JP7167913B2 - ウイルスの検査方法およびウイルスの検査用キット - Google Patents

Description

本発明は、核酸増幅によるウイルスの検出法に関する。より具体的には、試料から核酸の単離や加熱処理をすることなく、試料を極性有機溶媒と混合後、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）の反応液を加えることによる、例えば糞便試料または環境拭き取り試料などに含まれている、エンベロープを持たないＲＮＡウイルスの検出に関する。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。

核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。

ＲＮＡを分析する場合、このＰＣＲの前段として、鋳型ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を実施する。これをＲＴ－ＰＣＲという。このＲＴ－ＰＣＲは、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ－ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを、単一酵素を利用して連続して実施する一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ、（３）逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの２種類の酵素を利用して、ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲの３つに大別される。

ＲＴ－ＰＣＲのうち、遺伝子検査では、処理能力の高さや、反応途中での反応容器の開閉によるコンタミネーションを回避するため、１ステップＲＴ－ＰＣＲが好まれる。一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲでは、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼやＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが利用される。一方、二酵素１ステップＲＴ－ＰＣＲでは、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの少なくとも２種類の酵素が使用される。

逆転写酵素としては、レトロウイルスあるいは細菌由来の逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ；モロニーマウス白血病ウイルス）－ＲＴ （Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ；トリ骨髄芽球症ウイルス）－ＲＴ、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）－ＲＴ、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）２－ＲＴ、ＥＩＡＶ（Ｅｑｕｉｎｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｎｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）－ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼなど）やこれらの変異体が利用される。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては。Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体などが利用される。

一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ法は、２ステップＲＴ－ＰＣＲよりも感度が低いことが知られる（非特許文献１）。これに対し、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性と比べ、レトロウイルス由来の逆転写酵素の逆転写効率が高いことから、単一酵素共役ＲＴ－ＰＣＲよりも感度が高いとされる（非特許文献２）。しかし、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲは、２ステップＲＴ－ＰＣＲよりも感度が高いが、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼが干渉し、反応効率を低下させることが報告されている（非特許文献３）。この干渉を抑えるため、鋳型ＲＮＡの増加、非ホモログｔＲＮＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、あるいは逆転写酵素に対するＤＮＡポリメラーゼ比率の増加などの使用が行われてきた。

例えば、病原性ＲＮＡウイルスの一つであるノロウイルスは、急性胃腸炎の原因となる１本鎖ＲＮＡウイルスである。感染力が強く、集団食中毒や集団感染を引き起こすことから、公衆衛生上関心の高いウイルスである。ノロウイルスはＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩ（Ｇ１）及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ（Ｇ２）の２つの遺伝子群に分類される。ノロウイルスの病原体検査では、組織培養法が確立できておらず、電子顕微鏡法、ＥＬＩＳＡによる免疫学的抗原検出法、または核酸増幅技術を利用したウイルス遺伝子の検出法が開発されてきた。このうち、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に基づくＲＴ－ＰＣＲ法が公定法として普及している。

ノロウイルスの感染の原因として主にノロウイルスに汚染された食品を飲食することによるが、ヒトの手を介した感染が多いため、調理施設、医療現場、老人介護施設及び保育園などでは定期的な検便検査が求められている。大量調理施設衛生管理マニュアルには、調理従事者等の検便検査に、必要に応じてノロウイルスの流行期である１０月から３月についてノロウイルスの検査を含めることが追加されている。これはウイルスに感染していても症状がでない人（健康保因者）が少なからず存在し、これらの人たちが知らず知らずのうちに感染を広げる可能性があるためである。さらに、下痢や嘔吐などの症状がある調理従事者は医療機関を受診し、ノロウイルスに感染していることが判明した場合はリアルタイムＰＣＲ等の高感度検査を実施し、ノロウイルスを保有していないことが確認されるまでは食品に直接触れる調理作業を控えるなどの適切な処置をとることが望まれている。

ノロウイルスは、エンベロープを持たない、約３０ｎｍのキャプシドタンパク質からなる正二十面体構造を持ったウイルスである。このキャプシド構造にウイルスＲＮＡゲノムが封入される。そこで、従来、糞便試料からのノロウイルスの検出は、例えば糞便の１０％乳剤を作製し、遠心上清から市販のウイルスＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出・精製し、このＲＮＡ抽出液を用いてノロウイルスの検出が行われてきた（食安監１１０５００１号）。しかし、短時間で多数の検体を検査するには、このＲＮＡ抽出作業は煩雑である。そこで、近年、糞便試料から熱処理でキャプシドを破壊し、ウイルスＲＮＡを露出させた処理液をＲＴ－ＰＣＲに供することでウイルスの有無を検出する手法がとられるようになった（非特許文献４）。この際、ＲＮＡの抽出を省略することで、糞便試料中には含まれる、多糖類などのＰＣＲ反応阻害物質が持ち込まれる。

これらの影響を低減するような工夫が前処理剤やＰＣＲ反応液になされている（特許文献１）。便によるＰＣＲ阻害は、ベタイン、ＢＳＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、タンパク質分解酵素阻害剤の添加により改善されることが報告されているが、便試料にスパイクされたＤＮＡを検出したものでＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲによる検出を改善できるか不明であった（非特許文献５）。本発明者らは、既にアミノ酸における３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（ベタイン、Ｌ－カルニチン、など）、ウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコール、及びゼラチンの全部または一部を組み合わせることによって、便によるＰＣＲ阻害を解消できることを見出している。

一方で、前記糞便試料の熱処理は、逆転写酵素を失活させてしまうことから、熱処理後にＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する必要がある。ここで反応容器の開閉や試薬の添加が非常に手間と労力を要する。さらに、サンプル間のコンタミネーションのリスクもある。Ｋ．Ｋａｎｇらは、高病原性北米産豚生殖器呼吸器症候群ウイルスＲＮＡを豚血清サンプルから直接ＲＴ－ＰＣＲにより検出できることを報告している（非特許文献６）。この報告では、試料を直接ＲＴ－ＰＣＲ反応液と混合して反応するだけで、ウイルスのエンベロープ構造が破壊され、ウイルスＲＮＡが検出される。しかし、ノロウイルスのような消化管に感染しうるエンベロープを持たないウイルスは、胃酸による不活性化や胆汁酸の界面活性作用等に耐性のある、堅いキャプシド構造にＲＮＡが保持されている。そのため、未処理の試料を直接ＲＴ－ＰＣＲに供するだけではこのキャプシド構造が保持され、ＲＮＡの検出を十分に行えないケースがある。非特許文献７には、ウイルスに対する極性有機溶媒によるキャプシド構造の不安定化効果は、ウイルスの種類によっても異なることが報告されており、よりＲＮＡの検出を困難なものとしている。

そこで、ＲＴ－ＰＣＲ反応液にカオトロピック剤を加えることで、糞便試料や拭き取り検査の濃縮試料から事前にＲＮＡの単離や熱処理をせずに、効率よくウイルスＲＮＡの有無を検出できる方法もある。しかしながら、過剰なカオトロピック剤の添加はＰＣＲ反応を阻害してしまうことが知られており、ＰＣＲ反応時間の短縮化が困難であった。また、ＰＣＲ反応時間の短縮化に伴い、従来の加熱処理方法においてもノロウイルスの検出感度が低下するケースがある。そこで、更に効率的で且つＰＣＲ反応を阻害しにくいウイルスＲＮＡ含有検体の前処理方法が求められている。

特開２０１５―１１９６５６号公報

ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第１７巻，１９９４年、第１０３４－１０３６頁 ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２５巻，１９９８年、第２３０－２３４頁 Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第２０巻，１９９２年、第１４８７－１４９０頁 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，第１６３巻，２０１０年、第２８２－２８６頁 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第３８巻、２０００年、第４４６３－４４７０頁 Ｊ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第５巻、２０１４年、第４５頁 Ｂｕｌｌ，Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉ．，第１２９巻、２０１１年、第３７－５４頁

本発明の目的は、試料から非エンベロープウイルスのＲＮＡの単離や、試料の事前の加熱処理を行うことなく、１ステップＲＴ－ＰＣＲにより、従来知られている手法以上の精度でウイルスＲＮＡの有無の検出を可能とすることである。

本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、ウイルスＲＮＡの精製や事前の熱処理を行っていない試料を極性有機溶媒と混合後、１ステップＲＴ－ＰＣＲに供することで、非エンベロープウイルスＲＮＡの検出が可能であることを見出した。
さらに本発明者らは、ウイルスキャプシド構造の変性に必要な濃度の極性有機溶媒と１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応に許容される極性有機溶媒濃度を見極め、同一反応容器に極性有機溶媒、試料、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を順次添加して反応容器を密閉後、ＲＴ－ＰＣＲのための温度サイクルで反応を行うだけでウイルスＲＮＡを検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

代表的な本願発明は、以下の通りである。
項１．試料中のエンベロープを持たないＲＮＡウイルスの検査方法であって、試料からのＲＮＡ精製、または試料の事前の熱処理のない、以下の工程を含むことを特徴とする試料中のウイルスの存在の有無を検査するためのウイルスの検査方法。
（１）試料と極性有機溶媒を含む試薬を混合する工程、
（２）前記混合液に逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する工程、
（３）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
項２．前記工程（１）、（２）が同一容器で行われることを特徴とする項１に記載のウイルスの検査方法。
項３．工程（３）において反応容器を密閉後、一度もフタを開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする項１又は２に記載のウイルスの検査方法。
項４．試料が糞便である項１から３のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
項５．試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である項１から３のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
項６．試料が懸濁液の遠心上清である項１から３のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
項７．試料が環境中の拭き取り検査試料を水、生理食塩水または緩衝液に懸濁し、かつ、懸濁液を濃縮した試料であることを特徴とする項１から３のいずれかに記載の方法。
項８．エンベロープを持たないＲＮＡウイルスがノロウイルスである項１から７のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
項９．ノロウイルスがＧ１型かＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする項８に記載のウイルスの検査方法。
項１０．極性有機溶媒が、エタノール、メタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ピリジン、トリエチルアミンジメチルホルムアミド、ヘキサメチルホスホリックトリアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、およびアセトニトリルよりなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする項１から９のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
項１１．ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈおよびそれらの変異体よりなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする項１から１０のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
項１２．逆転写酵素の由来が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＲＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）およびこれらの変異体からなる群より選択されるいずれかであることを特徴とする項１から１１のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
項１３．工程（３）における１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、０．５ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含むことを特徴とする項１から１２のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
項１４．ベタイン様４級アンモニウム塩が、ベタインまたはＬ－カルニチンである項１３に記載のウイルスの検査方法。
項１５．試料の処理から１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応が完了するまでの所要時間が１時間以内である請求項１から１４のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
項１６．極性有機溶媒を含む試薬、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、および１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を含むことを特徴とするエンベロープを持たないウイルスの検査用キット。
項１７．工程（３）における１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、ベタイン様４級アンモニウム塩、０．５ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含む項１６に記載のウイルスの検査用キット。
項１８．検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応するプライマー対をさらに含むことを特徴とする項１６または１７に記載のウイルスの検査用キット。
項１９．検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブをさらに含むことを特徴とする項１６から１８のいずれかに記載のウイルスの検査用キット。
項２０．エンべロープを持たないＲＮＡウイルスがノロウイルスである項１６から１９のいずれかに記載のウイルスの検査用キット。
項２１．ノロウイルスがＧ１型かＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする項２０に記載のウイルスの検査用キット。

本発明によって、試料からウイルスＲＮＡの単離や事前の試料の熱処理を必要とせず、試料を極性有機溶媒と混合後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加するだけで、試料中のノロウイルスのような非エンベロープウイルスの有無を検出することが可能になる。この結果、検査業務がさらに効率化することから、ウイルス感染しても症状のない被験者の検査量を増やすことができ、感染症予防にも寄与する。また、熱処理工程の省略化により反応容器の蓋の開閉作業も省略される。この結果、蓋の開閉時におけるウイルス含有サンプルの飛散リスクをなくすことができ、他のサンプルへのコンタミリスクも低減することができる。これにより、偽陽性発生リスクも抑えることができ、検査業務の精度を更に高めることができる。

各溶媒におけるＰＣＲ反応阻害効果を検討した結果を示す図である。 各溶媒における検体前処理効果を検討した結果を示す図である。 反応時間短縮化時における各前処理方法の比較を検討した結果を示す図である。 各前処理方法の作業工程を示す図である。 各前処理方法の作業時間の比較を検討した結果を示す図である。

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。

本発明の一態様は、試料中のノロウイルスなどの非エンベロープＲＮＡウイルスの検査であって、試料からウイルスＲＮＡの精製や試料の事前の熱処理を行うことなく、試料と極性有機溶媒を含む試薬を混合し、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬を添加することからなるウイルスの存在の有無を検査するための方法である。

本発明の試料中のウイルスの存在の有無を検査するための方法は、少なくとも以下の工程が含まれることを特徴とするウイルスの存在の有無を検査するための方法である。
（１）試料と極性有機溶媒を含む試薬を混合する工程、
（２）前記混合液に逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する工程、
（３）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
前記工程（１）および（２）は、同一容器で行われることが好ましい。すなわち、工程（１）および（２）の間においては、混合液の全部または一部を別容器へ移し替えないことが好ましい。工程（１）により混合液の全量を工程（２）に供してもよいし、その一部を別の容器に移し替えて工程（２）を実施しても良い。更には、工程（３）においては、反応容器を密閉後、反応容器の蓋の開閉を行わないことが好ましい。

本発明において検査対象となるＲＮＡウイルスは、脂質二重膜に由来するエンベロープを持たない、非エンベロープ性のＲＮＡウイルスであれば、特に限定されるものではない。このような非エンベロープＲＮＡウイルスとしては、アストロウイルス科アストロウイルス、カリシウイルス科サポウイルス、ノロウイルス、ピコルナウイルス科Ａ型肝炎ウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、コクサッキ―ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、へぺウイルス科Ｅ型肝炎ウイルス、レオウイルス科ロタウイルスなどが挙げられるが、特に限定されるものではなく、特にノロウイルスの検出に有用である。非エンベロープウイルスの多くが糞口感染などによって消化管に感染可能で、胃酸による不活性化や胆汁酸の界面活性作用等に耐性のある、堅いキャプシド構造にＲＮＡが保持されている。このため非エンベロープ性ウイルスは、エンベロープ性ウイルス（例えばインフルエンザウイルス等）が不活化する条件においても、不活化されない場合がある。

本発明において用いられる試料として、例えば糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液などが挙げられるが、特に限定されるものではなく、生体に由来するもの全般に用いることが可能である。特には、糞便（排泄便、直腸便）からの検出に有用である。糞便には、夾雑物として、プロテアーゼ及び核酸分解酵素等が含まれている他、大腸菌由来のタンパク質及び核酸が多量含まれていることが特徴として挙げられる。ＲＴ－ＰＣＲ反応に用いる酵素やプライマー及び核酸プローブ等の反応液構成物は、糞便に含まれる夾雑物の影響により、消化または失活してしまい、検出感度が低下することが知られている。本発明においては、これら試料を市販のＲＮＡ精製キットでＲＮＡを単離したり、あるいは熱処理でＲＮＡをウイルス構造から露出させるための事前の熱処理を行う必要がないことを特徴とするものである。前記試料は直接検出に供してもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であってもよい。さらに、糞便など特に夾雑物の多い試料では、遠心分離し、その上清を使用してもよい。あるいは、フィルターろ過を実施してもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。

本発明における別の態様の試料としては、拭き取り検査試料である。汚染経路の解明や施設環境等の汚染状況の把握には、ふき取り検査が有用である。本発明において、拭き取り検査とは、特に限定されるものでないが、例えば綿棒等で該当区画や設備等を拭き取り、水や緩衝液に溶出し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱などで濃縮した試料である。具体的な拭き取り検査の要領としては、「ふきとり検体のノロウイルス検査法の改良」（ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｉａｓｒ／３２／３８２／ｄｊ３８２４．ｈｔｍｌ）などが例示されるが、特に限定はされるものではなく、これに準ずる方法が広く含まれる。拭き取り箇所の例としては、まな板や包丁、ふきん、食器などの調理器具類、冷蔵庫の取手やトイレ、浴室のドアノブ、洗面所、厨房、トイレ、浴室などの蛇口、調理者の手や指、浴室、トイレ、洗面、手すり、居室などの施設などが挙げられる。また、拭き取り検査ではないが、環境検査として、下水試料の濃縮試料にも適用できる。

本発明において、極性とは分子内に存在する電子的な偏りを指し、分子内の正電荷と負電荷の重心が一致しない分子を極性分子という。極性分子により構成された溶媒を極性溶媒という。極性溶媒の中でも、有機化合物により構成された極性有機溶媒を用いることにより、核酸やタンパク質のような生体分子の高次構造を不安定化することができる。この性質を利用することで、ウイルスのキャプシドタンパク質の疎水結合などを弱め、キャプシド構造を不安定化するような効果を奏するものである。上述した通り、ウイルスに対する極性有機溶媒によるキャプシド構造の不安定化効果は、ウイルスの種類によっても異なることが知られている（非特許文献７）。これはウイルスが保有するキャプシドタンパク質の性質の違いにより、疎水性結合などの強さが異なるからであると考えられる。

前記極性有機溶媒として、具体的にはエタノール、メタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、トリエチルアミン、ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルホスホリックトリアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、ピリジン等が挙げられるがこれに限られるものではない。好ましくは、メタノール、トリエチルアミン、ジメチルスルホキシド、アセトンである。また、これら極性有機溶媒を２つ以上含む混合溶液であっても良い。該極性有機溶媒のキャプシドタンパク質の変性剤としての下限の濃度としては、極性有機溶媒や他の添加剤の種類にもよるが、キャプシドタンパク質が変性される濃度であれば特に限定されるものではなく、また、ウイルスの種類によりキャプシドタンパク質が異なるため、極性溶媒の実効濃度は各ウイルス毎に異なっているが、通常は検体量に対する極性溶媒の実効濃度が１０％以上１００％未満、より好ましくは３０％以上９０％以下、さらに好ましくは５０％以上８５％以下である。

前記極性有機溶媒は、１種以上の界面活性剤、還元剤、キレート剤、金属塩と組み合わせて用いてもよい、

前記極性有機溶媒は、通常はＰＣＲの阻害剤としても知られる。そのため、前記極性有機溶媒の中でも、タンパク質の変性に必要な濃度とＰＣＲへの持込み許容濃度の相違が小さいものを選択することで、極性有機溶媒、試料、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液と順次添加することで、キャプシドタンパク質の変性から１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応まで同一容器で、途中で容器を開閉することなく簡便に検出操作が進められる。このような極性有機溶媒の例として、特に好ましくはジメチルスルホキシドが挙げられる。例えば、ジメチルスルホキシド１μＬと試料１μＬを混合し、１ステップＲＴ－ＰＣＲ液４８μＬを加えた場合、反応液中に持ち込まれるジメチルスルホキシドの濃度は２％である。２％のジメチルスルホキシドはＲＴ－ＰＣＲ液の持ち込まれても許容される濃度である。

試料の移し替えまたは加熱処理工程の際には、反応容器の開閉作業が生じる。反応容器の開閉作業は煩雑化かつ作業時間を伸ばす原因となる。これに加えて、ウイルス含有検体の入った反応容器の開閉には、ウイルス及びウイルス由来ＲＮＡの飛散リスクが生じる。ウイルスの飛散は作業者の安全及び健康を脅かすものであると同時に、検査作業環境の汚染を意味する。飛散したＲＮＡウイルスは作業場においてエアロゾル化するため、同時に検査している他のサンプルの汚染リスクが問題となっている。このため、蓋の開閉工程のないＲＴ－ＰＣＲを用いたウイルスの存在の有無を検査方法は、作業の単純化以上の意義を持っている。

前記混合液に添加される１ステップＲＴ－ＰＣＲ溶液は、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む。逆転写酵素活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼである、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼやＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどを使用することが好ましい。より好ましくは、二種の酵素の使用、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの少なくとも２種類の酵素の使用である。

前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素の由来としては、ＲＮＡをＤＮＡに変換できれば特に限定されないが、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）－ＲＴ、ＡＭＶ－ＲＴ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、ＥＩＡＶ－ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼ）やその変異体が例示される。特に好ましい例としては、ＭＭＬＶ－ＲＴ、ＡＭＶ－ＲＴ、またはそれらの変異体が挙げられる。

前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられるが、特に限定されない。より好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｔｈ又はこれらの変異体の使用である。特に好ましくはＴｔｈ又はその変異体の使用である。さらに、非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、逆転写反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲへの適用ができることが好ましい。

本発明に用いられる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼの他、緩衝剤、適当な塩として、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、検出対象のウイルスＲＮＡの検出対象領域に対応するプライマー対を含み、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。

本発明で使用される緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６～９、より好ましくはｐＨ７～８に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、１０～２００ｍＭ，より好ましくは２０～１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが挙げられる。

本発明で使用されるｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１～０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ程度加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションに対する予防処置をとってもよい。マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、マンガン塩としては、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示され、１～１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。

さらに１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる添加剤としては、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、０，５ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含むことが好ましい。

前記ベタイン様４級アンモニウム塩としては、ベタイン（トリメチルグリシン）、Ｌ－カルニチンなどが挙げられるが、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩であれば、特に限定されるものではない。ベタイン様４級アンモニウム塩が有する構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、界面活性剤のような性質を示し、ウイルス構造の不安定化を引き起こすものと考えられる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの核酸増幅を促進することが知られる。好ましい前記ベタイン様４級アンモニウム塩濃度は０．１Ｍ～２Ｍであり、より好ましくは０．２Ｍ～１．２Ｍである。

前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるウシ血清アルブミンとしては、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ以上である。夾雑物の多い試料では、ウシ血清アルブミンの濃度が好ましくは２ｍｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３ｍｇ／ｍｇ以上で、良好な検出が可能となる。

前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるゼラチンは、ウシや豚などの動物の皮膚や骨、腱、あるいは魚の鱗や皮に由来し、ＰＣＲ酵素の安定化に寄与すると考えられている。使用濃度としては、ＰＣＲ増幅を安定化する一方で、蛍光検出を妨げない程度が好ましい。好ましくは１～５％、さらに好ましくは１～２％である。特にゼラチンの由来については限定されるものではないが、ウシや豚由来よりも魚由来のものの方が、ゼリー強度が低く、反応液のハンドリングがよい点で好ましい。

さらには、当該技術分野でＲＴ－ＰＣＲを促進することが知られる物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用な促進物質とは、例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、トリトンＸ－１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊｉ５８などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール-ビス(２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでいてもよい。

本発明に用いられるプライマー対としては、検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応するプライマー対であり、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが挙げられる。また、別の態様として、上記プライマーが２対以上含まれる、いわゆるマルチプレックスＰＣＲも挙げられる。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。本発明でエンベロープを持たないＲＮＡウイルスの１種であるノロウイルスを検出する場合、プライマー対の例としては、ノロウイルス検出用のプライマーとしては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマーが挙げられるが、これに限るものではない。

本発明は、別の態様としては、さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含む検出方法である。これによって、増幅産物の分析を通常の電気泳動ではなく、蛍光シグナルのモニタリングで監視することができ、解析労力が低減される。さらには、反応容器を開放する必要がなく、コンタミネーションのリスク低減が可能である。ウイルスのサブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、ウイルスのサブタイプを識別することも可能である。

２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ，ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ－９、ＳＹＴＰ－１３、ＳＹＴＯ－８２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標；Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられる。

本発明において用いられるハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられる。ノロウイルス検出用のプローブの塩基配列としては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載の配列が挙げられるが、これに限るものではない。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重配列を含んでもよい。

本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査用キットであって、カオトロピック剤、並びに逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ（あるいは逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼ）、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を含むことを特徴とするエンベロープを持たないＲＮＡウイルスの検査用キットである。本発明のウイルスの検査用キットは、少なくとも極性有機溶媒を含む試薬、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、および１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を含む。１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、ベタイン様４級アンモニウム塩、０．５ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンのうちの少なくとも１つを含むことが好ましい。検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応するプライマー対、さらには検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブを含むことが好ましい。

以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１．加熱処理必要検体のスクリーニング
（１）ＲＴ－ＰＣＲ反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、有機溶媒の影響を評価した。
反応液 ３０μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プライマー液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
酵素液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
前処理液 ４μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）

（２）試料の調製方法
ノロウイルスＧ２陽性のヒト糞便１５検体を滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。

（３）反応
前処理を実施する条件では、前処理液 ４μＬに調製した試料をそれぞれ１μＬ添加した。前処理液との混合液をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製サーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００）にて、８５℃、１分間の加熱処理を行った。加熱処理後の前処理済液に前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液４５μＬ（反応液＋プライマー液＋プローブ液＋酵素液）を添加し、ＰＣＲ反応液とした。前処理を実施しない条件では、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液４５μＬに、前処理液４μＬを添加し、調製した試料をそれぞれ１μＬ添加し、加熱処理を行わずＰＣＲ反応液とした。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。後半３０サイクルの５４℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取りを行った。
４２℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒－５４℃ ２２秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ ２２秒 ３０サイクル（ＰＣＲ）

（４）結果
プローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）ではＦＡＭチャネルで内部コントロール遺伝子、Ｃｙ５チャネルでノロウイルスＧ１、ＲＯＸチャネルでノロウイルスＧ２を検出する。ここでは、Ｇ１、Ｇ２ ＲＮＡのＣｑ値を示す。この結果、熱処理を実施した条件では、全てのＧ２陽性の検体の検出が確認された（表１）。これに対して、前処理を実施しなかった検体においては、１１検体において検出を確認できなかった（表２）。これは加熱処理を行わなかったことで、検体中のウイルスのキャプシド構造が壊れず、ウイルス粒子の中からＲＮＡ分子が出てこなかったことに起因すると考えられる。本検討において、Ｇ２陽性シグナルを確認できなかった検体を加熱処理必要検体とした。

実施例２．１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応に利用できる溶媒のスクリーニング
（１）ＲＴ－ＰＣＲ反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、各溶媒のＲＴ―ＰＣＲへ与える影響を評価した。
反応液 ３０μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プライマー液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
酵素液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
前処理液 ４μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）

（２）溶媒条件
条件１ 蒸留水
条件２ ８Ｍウレア
条件３ エタノール
条件４ メタノール
条件５ １―プロパノール
条件６ ２－プロパノール
条件７ １－ブタノール
条件８ アセトン
条件９ １，４－ジオキサン
条件１０ ピリジン
条件１１ ジメチルスルホキシド
条件１２ トリエチルアミン
条件１３ 酢酸－３－メチルブチル
条件１４ アニソール
条件１５ ヘキサン
条件１６ ベンジン

（３）反応
反応チューブに前記溶媒を各２μＬずつ添加し、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液４９μＬ（反応液＋プライマー液＋プローブ液＋酵素液＋前処理液）を添加した。これにノロウイルスＧ２の合成ＲＮＡ２５０コピーを添加した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。後半３０サイクルの５４℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取りを行った。
４２℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒－５４℃ ２２秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ ２２秒 ３０サイクル（ＰＣＲ）

（４）結果
この結果のＧ２ ＲＮＡのＣｑ値を図１に示す。この結果、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、１，４－ジオキサン、ピリジンではＲＴ－ＰＣＲ反応を完全に阻害し、Ｇ２のシグナルが確認されなかった。また、アニソールでは蒸留水添加条件と比較し、Ｃｑ値が顕著に上昇し、ＰＣＲ阻害が起こっていることが確認された。

実施例３．ウイルス含有検体に対する前処理効果を持つ溶媒のスクリーニング
（１）ＲＴ－ＰＣＲ反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、各溶媒の検体の前処理効果を評価した。
反応液 ３０μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プライマー液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
酵素液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
前処理液 ４μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）

（２）溶媒条件
条件１ 蒸留水
条件２ ８Ｍウレア
条件３ エタノール
条件４ メタノール
条件５ アセトン
条件６ ジメチルスルホキシド
条件７ トリエチルアミン
条件８ 酢酸－３－メチルブチル
条件９ アニソール
条件１０ ヘキサン
条件１１ ベンジン

（３）試料の調製方法
加熱処理必要検体であるノロウイルスＧ２陽性のヒト糞便検体ａ１を、滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。

（４）反応
反応チューブに前記の各溶媒を各２μＬずつ添加し、チューブの底に落ちていることを確認した。調製した試料１μＬを添加し、各溶媒と混合した。これに前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液４９μＬ（反応液＋プライマー液＋プローブ液＋酵素液＋前処理液）を添加した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。後半３０サイクルの５４℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取りを行った。
４２℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒－５４℃ ２２秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ ２２秒 ３０サイクル（ＰＣＲ）

（５）結果
この結果のＧ２ ＲＮＡのＣｑ値を図２に示す。この結果、エタノール、酢酸－３－メチルブチル、アニソール、ヘキサン、ベンジンでは検出が確認されず、ウイルス含有検体に対する前処理効果は確認されなかった。これに対し、メタノール、アセトン、トリエチルアミン、ジメチルスルホキシドではＧ２シグナルの検出を確認した。特にジメチルスルホキシドにおいては、前処理効果のある尿素と比較し、Ｃｑ値が３以上低いことから、ウイルス含有検体に対する前処理効果が高いことが確認された。

実施例４．ジメチルスルホキシドの有効濃度の検討
（１）ＲＴ－ＰＣＲ反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、ウイルス含有検体に対する前処理効果のジメチルスルホキシドの有効濃度を評価した。
反応液 ３０μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プライマー液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
酵素液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
前処理液 ４μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）

（２）試料の調製方法
加熱処理必要検体であるノロウイルスＧ２陽性のヒト糞便検体ｅ１、ｆ１、ｈ２を、滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。

（３）ジメチルスルホキシドとの混合方法
蒸留水にて１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％ジメチルスルホキシド水溶液を調製し、以下の条件において試料ｅ１、ｆ１、ｈ２と混合した。
条件１ 各試料１μＬ、１００％ジメチルスルホキシド２μＬ（有効濃度６７％）
条件２ 各試料１μＬ、９０％ジメチルスルホキシド２μＬ（有効濃度６０％）
条件３ 各試料１μＬ、８０％ジメチルスルホキシド２μＬ（有効濃度５３％）
条件４ 各試料１μＬ、７０％ジメチルスルホキシド２μＬ（有効濃度４７％）
条件５ 各試料１μＬ、６０％ジメチルスルホキシド２μＬ（有効濃度４０％）
条件６ 各試料１μＬ、５０％ジメチルスルホキシド２μＬ（有効濃度３３％）
条件７ 各試料１μＬ、４０％ジメチルスルホキシド２μＬ（有効濃度２７％）
条件８ 各試料１μＬ、蒸留水２μＬ

（４）反応
反応チューブに前記条件の各ジメチルスルホキシド水溶液２μＬずつ添加し、チューブの底に落ちていることを確認した。調製した試料１μＬを添加し、混合した。これに前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液４９μＬ（反応液＋プライマー液＋プローブ液＋酵素液＋前処理液）を添加した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。後半３０サイクルの５４℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取りを行った。
４２℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒－５４℃ ２２秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ ２２秒 ３０サイクル（ＰＣＲ）

（５）結果
この結果、各条件におけるＧ２シグナルのＣｑ値を表３に示す。試料によって有効濃度は異なるが、試料とジメチルスルホキシドの混合液において、ジメチルスルホキシドの有効濃度が４０％以上、さらに好ましくは５０％以上で、混合しなかった条件に比べ、有意な検出感度の改善が認められた。この際、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中のジメチルスルホキシド濃度は２．４％～４％である。

実施例５．ジメチルスルホキシドのＲＴ－ＰＣＲ反応液への持ち込み許容量検討
（１）ＲＴ－ＰＣＲ反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、ジメチルスルホキシド持ち込み量がＲＴ―ＰＣＲへ与える影響を評価した。
反応液 ３０μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プライマー液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
酵素液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）

（２）ジメチルスルホキシドの添加量
条件１ ０μＬ ジメチルスルホキシド、５μＬ蒸留水 （最終濃度０％）
条件２ １μＬ ジメチルスルホキシド、４μＬ蒸留水（最終濃度２％）
条件３ ２μＬ ジメチルスルホキシド、３μＬ蒸留水（最終濃度４％）
条件４ ３μＬ ジメチルスルホキシド、２μＬ蒸留水（最終濃度６％）
条件５ ４μＬ ジメチルスルホキシド、１μＬ蒸留水（最終濃度８％）
条件６ ５μＬ ジメチルスルホキシド、０μＬ蒸留水（最終濃度１０％）

（３）反応
反応チューブにジメチルスルホキシドと蒸留水を前記条件に記載した容量ずつ添加し、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液４５μＬ（反応液＋プライマー液＋プローブ液＋酵素液）を添加した。これにノロウイルスＧ２およびＧ１の合成ＲＮＡを２５０コピー、５０コピー、１０コピーを添加した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。後半３０サイクルの５４℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取りを行った。
４２℃ ５分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒－５４℃ ２２秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ ２２秒 ３０サイクル（ＰＣＲ）

（４）結果
この結果、各試料のＧ１およびＧ２シグナルのＣｑ値を表４に示す。ジメチルスルホキシドの最終濃度が１０％で、Ｇ１およびＧ２シグナルは２５０コピーでのＣｑ値の増大が確認され、５０コピー及び１０コピーにおいてはシグナルが確認されなくなった。この結果より、５０コピー前後の検出を目的としたＲＴ－ＰＣＲを実施する際、ジメチルスルホキシドの反応液への持ち込み許容量としては、１０％以下と考えられ、更に好ましくは８％以下である。しかしながら、２５０コピー以上のノロウイルスＧ１及びＧ２ＲＮＡを検出する際には１０％以上の持ち込みも許容される。

実施例６．ジメチルスルホキシド処理と従来型前処理法の比較
（１）ＲＴ－ＰＣＲ反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、ＰＣＲ反応時間を短縮した条件において、ジメチルスルホキシドによるウイルス含有検体の前処理効果と、従来型の前処理方法を比較評価した。
反応液 ３０μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プライマー液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液 ５μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）
酵素液 ５μＬ
０．８ｕｎｉｔ／μＬ ｒＴｔｈ変異体 ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
０．２４μｇ／μＬ 抗Ｔｔｈ抗体（東洋紡）
１ｕｎｉｔ／μｌ ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
前処理液 ４μＬ
（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）

（２）試料の調製方法
加熱処理必要検体であるノロウイルスＧ２陽性のヒト糞便検体ｅ２、ｇ２を、滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。

（３）ジメチルスルホキシド処理による検出
ジメチルスルホキシド２μＬと試料１μＬを混合後、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液４５μＬ（反応液＋プライマー液＋プローブ液＋酵素液）を加え、ＢｉｏＲａｄ社ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、（６）に記載の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施し、後半３０サイクルの５４℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取を行った。

（４）カオトロピック処理による検出
８Ｍ尿素水溶液 ２μＬと試料１μＬを混合後、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液４５μＬ（反応液＋プライマー液＋プローブ液＋酵素液）を加え、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ
ＤＥＥＰを使用して、（６）に記載の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施し、後半３０サイクルの５４℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取を行った。

（５）熱処理法による検出
試料１μＬに前処理液４μＬを添加し、８５℃、１分間の熱処理を実施した。前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液４５μＬ（反応液＋プライマー液＋プローブ液＋酵素液）を混合後、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰを使用して、（６）に記載の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施し、後半３０サイクルの５４℃の伸長ステップにおいて蛍光値の読取りを行った。

（６）反応サイクル
４２℃ ３分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒－５４℃ ５秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ ５秒 ３０サイクル（ＰＣＲ）

（７）結果
各前処理方法を実施した際のＧ２シグナルのＣｑ値を図３に示す。本検討において、Ｇ２シグナルが得られた前処理方法はジメチルスルホキシドにおける処理のみであった。これはＲＴ－ＰＣＲ反応時間の短縮化に伴って、ウイルスのキャプシド構造の破砕効率が低く、反応液中へのＲＮＡの漏洩が少ない条件では、鋳型となるＲＮＡ量が不足し、ＲＴ－ＰＣＲが十分に反応しなかった事が原因として考えられる。よって、従来より知られる加熱処理法およびカオトロピック剤処理法と比較し、本発明のジメチルスルホキシド処理法では、検体中のウイルスのカプシド破砕効率が高いことが示された。

実施例７．ジメチルスルホキシド処理と従来型加熱処理法の作業時間の比較
（１）作業工程
ジメチルスルホキシド処理と加熱処理工程を含む前処理方法の主な作業工程を図４に示した。加熱処理工程を含む方法における反応容器の蓋の開閉には、日本ジェネティクス株式会社の専用冶具（Ｆａｓｔ Ｇｅｎｅ Ｃａｐ ｅａｓｙ）を利用した。

（２）比較方法
図４に示した作業フローにおいて、ＲＴ－ＰＣＲ反応の９６サンプル分の調製に要する時間を測定した。測定は５回実施し、平均値を算出し比較した。

（３）結果
加熱処理工程を含む従来法では、２１分３０秒程度時間を要するのに対し、本発明のジメチルスルホキシド処理では１４分程度であり、作業時間が３６％短縮される結果となった（図５）。
ＲＴ－ＰＣＲ反応時間はＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬ ＤＥＥＰにて以下の反応サイクルにて実施した場合、４５分となる。
４２℃ ３分（逆転写反応）、
９５℃ １０秒、
９５℃ １秒－５４℃ ５秒 １０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ ５秒 ３０サイクル（ＰＣＲ）
ジメチルスルホキシド処理を利用した前処理法の所要時間と合わせると５９分となり、検体の処理から、測定までの所要時間は１時間以内で達成できる。

本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理などを目的とした検査において、好適に用いられる。

Claims (20)

1. 糞便試料中のエンベロープを持たないＲＮＡウイルスの検査方法であって、糞便試料からのＲＮＡ精製、または糞便試料の事前の熱処理のない、以下の工程を含むことを特徴とする糞便試料中のウイルスの存在の有無を検査するためのウイルスの検査方法。
   （１）糞便試料と、メタノール、アセトン、トリエチルアミン、及びジメチルスルホキシドよりなる群から選択される少なくとも一種の極性有機溶媒を含む試薬とを混合する工程であって、混合液中における前記極性有機溶媒の有効濃度が４０％以上１００％未満となるように混合する、工程、
   （２）前記混合液に逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する工程、
   （３）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
2. 前記工程（１）の混合液中における前記極性有機溶媒の有効濃度が５０％以上８５％以下である請求項１に記載のウイルスの検査方法。
3. 前記工程（１）、（２）が同一容器で行われることを特徴とする請求項１又は２に記載のウイルスの検査方法。
4. 工程（３）において反応容器を密閉後、一度もフタを開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
5. 糞便試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された糞便懸濁液である請求項１から４のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
6. 糞便試料が糞便懸濁液の遠心上清である請求項１から５のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
7. エンベロープを持たないＲＮＡウイルスがノロウイルスである請求項１から６のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
8. ノロウイルスがＧ１型かＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする請求項７に記載のウイルスの検査方法。
9. ＤＮＡポリメラーゼが、ＴａｑおよびＴｔｈよりなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
10. 逆転写酵素の由来が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）およびトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）からなる群より選択されるいずれかであることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
11. 工程（３）における１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、０．５ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
12. ベタイン様４級アンモニウム塩が、ベタインまたはＬ－カルニチンである請求項１１に記載のウイルスの検査方法。
13. 試料の処理から１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応が完了するまでの所要時間が１時間以内である請求項１から１２のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
14. 前記工程（２）の１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に持ち込まれる前記極性有機溶媒の最終濃度が８％以下である請求項１から１３のいずれかに記載のウイルスの検査方法。
15. メタノール、アセトン、トリエチルアミン、及びジメチルスルホキシドよりなる群から選択される少なくとも一種の極性有機溶媒を含む試薬と、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを含み、請求項１から１４のいずれかに記載のウイルスの検査方法に用いるための、エンベロープを持たないウイルスの検査用キット。
16. 前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、ベタイン様４級アンモニウム塩、０．５ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含む請求項１５に記載のウイルスの検査用キット。
17. 検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応するプライマー対をさらに含むことを特徴とする請求項１５または１６に記載のウイルスの検査用キット。
18. 検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブをさらに含むことを特徴とする請求項１５から１７のいずれかに記載のウイルスの検査用キット。
19. エンべロープを持たないＲＮＡウイルスがノロウイルスである請求項１５から１８のいずれかに記載のウイルスの検査用キット。
20. ノロウイルスがＧ１型かＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする請求項１９に記載のウイルスの検査用キット。

Images