JP2020156470A - 非特異増幅が抑制された核酸増幅法 - Google Patents
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Abstract
Description
代表的な核酸増幅法は、PCRである。PCRは、(1)熱処理によるDNA変性(2本鎖DNAから1本鎖DNAへの解離)、(2)鋳型1本鎖DNAへのプライマーのアニーリング、(3)DNAポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という3ステップを1サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、2ステップで行う場合もある。
[項1] 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中の標的RNAの有無を検査する方法:
(1)試料に対して、反応液中終濃度が0.2ng/μL以上6ng/μL以下になるように調整された多糖類と耐熱性DNAポリメラーゼとを含む一酵素系1ステップRT−PCR反応液を添加する工程、及び、
(2)反応容器を密閉後、1ステップRT−PCR反応によって試料中の標的RNAの有無を検査する工程。
[項2] 前記多糖類が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種の酸性多糖類である、項1に記載の方法。
[項3] 前記多糖類がヘパリン及び/又はその塩であることを特徴とする項1又は2に記載の方法。
[項4] 前記多糖類の反応液中終濃度が0.2ng/μL以上4ng/μL以下となるように調整されていることを特徴とする項1から3のいずれかに記載の方法。
[項5] 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液における前記耐熱性DNAポリメラーゼの総量が4.2ng/μL以上である項1から4のいずれかに記載の方法。
[項6] 工程(1)において核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料を用いる、項1〜5のいずれかに記載の方法。
[項7] 前記工程(1)及び(2)が同一容器で行われることを特徴とする項1から6のいずれかに記載の方法。
[項8] 工程(2)において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく1ステップRT−PCR反応を実施することを特徴とする項1から7のいずれかに記載の方法。
[項9] 工程(2)において、PCRサイクル反応の前及び/又はPCRサイクル反応中に、試料中で核酸を露出させるため及び/又はPCR反応においてホットスタートPCRを行うために熱処理を実施することを含む項1から8のいずれかに記載の方法。
[項10] 前記熱処理が、60℃以上であり、かつ1秒以上の加熱を行うことを特徴とする項9に記載の方法。
[項11] 試料が血液試料、糞便試料、及び/又は拭き取り検査試料である項1から10のいずれかに記載の方法。
[項12] 試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された試料懸濁液である項1から11のいずれかに記載の方法。
[項13] 試料が試料懸濁液の遠心上清である項1から12のいずれかに記載の方法。
[項14] 前記標的RNAがエンベロープをもたないRNAウイルス由来の核酸であることを特徴とする項1から13のいずれかに記載の方法。
[項15] RNAウイルスがノロウイルスである項14に記載の方法。
[項16] ノロウイルスがGI型かGII型であるかの判別が可能であることを特徴とする項15に記載の方法。
[項17] 前記耐熱性DNAポリメラーゼがFamily Aに属するDNAポリメラーゼであることを特徴とする項1から16のいずれかに記載の方法。
[項18] 前記耐熱性DNAポリメラーゼが、Taq、Tth、Z05およびそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼであることを特徴とする項1から17のいずれかに記載の方法。
[項19] RT−PCR反応液が、検出対象の標的RNAの検出領域に対応するプライマー対をさらに含む項1から18のいずれかに記載の方法。
[項20] RT−PCR反応液が、検出対象の標的RNAの検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブをさらに含む項1から19のいずれかに記載の方法。
[項21] 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液が、更に1mM以上の2価陽イオンを含む、項1から20のいずれかに記載の方法。
[項22] 一酵素系1ステップRT−PCR反応において非特異増幅を抑制する方法であって、RT−PCR反応液において終濃度が0.2ng/μL以上6ng/μL以下となるように調整された多糖類と耐熱性DNAポリメラーゼとを共存させることを特徴とする、方法。
[項23] 項1〜22のいずれかに記載の方法に用いるための一酵素系1ステップRT−PCR反応用組成物であって、RT−PCR反応液中終濃度が0.2ng/μL以上6ng/μL以下となるように調整された多糖類、及び耐熱性DNAポリメラーゼ、を含むことを特徴とする、一酵素系1ステップRT−PCR反応用組成物。
[項24] 項23に記載の一酵素系1ステップRT−PCR反応用組成物を含むことを特徴とする、試料中の標的RNAの有無を検査するためのキット。
(1)試料に対して、反応液中終濃度が0.2ng/μL以上6ng/μL以下になるように調整された多糖類と耐熱性DNAポリメラーゼとを含む一酵素系1ステップRT−PCR反応液を添加する工程、及び、
(2)反応容器を密閉後、1ステップRT−PCR反応によって試料中の標的RNAの有無を検査する工程。
本発明の上記検査方法によれば、非特異増幅を効果的に抑制することが可能になるので、非特異増幅を招きやすい条件での検査(例えば、夾雑物質を多量に含むような試料を用いる場合、DNAポリメラーゼの量が多い場合等)においても良好な検査結果を得ることができるという利点がある。
上記の安定性を高める方法において用いられる、多糖類、耐熱性DNAポリメラーゼ、試料等の種類や濃度等は、上述した試料中の標的RNAの有無を検査する方法と同様である。
上記の組成物において用いられる、多糖類及び耐熱性DNAポリメラーゼ、試料等の種類や濃度等もまた、上述した試料中の標的RNAの有無を検査する方法と同様である。
上記の試料中の標的RNAの有無を検査するためのキットにおいて用いられる、多糖類及び耐熱性DNAポリメラーゼ、試料等の種類や濃度等もまた、上述した試料中の標的RNAの有無を検査する方法と同様である。
(1)試料
事前に精製されたノロウイルスG1、G2合成RNA 50コピー(N=3)を各RT−PCR反応液にスパイクした。この試料は、事前に単離して精製されたRNAを反応液に添加していることから、糞便や血液などの生体由来成分の夾雑物質を含んでいない試料といえる。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける糞便存在下での酵素量の検討を実施した。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
0.01μg/μl 抗Tth抗体
(2−2)酵素量
条件1 4.2ng/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件2 8.3ng/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件3 12.5ng/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件4 16.7ng/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μlずつに分注した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。この反応の間、反応液を添加した容器の蓋は開閉せず、最初から最後まで同一の容器内で反応を行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
プローブ液(ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出―(東洋紡)添付品)ではFAMチャネルで内部コントロール遺伝子、Cy5チャネルでノロウイルスG1、ROXチャネルでノロウイルスG2を検出する。ここでは、G1、G2 RNAの増幅曲線を図1に示す。条件1から条件4について、耐熱性DNAポリメラーゼの量を増加させるに従って、G1、G2共に増幅曲線の到達蛍光強度が減少した。この傾向は、ノロウイルスGII型の検出において顕著であった。この結果は、反応液中のポリメラーゼ量が増加するに従って、非特異増幅が増加していることを示唆している。
(1)試料
事前に精製されたノロウイルスG1、G2合成RNA 50コピー(N=3)を各RT−PCR反応液にスパイクした。この試料は、事前に単離して精製されたRNAを反応液に添加していることから、糞便や血液などの生体由来成分の夾雑物質を含んでいない試料といえる。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける糞便存在下での酵素量の検討を実施した。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
0.01μg/μl 抗Tth抗体
(2−2)酵素量
条件1 4.2ng/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件2 8.3ng/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件3 12.5ng/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件4 16.7ng/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMかつヘパリンナトリウムの終濃度が1.5ng/μlとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μlずつに分注した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。この反応の間、反応液を添加した容器の蓋は開閉せず、最初から最後まで同一の容器内で反応を行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1、G2 RNAの増幅曲線を図2に示す。条件1から条件4について、ヘパリンナトリウムが存在する場合には、耐熱性DNAポリメラーゼの量を増加させるに従って、G1、G2共に増幅曲線の到達蛍光強度は減少することなく、一定に保たれるかむしろ増加した。特に、耐熱性DNAポリメラーゼの量の増加に伴う蛍光強度の増加は、ノロウイルスGII型の検出において顕著であった。この結果は、反応液中にヘパリンが存在することで、反応液中の耐熱性DNAポリメラーゼの量が増加しても、非特異増幅の発生は抑制され、標的核酸に対する増幅反応の特異性が顕著に向上していることを示している。
(1)試料
事前に精製されたノロウイルスG1、G2合成RNA 250コピー(N=2)を各RT−PCR反応液にスパイクした。この試料は、事前に単離して精製されたRNAを反応液に添加していることから、糞便や血液などの生体由来成分の夾雑物質を含んでいない試料といえる。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける反応液中のヘパリン濃度による影響について検討を実施した。本試験例では、上記試験例2で良好な結果を示した高濃度の耐熱性DNAポリメラーゼを含むRT−PCR反応液で評価を行った。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
16.7ng/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μl 抗Tth抗体
(2−2)ヘパリン濃度
条件1 0ng/μl ヘパリンナトリウム
条件2 0.2ng/μl ヘパリンナトリウム
条件3 0.4ng/μl ヘパリンナトリウム
条件4 0.8ng/μl ヘパリンナトリウム
条件5 1.2ng/μl ヘパリンナトリウム
条件6 1.6ng/μl ヘパリンナトリウム
条件7 2.0ng/μl ヘパリンナトリウム
条件8 2.4ng/μl ヘパリンナトリウム
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μlずつに分注した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。この反応の間、反応液を添加した容器の蓋は開閉せず、最初から最後まで同一の容器内で反応を行った。
90℃ 1分
60℃ 5分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1、G2 RNAのCq値を表1に示す。ヘパリンナトリウムを全く添加していない条件1に比べて、ヘパリンナトリウムを0.2ng/μl添加した条件2におけるCq値は、G1の平均で1程度、G2の平均で4程度向上した。従って、ヘパリンナトリウムを0.2ng/μl添加した条件2では、同じ量の核酸を検出する場合、それぞれ21=2、24=16倍検出が容易になったといえる。また、ヘパリンナトリウムの添加量を増加するにつれて、Cq値が向上している。ヘパリンナトリウムを添加していない場合に比べて、G1では条件6で平均で2.5程度、G2では条件8で平均で7程度向上しており、同じ量の核酸を検出する場合、それぞれ22.5=5.7、27=128倍検出が容易になったと推測される。この結果は、反応液中にヘパリンが存在することで、標的核酸に対する増幅反応の特異性が顕著に向上し、標的核酸の検出が大幅に容易になったことを示している。従来、ヘパリン等の多糖類は、PCR反応を阻害する物質として知られていたことを考慮すると、本試験結果は全く予想外であった。そして、本試験例の結果から、核酸増幅反応の特異性向上に有効なヘパリンの濃度は、0.2ng/μl以上であることが明らかとなった。
(1)試料
事前に精製されたノロウイルスG1合成RNA 250コピー(N=2)を各RT−PCR反応液にスパイクした。この試料は、事前に単離して精製されたRNAを反応液に添加していることから、糞便や血液などの生体由来成分の夾雑物質を含んでいない試料といえる。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける反応液中のヘパリン濃度の検討を実施した。本試験例においても、上記試験例2で良好な結果を示した高濃度の耐熱性DNAポリメラーゼを含むRT−PCR反応液で評価を行った。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
16.7ng/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μl 抗Tth抗体
(2−2)ヘパリン濃度
条件1 0ng/μl ヘパリンナトリウム
条件2 0.75ng/μl ヘパリンナトリウム
条件3 1.5ng/μl ヘパリンナトリウム
条件4 2.0ng/μl ヘパリンナトリウム
条件5 2.5ng/μl ヘパリンナトリウム
条件6 3.0ng/μl ヘパリンナトリウム
条件7 3.5ng/μl ヘパリンナトリウム
条件8 4.0ng/μl ヘパリンナトリウム
条件9 6.0ng/μl ヘパリンナトリウム
条件10 12.0ng/μl ヘパリンナトリウム
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μlずつに分注した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。この反応の間、反応液を添加した容器の蓋は開閉せず、最初から最後まで同一の容器内で反応を行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1 RNAのCq値を表2に示す。今回の条件では、試験例3と逆転写温度の条件を変更している。逆転写反応時間を短くした場合においても、ヘパリンナトリウムを全く添加していない条件1に比べて、ヘパリンナトリウムを添加した条件2から条件9でCq値が向上した。さらにヘパリンナトリウムの濃度を上昇させて条件10とした場合には、大幅な阻害は確認されなかったものの、Cq値の向上は認められなかった。試験例3の結果も含めて総合考慮すると、核酸増幅反応の特異性向上に有効なヘパリンの濃度は、0.2ng/μl以上であれば、RT−PCR反応を阻害することなく使用することができ、0.2ng/μlから6ng/μlの範囲で、非特異増幅を抑制する効果が顕著に表れるといえる。
(1)試料
事前に精製されたノロウイルスG1、G2合成RNA1250コピーを各RT−PCR反応液にスパイクした。この試料は、事前に単離して精製されたRNAを反応液に添加していることから、糞便や血液などの生体由来成分の夾雑物質を含んでいない試料といえる。
(2)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける耐熱性DNAポリメラーゼを検討した。ここで使用した2種類の耐熱性DNAポリメラーゼはいずれも、逆転写活性を有することが知られている。
(2−1)Thermus species Z05由来の耐熱性DNAポリメラーゼ
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10ng/μl HawkZ05 Fast DNA Polymerase(Roche(ポリメラーゼ濃度はNanodrop測定値))
0.01μg/μl 抗Tth抗体
0.2ng/μl ヘパリンナトリウム
(2−2)Thermus acqaticus由来の耐熱性DNAポリメラーゼ
Volcano2G RT−PCR 2x Master Mix(myPOLS Biotech)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
20ng/μl Volcano 2G DNA Polymerase(myPOLS Biotech)(ポリメラーゼ濃度はNanodrop測定値))
0.2ng/μl ヘパリンナトリウム
(3)反応
(2−1)において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μlずつに分注した。(2−2)において、Volcano 2G DNA Polymerase添付の取り扱い説明書に従い、RT−PCR反応液を調製した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。この反応の間、反応液を添加した容器の蓋は開閉せず、最初から最後まで同一の容器内で反応を行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
条件1及び2のいずれの条件においても、ヘパリンナトリウムを添加してもRT−PCRを阻害することなく、G1、G2共にノロウイルス合成RNA 1250コピーを検出することが可能であった。
(1)試料
(1−1)拭き取り試料
不活化ノロウイルス NATtrol Norovirus GI/GII Positive Control(ZeptoMetrix、intact) 1000コピー(N=2)をプラスチック板の10cm×10cm(100cm2)領域に塗布した。BDラスパーチェックTMふき取り検査用スワブ(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)と濃縮液(ノロウイルス検出キットG1/G2 −ふき取り− <3色プローブ検出>(東洋紡)添付品)を用いて、上記の10cm×10cm(100cm2)領域から拭き取り検体の回収と濃縮を実施した。拭き取り検体の回収と濃縮は、取扱説明書(ノロウイルス検出キットG1/G2 −ふき取り− <3色プローブ検出>(東洋紡)添付品)に従った。濃縮後の白色沈殿を、前処理液1μL(ノロウイルス検出キットG1/G2 −ふき取り− <3色プローブ検出>(東洋紡)添付品)で懸濁して、RT−PCR反応液にスパイクした。
(1−2)スパイク試料(コントロール)
不活化ノロウイルス NATtrol Norovirus GI/GII Positive Control(ZeptoMetrix、intact) 100コピー(N=2)をRT−PCR反応液にスパイクした。
(2)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける不活化ノロウイルスの検出を実施した。本試験例では、上記試験例2、3および4で良好な結果を示した高濃度の耐熱性DNAポリメラーゼを含むRT−PCR反応液で評価を行った。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
17.6ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
0.5ng/μl ヘパリンナトリウム
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μLずつに分注した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1、G2 不活化ウイルスのCq値を表3に示す。拭き取り試料の不活化ノロウイルス1000コピー、スパイク試料の不活化ノロウイルス100コピーをいずれも検出可能であった。従って、本発明は、拭き取り検査試料中のノロウイルスの検出にも適応可能であることが判明した。
(1)試料の調製
ヒト糞便16検体を10%(重量%)となるように蒸留水に懸濁した。この懸濁液を12,000rpmで5分間遠心し、上清を採取した。本試験例では、これ以上の核酸の分離精製処理も加熱処理も行わず、採取した上清をそのまま生体試料として使用した。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける反応液中のヘパリン濃度の検討を実施した。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
16.7ng/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μl 抗Tth抗体
(2−2)ヘパリン濃度
条件1 0ng/μl ヘパリンナトリウム
条件2 0.5ng/μl ヘパリンナトリウム
条件3 1.0ng/μl ヘパリンナトリウム
(3)反応
各条件において、便懸濁液も含めたMnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、19μlずつに分注した。これらのRT−PCR反応液に対し、便懸濁液1μLを添加した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。この反応の間、反応液を添加した容器の蓋は開閉せず、最初から最後まで同一の容器内で反応を行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
糞便中のノロウイルスG1、G2のCq値を表4に示す。標的核酸が検出されなかった場合をハイフンで示す。検体1から検体6までの6検体は、いずれのヘパリン濃度の条件でもノロウイルスが検出されなかった。検体7と検体8の2検体では、いずれの条件でもG1陽性となった。検体9から検体16までの8検体では、条件2及び条件3ではいずれもG2陽性となり、条件1では検体9及び検体13は陰性となった。検体9及び検体13は、条件2、3においてもCq値が高く、標的核酸の濃度が極めて低い検体であったことが想定される。しかしながら、ヘパリンを反応液に添加した条件2及び条件3では、このような検体であっても標的核酸を検出できており、ヘパリンを添加していない条件1に比べて、ノロウイルスの検出感度が向上していることがわかる。また、各条件におけるCq値を比較すると、ヘパリンを反応液に添加した条件2及び条件3では、ヘパリンを添加していない条件1に比べ、Cq値の平均が向上している(検出されなかったサンプルについては、Cq値を35として計算する)。従って、反応液中にヘパリンが存在することで、PCR反応の非特異増幅が抑制されて標的核酸に対する増幅反応の特異性が改善され、Cq値が向上するとともに、ノロウイルスの検出感度が顕著に向上したと結論付けられる。
Claims (24)
- 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中の標的RNAの有無を検査する方法:
(1)試料に対して、反応液中終濃度が0.2ng/μL以上6ng/μL以下になるように調整された多糖類と耐熱性DNAポリメラーゼとを含む一酵素系1ステップRT−PCR反応液を添加する工程、及び、
(2)反応容器を密閉後、1ステップRT−PCR反応によって試料中の標的RNAの有無を検査する工程。 - 前記多糖類が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種の酸性多糖類である、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖類がヘパリン及び/又はその塩であることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記多糖類の反応液中終濃度が0.2ng/μL以上4ng/μL以下となるように調整されていることを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液における前記耐熱性DNAポリメラーゼの総量が4.2ng/μL以上である請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 工程(1)において核酸の分離精製処理も加熱処理も行っていない試料を用いる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記工程(1)及び(2)が同一容器で行われることを特徴とする請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 工程(2)において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく1ステップRT−PCR反応を実施することを特徴とする請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 工程(2)において、PCRサイクル反応の前及び/又はPCRサイクル反応中に、試料中で核酸を露出させるため及び/又はPCR反応においてホットスタートPCRを行うために熱処理を実施することを含む請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 前記熱処理が、60℃以上であり、かつ1秒以上の加熱を行うことを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 試料が血液試料、糞便試料、及び/又は拭き取り検査試料である請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された試料懸濁液である請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 試料が試料懸濁液の遠心上清である請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- 前記標的RNAがエンベロープをもたないRNAウイルス由来の核酸であることを特徴とする請求項1から13のいずれかに記載の方法。
- RNAウイルスがノロウイルスである請求項14に記載の方法。
- ノロウイルスがGI型かGII型であるかの判別が可能であることを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記耐熱性DNAポリメラーゼがFamily Aに属するDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項1から16のいずれかに記載の方法。
- 前記耐熱性DNAポリメラーゼが、Taq、Tth、Z05およびそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項1から17のいずれかに記載の方法。
- RT−PCR反応液が、検出対象の標的RNAの検出領域に対応するプライマー対をさらに含む請求項1から18のいずれかに記載の方法。
- RT−PCR反応液が、検出対象の標的RNAの検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブをさらに含む請求項1から19のいずれかに記載の方法。
- 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液が、更に1mM以上の2価陽イオンを含む、請求項1から20のいずれかに記載の方法。
- 一酵素系1ステップRT−PCR反応において非特異増幅を抑制する方法であって、RT−PCR反応液において終濃度が0.2ng/μL以上6ng/μL以下となるように調整された多糖類と耐熱性DNAポリメラーゼとを共存させることを特徴とする、方法。
- 請求項1〜22のいずれかに記載の方法に用いるための一酵素系1ステップRT−PCR反応用組成物であって、RT−PCR反応液中終濃度が0.2ng/μL以上6ng/μL以下となるように調整された多糖類、及び耐熱性DNAポリメラーゼ、を含むことを特徴とする、一酵素系1ステップRT−PCR反応用組成物。
- 請求項23に記載の一酵素系1ステップRT−PCR反応用組成物を含むことを特徴とする、試料中の標的RNAの有無を検査するためのキット。
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