルスの有無を検出するのにも有用である。さらに、遠心分離による不溶性物質の除去工程を含む前処理工程の省略化により、検査業務がさらに効率化することから、ウイルス感染しても症状のない被験者の検査量を増やすことができ、感染症予防にも大きく寄与し得る。また、前処理工程の省略化により反応容器の蓋の開閉作業も省略が可能となる。この結果、試他のサンプルへのコンタミネーションリスクも低減することができる。これにより、偽陽性発生リスクも抑えることができ、検査業務の精度を更に高めることができる。
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されない。
本発明の一実施態様は、試料中のノロウイルスなどのＲＮＡウイルスの検査であって、試料を予め遠心分離して不溶性物質を除去することなく、特定の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬と、不溶性物質を含む試料とを混合してＲＴ－ＰＣＲ反応させることからなるＲＮＡウイルスの存在の有無を検査するための方法である。ここで、ＲＮＡウイルスは、非エンベロープＲＮＡウイルスであってもよく、更に、硬いキャプシド構造にＲＮＡが保持されているＲＮＡウイルスであってもよい。
一つの実施形態において、本発明の試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法は、少なくとも以下の工程が含まれることを特徴とする方法である。
（１）事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料と、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程；
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
前記工程（１）における混合液を調製する工程は、例えば、事前の遠心分離操作により不溶性物質を除去していない試料に、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加することによって行うことができる。前記工程（１）および（２）は、同一容器で行われることが好ましい。すなわち、工程（１）および（２）の間においては、混合液の全部または一部を別容器へ移し替えないことが好ましい。更には、工程（２）においては、反応容器を密閉後、反応容器の蓋の開閉を行わないことが好ましい。また、前記工程（１）で使用する不溶性物質を含む試料は、事前に水または緩衝液等にて懸濁した懸濁液であってもよく、糞便試料等の試料を１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に直接添加してもよい。
（１）事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料と、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程；
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
前記工程（１）における混合液を調製する工程は、例えば、事前の遠心分離操作により不溶性物質を除去していない試料に、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加することによって行うことができる。前記工程（１）および（２）は、同一容器で行われることが好ましい。すなわち、工程（１）および（２）の間においては、混合液の全部または一部を別容器へ移し替えないことが好ましい。更には、工程（２）においては、反応容器を密閉後、反応容器の蓋の開閉を行わないことが好ましい。また、前記工程（１）で使用する不溶性物質を含む試料は、事前に水または緩衝液等にて懸濁した懸濁液であってもよく、糞便試料等の試料を１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に直接添加してもよい。
本発明における検査対象はＲＮＡウイルスであり、特に限定されるものではない。なかでも、脂質二重膜に由来するエンベロープを持たない、非エンベロープ性のＲＮＡウイルスである。このような非エンベロープＲＮＡウイルスとしては、アストロウイルス科ウイルス（例えば、アストロウイルス）；カリシウイルス科ウイルス（例えば、サポウイルス、ノロウイルス）；ピコルナウイルス科ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス）；へぺウイルス科ウイルス（例えば、Ｅ型肝炎ウイルス）；レオウイルス科ウイルス（例えば、ロタウイルス）などが挙げられ、限定されるものではないが、好ましくはカリシウイルス科ウイルス及びレオウイルス科ウイルスの検出に有用であり、より好ましくはノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルスの検出に有用であり、更に好ましくはノロウイルス、ロタウイルスの検出に有用であり、特にノロウイルスの検出に有用である。非エンベロープウイルスの多くが糞口感染などによって消化管に感染可能で、胃酸による不活性化や胆汁酸の界面活性作用等に耐性のある、堅いキャプシド構造にＲＮＡが保持されている。
ノロウイルスは、大きく、ＧＩ型ノロウイルス及びＧＩＩ型ノロウイルスの遺伝子型で分類されることが知られている。そして、ＧＩ型ノロウイルスとＧＩＩ型ノロウイルスを判別することが、感染経路の推定などの疫学的データを収集する観点から望まれている。本発明のＲＮＡウイルス検査法では、ノロウイルスの存在の有無を確認できるだけでなく、感染しているノロウイルスがＧＩ型であるかＧＩＩ型であるかの判別（鑑別）も可能であるという点で非常に有益である。
本発明において用いられる試料として、例えば糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液などが挙げられるが、限定されるものではなく、生体に由来するもの全般に用いることが可能であり、特に糞便（排泄便、直腸便）からの検出に有用である。本発明においては、これら試料を遠心分離工程に供して不溶性物質の除去を行う必要がないことを一つの特徴とするものである。前記試料は直接検出に供してもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であってもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。
特定の好ましい実施形態では、本発明において用いられる試料は、事前の遠心分離工程のみならず、例えば事前に市販のＲＮＡ精製キット等を用いて試料からＲＮＡを単離する操作及び／又は事前に加熱処理してＲＮＡをウイルス構造から露出させる操作を実施していない試料であってもよい。本発明の方法では、このような事前のＲＮＡ単離も加熱処理も省いた試料であっても、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応のサイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に熱処理を内包させて、ウイルス構造からＲＮＡを露出させ、ＲＴ－ＰＣＲ反応に供することができる。このようにして事前の核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料を用いることで、より一層簡便に短時間でウイルスＲＮＡの検査が行えるだけでなく、試料のロスやキャリーオーバーによる他のサンプルへの汚染の危険性を低減することができる。特に糞便を試料とする多数の検体を処理するような検査において、その効果は顕著となる。
本発明における別の態様の試料としては、拭き取り検査試料である。汚染経路の解明や施設環境等の汚染状況の把握には、ふき取り検査が有用である。本発明において、拭き取り検査とは、特に限定されるものでないが、例えば綿棒等で該当区画や設備等を拭き取り、水や緩衝液に溶出し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱などで濃縮した試料である。具体的な拭き取り検査の要領としては、「ふきとり検体のノロウイルス検査法の改良」（ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｉａｓｒ／３２／３８２／ｄｊ３８２４．ｈｔｍｌ）などが例示されるが、特に限定はされるものではなく、これに準ずる方法が広く含まれる。拭き取り箇所の例としては、まな板や包丁、ふきん、食器などの調理器具類、冷蔵庫の取手やトイレ、浴室のドアノブ、洗面所、厨房、トイレ、浴室などの蛇口、調理者の手や指、浴室、トイレ、洗面、手すり、居室などの施設などが挙げられる。また、拭き取り検査ではないが、環境検査として、下水試料の濃縮試料にも適用できる。これらの検査試料は、検査場所の汚れやほこりを多量含むことから、不溶性物質を含みうる試料において夾雑耐性を強化した本手法は、これらの検査に対して有益である。
前記工程（１）においてＲＴ－ＰＣＲに供される試料が含みうる不溶性物質は、糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液、血液、拭き取り検査試料に由来するものが挙げられるが、限定されるものではない。例えば、生体に由来するもの（生体からの分泌物や排泄物等を含む）や、環境検査試料に由来するものなど、ＲＴ－ＰＣＲ反応の測定時の蛍光強度に影響し得る任意の不溶性物質であり得る。特に糞便（排泄便、直腸便）に含まれる不溶性物質を含む試料からの検出に有用である。本発明の方法により測定可能な不溶性物質の濁度は、検査試料や所望される効果の程度等によっても異なるが、例えば、濁度ＯＤ６６０において、ＲＴ－ＰＣＲ反応液が０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である場合等を挙げることができる。当然のことながら濁度が高くなるにつれて、検査感度が影響を受ける可能性が高まるが、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中における不溶性物質による濁度がＯＤ６６０にて０．１Ａｂｓ／μＬ以上、更には、０．５Ａｂｓ／μＬ以上、更には０．８Ａｂｓ／μＬ以上、更には１．０Ａｂｓ／μＬ以上、更には２．０Ａｂｓ／μＬ以上、例えば３Ａｂｓ／μＬ以上であっても、本発明によれば高感度な検出が可能であり好適である。ＲＴ－ＰＣＲ反応液中における不溶性物質による濁度の上限値は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、一例として、５．０Ａｂｓ／μＬ以下、好ましくは４．０Ａｂｓ／μＬ以下、例えば３Ａｂｓ／μＬ以下とすることができる。
水または緩衝液にて懸濁した試料の遠心分離操作の際には、遠心分離機等の装置を必要とし、反応容器の開閉作業も伴うことから、作業の煩雑化かつ作業時間を延ばす原因となる。作業現場での作業を簡略化し、迅速に検査を実施することで、さらなる感染拡大を未然に防ぐことにつながる。これに加えて、ウイルス含有検体の入った反応容器の開閉には、ウイルス及びウイルス由来ＲＮＡの飛散リスクが生じる。ウイルスの飛散は作業者の安全及び健康を脅かすものであると同時に、検査作業環境の汚染を意味する。飛散したＲＮＡウイルスは作業場においてエアロゾル化するため、同時に検査している他のサンプルの汚染リスクが問題となっている。このため、蓋の開閉工程のないＲＴ－ＰＣＲを用いたウイルスの存在の有無を検査方法は、作業の単純化以上の意義を持っている。
本発明の試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法は、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応において、ＤＮＡポリメラーゼとして、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることを一つの特徴とする。このように特定の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることによって、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に多量の不溶性物質が存在する濁度が高い反応液中であっても、高感度にウイルスＲＮＡを検出することが可能となる。ここで、逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとは、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する能力とＤＮＡを増幅する能力を兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼである。また、耐熱性とは、７０℃で１分以上の熱処理を実施しても、酵素活性が半分以上低下しないことをいう。ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼとしては、従来、好熱細菌に由来するファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌＩ型とも呼ばれる）、超好熱古細菌に由来するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ（α型とも呼ばれる）などが知られている。このうちファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼは、一般に、ＰＣＲ阻害物質に影響を受けやすく、未精製サンプルからの増幅は困難であるとされてきた。しかしながら、本発明では、このような阻害物質の影響を受けやすいファミリーＡに属し、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を行うことにより、遠心分離操作を行わず不溶性物質等の夾雑物を多量に含む試料においても、高感度にＲＮＡウイルスの検出ができるという予想外の結果に基づく。
具体的に、本発明に用いられ得るファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ポリメラーゼとしては、特に限定はされないが、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ． Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）などが挙げられ、これらの逆転写活性と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性が失われていない変異体であってもよい。好ましくは、Ｔｔｈ、Ｚ０５及びこれらの変異体からなる群より選択される逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。なかでも好ましくは、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体よりなる群より選択される少なくとも１つであり、これらを用いることによって、不溶性物質を多量に含む試料を用いる場合であっても、より一層高感度なＲＮＡウイルスの検出が可能となる。このような本発明に特に好適に用いられ得るＴｔｈポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１０）と、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１１）を配列表に示す。本発明には、これらのアミノ酸配列に基づき、効果を失わない範囲で一部のアミノ酸を改変した変異型ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼ変異体）も好適に使用することができる。
本明細書において、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの変異体とは、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、なかでも好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性を有するものをいう。ここで、アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、当該分野で公知の任意の手段で行うことができる。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。また、本発明に用いられ得る変異体は、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」ともいう）したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性を有するものであってもよい。ここで１又は数個とは、例えば、１～８０個、好ましくは１～４０個、よりこのましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、さらにより好ましくは１～３個であり得るが、特に限定されない。
特定の実施形態において、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量は、本発明の効果を奏する限りにおいて特に限定されないが、一例として、少なくとも４．２ｎｇ／μＬ以上あればよく、５．０ｎｇ／μＬ以上であることが好ましく、５．８ｎｇ／μＬ以上であることがより好ましい。なかでも好ましくは、８．３ｎｇ／μＬ以上である。一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量の上限は特に限定されないが、一例として、２０ｎｇ／μＬ以下とすることができ、１６．７ｎｇ／μＬ以下であっても十分に本発明の効果を得ることができる。ポリメラーゼの量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法もしくはＮａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャー社）により定量した値であり、安全データシート（ＳＤＳ）から概算してもよい。ＢＳＡなどのタンパク質を含む場合は、後者の方法で算出することが望ましい。
前記工程（２）におけるＲＴ－ＰＣＲサイクルは、１．熱処理、２．逆転写反応、３．ＰＣＲの３ステップから成る。各ステップの前後に、ホットスタート酵素を活性化させるための熱処理工程を含んでもよい。１の熱処理工程では、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させる、及び／もしくは核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させる工程を含む。これらの熱処理工程を含むことにより、ウイルスのキャプシド構造からＲＮＡを露出（溶出）させることが可能となる。前記熱処理工程の温度及び時間は、６０℃以上であり、かつ１秒以上であればよく、好ましくは７０℃、３０秒以上、より好ましくは８０℃、３０秒以上、特に好ましくは８５℃、３０秒以上である。２の逆転写反応の温度は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性と、プライマー及びプローブのＴｍ値によって決定され、少なくとも２５℃以上であればよい。より好ましくは３７℃以上である。３のＰＣＲでは、［１］熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、［２］鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、［３］ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、の３ステップを含んでいればよく、［２］と［３］を同一の温度で実施して、２ステップとしてもよい。迅速なＲＴ－ＰＣＲを実施するためには、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応に使用するサーマルサイクラーは、前記［２］と［３］のステップの伸長時間を合わせて１５秒以下、より好ましくは１０秒以下の測定プログラムを設定することが望ましい。なお、本明細書において「ＰＣＲの伸長時間」とは、サーマルサイクラーでの設定温度を指す。
本発明に用いられる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する前に、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲへの適用ができることが好ましい。
本発明に用いられる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの他、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、検出対象のウイルスＲＮＡの検出対象領域に対応するプライマー対、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
本発明で使用される緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６～９、より好ましくはｐＨ７～９に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、１０～２００ｍＭ，より好ましくは２０～１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが挙げられる。
本発明で使用されるｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１～０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ程度加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションに対する予防処置をとってもよい。クロスコンタミネーションに対する予防処置を講じる場合、Ｕｒａｃｉｌ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）を含むことが好ましい。
更に、本発明では、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＴ反応液に、２価陽イオンを含むことが好ましい。このように２価陽イオンを含むことで、より安定して高い夾雑耐性が得られ高感度な検出が可能となる。２価陽イオンとしては、特に限定されないが、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、銅イオン、鉄イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン等を挙げることができる。好ましくは、２価陽イオンとして、マグネシウムイオン、マンガンイオンを含むことが好ましい。本発明において、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液にマグネシウムイオンやマンガンイオン等を添加する場合は、マグネシウムやマンガンを添加してもよいし、これらの塩を添加してもよい。マグネシウム又はその塩としては、マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等が例示され、マンガン又はその塩としては、マンガン、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示される。このようなマグネシウム、マンガン、又はこれらの塩は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に１～１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。本発明のＲＮＡウイルス検査方法において安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マンガン又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において１ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、１．５ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、２．０ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことがより好ましい。
さらに１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる添加剤として、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン等）、セリシン、ＢＰＦ、グリセロール、グリコール、ゼラチン（例えば、魚ゼラチン、豚ゼラチン等）及び界面活性剤よりなる群から選択された少なくとも１つを含んでいてもよい。なかでも、アルブミン及び／又はゼラチンを含有することが好ましく、アルブミン及びゼラチンを両方を含有することが好ましく、とりわけ、ウシ血清アルブミンと、魚ゼラチン及び／又は豚ゼラチンとを含有することが好ましい。これらは例えば、常法に従いＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した場合に、分子量が約１～１０００ｋＤａ（一例として、約５～５００ｋＤａ）のアルブミンやゼラチンであり得るが、特に限定されない。
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液がウシ血清アルブミン（ＢＳＡとも略称する）を含有する場合、その濃度は特に限定されないが、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ反応液全体に対して、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ以上である。夾雑物の多い試料では、ウシ血清アルブミンの濃度が好ましくは２ｍｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３ｍｇ／ｍｌ以上で、良好な検出が可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、１０ｍｇ／ｍｌ以下とすることができる。
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液がゼラチン（例えば、魚ゼラチン、豚ゼラチン）を含有する場合、その濃度は特に限定されないが、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ反応液全体に対して、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ以上、更に好ましくは５ｍｇ／ｍｌ以上である。夾雑物の多い試料では、ゼラチンの濃度が好ましくは７．５ｍｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１５ｍｇ／ｍｌ以上で、良好な検出が可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、３０ｍｇ／ｍｌ以下とすることができる。
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる界面活性剤としては、トリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、トリトンＸ－１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊｉ３５、Ｂｒｉｊｉ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｅｍｕｌｇｅｎ４２０などが挙げられるが、特に限定されない。ＲＴ－ＰＣＲ反応液中の前記界面活性剤の濃度も特に限定はされないが、好ましくは０．０００１％以上、より好ましくは０．００２％以上、さらに好ましくは０．００５％以上で、良好な検出が可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、０．１％以下とすることができる。
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるベタイン様４級アンモニウムとしては、ベタイン（トリメチルグリシン）、カルニチンなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。ベタイン構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、界面活性剤のような性質を示し、ウイルス構造の不安定化を引き起こすと考えられる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの核酸増幅を促進することが知られる。好ましい前記ベタイン様４級アンモニウム濃度は、０．１Ｍ～２Ｍ、より好ましくは０．２Ｍ～１．２Ｍである。
さらには、当該技術分野でＲＴ－ＰＣＲを促進することが知られる物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用な促進物質とは、例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール-ビス(２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでいてもよい。
本発明に用いられるプライマー対としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが挙げられる。また、別の態様として、上記プライマーが２対以上含まれる、いわゆるマルチプレックスＰＣＲも挙げられる。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。本発明でエンベロープを持たないＲＮＡウイルスの１種であるノロウイルスを検出する場合、プライマー対の例としては、ノロウイルス検出用のプライマーとしては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマー記載のプライマー（配列番号１～５）が挙げられるが、これに限るものではない。前記記載のプライマーでは、配列番号１、２によりノロウイルスＧ１型、配列番号３～５によりノロウイルスＧ２型を検出する。検出対象のプライマー濃度としては、特に限定はされないが、ＲＴ－ＰＣＲ反応液全体に対して、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上２μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．５μＭ以上２μＭ以下である。
本発明は、別の態様としては、さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含む検出方法である。これによって、増幅産物の分析を通常の電気泳動ではなく、蛍光シグナルのモニタリングで監視することができ、解析労力が低減される。さらには、反応容器を開放する必要がなく、コンタミネーションのリスク低減が可能である。ウイルスのサブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、ウイルスのサブタイプを識別することも可能である。
２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ，ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ－９、ＳＹＴＰ－１３、ＳＹＴＯ－８２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標；Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられる。
本発明において用いられるハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられる。ノロウイルス検出用のプローブの塩基配列としては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載の配列（配列番号６～９）が挙げられるが、これに限るものではない。前記記載のプローブ配列では、配列番号６または７によりノロウイルスＧ１型、配列番号８または９によりノロウイルスＧ２型を検出する。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重配列を含んでもよい。蛍光標識プローブの濃度としては、０．０１μＭ以上１．０μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、０．０１３μＭ以上０．７５μＭ以下であり、更に好ましくは、０．０２μＭ以上０．５μＭ以下である。
本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査用キットまたは組成物であって、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含む試料から一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でＲＮＡウイルスの検査を行うための検査用キットまたは組成物である。
この実施態様において使用される、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの種類や量、プライマー又はプローブの種類や量、検査対象となるＲＮＡウイルス等は、前記のＲＮＡ検査方法において詳述したものと同様であり得る。本発明の検査用キットは、例えば、本発明の使用方法を説明する使用説明書等を含むことができる。例えば、本発明の検査用キットはファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、他の成分とを同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法に関する情報を含む態様で提供することができる。
以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
試験例１．糞便懸濁液の調製
（１）試料の調製
ノロウイルス陰性のヒト糞便検体を５０％（重量％）となるように滅菌水にて懸濁した。この懸濁液を水にて２００倍希釈した。
（２）濁度（ＯＤ６６０）の測定
２００倍に希釈した糞便懸濁液のＯＤ６６０を測定した。測定結果に希釈倍率を掛け合わせ、調製した糞便懸濁液の濁度を決定した。
（３）結果
調製した糞便懸濁液の濁度は４１．８Ａｂｓであることを確認した。糞便懸濁液を利用した以後の検討は、該糞便懸濁液を用いた。
（１）試料の調製
ノロウイルス陰性のヒト糞便検体を５０％（重量％）となるように滅菌水にて懸濁した。この懸濁液を水にて２００倍希釈した。
（２）濁度（ＯＤ６６０）の測定
２００倍に希釈した糞便懸濁液のＯＤ６６０を測定した。測定結果に希釈倍率を掛け合わせ、調製した糞便懸濁液の濁度を決定した。
（３）結果
調製した糞便懸濁液の濁度は４１．８Ａｂｓであることを確認した。糞便懸濁液を利用した以後の検討は、該糞便懸濁液を用いた。
試験例２．ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを利用した不溶性物質濃度による阻害効果の検討
（１－１）ノロウイルス液の調製
ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり２５０、５０、１０コピー相当添加した。
（１－２）糞便懸濁液の添加
試験例１にて調製したノロウイルス陰性の糞便懸濁液を、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度ＯＤ６６０が以下の条件となるように反応液に添加した。
条件１ ０ Ａｂｓ/μＬ
条件２ ０．１Ａｂｓ/μＬ
条件３ ０．５Ａｂｓ/μＬ
条件４ １．０Ａｂｓ/μＬ
条件５ ３．０Ａｂｓ/μＬ
条件６ ５．０Ａｂｓ/μＬ
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。本試験例で使用したｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。
反応液
（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)
２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ 抗体
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
５ｍｇ／ｍｌ 魚ゼラチン
前記各試薬を混合して、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便懸濁液は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度が以下の条件になるように１μＬずつ添加し、以下の添加剤を含めて５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。
（３） 結果
糞便懸濁液の不溶性物質の濃度として終濃度１Ａｂｓ/μＬまでにおいて、ノロウイルスＧ１、Ｇ２ともに１０コピーまでの検出を確認した。また、３Ａｂｓ/μＬにおいて、Ｇ１でのみ１０コピーまでの検出を確認し、Ｇ２では５０コピーまでの検出を確認した。終濃度５Ａｂｓ/μＬ以上では著しく蛍光強度の低下が確認され、Ｇ１、Ｇ２ともに検出をすることができなかった。
（１－１）ノロウイルス液の調製
ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり２５０、５０、１０コピー相当添加した。
（１－２）糞便懸濁液の添加
試験例１にて調製したノロウイルス陰性の糞便懸濁液を、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度ＯＤ６６０が以下の条件となるように反応液に添加した。
条件１ ０ Ａｂｓ/μＬ
条件２ ０．１Ａｂｓ/μＬ
条件３ ０．５Ａｂｓ/μＬ
条件４ １．０Ａｂｓ/μＬ
条件５ ３．０Ａｂｓ/μＬ
条件６ ５．０Ａｂｓ/μＬ
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。本試験例で使用したｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。
反応液
（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)
２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ 抗体
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
５ｍｇ／ｍｌ 魚ゼラチン
前記各試薬を混合して、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便懸濁液は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度が以下の条件になるように１μＬずつ添加し、以下の添加剤を含めて５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。
（３） 結果
糞便懸濁液の不溶性物質の濃度として終濃度１Ａｂｓ/μＬまでにおいて、ノロウイルスＧ１、Ｇ２ともに１０コピーまでの検出を確認した。また、３Ａｂｓ/μＬにおいて、Ｇ１でのみ１０コピーまでの検出を確認し、Ｇ２では５０コピーまでの検出を確認した。終濃度５Ａｂｓ/μＬ以上では著しく蛍光強度の低下が確認され、Ｇ１、Ｇ２ともに検出をすることができなかった。
試験例３．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いた１ステップＲＴ－ＰＣＲ
（１－１）ノロウイルス液の調製
ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり２５０コピー相当添加した。
（１－２）糞便懸濁液の添加
試験例１にて調製したノロウイルス陰性の糞便懸濁液を、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度ＯＤ６６０が１．０Ａｂｓ/μＬになるように以下の反応液に添加した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。ファミリーＡに属する耐熱性ポリメラーゼは各条件において、変更した。
反応液
（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)
２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μｌ 各耐熱性ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 変異体
０．０１μｇ／μｌ 各抗耐熱性ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 抗体
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
５ｍｇ／ｍｌ 魚ゼラチン
前記各試薬を混合して、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便懸濁液は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、終濃度が以下の条件になるように１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（３）使用した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体
以下に示される耐熱性ポリメラーゼおよびその変異体を、記載の濃度にてそれぞれ反応に使用した。変異体に関する表記は、アミノ酸の１文字略語表記に従う。変異導入部位に関しては酵素の名称に含む数字となっており、左に変更前のアミノ酸、右に変更後のアミノ酸を記載した。例えば、「Ｔｔｈ変異体（Ｅ６２８Ｋ）」は、Ｔｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（配列番号１０）の６２８位のＥ（グルタミン酸）をＫ（リシン）に変異させていることを意味する。
（使用酵素）
・酵素１：Ｔｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（野生型）（東洋紡）
・酵素２：Ｔｔｈ変異体（Ｅ６２８Ｋ）
・酵素３：Ｔｔｈ変異体（Ｑ５０９Ｒ）
・酵素４：Ｔｔｈ変異体（Ｄ５４９Ｇ）
・酵素５：Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（野生型）（東洋紡）
・酵素６：Ｔａｑ変異体（Ｅ５０７Ｒ）
（４）結果
ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに該当するＴｔｈＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびその変異体においては、不溶性物質の濃度が１Ａｂｓ/μＬの条件下においても、Ｇ１およびＧ２両者のノロウイルスの検出を確認した。反面、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびその変異体においては、内部標準（ＩＣ）の検出も確認することができなかった。
（１－１）ノロウイルス液の調製
ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり２５０コピー相当添加した。
（１－２）糞便懸濁液の添加
試験例１にて調製したノロウイルス陰性の糞便懸濁液を、ＲＴ－ＰＣＲ反応液の濁度ＯＤ６６０が１．０Ａｂｓ/μＬになるように以下の反応液に添加した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。ファミリーＡに属する耐熱性ポリメラーゼは各条件において、変更した。
反応液
（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)
２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μｌ 各耐熱性ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 変異体
０．０１μｇ／μｌ 各抗耐熱性ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 抗体
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
５ｍｇ／ｍｌ 魚ゼラチン
前記各試薬を混合して、最終液量が４９μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便懸濁液は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、終濃度が以下の条件になるように１μＬずつ添加し、５０μＬ反応系としてＲＴ－ＰＣＲを実施した。
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ－蛍光読み取り）
（３）使用した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体
以下に示される耐熱性ポリメラーゼおよびその変異体を、記載の濃度にてそれぞれ反応に使用した。変異体に関する表記は、アミノ酸の１文字略語表記に従う。変異導入部位に関しては酵素の名称に含む数字となっており、左に変更前のアミノ酸、右に変更後のアミノ酸を記載した。例えば、「Ｔｔｈ変異体（Ｅ６２８Ｋ）」は、Ｔｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（配列番号１０）の６２８位のＥ（グルタミン酸）をＫ（リシン）に変異させていることを意味する。
（使用酵素）
・酵素１：Ｔｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（野生型）（東洋紡）
・酵素２：Ｔｔｈ変異体（Ｅ６２８Ｋ）
・酵素３：Ｔｔｈ変異体（Ｑ５０９Ｒ）
・酵素４：Ｔｔｈ変異体（Ｄ５４９Ｇ）
・酵素５：Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（野生型）（東洋紡）
・酵素６：Ｔａｑ変異体（Ｅ５０７Ｒ）
（４）結果
ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに該当するＴｔｈＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびその変異体においては、不溶性物質の濃度が１Ａｂｓ/μＬの条件下においても、Ｇ１およびＧ２両者のノロウイルスの検出を確認した。反面、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびその変異体においては、内部標準（ＩＣ）の検出も確認することができなかった。
試験例４．糞便試料を直接添加した条件での１ステップＲＴ－ＰＣＲ
（１－１）ノロウイルス液の調製
ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり５０コピー相当添加した。
（１－２）糞便試料の添加
ノロウイルス陰性の糞便試料（２検体）を、竹串を使って採取し、以下の方法で調製したＲＴ－ＰＣＲ反応液に直接添加し、懸濁した。一部を分取し、濁度（ＯＤ６６０）が１．０Ａｂｓ/μＬ前後であることを確認した。また、試料の採取量にばらつきが出るため、Ｎ＝３にて実施した。
（２）ＲＴ－ＰＣＲ反応液調製
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。
反応液
（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)
２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ 抗体
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
５ｍｇ／ｍｌ 魚ゼラチン
前記各試薬を混合して、最終液量が１００μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便試料を混合後、５０μＬを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。残りの５０μＬにて濁度測定を実施した。
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ―蛍光読み取り）
（４）結果
糞便検体を直接添加した条件において、不溶性物質の濁度が０．８～１．２５Ａｂｓ/μＬの範囲において、Ｇ１およびＧ２のノロウイルス５０コピーの検出が可能であることを確認した。
（１－１）ノロウイルス液の調製
ノロウイルスのサンプルとして、ノロウイルス検体であるＮｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩおよびＧＩＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）を利用した。Ｇ１型およびＧ２型ノロウイルスの各検体を、１反応当たり５０コピー相当添加した。
（１－２）糞便試料の添加
ノロウイルス陰性の糞便試料（２検体）を、竹串を使って採取し、以下の方法で調製したＲＴ－ＰＣＲ反応液に直接添加し、懸濁した。一部を分取し、濁度（ＯＤ６６０）が１．０Ａｂｓ/μＬ前後であることを確認した。また、試料の採取量にばらつきが出るため、Ｎ＝３にて実施した。
（２）ＲＴ－ＰＣＲ反応液調製
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、１酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、反応液中のノロウイルスを検出した。
反応液
（ｒＴａｑ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ １０ｘＢｕｆｆｅｒ（東洋紡）添付品）
１０ｘ プライマー液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘ プローブ液
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２ｍＭ ｓＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ (東洋紡)
２ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ （東洋紡）
４．２ｎｇ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ 抗体
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
５ｍｇ／ｍｌ 魚ゼラチン
前記各試薬を混合して、最終液量が１００μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。糞便試料を混合後、５０μＬを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。残りの５０μＬにて濁度測定を実施した。
これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５２℃、４０サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分（熱処理条件）
５８℃ ５分（逆転写条件）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５２℃ １０秒 ４０サイクル（ＰＣＲ―蛍光読み取り）
（４）結果
糞便検体を直接添加した条件において、不溶性物質の濁度が０．８～１．２５Ａｂｓ/μＬの範囲において、Ｇ１およびＧ２のノロウイルス５０コピーの検出が可能であることを確認した。
本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理などを目的とした検査において、好適に用いられる。
Claims (28)
- 以下の工程を含むことを特徴とする、糞便試料中のＲＮＡウイルスの存在を検査するための方法：
（１）事前の遠心分離操作をおこなわず不溶性物質を含む糞便試料と、ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液を調製する工程であって、
前記ファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）及びそれらのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり且つ逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す変異体からなる群より選択される少なくとも一種であり、
前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液がゼラチン及び／又はアルブミンを含み、
前記糞便試料が、加熱処理を行っていない糞便試料である、工程、及び、
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。 - 前記混合液中における不溶性物質の濁度がＯＤ６６０にて０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である請求項１に記載の方法。
- 前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記工程（１）において使用する不溶性物質を含む糞便試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない糞便試料である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
- 前記工程（１）及び（２）が同一容器で行われることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
- 工程（２）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
- 前記工程（２）において、サイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させるため及び／又は核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させるために熱処理を実施することを含む請求項１から６のいずれかに記載の方法。
- 前記糞便試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された糞便懸濁液である請求項１から７のいずれかに記載の方法。
- 前記ＲＮＡウイルスがエンベロープをもたないＲＮＡウイルスである請求項１から８のいずれかに記載の方法。
- エンベロープをもたないＲＮＡウイルスがレオウイルス科ウイルスまたはカリシウイルス科ウイルスである請求項１から９のいずれかに記載の方法。
- レオウイルス科ウイルスがロタウイルスである請求項１０に記載の方法。
- カリシウイルス科ウイルスがノロウイルスである請求項１０に記載の方法。
- ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
- 前記ゼラチン及び／又はアルブミンとして、ウシ血清アルブミン、魚ゼラチン、及び豚ゼラチンからなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
- 前記混合液が、混合液中終濃度として、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、及び１ｍｇ／ｍｌ以上のゼラチンよりなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
- 前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
- Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）、Ｈａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）及びそれらのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり且つ逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す変異体からなる群より選択される少なくとも一種のファミリーＡに属する逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、ゼラチン及び／又はアルブミンとを含有することを特徴とする、事前の遠心分離操作を行わず不溶性物質を含み、加熱処理を行っていない糞便試料から一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応でＲＮＡウイルスの検査を行うための組成物。
- 前記組成物と前記糞便試料との混合液における不溶性物質の濁度がＯＤ６６０にて０．０１Ａｂｓ／μＬ以上である請求項１７に記載の組成物。
- 前記変異体が、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１０）又はＨａｗｋ Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、且つ、逆転写活性及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すものである、請求項１７又は１８に記載の組成物。
- 前記不溶性物質を含む試料が、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料である、請求項１７から１９のいずれかに記載の組成物。
- 前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、請求項１７から２０のいずれかに記載の組成物。
- 前記ゼラチン及び／又はアルブミンとして、ウシ血清アルブミン、魚ゼラチン、及び豚ゼラチンよりなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１７から２１のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物と前記試料との混合液が、混合液中終濃度として、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、及び１ｍｇ／ｍｌ以上のゼラチンよりなる群から選択される少なくとも１つを含むように調整して配合されている、請求項１７から２２のいずれかに記載の組成物。
- ウイルスがエンベロープをもたないＲＮＡウイルスである請求項１７から２３のいずれかに記載の組成物。
- エンベロープをもたないＲＮＡウイルスがレオウイルス科ウイルスまたはカリシウイルス科ウイルスである請求項１７から２４のいずれかに記載の組成物。
- レオウイルス科ウイルスがロタウイルスである請求項２５に記載の組成物。
- カリシウイルス科ウイルスがノロウイルスであ請求項２５に記載の組成物。
- ノロウイルスがＧＩ型かＧＩＩ型であるかの判別が可能であることを特徴とする請求項２７に記載の組成物。
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| Appl. Environ. Microbiol.，2001年02月，Vol.67, No.2，pp.742-749 |
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