JP7140762B2 - 非エンベロープ型rnaウイルスの有無を検出する方法 - Google Patents
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Description
[1] 排出検体に由来する試料中の、非エンベロープ型RNAウイルスの有無を検出する方法であって、
(a)RNAウイルスを含有する可能性のある試料を含むアルカリ性の混合液を調製する工程、
(b)工程(a)で得られた混合液を加熱せず放置する工程、及び
(c)工程(b)の放置後の混合液をcDNA合成反応に供する工程、
を包含する、RNAウイルスの検出方法。
[2] 工程(a)が、RNAウイルスを含有する可能性のある試料に強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、前記[1]記載の方法。
[3] 工程(a)が、RNAウイルスを含有する可能性のある試料をキレート剤を含む溶液で懸濁した後に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、前記[1]記載の方法。
[4] 強アルカリ性の水酸化物が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム及び水酸化カルシウムからなる群より選択される1種以上である、前記[2]又は[3]記載の方法。
[5] 工程(a)におけるアルカリ性の混合液が水酸化ナトリウムを含有し、該水酸化ナトリウムの濃度が20~70mMである、前記[1]~[4]のいずれか1項に記載の方法。
[6] 工程(d)として、工程(c)で得られたcDNAを鋳型とする核酸増幅の工程をさらに含むことを特徴とする、前記[1]~[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7] 工程(d)における核酸増幅が、PCRにより実施されることを特徴とする、前記[6]記載の方法。
[8] 工程(c)と工程(d)が、同一の反応液内で行われることを特徴とする、前記[6]又は[7]記載の方法。
[9] 工程(b)が、室温での放置により実施されることを特徴する、前記[1]~[8]のいずれか1項に記載の方法。
[10] 工程(b)が、30℃以下での放置により実施されることを特徴する、前記[1]~[9]のいずれか1項に記載の方法。
[12] 工程(a)におけるRNAウイルスを含有する可能性のある試料が、糞便懸濁液上清であることを特徴とする、前記[1]~[11]のいずれか1項に記載の方法。
[13] 糞便懸濁液上清が、糞便を滅菌水、生理食塩水又はPBSに懸濁して、調製されたことを特徴とする、前記[12]記載の方法。
[14] アルカリ性の混合液を、中和可能な物質と接触させることを特徴とする、前記[1]~[13]のいずれか1項に記載の方法。
[15] 中和可能な物質が、工程(c)におけるcDNA合成反応を実施する反応液中に含まれることを特徴とする、前記[14]記載の方法。
[16] 生体排出検体に由来する試料中の、非エンベロープ型RNAウイルスの有無を検出する方法であって、
(a)RNAウイルスを含有する可能性のある試料を含むアルカリ性の混合液を調製する工程、及び
(b’)工程(a)で得られた混合液を加熱することなくcDNA合成反応に供する工程、
を包含する、RNAウイルスの検出方法。
[17] 工程(a)が、RNAウイルスを含有する可能性のある試料をキレート剤を含む溶液で懸濁した後に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、前記[16]記載の方法。
[18] 前記[1]又は[16]記載の方法のためのキットであって、
(i)強アルカリ性の水酸化物を含む溶液、
(ii)逆転写酵素、
(iii)逆転写反応用試薬、
(iv)耐熱性DNAポリメラーゼ、及び
(v)DNAポリメラーゼ連鎖反応用試薬、を含むキット。
[19] さらに、(vi)キレート剤を含む溶液、を含む前記[18]記載のキット。
アルカリ性の混合液を調製するための具体的な方法としては、例えば、RNAウイルスを含有する可能性のある試料に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加する方法が挙げられる。この場合の強アルカリ性の水酸化物溶液中の水酸化物の濃度は、試料との混合比により適宜調整すればよいが、混合後の「アルカリ性の混合液」における水酸化物の終濃度として、好ましくは10mM~100mM、より好ましくは20mM~70mM、更に好ましくは30mM~60mM、更に好ましくは30~40mMである。強アルカリ性の水酸化物を複数種使用する場合、各水酸化物の濃度の合計が上記範囲を満たすことが好ましい。
試料と前処理液を混合して得られるアルカリ性の混合液は、従来技術とは異なり、加熱せずに放置しても十分精度の高い結果を得ることができる。
本発明においては、アルカリ性溶液のみ、あるいは前述のキレート剤とアルカリ性溶液の組み合わせのいずれにおいても、室温で実施することが可能である。従って、工程(b)の好ましい態様の一つは、工程(b)を室温での放置により実施することである。ここで、室温とは作業員が作業しやすい環境温度を言う。混合液を放置する温度としては、好ましくは、30℃以下、より好ましくは、25℃以下である。処理時間、即ち放置時間は、特に限定はなく、アルカリ性混合液を入れた後、直ちにRT-PCRに供してもよく、2~60分間保持してからRT-PCRに供してもよく、検体数に応じて適宜調整することができる。保持時間による反応に大差はない。
以上のように工程(b)で処理された試料を含むアルカリ性の混合液(本明細書において、「前処理後の試料」とも記載する)を逆転写反応に供して、当該混合液に含有されるRNAに相補的なDNA(cDNA)を合成することができる。なお、本発明の好適な態様では、前処理後の試料を含む逆転写反応液を作成する前に、当該前処理後の試料から特定の成分を除去する操作や加熱処理を行う必要はない。
本発明の方法において、得られたcDNAを鋳型とした核酸増幅を利用すると、微量のウイルスゲノムRNAを検出することができる。従って、本発明において、かかる工程(d)をさらに含むことがより好ましい。
American Type Culture Collection (ATCC)より購入したVR-782,Feline calicivirus,F-9 (Caliciviridae)、ネコカリシウイルス(FCV)を20倍になるよう生理食塩水で希釈してウイルス懸濁液を作成した。FCVが検出できるよう、別途FCV Primer/Probe Mixを作成した。該懸濁液1μLに対し6.25、12.5、25、100mMのNaOH溶液を4μLずつ添加し、NaOHの終濃度5mM、10mM、20mM、40mM、80mMのアルカリ性の混合液を調製した。該混合液を室温(27℃)にて5分間放置後、前処理後の試料とした。
2μM FCV検出プライマー CCATTGGTGCTAATAGGGAAAGG(配列番号1)
2μM FCV検出プライマー CCACCACGAGCACCAGTTT(配列番号2)
2μM FCV検出プローブ FAM-TGCGCATCAGCACGCTTCCC-BHQ1(配列番号3)
5.0μL 前処理後の試料
12.0μL PCR Buffer(NV)4
2.5μL FCV Primer/Probe Mix
1.5μL Enzyme Mix(NV)4
4.0μL 滅菌水
前記反応液25μLを以下の温度サイクルで反応した。
42℃ 5min、
95℃ 30sec、
95℃ 5sec-54℃ 30sec 45サイクル(FAM、ROX、Cy5蛍光検出)
実施例1で調製したFCV懸濁液1μLに対し、50mMのNaOH溶液を4μL添加し、NaOHの終濃度40mMのアルカリ性の混合液5μLを調製し室温(27℃)に放置した。該混合液を前処理後の試料とした。
この前処理後の試料を用いて実施例1と同様の組成物のRT-PCR用反応液を調製し、実施例1と同様の反応条件でRT-PCRに供し、Ct値を求めた。なお、室温放置時間の検討として以下1~6番までの試験を実施した。
実施例1で調製したFCV懸濁液1μLに対し、42mMのNaOH溶液5μLを添加し、NaOHの終濃度35mMのアルカリ性の混合液を調製した。該混合液を氷上、室温(27℃)、37℃、50℃でそれぞれ10分放置後、前処理後の試料とした。
ノロウイルス陽性の糞便検体を5~10%(w/v)となるようPBSに懸濁した後、15,000rpmにて5分間遠心処理を行った。該上清1μLに対し、12、24、42、66、96mMのNaOH溶液を5μLずつ添加し、NaOHの終濃度10、20、35、55、80mMのアルカリ性の混合液を調製した。該混合液を室温(27℃)にて5min放置後、前処理後の試料とした。なお、ノロウイルスが検出できるよう、別途NV Primer/Probe Mixを作成した。
4μM NV検出プライマー CGYTGGATGCGNTTYCATGA(配列番号4)
4μM NV検出プライマー CTTAGACGCCATCATCATTYAC(配列番号5)
2μM NV検出プローブ FAM-AGATYGCGATCYCCTGTCCA-BHQ1(配列番号6)
4μM NV検出プライマー CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG(配列番号7)
4μM NV検出プライマー TCGACGCCATCTTCATTCACA(配列番号8)
2μM NV検出プローブ ROX-TGGGAGGGSGATCGCRATCT-BHQ2(配列番号9)
上記配列番号:4~6で示されるプライマーとプローブの組み合わせによって、ノロウイルスGIを検出することができ、上記配列番号:7~9で示されるプライマーとプローブの組み合わせによって、ノロウイルスGIIを検出することができる。
なお、上記配列番号:4及び配列番号:7における「N」とは、その塩基がアデニン、グアニン、シトシン又はチミンであることを示す記号である。
6.0μL 前処理後の試料
12.0μL PCR Buffer(NV)4
2.5μL NV Primer/Probe Mix4
1.5μL Enzyme Mix(NV)4
3.0μL 滅菌水
前記反応液25μLを以下の温度サイクルで反応した。なお、最初の5サイクルは蛍光検出を行っていないため、結果は5サイクルを足したCt値を表記した。
42℃ 5min、
95℃ 30sec、
95℃ 5sec-56℃ 40sec 5サイクル
90℃ 5sec-56℃ 40sec 35サイクル(FAM、ROX、Cy5蛍光検出)
実施例4と同様に調製したノロウイルス陽性懸濁液の上清1μLに対し、42mMのNaOH溶液5μLを添加し、アルカリ性の混合液を調製した。該混合液を室温(27℃)にそれぞれ、2、5、10、20、30分放置後、前処理後の試料とした。
実施例4と同様に調製したノロウイルス陽性懸濁液の上清1μLに対し、42mMのNaOH溶液5μLを添加し、NaOHの終濃度35mMのアルカリ性の混合液を調製した。該混合液を氷上で、2、5、10、20、30分放置後、前処理後の試料とした。
実施例4と同様に調製した、ノロウイルス陽性懸濁液の上清1μLに対し、42mMのNaOH溶液5μLを添加(NaOHの終濃度は35mM)して、アルカリ性の混合液(最終容量6μL)を調製した。一方で、ノロウイルス陽性懸濁液の上清1μLに対し、60mMのEGTA 1μL(終濃度10mM)を添加して撹拌して懸濁液を得、次いでこれに52.5mMのNaOH溶液4μLを添加(NaOHの終濃度35mM)して、アルカリ性の混合液(最終容量6μL)を調製した。これらのアルカリ性の混合液を室温(27℃)で30分放置した後、前処理後の試料とした。
実施例4と同様に調製したノロウイルス陽性懸濁液の上清1μLに対し、氷上で42mMのNaOH水溶液を5μL添加(終濃度35mM)し、アルカリ性の混合液(最終容量6μL)を調製した。該混合液は氷上で30分放置した。
ノロウイルス陽性の糞便検体を10%(w/v)糞便懸濁液となるように、100mM EGTA2ナトリウム溶液で懸濁した。この時、EGTA濃度は終濃度で60mMである。次に前記糞便懸濁液1μLにNaOH溶液5μLを添加した。この時、NaOH濃度は、終濃度で35mMである。当該アルカリ性の混合液6μLを直ちにRT-PCRに供した場合のCt値と室温(27℃)又は氷上で5分間、15分間又は30分間それぞれ保持した後にRT-PCRに供した場合のCt値とを比較した。
試験用の検体として実検体、即ち、被験者より採取されたノロウイルスGIの糞便検体18-016及び18-017、GII陽性検体18-077及び18-078の4種類の検体を使用した。
反応条件は、以下の設定で行った。サーマルサイクラーは、実施例4と同じである。
95℃ 30sec(1サイクル)
95℃ 5sec-56℃ 40sec (5サイクル)
90℃ 5sec-56℃ 40sec (35サイクル)
(FAM、ROX、Cy5蛍光検出)
SEQ ID No:2 ; PCR Reverse Primer FCVgp2-R.
SEQ ID No:3 ; Probe FCVGP2-P. 5’-end is labeled FAM and 3’-end is labeled BHQ1.
SEQ ID No:4 ; PCR Forward Primer COG1F.
SEQ ID No:5 ; PCR Reverse Primer COG1R.
SEQ ID No:6 ; Probe RING1-TP(a). 5’-end is labeled FAM and 3’-end is labeled BHQ1.
SEQ ID No:7 ; PCR Forward Primer COG2F.
SEQ ID No:8 ; PCR Reverse Primer COG2R.
SEQ ID No:9 ; Probe RING2AL-TP. 5’end is labeled ROX and 3’-end is labeled BHQ2.
Claims (17)
- 排出検体に由来する試料中の、非エンベロープ型RNAウイルスの有無を検出する方法であって、
(a)RNAウイルスを含有する可能性のある試料を含むアルカリ性の混合液を調製する工程、
(b)工程(a)で得られた混合液を加熱せず放置する工程、及び
(c)工程(b)の放置後の混合液をcDNA合成反応に供する工程、
を包含する、RNAウイルスの検出方法(ただし、工程(a)の前にRNAウイルスを含有する可能性のある試料を粘土鉱物と接触させる工程を含む方法を除く。)。 - 工程(a)が、RNAウイルスを含有する可能性のある試料に強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、請求項1記載の方法。
- 工程(a)が、RNAウイルスを含有する可能性のある試料をキレート剤を含む溶液で懸濁した後に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、請求項1記載の方法。
- 強アルカリ性の水酸化物が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム及び水酸化カルシウムからなる群より選択される1種以上である、請求項2又は3記載の方法。
- 工程(a)におけるアルカリ性の混合液が水酸化ナトリウムを含有し、該水酸化ナトリウムの濃度が20~70mMである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(d)として、工程(c)で得られたcDNAを鋳型とする核酸増幅の工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(d)における核酸増幅が、PCRにより実施されることを特徴とする、請求項6記載の方法。
- 工程(c)と工程(d)が、同一の反応液内で行われることを特徴とする、請求項6又は7記載の方法。
- 工程(b)が、室温での放置により実施されることを特徴する、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)が、30℃以下での放置により実施されることを特徴する、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 生体排出検体が糞便であることを特徴とする、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)におけるRNAウイルスを含有する可能性のある試料が、糞便懸濁液上清であることを特徴とする、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 糞便懸濁液上清が、糞便を滅菌水、生理食塩水又はPBSに懸濁して、調製されたことを特徴とする、請求項12記載の方法。
- アルカリ性の混合液を、中和可能な物質と接触させることを特徴とする、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
- 中和可能な物質が、工程(c)におけるcDNA合成反応を実施する反応液中に含まれることを特徴とする、請求項14記載の方法。
- 生体排出検体に由来する試料中の、非エンベロープ型RNAウイルスの有無を検出する方法であって、
(a)RNAウイルスを含有する可能性のある試料を含むアルカリ性の混合液を調製する工程、及び
(b’)工程(a)で得られた混合液を加熱することなくcDNA合成反応に供する工程、
を包含する、RNAウイルスの検出方法(ただし、工程(a)の前にRNAウイルスを含有する可能性のある試料を粘土鉱物と接触させる工程を含む方法を除く。)。 - 工程(a)が、RNAウイルスを含有する可能性のある試料をキレート剤を含む溶液で懸濁した後に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、請求項16記載の方法。
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