WO2021221109A1 - Ｒｎａウイルスの検出方法 - Google Patents

Ｒｎａウイルスの検出方法 Download PDF

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Composition including [8] A kit for a method for detecting an RNA virus in a biological sample according to any one of [1] to [5].
  • the sample solution may be subjected to high temperature treatment in order to inactivate the proteolytic enzyme.
  • the high temperature treatment temperature include 91 ° C. to 99 ° C., preferably 93 ° C. to 97 ° C.
  • the high temperature treatment time include, for example, 1 second to 10 minutes, preferably 30 seconds to 5 minutes.
  • the sample liquid may be subjected to a high temperature treatment after the above heat insulating treatment, or may be subjected to only a high temperature treatment without the heat insulating treatment. Therefore, the method for preparing a sample solution for nucleic acid amplification of the present invention may further include a step of holding the mixed solution containing the biological sample and the additive for a certain period of time. In yet another aspect, the method for preparing a sample solution for nucleic acid amplification of the present invention may further include a step of retaining and / or heating the mixed solution containing the biological sample and the additive.
  • Thermal Cycler Dice registered trademark
  • Real Time System III PC
  • the PCR conditions were 52 ° C. for 5 minutes and 95 ° C. for 10 seconds, followed by a 45-cycle reaction with 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds as one cycle.
  • the amplification result was evaluated by comparing the Ct value with the control to which no additive was added. The results are shown in Table 2.
  • the biological sample suspension is diluted 10 to 20 times to 70 U / ml. It was confirmed that the Ct value was equivalent to that when high-concentration Proteinase K was added. Based on the above, even when RNA is detected from a sample in which an inactivated virus is spiked on a biological sample close to the actual sample, a combination of high-concentration Proteinase K, guanidin thiocyanate and / or sodium dodecyl sulfate is used as an additive of the present invention. Was confirmed to be promising.
  • the experiment was carried out as follows. That is, Proteinase K having a final concentration of 70 U / ml or 17.5 U / ml was added to the biological sample suspension, left at room temperature for 5 minutes, held at 55 ° C. for 5 minutes, and then heated at 95 ° C. for 5 minutes. After that, it was evaluated by the RT-qPCR method.
  • the RT-qPCR reagent used was the same as the reagent used in Example 1.

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Abstract

生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、以下の工程： （１）生体試料と、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤、を含む試料液を調製する工程、 （２）前記工程（１）で調製された試料液と、逆転写活性を有するポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含む核酸増幅反応液を調製する工程、及び （３）前記工程（２）で調製された反応液中で前記ＲＮＡウイルスの核酸を増幅する工程、 を包含する、方法が提供される。

Description

ＲＮＡウイルスの検出方法
　本発明は、生体試料に含まれるＲＮＡウイルスの検出方法、当該方法のための組成物並びにキットに関する。
　生体試料に含まれるウイルスを検出することは臨床診断などにおいて重要であり、生体試料中の核酸をＰＣＲ等で増幅し、増幅した核酸を検出し、ウイルスを特定する方法が行われている。しかし、生体試料中には核酸のほかに様々な生体由来物質が含まれているため、生体試料から核酸を精製することなく核酸増幅を実行すると増幅阻害や検出阻害が生じる。そこで、生体試料中の目的のウイルスを検出する際に、例えば、まずカラム等を用いて生体試料から核酸精製した後に、核酸増幅反応に供する方法が採用されている。
　また、核酸増幅反応液に、生体由来物質による増幅阻害を抑止するための核酸含有試料の処理方法や反応液への添加剤を用いる方法が報告されているが、完全に核酸増幅反応への影響を排除したものとは言えない。例えば、ＲＮＡウイルスにタンパク質分解酵素を作用させたのち、ＲＴ－Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行って検出する方法が報告されている（特許文献１参照）。また、ウイルスからの核酸抽出において、生体試料に還元剤や多糖類分解酵素を作用させて、ＲＴ－ＰＣＲを行って検出する方法が報告されている（特許文献２参照）。
特開平０６－０４６９００号公報 特開２０１８－０００１２４号公報
　まず核酸結合担体等を用いて生体試料より核酸を精製した後に、核酸増幅反応に供する方法では、ウイルスが失活するまでの間、操作従事者が当該ウイルスに感染する危険性があり、そのためウイルスに適合する封じ込めレベルで試料を取り扱わなければならない。即ち、コスト及びリスクが高いという問題があった。本発明の目的は、操作従事者の感染リスクを下げつつ、コスト高にならず、操作も煩雑でない高感度検出可能な、生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、生体試料と、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤を含む試料液を調製する工程を経ることにより、逆転写活性とＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを含む核酸増幅反応で目的のＲＮＡウイルス由来の核酸を効率よく増幅することができ、併せて高感度に検出できることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、
［１］生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、以下の工程：
（１）生体試料と、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤、を含む試料液を調製する工程、
（２）前記工程（１）で調製された試料液と、逆転写活性を有するポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含む核酸増幅反応液を調製する工程、及び
（３）前記工程（２）で調製された反応液中で前記ＲＮＡウイルスの核酸を増幅する工程、
を包含する、方法、
［２］前記タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫ、サーモリシン又はプロナーゼである、［１］に記載の方法、
［３］前記カオトロピック試薬がグアニジン又はその塩、尿素、ヨウ素又はその塩、あるいはこれらの組み合わせである、［１］又は［２］に記載の方法、
［４］前記生体試料が、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、唾液、血液、尿及び便懸濁液からなる群より選択される少なくとも１種である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法、
［５］前記ＲＮＡウイルスが、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、メタニューモウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及びＨＩＶからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法、
［６］生体試料と、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬、ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤、を含む混合液を調製する工程、を包含する、核酸増幅用試料液の調製方法、
［７］［１］～［５］のいずれか１つに記載の生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法のための組成物であって、（１）タンパク分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤と生体試料とを含む試料液、及び（２）逆転写酵素活性を有するポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、
を含む組成物、
［８］［１］～［５］のいずれか１つに記載の生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法のためのキットであって、
（１）タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤、及び
（２）逆転写活性を有するポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、
を含むキット、
［９］生体試料と、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬、ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤、を含む、核酸増幅用試料液、
等に関する。
　核酸抽出及び精製に要する特殊な機器、有機溶媒等の試薬、抽出及び精製のための時間を必要とすることのない簡便な生体試料の前処理により、操作従事者にリスクのない核酸増幅に適した核酸増幅用試料液を調製できる。この試料液を用いて核酸増幅することにより目的の核酸を検出できる。したがって、本発明によれば、安全かつ簡便な操作で高感度検出が可能な、生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法が提供される。
　本明細書において、「耐熱性」とは、熱処理に対する抵抗性のことを言う。例えば、酵素学的な至適温度が４０℃であれば、５０℃以上、６０℃以上、あるいは７０℃以上でも活性を保持することができた場合に「耐熱性」が向上したと言える。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素の場合、野生型酵素の至適温度は３７～４２℃であるので、例えば４３℃以上、好ましくは４５℃以上、さらに好ましくは５０℃以上で酵素活性を保持する逆転写酵素変異体は、「耐熱性である」又は「向上した耐熱性を有する」と言える。
　以下、詳細に説明する。
　１．本発明の生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法
　本発明の生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法は、（１）生体試料と、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤を含む試料液を調製する工程、
（２）前記工程（１）で調製された試料液と、逆転写活性を有するポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含む核酸増幅反応液を調製する工程、及び
（３）前記工程（２）で調製された反応液中で前記ＲＮＡウイルスの核酸を増幅する工程、
を包含することを特徴とする。
［検出しようとするＲＮＡウイルス］
　本発明の方法で検出するＲＮＡウイルスとしては、ＲＮＡをゲノムとするものであればよく、限定されない。例えば、二本鎖ＲＮＡウイルス（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス（＋鎖型）、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス（－鎖型）が例示される。特に限定はされないが、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、メタニューモウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む、本明細書ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は２０１９－ｎＣｏＶとも称す）、ＭＥＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及びＨＩＶが挙げられる。
　［生体試料］
　本発明で用いる生体試料は、ＲＮＡウイルスが存在していると疑われる試料であり、生体より採取された試料そのものの他、その派生物、例えば懸濁液、溶解液ならびに希釈液を包含する。前記の生体試料としては、特に限定はされないが口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、唾液、血液、尿又は便懸濁液が例示される。また前記試料以外にもＲＮＡウイルスの存在が疑われる環境由来試料として、環境水（海水、河川水、湖沼水、下水、家庭排水、産業排水等）、スワブなどによる拭取り操作で得られた採取物の懸濁液が挙げられる。当該拭取りの対象としては、食品などの製造設備、実験設備、医療設備、厨房やトイレなどの床、壁、作業台、シンク、各種の器具・備品等が挙げられる。前記生体試料はそれぞれに本発明に使用されることもできるが、複数の生体試料を混合したうえで本発明に使用してもよい。
　［添加剤］
　本発明に用いる添加剤は生体試料の前処理に使用されるものであり、特に限定はされないが例えば、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤が挙げられる。
　前記タンパク質分解酵素は、ＲＮＡウイルスのエンベロープ、カプシド等、あるいは生体試料由来のヌクレアーゼ等に作用して、カプシド内に存在するＲＮＡゲノムを分解することなく放出できるものであれば特に限定はない。例えば、セリンプロテイナーゼ、酸性プロテイナーゼ（アスパラギン酸プロテイナーゼ、グルタミン酸プロテイナーゼ）、アルカリプロテイナーゼ、セミアルカリプロテイナーゼ、金属プロテイナーゼ、システインプロテイナーゼ、Ｎ－末端スレオニンプロテイナーゼ等を単独あるいは、組み合わせて使用してもよい。前記タンパク質分解酵素はまた、エンドペプチダーゼであってもよい。エンドペプチダーゼとしては、セリンプロテイナーゼの代表としてプロテイナーゼＫが挙げられるが、サーモリシン、プロナーゼ又はこれらの変異体も好適に使用できる。本発明においては、生体試料の前処理時におけるタンパク質分解酵素の使用濃度は適宜決定すればよい。例えば、プロテイナーゼＫ又はその変異体の最終濃度の範囲は、好ましくは３Ｕ／ｍｌ～１５０Ｕ／ｍｌの範囲、さらに好ましく３Ｕ／ｍｌ～１２０Ｕ／ｍｌの範囲、特に好ましくは３０Ｕ／ｍｌ～１００Ｕ／ｍｌで使用することができる。カオトロピック試薬や界面活性剤と組み合わせる場合には、１Ｕ／ｍｌ～１２０Ｕ／ｍｌの範囲、好ましくは２Ｕ／ｍｌ～１００Ｕ／ｍｌの範囲である。本明細書においてプロテイナーゼＫの活性は、変性ウシヘモグロビンを基質として、３７℃、ｐＨ７．５で１分間に１．０μｍｏｌのチロシンに相当するＦｏｌｉｎ陽性アミノ酸を遊離する酵素量を１Ｕと定義する。
　また、核酸増幅の標的とならない核酸とは、本発明の検出対象であるＲＮＡウイルス由来のＲＮＡとは異なる塩基配列を有するＤＮＡ及び／又はＲＮＡあるいは核酸類縁体等のことを言う。前記核酸増幅の標的とならない核酸は、検出対象であるＲＮＡウイルス以外のウイルスや生物に由来する種々の核酸が使用でき、特に限定はされないが大腸菌由来の核酸、枯草菌由来の核酸あるいは酵母由来の核酸であってよい。好適には、大腸菌や酵母由来のリボソーマルＲＮＡが使用される。
　さらに、カオトロピック試薬とは、水分子間の相互作用を減少させ、それにより溶液中に存在する分子の構造を不安定化させる物質であり、特に限定はされないがグアニジン及びその塩、尿素、ヨウ素及びその塩、ならびにこれらの組み合わせが例示される。例えば、グアニジン塩としては塩酸グアニジン、硝酸グアニジン、炭酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン等が例示される。また、ヨウ化物としては、ヨウ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化カルシウム等が例示される。本発明においては、カオトロピック試薬の終濃度は、限定するものではないが、例えば０．５ｗ／Ｖ％～５ｗ／Ｖ％の範囲、好ましくは１ｗ／Ｖ％～４ｗ／Ｖ％の範囲、特に好ましくは２ｗ／Ｖ％～４ｗ／Ｖ％の範囲で使用することができる。また、カオトロピックイオンの最終モル濃度としては、限定するものではないが、例えば４０μｍｏｌ／ｍｌ～４５０μｍｏｌ／ｍｌの範囲、好ましくは８０μｍｏｌ／ｍｌ～３４０μｍｏｌ／ｍｌの範囲、特に好ましくは１６０μｍｏｌ／ｍｌ～３４０μｍｏｌ／ｍｌの範囲で使用することができる。
　本発明に使用できる界面活性剤としては、特に限定はないが、陰イオン性界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等）、非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５等）、陽イオン性界面活性剤等が例示される。例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを使用する場合の終濃度は、質量パーセント濃度（ｗ／ｖ　％）で、０．００１～１％の範囲、好ましくは０．００５～１％の範囲、さらに好ましくは０．００５～０．５％の範囲で使用することができる。当該濃度は、使用するタンパク質分解酵素やＲＴ－ｑＰＣＲ試薬との組み合わせで、適宜調整するのは当然のことである。
　［核酸増幅に使用されるポリペプチド］
　本発明の方法においては、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写活性を有するポリペプチドと、前記ｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を増幅するための、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性（本明細書ではＤＮＡポリメラーゼ活性と記載する）を有するポリペプチドを核酸増幅反応に使用することができる。当該逆転写活性を有するポリペプチドとＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、それぞれ別のポリペプチドであってもよく、又は両活性を併せ持つ単一のポリペプチドであってもよい。前記逆転写活性を有するポリペプチドとしては、例えば、ＨＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｃ　ｔｈｅｒｍ．ポリメラーゼ、及びＴｔｈポリメラーゼ、さらに例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴａｓｅ、ＲｅｖｅＲＴｒａ　Ａｃｅ（登録商標）ＲＴａｓｅ、ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ　（商標）ＲＴａｓｅ、Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ　ＲＴａｓｅ、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ　ＲＴａｓｅ等が例示される。
　本明細書におけるＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、特に断りの無い限り、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。該ポリメラーゼとしてはとしては、ファミリーＡ（ＰｏｌＩ型）に属するＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ（α型）に属するＤＮＡポリメラーゼ、前記２種のポリメラーゼの混合物、のいずれもが好適に使用できる。好適には耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが使用される。前記ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されるものではないが、例えば好熱性真正細菌由来のＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ等や、好熱性古細菌由来のＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ等を用いることができる。特定の実施形態では、正確性に優れたα型ＤＮＡポリメラーゼ（又はファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ）を用いることが好ましい。α型ＤＮＡポリメラーゼとしては特に限定はされないが、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ又はＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）のような市販のポリメラーゼを使用することができる。さらに逆転写活性とＤＮＡポリメラーゼ活性を有する単一のポリペプチドであってもよく、例えばＴｔｈポリメラーゼが例示される。
　上記逆転写活性を有するポリペプチドとＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は両活性を併せ持つポリペプチドは、本発明の方法に適合するものであれば天然型であっても変異体であってもよい。
　本発明の検出方法において、逆転写活性を有するポリペプチドとＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は両活性を併せ持つポリペプチドは、反応前の、非特異的増幅を防止するための当該ポリペプチドの抗体を組み合わせたホットスタート酵素であってもよい。さらにＰＣＮＡなどの伸長因子や核酸増幅反応の効率を向上させることが知られている各種の物質、例えば界面活性剤、ウシ血清アルブミン、酸性高分子物質、両性アミノ酸等を組み合わせてもよい。
　［核酸増幅反応液］
　本発明の検出方法に使用される核酸増幅反応液は、生体試料及び添加剤を含む前記試料液と、逆転写活性を有するポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドとを含み、前記ポリペプチドがその活性を発揮しうる組成の溶液である。ＲＴ－ＰＣＲ法により核酸増幅を実施する場合、当該反応液には最適なｐＨを保つための緩衝成分、二価金属塩（マグネシウム塩、マンガン塩等）、ｄＮＴＰが含まれるが、さらに中性塩、界面活性剤やその他の成分を含有させてもよい。この反応液は、検出しようとするＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ上の特定の領域を核酸増幅するためのプライマー対や検出用核酸プローブ（例えば消光プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　Ｐｒｏｂｅ；Ｑプローブ）、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ）等を含んでいてもよい。あるいは、検出用核酸プローブの代わりにインターカレーター色素（例えばＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ、ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標））等を含んでいてもよい。さらに核酸増幅反応に使用されるその他の試薬を含んでいてもよい。特に限定はされないが、２０１９－ｎＣｏＶを検出する場合、国立感染研マニュアル「病原体検出マニュアル　２０１９－ｎＣｏＶ　Ｖｅｒ．２．９．１」記載のプライマー対と検出用核酸プローブ、アメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）「２０１９－Ｎｏｖｅｌ　Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　（２０１９－ｎＣｏＶ）　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｒＲＴ－ＰＣＲ　Ｐａｎｅｌ　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｂｅｓ」記載のプライマー対と検出用核酸プローブ等が好適に使用できる。さらに核酸増幅反応は、反応阻害確認などの目的で、検出対象であるＲＮＡウイルス由来の核酸とは異なる配列を有する内部標準ＲＮＡ、当該内部標準ＲＮＡを検出するためのプライマー対と検出用核酸プローブを組み合わせたマルチプレックス検出であってもよい。例えば、２０１９－ｎＣｏＶ検出の場合、前記国立感染研マニュアル記載のＮセットプライマー、ＮセットＮｏ．２のプライマー／プローブ、あるいは、前記ＣＤＣマニュアル記載のＮ１プライマー／プローブ、Ｎ２プライマー／プローブあるいはＮ３プライマー／プローブのいずれもが好適に使用できる。
　また、本発明の検出方法において、検出しようとするウイルスのゲノムＲＮＡ上の複数の異なる遺伝子領域を増幅し、当該異なる遺伝子領域を複数のプローブで検出することができる。この場合、前記の複数のプローブは同一の標識を付されていてもよい。即ち、２領域１波長検出であってもよい。当該標識プローブは、ＦＲＥＴ法、非ＦＲＥＴ法に基づく蛍光標識の組み合わせ、あるいは、蛍光標識と消光標識の組み合わせであってもよい。前記蛍光標識としては、ＦＡＭ、Ｃｙ５、ＲＯＸあるいはＨＥＸ等が例示される。前記消光物質としては、ダーククエンチャーと呼ばれるエクリプスやＢＨＱ（登録商標）系の標識が好適に使用できる。
　本発明を特に限定するものではないが、２０１９－ｎＣｏＶを検出する場合、例えば、ＣＤＣが「２０１９－Ｎｏｖｅｌ　Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　（２０１９－ｎＣｏＶ）　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｒＲＴ－ＰＣＲ　Ｐａｎｅｌ　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｂｅｓ」にて公開しているＮ１プライマー／プローブ、Ｎ２プライマー／プローブ、Ｎ３プライマー／プローブから選択される２以上を同時に使用し、複数領域を同時に検出する核酸増幅反応液を調製することができる。この際、反応液に含まれる複数のプローブを同じ蛍光色素で標識しておくことにより、前記ウイルスを高感度に検出することができる。
　前記の核酸増幅反応液は、ウイルスゲノムＲＮＡ標的領域からのｃＤＮＡの合成、ならびにｃＤＮＡの増幅、の反応が順次に起こるよう、適切な温度条件でインキュベートに供される。その条件としては、当業者に１ステップＲＴ－ＰＣＲとして周知の条件を採用することができる。この際、温度、保温時間やサイクル数は標的とする配列、プライマーやプローブの鎖長に応じて適宜調製すればよい。
　本発明の検出方法においては、（１）生体試料と、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤を含む試料液が調製され、核酸増幅反応液に添加される。核酸増幅反応液への添加に先だって、後述のようにこの試料液を保温もしくは加温してもよい。
　本発明の検出方法において、生体試料中のＲＮＡウイルスから核酸を精製することなく逆転写反応及び核酸増幅反応に供することができる。そのため逆転写反応及び核酸増幅反応に持ち込む鋳型量を多くすることができ、例えば反応容量５０μｌあたり、鋳型溶液量として例えば、３０μｌ以下であって、５μｌから１０μｌ相当の生体試料処理液（前記試料液）の持ち込みを可能とする。
　２．本発明の核酸増幅用の試料液の調製方法
　本発明の核酸増幅用試料液は、前記１．で説明した、生体試料と、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤を含む混合液である。したがって、本発明の核酸増幅用試料液の調製方法は、生体試料と添加剤を含む混合液を調製する工程を含む。本発明の試料液は、生体試料と添加剤を混合して調製してもよく、又はあらかじめ調製された、添加剤を含む溶液に生体試料を直接懸濁して調製してもよい。試料液は複数の添加剤を含んでもよい。その際、各添加剤の添加量はＲＮＡウイルスの検出感度等を指標に適宜設定すればよい。
　前記の試料液は、特に本発明を限定するものではないが、一定時間保持した後に核酸増幅反応に供されてもよい。保持時間としては、限定するものではないが、例えば１秒～３０分、好ましくは１０秒～２０分、より好ましくは２０秒～１０分、さらに好ましくは３０秒～５分が例示される。さらに、前記試料液は、異なる複数の温度で保持されてもよい。生体試料と、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤を含む試料液は、核酸増幅反応液へ添加する前に保温及び／又は加温処理を施すことができる。例えば室温もしくは、１℃～９９℃の範囲で保温及び／又は加温することができる。タンパク質分解酵素を含む試料液の場合、当該酵素の作用を促す観点から、例えば２０℃～９０℃、好ましくは３０℃～８０℃、より好ましくは、４０℃～７０℃、さらに好ましくは、５０～６０℃で保温することができる。保温時間としては、例えば１秒～３０分、好ましくは１０秒～２０分、より好ましくは２０秒～１０分、さらに好ましくは３０秒～５分が例示される。例えば、限定するものではないが、試料液を５５℃で５分～１０分間保温してもよい。さらに、タンパク質分解酵素を失活させるために試料液を高温処理に付してもよい。高温処理温度としては、例えば９１℃～９９℃、好ましくは９３℃～９７℃が例示される。高温処理時間としては、例えば１秒～１０分、好ましくは３０秒～５分が例示される。試料液は、上記の保温処理後に高温処理に付してもよく、または保温処理せずに、高温処理のみを行ってもよい。したがって、本発明の核酸増幅用試料液の調製方法は、さらに、前記の生体試料と添加剤を含む混合液を一定時間保持する工程を含んでいてもよい。また別の態様において、本発明の核酸増幅用試料液の調製方法は、さらに、前記の生体試料と添加剤を含む混合液を保温及び／または加温する工程を含んでいてもよい。
　３．本発明の生体試料中のＲＮＡウイルスを検出するための組成物
　本発明の組成物は、前記の、本発明のＲＮＡウイルスを検出する方法に使用するための核酸増幅反応液として使用される組成物であり、前記１．で説明した、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤と生体試料とを含む試料液、及び逆転写酵素活性を有するポリペプチドとＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含むことを特徴とする。上記試料液がタンパク質分解酵素を含む場合、本発明の組成物中のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドが分解しないように、当該タンパク質分解酵素は好ましくは、上記２．で説明したように試料液調製後に失活させた、失活済みのタンパク質分解酵素である。本発明の組成物はさらに、逆転写酵素活性を有するポリペプチドとＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドが活性を発揮するために必要な各種の成分を含むことができる。さらに、当該組成物は、目的のＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ上の特定の領域を核酸増幅するためのプライマー対や検出用核酸プローブ等を含んでいてもよい。当該核酸プローブを用いて核酸を検出する方法として、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブやＱプローブ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎ等を使用する方法が挙げられる。前記の方法では、例えば核酸プローブの分解のモニタリングや、核酸プローブを核酸にハイブリダイズさせて融解曲線解析を行うことで標的核酸を検出できる。検出工程におけるその他の条件は検出対象核酸の種類や配列、プローブの種類などを考慮して適宜設定すればよい。あるいは、検出用核酸プローブの代わりにインターカレーター色素（例えばＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標））等を含んでいてもよい。特に限定はされないが、２０１９－ｎＣｏＶコロナウイルスを検出する場合、国立感染研マニュアル記載のプライマー対と検出用核酸プローブ、米国ＣＤＣマニュアル記載のプライマー対と検出用核酸プローブ等が好適に使用できる。また、反応阻害確認のために、内部標準増幅用のプライマー対と検出用核酸プローブを含んでいてもよい。
　４．本発明の生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法のためのキット
　本発明のキットは、前記１．で説明した、
（１）タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤、及び
（２）逆転写酵素活性を有するポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、
を含むことを特徴とする。
　本発明のキットは、前記の各要素を、前記の「本発明の生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法」の実施、ならびに「本発明の生体試料中のＲＮＡウイルスを検出するための組成物」の調製のために適切な形態で含んでいればよい。そのために、本発明のキットはさらに、核酸増幅用の試料液を調製するための希釈液やＲＮＡウイルス検出用の核酸増幅反応液を調製するための緩衝液等を含んでいてもよい。ここで、本発明のキットは、本発明の方法によりＲＮＡウイルスを検出するための試薬を含んでいてもよい。前記試薬としては、例えば、緩衝成分、二価金属塩、ｄＮＴＰ、中性塩等が例示されるがそれらに限定されるものではない。本発明の一態様として、逆転写酵素活性を有するポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、前記両ポリペプチドが活性を示すのに必要な諸成分を適切な濃度で含有するプレミックス反応液と、前記の添加剤とを含むキットが提供される。
　本発明のキットはさらに、目的のＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ上の特定の領域を核酸増幅するためのプライマー対や検出用核酸プローブ等を含んでいてもよい。あるいは、検出用核酸プローブの代わりにインターカレーター色素等を含んでいてもよい。特に限定はされないが、２０１９－ｎＣｏＶコロナウイルスを検出する場合、国立感染研マニュアル記載のプライマー対と検出用核酸プローブ、米国ＣＤＣマニュアル記載のプライマー対と検出用核酸プローブ等が好適に使用できる。また、本発明のキットは、反応阻害確認のために、内部標準増幅用のプライマー対と検出用核酸プローブを含んでいてもよい。
　以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
　添加剤の検討１
　本発明の検出方法について検討した。まず、配列表の配列番号４記載の塩基配列を有し、国立感染研マニュアル「病原体検出マニュアル　２０１９－ｎＣｏＶ　Ｖｅｒ．２．９．１」記載のプライマー対と検出用核酸プローブの感度検定で用いるＲＮＡ陽性コントロールのうち、Ｎ２セットと称されるものを常法により調製した。次に市販の喀痰試料（ＮＯＶＡ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社製）を生理食塩水で３倍希釈したものを原液とし、さらに生理食塩水で２０倍に希釈し、上記ＲＮＡ陽性コントロールと混合し、生体試料懸濁液とした。喀痰試料なしのものも調製した。次に、当該生体試料と混合する添加剤は、タンパク質分解酵素としてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（タカラバイオ社製、約４００Ｕ／ｍｌ）、カオトロピック試薬としてチオシアン酸グアニジン（ＣＡＳ登録番号　５９３－８４－０）（東京化成工業社製）（グアニジンチオシアン酸塩、あるいはグアニジンチオシアネートとも称される。）、界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム（東京化成工業社製）を用いた。また、生体試料懸濁液に何も添加しないコントロールも設定した。
　上記生体試料懸濁液に最終濃度３．５Ｕ／ｍｌ（１７５μｇ／ｍｌ）、７Ｕ／ｍｌ（３５０μｇ／ｍｌ）、３５Ｕ／ｍｌ（１７５０μｇ／ｍｌ）あるいは７０Ｕ／ｍｌ（３５００μｇ／ｍｌ）のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、さらに最終濃度２０９μｍｏｌ／ｍｌのチオシアン酸グアニジン、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウムを添加し、５５℃で５～１０分間保温した後、又は保温せずに、９５℃で５分間加熱した。これにＲＮＡ陽性コントロールを２．５×１０＾５コピー／反応になるように添加し、その混合液をＲＴ－ＰＣＲに供した。ＲＴ－ＰＣＲ試薬は、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ　ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いた。即ち、前記混合液５μｌに２５μｌの２×ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ、配列表の配列番号１及び２記載の感染研ＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ＿Ｆプライマー（最終濃度０．５μＭ）及びＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ＿Ｒプライマー（最終濃度０．７μＭ）、配列表の配列番号３記載の塩基配列を有するＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ＿Ｐプローブ（最終濃度０．２μＭ、５’ＦＡＭ標識、３’ＢＨＱ１標識）及びＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｈ２Ｏを混合し、最終容量５０μｌとした。
　サーマルサイクラーは、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＩＩＩ（Ｃｙ５）　ｗｉｔｈ　ＰＣ（タカラバイオ社製）を用いた。ＰＣＲ条件は、５２℃５分、９５℃１０秒の後、９５℃５秒、６０℃３０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行った。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示したように、３５～７０Ｕ／ｍｌ（１７５μｇ／ｍｌ～３５００μｇ／ｍｌ）の高濃度のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（表中、「ＰｒｏＫ」）を添加した場合、生体試料懸濁液なしの場合のＣｔ値とほぼ同等となり、生体試料懸濁液の影響が解消された。また、３．５Ｕ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫとグアニジンチオシアネート（表中、「ＧＴ」）、３．５Ｕ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫと０．０１％のドデシル硫酸ナトリウム（表中、「ＳＤＳ」）を組み合わせることにより、生体試料懸濁液なしの場合のＣｔ値とほぼ同等となり、生体試料懸濁液の影響が解消された。以上のことより、本発明の添加剤として、高濃度のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、またはＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫとグアニジンチオシアネート及び／又はドデシル硫酸ナトリウムの組み合わせが有望であることを確認した。また、試料液の５５℃処理を省略した場合でも、試料中のＲＮＡウイルスを検出することが可能であった。
　添加剤の検討２
　本発明の検出方法について、不活性化ウイルスを用いて検討した。本実施例では不活性化ＲＮＡウイルスとしてＮＡＴｔｒｏｌ（商標）　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ／Ｂ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社製）を用いた。その原液若しくは生理食塩水で１０倍～２０倍に希釈したものを実施例１で調製した喀痰試料と混合し、生体試料懸濁液とした。喀痰試料なしのものも調製した。
　添加剤は、タンパク質分解酵素としてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、カオトロピック試薬としてチオシアン酸グアニジン、界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウムを用いた。
　実験は、以下のようにして実施した。即ち、上記生体試料懸濁液に最終濃度３．５Ｕ／ｍｌあるいは７０Ｕ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、最終濃度２．５％（ｗ／ｖ）のチオシアン酸グアニジン又は最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウムを組み合わせて添加して室温又は５５℃で５分間保持し、次いで９５℃で５分間加熱した後、ＲＴ－ｑＰＣＲ法にて評価した。ＲＴ－ｑＰＣＲ試薬は、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）　ＩＩＩ　ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いた。前記添加剤を含む生体試料懸濁液５μｌに２５μｌの２×ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ、配列表の配列番号５及び６記載の塩基配列を有する、ＩＡｍｇ－Ｆ０１及びＩＡｍｇ－Ｒ０１　プライマー（最終濃度０．２μＭ）、配列表の配列番号７記載の塩基配列を有するインフルエンザウイルスＡ検出用ＩＡｍｇ－ＰＲ０１プローブ（最終濃度０．２μＭ、５’ＦＡＭ標識、３’ＢＨＱ１標識）並びに及びＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｈ２Ｏを混合し、最終容量５０μｌとした。
　サーマルサイクラーは、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＩＩＩ　（Ｃｙ５）　ｗｉｔｈ　ＰＣ（タカラバイオ社製）を用いた。ＰＣＲ条件は、５２℃５分、９５℃１０秒の後、９５℃５秒、６０℃３０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行った。増幅結果の評価は、添加剤を加えないコントロールとのＣｔ値の比較で行った。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示したように生体試料懸濁液原液から２０倍希釈液に７０Ｕ／ｍｌの高濃度のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（表中、「ＰｒｏＫ」）を添加した場合、生体試料懸濁液なしの場合と同等のＣｔ値となり、生体試料懸濁液の影響が解消された。また、３．５Ｕ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫとグアニジンチオシアネート（表中、「ＧＴ」）を組み合わせることにより、７０Ｕ／ｍｌの高濃度のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを添加した場合と同等のＣｔ値となることを確認した。さらに、３．５Ｕ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫと０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（表中、「ＳＤＳ」）を組み合わせる場合は、生体試料懸濁液を１０倍から２０倍希釈することにより、７０Ｕ／ｍｌの高濃度のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを添加した場合と同等のＣｔ値となることを確認した。以上のことより、実検体に近い生体試料に不活性化ウイルスをスパイクした検体からＲＮＡを検出する場合でも本発明の添加剤として、高濃度のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、チオシアン酸グアニジン及び／又はドデシル硫酸ナトリウムの組み合わせが有望であることを確認した。
　生体試料の検討
　本発明の検出方法について、不活性化ウイルスを用いて検討した。不活性化ウイルスとしては、市販の不活性化ＲＮＡウイルスであるＮＡＴｔｒｏｌ（商標）　ＳＡＲＳ＿ＣＯＲＯＮＡ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ　社製）を用い、生理食塩水にて１．２倍と１２倍に希釈した。また、生体試料は、市販の唾液（ＬＥＥ　ＢＩＯＳＯＬＵＴＩＯＮＳ社製）の原液あるいはウイルス輸送用液（製品名：ウイルス輸送液（ＶＴＭ）：スギヤマゲン社製）にて希釈したものを使用した。この生体試料と上記不活性化ウイルス溶液を混合して生体試料懸濁液を調製した。また、当該生体試料懸濁液と混合する添加剤は、タンパク質分解酵素としてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを用いた。
　実験は、以下のようにして実施した。即ち、上記生体試料懸濁液に最終濃度７０Ｕ／ｍｌあるいは１７．５Ｕ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを添加して、室温で５分放置後、５５℃で５分間保持し、次いで９５℃で５分間加熱した後、ＲＴ－ｑＰＣＲ法にて評価した。ＲＴ－ｑＰＣＲ試薬は、実施例１で用いた試薬と同じものを使用した。前記添加剤を含む生体試料液１０μｌに２×ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ、配列表の配列番号８及び９記載の塩基配列を有する、ＰＣＲ　Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｎ１＿ＳＡＲＳ　ＣＯＶ＿Ｆ及びＲプライマー（最終濃度０．２μＭ）、配列表の配列番号１１及び１２記載の塩基配列を有する、ＰＣＲ　Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｎ２＿ＳＡＲＳ　ＣＯＶ＿Ｆ及びＲプライマー（最終濃度０．２μＭ）、配列表の配列番号１０記載の塩基配列を有するＳＡＲＳ＿ＣＯＲＯＮＡ検出用Ｎ１＿ＳＡＲＳ　ＣＯＶ＿Ｐプローブ（最終濃度０．２μＭ、５’Ｃｙ５標識、３’ＢＨＱ３標識）、配列表の配列番号１３記載の塩基配列を有するＳＡＲＳ＿ＣＯＲＯＮＡ検出用Ｎ２＿ＳＡＲＳ　ＣＯＶ＿Ｐプローブ（最終濃度０．２μＭ、５’Ｃｙ５標識、３’ＢＨＱ３標識）並びに及びＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｈ２Ｏを混合し、最終容量５０μｌとした。
　サーマルサイクラー及びＰＣＲ条件は、実施例１と同じにして実施した。増幅結果の評価は、添加剤を加えないコントロールとのＣｔ値の比較で行った。その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示したように唾液原液又は唾液とＶＴＭの混合液に不活性化ウイルスを添加したものすべてにおいて核酸増幅が確認できた。また添加剤について、７０Ｕ／ｍｌ並びに１７．５Ｕ／ｍｌのいずれのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（表中、「ＰｒｏＫ」）を添加した場合でも同等のＣｔ値となった。以上のことより、唾液のような生体試料に不活性化ウイルスをスパイクした検体からＲＮＡを検出する場合でも本発明は有効であることが確認できた。
　ウラシル－Ｎ－グルコシダーゼ（ＵＮＧ）処理の検討
　本発明の検出方法について、生体試料懸濁液及び添加剤は実施例３と同じものを用いた。
　本実施例においてもＲＴ－ＰＣＲまでの生体試料懸濁液の処理方法は、実施例３と同じ方法で行った。また、ＲＴ－ｑＰＣＲ法の評価は、ＲＴ－ＰＣＲ試薬として、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ　ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）をｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）　ＩＩＩ　ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ，ｗｉｔｈ　ＵＮＧ（タカラバイオ社製）に置き換える以外は、実施例３と同様の条件で行った。サーマルサイクラー及びＰＣＲ条件は、実施例１と同じにして実施した。増幅結果の評価は、添加剤を加えないコントロールとのＣｔ値の比較で行った。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示したように唾液原液又は唾液とＶＴＭの混合液に不活性化ウイルスを添加したものすべてにおいて核酸増幅が確認できた。また添加剤について、７０Ｕ／ｍｌ並びに１７．５Ｕ／ｍｌのいずれのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（表中、「ＰｒｏＫ」）を添加した場合でも同等のＣｔ値となった。以上のことより、本発明は、増幅物による汚染防止のためのウラシル－Ｎ－グルコシダーゼならびにｄＵＴＰを含むＲＴ－ｑＰＣＲにおいても有効であることが確認できた。
　本発明の検出方法を用いることで、核酸の単離を要することなく、試料中に含まれるＲＮＡウイルス由来の核酸を検出することができるため、臨床診断の分野に大きく貢献できる。
SEQ ID NO: 1:PCR Forward Primer NIID_2019-nCOV_N_F2
SEQ ID NO: 2:PCR Reverse Primer NIID_2019-nCOV_N_R2
SEQ ID NO: 3:Probe NIID_2019-nCOV_N_P2. 5’-end is labeled FAM and 3’-end is labeled BHQ1
SEQ ID NO: 4:RNA positive control sequence for 2019-nCoV N2 set
SEQ ID NO: 5:PCR Forward Primer IAmg-F01
SEQ ID NO: 6:PCR Reverse Primer IAmg-R01
SEQ ID NO: 7:Probe IAmg-PB1. 5’-end is labeled FAM and 3’-end is labeled BHQ1
SEQ ID NO: 8 PCR Forward Primer N1_SARS COV_F
SEQ ID NO: 9 PCR Reverse Primer N1_SARS COV_R
SEQ ID NO: 10 N1_SARS COV_P. 5’-end is labeled Cy5 and 3’-end is labeled BHQ3
SEQ ID NO: 11 PCR Forward Primer N2_SARS COV_F
SEQ ID NO: 12 PCR Reverse Primer N2_SARS COV_R
SEQ ID NO: 13 N2_SARS COV_P. 5’-end is labeled Cy5 and 3’-end is labeled BHQ3

Claims (8)

  1. 　生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、以下の工程：
    （１）生体試料と、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤、を含む試料液を調製する工程、
    （２）前記工程（１）で調製された試料液と、逆転写活性を有するポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含む核酸増幅反応液を調製する工程、及び
    （３）前記工程（２）で調製された反応液中で前記ＲＮＡウイルスの核酸を増幅する工程、
    を包含する、方法。
  2. 　前記タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫ、サーモリシン又はプロナーゼである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記カオトロピック試薬がグアニジン又はその塩、尿素、ヨウ素又はその塩、あるいはこれらの組み合わせである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記生体試料が、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、唾液、血液、尿及び便懸濁液からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～３のいずれか１つに記載の方法。
  5. 　前記ＲＮＡウイルスが、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、メタニューモウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス及びＨＩＶからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～４のいずれか１つに記載の方法。
  6. 　生体試料と、タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬、ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤、を含む混合液を調製する工程、
    を包含する、核酸増幅用試料液の調製方法。
  7. 　請求項１～５のいずれか１つに記載の生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法のための組成物であって、
    （１）タンパク分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤と生体試料とを含む試料液、及び
    （２）逆転写酵素活性を有するポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、
    を含む組成物。
  8. 　請求項１～５のいずれか１つに記載の生体試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法のためのキットであって、
    （１）タンパク質分解酵素、核酸増幅の標的とならない核酸、カオトロピック試薬ならびに界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一つの添加剤、及び
    （２）逆転写酵素活性を有するポリペプチド及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、又は逆転写酵素活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド
    を含むキット。
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