JPH0646900A - 単一容器内での逆転写酵素介在二段階遺伝子増幅反応によるｒｎａ遺伝子の増幅検出方法 - Google Patents
単一容器内での逆転写酵素介在二段階遺伝子増幅反応によるｒｎａ遺伝子の増幅検出方法Info
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- JPH0646900A JPH0646900A JP22218492A JP22218492A JPH0646900A JP H0646900 A JPH0646900 A JP H0646900A JP 22218492 A JP22218492 A JP 22218492A JP 22218492 A JP22218492 A JP 22218492A JP H0646900 A JPH0646900 A JP H0646900A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、単一容器内でＲＮＡ抽出、ｃＤＮ
Ａ合成、第１及び第２ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
によるＤＮＡ増幅の全工程を実施し、次いで増幅ＤＮＡ
を検出するＲＮＡウイルス由来遺伝子の増幅・検出方法
に関する。この方法の特徴は、蛋白質分解酵素の存在下
でＲＮＡ抽出を行うこと、および、第１プライマーと第
２プライマーの長さ、存在比、アニーリング温度を調節
してＰＣＲを実施することにある。 【効果】コンタミネーションの危険性が減少し、分析結
果の信頼性、再現性が上昇する。
Ａ合成、第１及び第２ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
によるＤＮＡ増幅の全工程を実施し、次いで増幅ＤＮＡ
を検出するＲＮＡウイルス由来遺伝子の増幅・検出方法
に関する。この方法の特徴は、蛋白質分解酵素の存在下
でＲＮＡ抽出を行うこと、および、第１プライマーと第
２プライマーの長さ、存在比、アニーリング温度を調節
してＰＣＲを実施することにある。 【効果】コンタミネーションの危険性が減少し、分析結
果の信頼性、再現性が上昇する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＲＮＡウイルス由来遺
伝子を増幅し、検出するための方法に関する。さらに詳
細には、本発明は、単一容器内でＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ
合成、第１及び第２ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
よるＤＮＡ増幅の全工程を実施し、次いで増幅ＤＮＡを
検出する方法に関する。本発明はまた、この方法に使用
するための、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子を検出するための
プライマーセットに関する。
伝子を増幅し、検出するための方法に関する。さらに詳
細には、本発明は、単一容器内でＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ
合成、第１及び第２ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
よるＤＮＡ増幅の全工程を実施し、次いで増幅ＤＮＡを
検出する方法に関する。本発明はまた、この方法に使用
するための、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子を検出するための
プライマーセットに関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、感染症の診断は、病原体に対する
抗体を検出する抗体検出法と病原体そのものを抗原とし
て検出する抗原検出法の２つの方法があるが、その人が
検査の時点で病原体に感染しており、いわゆるキャリア
ーの状態であるかどうかを判定するためには抗原検出法
を用いなければならない。しかしながら、ウイルス等の
病原体が、非常に微量の場合には、現在一般的に用いら
れている検出法、例えばＥＩＡ法やＲＩＡ法では検出限
界以下となり検出が不可能である。このため抗原検出に
代わるものとして、病原体の遺伝子を増幅し、遺伝子自
体を検出する方法、すなわち遺伝子増幅法（Polymerase
chain reaction 法；ＰＣＲ法）が利用されてきている
（R. K. Saiki ら、Science, 250, 1350 (1980); M. A.
Innisら編、“PCR Protocol”，Academic Press (199
0) ）。ＰＣＲ法は、耐熱性のポリメラーゼを用いＤＮ
Ａを標的として２本のプライマー（センスプライマーと
アンチセンスプライマー）ではさまれた領域を特異的に
増幅させ、検出する方法であるが、病原体遺伝子がＲＮ
Ａの場合でも逆転写酵素（Reverse Transcriptase;RT）
を用いＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、そのｃＤＮＡを標
的遺伝子としてＰＣＲを行うことにより、増幅可能であ
り、この増幅産物をアガロースゲル中でエチジウムブロ
マイド染色することにより、バンドとして検出できる。
しかしながらＰＣＲ法でも１〜１０００コピー程度の病
原体遺伝子しか存在しない場合には、バンドとしての検
出は困難なため、アガロースゲルから、ニトロセルロー
ス膜などにＤＮＡをブロットし、増幅産物の中に存在す
るシークエンスに相補的なプローブを用いたサザンブロ
ッティングでの検出が必要である。このサザンブロッテ
ィング等の操作を行なわずにアガロースゲル中のバンド
として極めて微量の遺伝子を直接検出するために現在二
段階遺伝子増幅反応（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）法が行わ
れつつある（S. Kaneko ら、J. Clin. Microbiol. 27:1
930 (1989)）。これは、１回目のＰＣＲ（第１ＰＣＲ）
を行ったあとにそのＰＣＲ産物の一部を１回目のＰＣＲ
で用いたプライマーよりさらに内側の２本のプライマー
を用いて２回目のＰＣＲ（第２ＰＣＲ）をかけ増幅させ
る方法である。この二段階ＰＣＲ法を用いることにより
極微量の遺伝子でもアガロースゲル中でバンドとして検
出可能な濃度まで増幅される。
抗体を検出する抗体検出法と病原体そのものを抗原とし
て検出する抗原検出法の２つの方法があるが、その人が
検査の時点で病原体に感染しており、いわゆるキャリア
ーの状態であるかどうかを判定するためには抗原検出法
を用いなければならない。しかしながら、ウイルス等の
病原体が、非常に微量の場合には、現在一般的に用いら
れている検出法、例えばＥＩＡ法やＲＩＡ法では検出限
界以下となり検出が不可能である。このため抗原検出に
代わるものとして、病原体の遺伝子を増幅し、遺伝子自
体を検出する方法、すなわち遺伝子増幅法（Polymerase
chain reaction 法；ＰＣＲ法）が利用されてきている
（R. K. Saiki ら、Science, 250, 1350 (1980); M. A.
Innisら編、“PCR Protocol”，Academic Press (199
0) ）。ＰＣＲ法は、耐熱性のポリメラーゼを用いＤＮ
Ａを標的として２本のプライマー（センスプライマーと
アンチセンスプライマー）ではさまれた領域を特異的に
増幅させ、検出する方法であるが、病原体遺伝子がＲＮ
Ａの場合でも逆転写酵素（Reverse Transcriptase;RT）
を用いＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、そのｃＤＮＡを標
的遺伝子としてＰＣＲを行うことにより、増幅可能であ
り、この増幅産物をアガロースゲル中でエチジウムブロ
マイド染色することにより、バンドとして検出できる。
しかしながらＰＣＲ法でも１〜１０００コピー程度の病
原体遺伝子しか存在しない場合には、バンドとしての検
出は困難なため、アガロースゲルから、ニトロセルロー
ス膜などにＤＮＡをブロットし、増幅産物の中に存在す
るシークエンスに相補的なプローブを用いたサザンブロ
ッティングでの検出が必要である。このサザンブロッテ
ィング等の操作を行なわずにアガロースゲル中のバンド
として極めて微量の遺伝子を直接検出するために現在二
段階遺伝子増幅反応（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）法が行わ
れつつある（S. Kaneko ら、J. Clin. Microbiol. 27:1
930 (1989)）。これは、１回目のＰＣＲ（第１ＰＣＲ）
を行ったあとにそのＰＣＲ産物の一部を１回目のＰＣＲ
で用いたプライマーよりさらに内側の２本のプライマー
を用いて２回目のＰＣＲ（第２ＰＣＲ）をかけ増幅させ
る方法である。この二段階ＰＣＲ法を用いることにより
極微量の遺伝子でもアガロースゲル中でバンドとして検
出可能な濃度まで増幅される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】前述のようなＲＮＡを
標的とする逆転写酵素介在二段階ＰＣＲ法を用いること
で、微量のＲＮＡ病原体遺伝子のアガロースゲル中での
検出が可能となってきた。しかしながらサザンブロッテ
ィングの操作がなくなったとはいっても依然として操作
法は繁雑であり、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、第１ＰＣ
Ｒ、第２ＰＣＲというように主な操作段階は４段階に分
かれており、通常の操作では２日以上の時間がかかって
しまう。また、最低で２回（ＲＮＡ抽出→ｃＤＮＡ合
成、第１ＰＣＲ→第２ＰＣＲ）の容器またはチューブ
（ｔｕｂｅ）の交換が必要である。すなわち、現在一般
的に用いられているＲＮＡ抽出法は、強力な蛋白変性剤
であるグアニジンチオシアネートを用いた方法である
が、蛋白変性後、蛋白質や、グアニジンチオシアネート
自身を反応液から除くために、フェノール／クロロホル
ム抽出、さらにエタノール沈殿、リンス等の操作が必要
であり、ＲＮＡ抽出からｃＤＮＡ合成の段階でチューブ
の交換が不可欠である。ＰＣＲ法は、微量の遺伝子を検
出可能なために、検体から検体への遺伝子のキャリーオ
ーバーによる汚染、あるいは、大量に増幅されるＰＣＲ
最終産物の検体中への汚染、いわゆるコンタミネーショ
ンの問題がおこりやすい。これはチューブからチューブ
への検体の移し換えや、チューブの開け閉めなどの操作
が多くなり繁雑であればあるほど危険性は高くなってい
く。また、ＲＮＡ抽出の時に行うフェノール／クロロホ
ルム抽出や、チューブの交換等により、ＲＮＡやｃＤＮ
Ａをロスすることも考えられるため、繁雑な操作は感度
の点からも問題である。このため、現在、いくつかの実
験室で微量のＲＮＡ病原体の検出、例えばＣ型肝炎ウイ
ルスの遺伝子の検出が行われているが、感度もまちまち
であり、またコンタミネーションの問題もあり、比較し
て評価ができない現状である。
標的とする逆転写酵素介在二段階ＰＣＲ法を用いること
で、微量のＲＮＡ病原体遺伝子のアガロースゲル中での
検出が可能となってきた。しかしながらサザンブロッテ
ィングの操作がなくなったとはいっても依然として操作
法は繁雑であり、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、第１ＰＣ
Ｒ、第２ＰＣＲというように主な操作段階は４段階に分
かれており、通常の操作では２日以上の時間がかかって
しまう。また、最低で２回（ＲＮＡ抽出→ｃＤＮＡ合
成、第１ＰＣＲ→第２ＰＣＲ）の容器またはチューブ
（ｔｕｂｅ）の交換が必要である。すなわち、現在一般
的に用いられているＲＮＡ抽出法は、強力な蛋白変性剤
であるグアニジンチオシアネートを用いた方法である
が、蛋白変性後、蛋白質や、グアニジンチオシアネート
自身を反応液から除くために、フェノール／クロロホル
ム抽出、さらにエタノール沈殿、リンス等の操作が必要
であり、ＲＮＡ抽出からｃＤＮＡ合成の段階でチューブ
の交換が不可欠である。ＰＣＲ法は、微量の遺伝子を検
出可能なために、検体から検体への遺伝子のキャリーオ
ーバーによる汚染、あるいは、大量に増幅されるＰＣＲ
最終産物の検体中への汚染、いわゆるコンタミネーショ
ンの問題がおこりやすい。これはチューブからチューブ
への検体の移し換えや、チューブの開け閉めなどの操作
が多くなり繁雑であればあるほど危険性は高くなってい
く。また、ＲＮＡ抽出の時に行うフェノール／クロロホ
ルム抽出や、チューブの交換等により、ＲＮＡやｃＤＮ
Ａをロスすることも考えられるため、繁雑な操作は感度
の点からも問題である。このため、現在、いくつかの実
験室で微量のＲＮＡ病原体の検出、例えばＣ型肝炎ウイ
ルスの遺伝子の検出が行われているが、感度もまちまち
であり、またコンタミネーションの問題もあり、比較し
て評価ができない現状である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述した
ような問題点を克服するために、すなわち操作時間の短
縮、コンタミネーションの防止、ＲＮＡやｃＤＮＡのロ
スの防止のために、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、第１Ｐ
ＣＲ、及び第２ＰＣＲの全行程を単一容器内で行う遺伝
子増幅法を見出し、本発明を完成させた。この方法は工
程の途中で容器の交換がなく、すべて検体に試薬類を加
えて反応させていくところに特徴がある。
ような問題点を克服するために、すなわち操作時間の短
縮、コンタミネーションの防止、ＲＮＡやｃＤＮＡのロ
スの防止のために、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、第１Ｐ
ＣＲ、及び第２ＰＣＲの全行程を単一容器内で行う遺伝
子増幅法を見出し、本発明を完成させた。この方法は工
程の途中で容器の交換がなく、すべて検体に試薬類を加
えて反応させていくところに特徴がある。
【０００５】したがって、本発明は、ＲＮＡウイルス由
来遺伝子を増幅し、検出するための方法であって、ＲＮ
Ａウイルスを含有する検体を、ウイルス破壊可能な蛋白
質分解酵素の存在下に処理してウイルスＲＮＡを露出さ
せ、次いで熱処理により該蛋白質分解酵素を失活させる
第１段階、Ｔｍ値４５以上の第１ＰＣＲ用アンチセンス
プライマーの存在下、該ウイルスＲＮＡに逆転写酵素を
作用して該ＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成する第２段
階、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下、並びに、Ｔｍ
値４５以上の第１ＰＣＲ用センスプライマーとＴｍ値３
０〜７０の第２ＰＣＲ用センス及びアンチセンスプライ
マーとの存在下、第１ＰＣＲ用センスもしくはアンチセ
ンスプライマー／第２ＰＣＲ用センスもしくはアンチセ
ンスプライマーのモル比１／２０〜１／1000及び下記の
温度条件： 第１ＰＣＲ： ＤＮＡ変性−−鋳型２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡへ解離
することが可能である温度 アニーリング−該１本鎖ＤＮＡへの第１ＰＣＲ用プライ
マーのアニーリングを優先的に起こすことが可能である
温度 伸長反応−−−該１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡの合成
を可能にする温度 第２ＰＣＲ： ＤＮＡ変性−−第１ＰＣＲで合成された鋳型２本鎖ＤＮ
Ａを１本鎖ＤＮＡへ解離することが可能である温度 アニーリング−該１本鎖ＤＮＡへの第２ＰＣＲ用プライ
マーのアニーリングを起こすことが可能である温度 伸長反応−−−該１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡの合成
を可能にする温度 で第１及び第２ＰＣＲを各々１サイクル以上実施してＤ
ＮＡを増幅する第３段階、該増幅ＤＮＡを検出する第４
段階、を包含し、且つ、前記第１〜３段階の全工程を単
一容器内で実施する前記方法を提供する。
来遺伝子を増幅し、検出するための方法であって、ＲＮ
Ａウイルスを含有する検体を、ウイルス破壊可能な蛋白
質分解酵素の存在下に処理してウイルスＲＮＡを露出さ
せ、次いで熱処理により該蛋白質分解酵素を失活させる
第１段階、Ｔｍ値４５以上の第１ＰＣＲ用アンチセンス
プライマーの存在下、該ウイルスＲＮＡに逆転写酵素を
作用して該ＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成する第２段
階、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下、並びに、Ｔｍ
値４５以上の第１ＰＣＲ用センスプライマーとＴｍ値３
０〜７０の第２ＰＣＲ用センス及びアンチセンスプライ
マーとの存在下、第１ＰＣＲ用センスもしくはアンチセ
ンスプライマー／第２ＰＣＲ用センスもしくはアンチセ
ンスプライマーのモル比１／２０〜１／1000及び下記の
温度条件： 第１ＰＣＲ： ＤＮＡ変性−−鋳型２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡへ解離
することが可能である温度 アニーリング−該１本鎖ＤＮＡへの第１ＰＣＲ用プライ
マーのアニーリングを優先的に起こすことが可能である
温度 伸長反応−−−該１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡの合成
を可能にする温度 第２ＰＣＲ： ＤＮＡ変性−−第１ＰＣＲで合成された鋳型２本鎖ＤＮ
Ａを１本鎖ＤＮＡへ解離することが可能である温度 アニーリング−該１本鎖ＤＮＡへの第２ＰＣＲ用プライ
マーのアニーリングを起こすことが可能である温度 伸長反応−−−該１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡの合成
を可能にする温度 で第１及び第２ＰＣＲを各々１サイクル以上実施してＤ
ＮＡを増幅する第３段階、該増幅ＤＮＡを検出する第４
段階、を包含し、且つ、前記第１〜３段階の全工程を単
一容器内で実施する前記方法を提供する。
【０００６】以下に本発明を詳しく説明する。
【０００７】ＲＮＡを抽出する検体としては、全血、血
漿、血清、尿、唾液、乳汁等の、標的ＲＮＡウイルス粒
子及び／又はＲＮＡウイルス由来遺伝子が含まれている
可能性のあるすべてのものが含まれる。
漿、血清、尿、唾液、乳汁等の、標的ＲＮＡウイルス粒
子及び／又はＲＮＡウイルス由来遺伝子が含まれている
可能性のあるすべてのものが含まれる。
【０００８】本発明方法に適用し得るＲＮＡウイルスと
しては、picornavirus科ウイルス（例えばpoliovirus，
ヒトrhinovirus）、reovirus科ウイルス（例えば乳幼児
下痢症ウイルス、reovirus）、togavirus 科ウイルス
（例えば風疹ウイルス、日本脳炎ウイルス）、orthomyx
ovirus科ウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、
paramyxovirus 科ウイルス（例えばセンダイウイル
ス）、rhabdovirus 科ウイルス（例えば水疱性口内炎ウ
イルス、狂犬病ウイルス）、retrovirus科ウイルス（例
えば Rous 肉腫ウイルス）、arenavirus科ウイルス（例
えばＬＣＭウイルス）、coronavirus 科ウイルス（例え
ばトリ伝染性気管支炎ウイルス）、後天性免疫不全ウイ
ルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルスなどが例示される。
しては、picornavirus科ウイルス（例えばpoliovirus，
ヒトrhinovirus）、reovirus科ウイルス（例えば乳幼児
下痢症ウイルス、reovirus）、togavirus 科ウイルス
（例えば風疹ウイルス、日本脳炎ウイルス）、orthomyx
ovirus科ウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、
paramyxovirus 科ウイルス（例えばセンダイウイル
ス）、rhabdovirus 科ウイルス（例えば水疱性口内炎ウ
イルス、狂犬病ウイルス）、retrovirus科ウイルス（例
えば Rous 肉腫ウイルス）、arenavirus科ウイルス（例
えばＬＣＭウイルス）、coronavirus 科ウイルス（例え
ばトリ伝染性気管支炎ウイルス）、後天性免疫不全ウイ
ルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルスなどが例示される。
【０００９】本発明方法の第１段階すなわちウイルスＲ
ＮＡの抽出もしくは露出工程においては、蛋白質分解作
用によりウイルスを破壊してウイルスＲＮＡを露出する
ことが可能な蛋白質分解酵素を存在させる。このような
種類の酵素の具体例は、プロティナーゼＫ、トリプシ
ン、キモトリプシン、エラスターゼなどである。前述し
たように、従来のＲＮＡ抽出法では、蛋白変性剤が使用
され、これを除去するためにフェノール／クロロホルム
抽出が行なわれ、このために、ｃＤＮＡ合成前に容器の
交換が不可欠であった。本発明では、これらの一般的な
試薬類に代えて蛋白質分解酵素を使用するために、容器
の交換が不要である。本発明で使用する蛋白質分解酵素
の用量は、特に限定されない。また、ＲＮＡ抽出時に
は、使用される蛋白質分解酵素の特性に応じた至適ｐＨ
の緩衝液及び至適温度が一般に用いられる。例えば、プ
ロティナーゼＫの場合、ｐＨ７．５〜１２、温度３７〜
５４℃が好適である。さらにプロティナーゼＫの活性を
高めるため SDS, Nonidet P40,Tween 20, Triton X100
等の界面活性剤、あるいは、尿素を添加することも可能
である。ＲＮＡ抽出後、加熱処理（通常９０〜９５℃）
によって蛋白質分解酵素を失活させる。
ＮＡの抽出もしくは露出工程においては、蛋白質分解作
用によりウイルスを破壊してウイルスＲＮＡを露出する
ことが可能な蛋白質分解酵素を存在させる。このような
種類の酵素の具体例は、プロティナーゼＫ、トリプシ
ン、キモトリプシン、エラスターゼなどである。前述し
たように、従来のＲＮＡ抽出法では、蛋白変性剤が使用
され、これを除去するためにフェノール／クロロホルム
抽出が行なわれ、このために、ｃＤＮＡ合成前に容器の
交換が不可欠であった。本発明では、これらの一般的な
試薬類に代えて蛋白質分解酵素を使用するために、容器
の交換が不要である。本発明で使用する蛋白質分解酵素
の用量は、特に限定されない。また、ＲＮＡ抽出時に
は、使用される蛋白質分解酵素の特性に応じた至適ｐＨ
の緩衝液及び至適温度が一般に用いられる。例えば、プ
ロティナーゼＫの場合、ｐＨ７．５〜１２、温度３７〜
５４℃が好適である。さらにプロティナーゼＫの活性を
高めるため SDS, Nonidet P40,Tween 20, Triton X100
等の界面活性剤、あるいは、尿素を添加することも可能
である。ＲＮＡ抽出後、加熱処理（通常９０〜９５℃）
によって蛋白質分解酵素を失活させる。
【００１０】ｃＤＮＡ合成は通常の方法で実施し得る。
例えば、蛋白質分解酵素処理検体に、ｄＮＴＰｓ（Ｎ＝
Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃ）、RNase 阻害剤、逆転写酵素、さらに
第１ＰＣＲに用いる２つのプライマーのうちアンチセン
スプライマーを加え、ｃＤＮＡ合成を行う。逆転写酵素
としては、各種ウイルスＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を触
媒する任意の酵素類が用いられ、例えばＡＭＶ−リバー
ストランスクリプターゼ、ＭＭＬＶ−リバーストランス
クリプターゼなどが挙げられる。ｃＤＮＡ合成後、逆転
写酵素を失活させてもさせなくてもよいが、高温（通常
９０〜９５℃）で該酵素を失活させるのが好ましい。逆
転写酵素を失活させない場合には、ＰＣＲを行う際に該
酵素が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害するため
に感度の低下がみられることがあり、ＰＣＲ産物がバン
ドとして検出できない場合がある。
例えば、蛋白質分解酵素処理検体に、ｄＮＴＰｓ（Ｎ＝
Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃ）、RNase 阻害剤、逆転写酵素、さらに
第１ＰＣＲに用いる２つのプライマーのうちアンチセン
スプライマーを加え、ｃＤＮＡ合成を行う。逆転写酵素
としては、各種ウイルスＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を触
媒する任意の酵素類が用いられ、例えばＡＭＶ−リバー
ストランスクリプターゼ、ＭＭＬＶ−リバーストランス
クリプターゼなどが挙げられる。ｃＤＮＡ合成後、逆転
写酵素を失活させてもさせなくてもよいが、高温（通常
９０〜９５℃）で該酵素を失活させるのが好ましい。逆
転写酵素を失活させない場合には、ＰＣＲを行う際に該
酵素が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害するため
に感度の低下がみられることがあり、ＰＣＲ産物がバン
ドとして検出できない場合がある。
【００１１】次に遺伝子増幅反応を行うが、ＰＣＲは上
記のｃＤＮＡ合成後の検体に第１ＰＣＲ用のセンスプラ
イマー、第２ＰＣＲ用のセンスプライマー及びアンチセ
ンスプライマー、さらに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを加
えて行う。現在一般的に行われている方法では、第１Ｐ
ＣＲと第２ＰＣＲの間にチューブの交換が必要である。
この場合、チューブの交換を行わずに第１ＰＣＲを行っ
たあとのチューブに第２ＰＣＲのプライマーを加えＰＣ
Ｒを行うと目的のバンドが検出できなかったり、あるい
は目的のバンド以外の非特異バンドが検出され判定が不
可能になる。これは、一般にＰＣＲに用いられている量
のプライマーを用いると量が過剰なために第１ＰＣＲの
プライマー及び第２ＰＣＲのプライマーでの遺伝子増幅
がおこったり、あるいは、第１ＰＣＲのプライマーで非
特異反応がおこり、目的の遺伝子以外のものを増幅させ
たりするが、それをそのまま第２ＰＣＲのプライマーを
用いて第２ＰＣＲを行うと、さらに、非特異的な遺伝子
の増幅を引き起こすためである。これらの現象を防ぐた
め、第１ＰＣＲの産物を希釈し、第１ＰＣＲのプライマ
ーの量と第１ＰＣＲで生じた非特異産物の量を減らし、
チューブ交換を行ってから第２ＰＣＲを行い特異的なＰ
ＣＲ産物を検出する方法をとっている。
記のｃＤＮＡ合成後の検体に第１ＰＣＲ用のセンスプラ
イマー、第２ＰＣＲ用のセンスプライマー及びアンチセ
ンスプライマー、さらに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを加
えて行う。現在一般的に行われている方法では、第１Ｐ
ＣＲと第２ＰＣＲの間にチューブの交換が必要である。
この場合、チューブの交換を行わずに第１ＰＣＲを行っ
たあとのチューブに第２ＰＣＲのプライマーを加えＰＣ
Ｒを行うと目的のバンドが検出できなかったり、あるい
は目的のバンド以外の非特異バンドが検出され判定が不
可能になる。これは、一般にＰＣＲに用いられている量
のプライマーを用いると量が過剰なために第１ＰＣＲの
プライマー及び第２ＰＣＲのプライマーでの遺伝子増幅
がおこったり、あるいは、第１ＰＣＲのプライマーで非
特異反応がおこり、目的の遺伝子以外のものを増幅させ
たりするが、それをそのまま第２ＰＣＲのプライマーを
用いて第２ＰＣＲを行うと、さらに、非特異的な遺伝子
の増幅を引き起こすためである。これらの現象を防ぐた
め、第１ＰＣＲの産物を希釈し、第１ＰＣＲのプライマ
ーの量と第１ＰＣＲで生じた非特異産物の量を減らし、
チューブ交換を行ってから第２ＰＣＲを行い特異的なＰ
ＣＲ産物を検出する方法をとっている。
【００１２】本発明ではこの第１ＰＣＲと第２ＰＣＲを
１つの容器の中で行うために、第１ＰＣＲに用いられる
プライマーの量を第２ＰＣＲに用いられるプライマーの
量より少なくし、第１ＰＣＲのプライマーが使い切られ
てから第２ＰＣＲが行われるような方法を採用した。
１つの容器の中で行うために、第１ＰＣＲに用いられる
プライマーの量を第２ＰＣＲに用いられるプライマーの
量より少なくし、第１ＰＣＲのプライマーが使い切られ
てから第２ＰＣＲが行われるような方法を採用した。
【００１３】しかしながら、通常のＰＣＲのプロファイ
ル（温度の上がり下がり）を行うと、４種のプライマー
の間でＰＣＲがかかるため目的以外のバンドも検出され
る。そのため最初に第１ＰＣＲ用の２本のプライマーの
みでＰＣＲがかかる方法が必要である。このために、第
１ＰＣＲ用のプライマーのＴｍ値が４５以上、好ましく
は７５〜９０、より好ましくは８０、及び第２ＰＣＲの
プライマーのＴｍ値が３０〜７０、好ましくは４５〜６
５、より好ましくは約６０となるようにセンス及びアン
チセンスプライマーを設計する。
ル（温度の上がり下がり）を行うと、４種のプライマー
の間でＰＣＲがかかるため目的以外のバンドも検出され
る。そのため最初に第１ＰＣＲ用の２本のプライマーの
みでＰＣＲがかかる方法が必要である。このために、第
１ＰＣＲ用のプライマーのＴｍ値が４５以上、好ましく
は７５〜９０、より好ましくは８０、及び第２ＰＣＲの
プライマーのＴｍ値が３０〜７０、好ましくは４５〜６
５、より好ましくは約６０となるようにセンス及びアン
チセンスプライマーを設計する。
【００１４】また、第１ＰＣＲ用センスもしくはアンチ
センスプライマー／第２ＰＣＲ用センスもしくはアンチ
センスプライマーのモル比１／２０〜１／1000、好まし
くは１／100 で遺伝子増幅反応を実施する。
センスプライマー／第２ＰＣＲ用センスもしくはアンチ
センスプライマーのモル比１／２０〜１／1000、好まし
くは１／100 で遺伝子増幅反応を実施する。
【００１５】本明細書中で使用する用語「Ｔｍ」は、セ
ンスもしくはアンチセンスプライマー量の５０％が対応
する鋳型にアニーリングする温度として定義される。Ｔ
ｍ値はプライマーのＧＣ含量に大きく影響を受けるがＧ
Ｃ含量が５０％程度であればヌクレオチド配列の長さと
ほぼ相関性があり、例えば、Ｔｍ＝約７０の場合約２５
mer、Ｔｍ＝約６０の場合約２０ merである。
ンスもしくはアンチセンスプライマー量の５０％が対応
する鋳型にアニーリングする温度として定義される。Ｔ
ｍ値はプライマーのＧＣ含量に大きく影響を受けるがＧ
Ｃ含量が５０％程度であればヌクレオチド配列の長さと
ほぼ相関性があり、例えば、Ｔｍ＝約７０の場合約２５
mer、Ｔｍ＝約６０の場合約２０ merである。
【００１６】このようなプライマーセットの例として
は、下記に示すＣ型肝炎ウイルス検出用プライマー： 第１ＰＣＲ用センスプライマー： ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ 第１ＰＣＲ用アンチセンスプライマー： ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ 第２ＰＣＲ用センスプライマー： ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴ［ＧまたはＡ］Ｃ−３’ 第２ＰＣＲ用アンチセンスプライマー： ５’−［ＡまたはＧ］ＧＧＣＡＴ［ＴまたはＡ］ＧＡＧ［ＣまたはＴ］ＧＧＧ ＴＴＴＡＴＣ−３’ が挙げられる。
は、下記に示すＣ型肝炎ウイルス検出用プライマー： 第１ＰＣＲ用センスプライマー： ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ 第１ＰＣＲ用アンチセンスプライマー： ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ 第２ＰＣＲ用センスプライマー： ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴ［ＧまたはＡ］Ｃ−３’ 第２ＰＣＲ用アンチセンスプライマー： ５’−［ＡまたはＧ］ＧＧＣＡＴ［ＴまたはＡ］ＧＡＧ［ＣまたはＴ］ＧＧＧ ＴＴＴＡＴＣ−３’ が挙げられる。
【００１７】ＰＣＲの温度条件は下記の通りである。
【００１８】第１ＰＣＲ：ＤＮＡ変性温度は、一般的に
は鋳型２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡへ解離することが可
能である温度であり、好ましくは92〜96℃である。
は鋳型２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡへ解離することが可
能である温度であり、好ましくは92〜96℃である。
【００１９】アニーリング温度は、一般的には該１本鎖
ＤＮＡへの第１ＰＣＲ用プライマーのアニーリングを優
先的に起こすことが可能である温度であり、好ましくは
65〜75℃である。
ＤＮＡへの第１ＰＣＲ用プライマーのアニーリングを優
先的に起こすことが可能である温度であり、好ましくは
65〜75℃である。
【００２０】伸長反応温度は、一般的には該１本鎖ＤＮ
Ａに相補的なＤＮＡの合成を可能にする温度であり、好
ましくは65〜75℃である。
Ａに相補的なＤＮＡの合成を可能にする温度であり、好
ましくは65〜75℃である。
【００２１】第２ＰＣＲ：ＤＮＡ変性温度及び伸長反応
温度は第１ＰＣＲの場合と同様である。
温度は第１ＰＣＲの場合と同様である。
【００２２】アニーリング温度は、一般的には第１ＰＣ
Ｒで合成された鋳型２本鎖ＤＮＡを変性して得られた１
本鎖ＤＮＡに第２ＰＣＲ用プライマーがアニーリングす
ることが可能である温度であり、好ましくは45〜60℃で
ある。
Ｒで合成された鋳型２本鎖ＤＮＡを変性して得られた１
本鎖ＤＮＡに第２ＰＣＲ用プライマーがアニーリングす
ることが可能である温度であり、好ましくは45〜60℃で
ある。
【００２３】上記ＰＣＲ条件で重要な特徴の１つがアニ
ーリング温度である。即ち、第１ＰＣＲ用のプライマー
のアニーリングは好ましくは65〜75℃、より好ましくは
72℃で行う。この温度条件では第２のＰＣＲのプライマ
ーはほとんどアニーリングしないために、第１ＰＣＲ用
のプライマーのみで増幅がおこる。このあとアニーニン
グ温度を好ましくは４５〜６０℃、より好ましくは５５
℃に下げ第２ＰＣＲ用のプライマーでＰＣＲを行わせ
る。本発明の実施態様においては、前半の１０〜２５サ
イクルはＤＮＡ変性を９４℃で、アニーリングと伸長反
応を同時におこさせるために７２℃で行う。後半の２０
〜３０サイクルは、ＤＮＡ変性９４℃、アニーリング５
５℃、伸長反応７２℃で行うことにより第２ＰＣＲのプ
ライマーで増幅がおこる。このようにプライマーの量と
ＰＣＲのプロファイルを変化させることにより単一容器
内での遺伝子増幅反応が可能となる。
ーリング温度である。即ち、第１ＰＣＲ用のプライマー
のアニーリングは好ましくは65〜75℃、より好ましくは
72℃で行う。この温度条件では第２のＰＣＲのプライマ
ーはほとんどアニーリングしないために、第１ＰＣＲ用
のプライマーのみで増幅がおこる。このあとアニーニン
グ温度を好ましくは４５〜６０℃、より好ましくは５５
℃に下げ第２ＰＣＲ用のプライマーでＰＣＲを行わせ
る。本発明の実施態様においては、前半の１０〜２５サ
イクルはＤＮＡ変性を９４℃で、アニーリングと伸長反
応を同時におこさせるために７２℃で行う。後半の２０
〜３０サイクルは、ＤＮＡ変性９４℃、アニーリング５
５℃、伸長反応７２℃で行うことにより第２ＰＣＲのプ
ライマーで増幅がおこる。このようにプライマーの量と
ＰＣＲのプロファイルを変化させることにより単一容器
内での遺伝子増幅反応が可能となる。
【００２４】さらに容器の蓋の開閉の回数を減らすため
にＲＮＡ抽出後の反応をｃＤＮＡ合成およびＰＣＲに必
要なすべての試薬を加えｃＤＮＡ合成とＰＣＲを連続し
て行うことも可能である。この場合、ｃＤＮＡが合成さ
れる時に４本のプライマーが反応系に入っているため
に、第１ＰＣＲ用のアンチセンスプライマーと第２ＰＣ
Ｒ用のアンチセンスプライマーの２本から長さの異なる
２本のｃＤＮＡが合成される。第２ＰＣＲ用のアンチセ
ンスプライマーから合成されたｃＤＮＡは短いために、
第１ＰＣＲ用のプライマーの組合せでは遺伝子の増幅が
行われず第１ＰＣＲ反応が行われないので感度が悪くな
る可能性がある。これを防ぐために、第１ＰＣＲのアン
チセンスプライマーの５’端ヌクレオチド配列と第２Ｐ
ＣＲ用のアンチセンスプライマーのヌクレオチド配列を
同一にし、前述と同様の範囲内で第１ＰＣＲ用のプライ
マーはＴｍ値を上げるために長く、第２ＰＣＲ用のプラ
イマーはＴｍ値を低くするために短くしたものを用い
た。このプライマーを用いることにより、どちらのプラ
イマーからでも同じ長さのｃＤＮＡが合成されるために
ｃＤＮＡ合成による感度の低下はみられない。
にＲＮＡ抽出後の反応をｃＤＮＡ合成およびＰＣＲに必
要なすべての試薬を加えｃＤＮＡ合成とＰＣＲを連続し
て行うことも可能である。この場合、ｃＤＮＡが合成さ
れる時に４本のプライマーが反応系に入っているため
に、第１ＰＣＲ用のアンチセンスプライマーと第２ＰＣ
Ｒ用のアンチセンスプライマーの２本から長さの異なる
２本のｃＤＮＡが合成される。第２ＰＣＲ用のアンチセ
ンスプライマーから合成されたｃＤＮＡは短いために、
第１ＰＣＲ用のプライマーの組合せでは遺伝子の増幅が
行われず第１ＰＣＲ反応が行われないので感度が悪くな
る可能性がある。これを防ぐために、第１ＰＣＲのアン
チセンスプライマーの５’端ヌクレオチド配列と第２Ｐ
ＣＲ用のアンチセンスプライマーのヌクレオチド配列を
同一にし、前述と同様の範囲内で第１ＰＣＲ用のプライ
マーはＴｍ値を上げるために長く、第２ＰＣＲ用のプラ
イマーはＴｍ値を低くするために短くしたものを用い
た。このプライマーを用いることにより、どちらのプラ
イマーからでも同じ長さのｃＤＮＡが合成されるために
ｃＤＮＡ合成による感度の低下はみられない。
【００２５】このようなプライマーセットの例として
は、下記に示すＣ型肝炎ウイルス検出用プライマー： 第１ＰＣＲ用センスプライマー： ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ 第１ＰＣＲ用アンチセンスプライマー： ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ 第２ＰＣＲ用センスプライマー： ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣ−３’ 第２ＰＣＲ用アンチセンスプライマー： ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ−３’ が挙げられる。
は、下記に示すＣ型肝炎ウイルス検出用プライマー： 第１ＰＣＲ用センスプライマー： ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ 第１ＰＣＲ用アンチセンスプライマー： ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ 第２ＰＣＲ用センスプライマー： ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣ−３’ 第２ＰＣＲ用アンチセンスプライマー： ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ−３’ が挙げられる。
【００２６】増幅ＤＮＡの検出手段としては、増幅ＤＮ
Ａをアガロースゲル電気泳動にかけてそのサイズ分析に
よる方法が、その簡易さの点で好適である。この他に、
サザンブロット法、32Ｐ標識プローブを用いるハイブリ
ダイゼーション法などの手段もウイルスの同定、検出に
使用し得る。
Ａをアガロースゲル電気泳動にかけてそのサイズ分析に
よる方法が、その簡易さの点で好適である。この他に、
サザンブロット法、32Ｐ標識プローブを用いるハイブリ
ダイゼーション法などの手段もウイルスの同定、検出に
使用し得る。
【００２７】本発明はまた、上記に説明した方法で使用
するための、Ｃ型肝炎ウイルスを検出するための下記の
プライマーセットを提供する。
するための、Ｃ型肝炎ウイルスを検出するための下記の
プライマーセットを提供する。
【００２８】 プライマーセット１： ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣ−３’ ５’−ＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＴＡＴＣ−３’ プライマーセット２： ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＡＣ−３’ ５’−ＧＧＧＣＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＡＴＣ−３’ プライマーセット３： ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣ−３’ ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ−３’
【００２９】
【実施例】以下の実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３０】実施例１ 単一容器内での逆転写酵素介在二段階ＰＣＲ この反応系はＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ反応の
３段階に分けられる。ＲＮＡ抽出はプロティナーゼＫを
用いる。シリコナイズを行った０．５ｍｌのマイクロチ
ューブに１０μｌのＣ型肝炎患者血清を入れる。これに
２×プロティナーゼ反応液１０μｌ［100mM Tris HCl p
H8.3, 100mM KCl,プロティナーゼ40μg/ml］を加え、ミ
ネラルオイル１滴を重層し５４℃で１時間反応させる。
反応終了後、９４℃で１５分間保持し、プロティナーゼ
Ｋを失活させる。この反応液に2.5×ｃＤＮＡ合成反応
液３０μｌ［50mM Tris HCl pH 8.3, 50mM KCl, 1.7mMD
TT, 660μM dATP， 660μM dTTP， 660μM dCTP， 660
μM dGTP， 200単位のリボヌクレアーゼ阻害剤，プライ
マー５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ
ＣＡＡＧ−３’2pmole, 3.3mM MgCl2 ， AMV−リバース
・トランスクリプターゼ（生化学工業製）10単位］を加
え軽く撹拌した後、遠心する。このチューブを４２℃で
１時間反応させる。反応終了後、 AMV−リバース・トラ
ンスクリプターゼを失活させるため、９５℃で１０分間
保持する。次にＰＣＲを行うために、２×ＰＣＲ反応液
［50mM KCl，0.02% ゼラチン，プライマー５’−ＣＴＧ
ＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’
2pmole，プライマー５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴ
ＧＴＣＧＴＧＣ−３’100pmole，プライマー５’−ＡＧ
ＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＴＡＴＣ−３’100pmol
e，５単位のTaq DNA ポリメラーゼ（ベーリンガー マ
ンハイム ヤマノウチ社製）］を５０μｌ加え軽く撹拌
した後、遠心する。ＰＣＲ反応は、Perkin Elmer Cetus
社のDNA thermalCyclerを用いて行った。反応のプロフ
ァイルは、ＤＮＡ変性９４℃ 1.5分、アニーリング／伸
長反応７２℃２分で２５サイクル、及び、ＤＮＡ変性９
４℃１分、アニーリング５０℃ 1.5分、伸長反応７２℃
1.5分で３０サイクルとした。反応終了後、７２℃で１
０分間保持し、４℃に放置する。
３段階に分けられる。ＲＮＡ抽出はプロティナーゼＫを
用いる。シリコナイズを行った０．５ｍｌのマイクロチ
ューブに１０μｌのＣ型肝炎患者血清を入れる。これに
２×プロティナーゼ反応液１０μｌ［100mM Tris HCl p
H8.3, 100mM KCl,プロティナーゼ40μg/ml］を加え、ミ
ネラルオイル１滴を重層し５４℃で１時間反応させる。
反応終了後、９４℃で１５分間保持し、プロティナーゼ
Ｋを失活させる。この反応液に2.5×ｃＤＮＡ合成反応
液３０μｌ［50mM Tris HCl pH 8.3, 50mM KCl, 1.7mMD
TT, 660μM dATP， 660μM dTTP， 660μM dCTP， 660
μM dGTP， 200単位のリボヌクレアーゼ阻害剤，プライ
マー５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ
ＣＡＡＧ−３’2pmole, 3.3mM MgCl2 ， AMV−リバース
・トランスクリプターゼ（生化学工業製）10単位］を加
え軽く撹拌した後、遠心する。このチューブを４２℃で
１時間反応させる。反応終了後、 AMV−リバース・トラ
ンスクリプターゼを失活させるため、９５℃で１０分間
保持する。次にＰＣＲを行うために、２×ＰＣＲ反応液
［50mM KCl，0.02% ゼラチン，プライマー５’−ＣＴＧ
ＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’
2pmole，プライマー５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴ
ＧＴＣＧＴＧＣ−３’100pmole，プライマー５’−ＡＧ
ＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＴＡＴＣ−３’100pmol
e，５単位のTaq DNA ポリメラーゼ（ベーリンガー マ
ンハイム ヤマノウチ社製）］を５０μｌ加え軽く撹拌
した後、遠心する。ＰＣＲ反応は、Perkin Elmer Cetus
社のDNA thermalCyclerを用いて行った。反応のプロフ
ァイルは、ＤＮＡ変性９４℃ 1.5分、アニーリング／伸
長反応７２℃２分で２５サイクル、及び、ＤＮＡ変性９
４℃１分、アニーリング５０℃ 1.5分、伸長反応７２℃
1.5分で３０サイクルとした。反応終了後、７２℃で１
０分間保持し、４℃に放置する。
【００３１】反応が終了したＰＣＲ産物は、１０μｌを
電気泳動し、ＰＣＲ産物のサイズを確認する。電気泳動
はＴＡＫＡＲＡのNusiere ３：１のアガロースゲル４％
を用いて行う。ＰＣＲ産物１０μｌに５×染料［0.25％
ブロモフェノールブルー，0.25％キシレン・シアノール
FF，40％グリセロールからなる水溶液］を２．５μｌ加
え、Ｍｕｐｉｄ電気泳動槽１００Ｖで約３０分泳動す
る。泳動終了後、エチジウムブロマイドで染色しＵＶラ
イト下でバンドの検出を行った。図１に陰性対称と、陽
性サンプルの電気泳動像を示した。ＰＣＲ産物は１３２
bpのバンドとして検出される。
電気泳動し、ＰＣＲ産物のサイズを確認する。電気泳動
はＴＡＫＡＲＡのNusiere ３：１のアガロースゲル４％
を用いて行う。ＰＣＲ産物１０μｌに５×染料［0.25％
ブロモフェノールブルー，0.25％キシレン・シアノール
FF，40％グリセロールからなる水溶液］を２．５μｌ加
え、Ｍｕｐｉｄ電気泳動槽１００Ｖで約３０分泳動す
る。泳動終了後、エチジウムブロマイドで染色しＵＶラ
イト下でバンドの検出を行った。図１に陰性対称と、陽
性サンプルの電気泳動像を示した。ＰＣＲ産物は１３２
bpのバンドとして検出される。
【００３２】
【発明の効果】本発明のＲＮＡ遺伝子の増幅検出方法の
特徴は、ウイルスＲＮＡの抽出に蛋白質分解酵素を使用
し、且つ、二段階遺伝子増幅反応に、限定された長さと
量比の第１ＰＣＲ用プライマー及び第２ＰＣＲ用プライ
マーを使用することによって、全工程を単に温度コント
ロールのみで操作することが可能であり、したがってＲ
ＮＡ抽出から遺伝子増幅までを単一容器内で実施し得
る。これによって、操作時間の短縮（１人あたりの処理
検体数：本発明約３０検体／日；従来方法約９検体／
日）、簡便な操作、コンタミネーションの危険性の減少
がはかられ、分析結果の信頼性、再現性が上昇する。
特徴は、ウイルスＲＮＡの抽出に蛋白質分解酵素を使用
し、且つ、二段階遺伝子増幅反応に、限定された長さと
量比の第１ＰＣＲ用プライマー及び第２ＰＣＲ用プライ
マーを使用することによって、全工程を単に温度コント
ロールのみで操作することが可能であり、したがってＲ
ＮＡ抽出から遺伝子増幅までを単一容器内で実施し得
る。これによって、操作時間の短縮（１人あたりの処理
検体数：本発明約３０検体／日；従来方法約９検体／
日）、簡便な操作、コンタミネーションの危険性の減少
がはかられ、分析結果の信頼性、再現性が上昇する。
【図１】 この図は、実施例１の方法でのＰＣＲ産物の
アガロースゲル電気泳動像を示す図である。陽性の場合
１３２bpのバンドがみられる。
アガロースゲル電気泳動像を示す図である。陽性の場合
１３２bpのバンドがみられる。
Ｍ：マーカー（φＸ174 ／ＨａｅIII 消化物） １，２：陽性サンプル ３，４：陰性サンプル
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/70 7823−4Ｂ
Claims (11)
- 【請求項１】 ＲＮＡウイルス由来遺伝子を増幅し、検
出するための方法であって、 ＲＮＡウイルスを含有する検体を、ウイルス破壊可能な
蛋白質分解酵素の存在下に処理してウイルスＲＮＡを露
出させ、次いで熱処理により該蛋白質分解酵素を失活さ
せる第１段階、 Ｔｍ値４５以上の第１ＰＣＲ用アンチセンスプライマー
の存在下、該ウイルスＲＮＡに逆転写酵素を作用して該
ＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成する第２段階、 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下、並びに、Ｔｍ値４
５以上の第１ＰＣＲ用センスプライマーとＴｍ値３０〜
７０の第２ＰＣＲ用センス及びアンチセンスプライマー
との存在下、第１ＰＣＲ用センスもしくはアンチセンス
プライマー／第２ＰＣＲ用センスもしくはアンチセンス
プライマーのモル比１／２０〜１／1000及び下記の温度
条件： 第１ＰＣＲ： ＤＮＡ変性−−鋳型２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡへ解離
することが可能である温度 アニーリング−該１本鎖ＤＮＡへの第１ＰＣＲ用プライ
マーのアニーリングを優先的に起こすことが可能である
温度 伸長反応−−−該１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡの合成
を可能にする温度 第２ＰＣＲ： ＤＮＡ変性−−第１ＰＣＲで合成された鋳型２本鎖ＤＮ
Ａを１本鎖ＤＮＡへ解離することが可能である温度 アニーリング−該１本鎖ＤＮＡへの第２ＰＣＲ用プライ
マーのアニーリングを起こすことが可能である温度 伸長反応−−−該１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡの合成
を可能にする温度 で第１及び第２ＰＣＲを各々１サイクル以上実施してＤ
ＮＡを増幅する第３段階、 該増幅ＤＮＡを検出する第４段階、 を包含し、且つ、前記第１〜３段階の全工程を単一容器
内で実施することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 蛋白質分解酵素がプロティナーゼＫであ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記検出を、増幅ＤＮＡをアガロースゲ
ル電気泳動にかけてそのサイズ分析により実施する請求
項１記載の方法。 - 【請求項４】 前記第１ＰＣＲでのアニーリングと伸長
反応を同時に実施する請求項１〜３のいずれか一項に記
載の方法。 - 【請求項５】 前記第２段階で、ｃＤＮＡ合成後に熱処
理により逆転写酵素を失活させる請求項１〜４のいずれ
か一項に記載の方法。 - 【請求項６】 第１及び第２プライマーがＣ型肝炎ウイ
ルスを検出するためのものであり、第１ＰＣＲ用センス
及びアンチセンスプライマーがそれぞれ ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ であり、並びに、第２ＰＣＲ用センス及びアンチセンス
プライマーがそれぞれ ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴ［ＧまたはＡ］Ｃ−３’ ５’−［ＡまたはＧ］ＧＧＣＡＴ［ＴまたはＡ］ＧＡＧ［ＣまたはＴ］ＧＧＧ ＴＴＴＡＴＣ−３’ である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲに必要な全試薬
の存在下に、はじめにｃＤＮＡ合成、次いでＤＮＡ増幅
を実施する、このとき、第１ＰＣＲ用アンチセンスプラ
イマーの５’端ヌクレオチド配列と第２ＰＣＲ用アンチ
センスプライマーのヌクレオチド配列を同一にする、請
求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】 第１及び第２プライマーがＣ型肝炎ウイ
ルスを検出するためのものであり、第１ＰＣＲ用センス
及びアンチセンスプライマーがそれぞれ ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ であり、並びに、第２ＰＣＲ用センス及びアンチセンス
プライマーがそれぞれ ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣ−３’ ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ−３’ である請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 請求項１に記載の方法で使用するため
の、Ｃ型肝炎ウイルスを検出するための下記の４種のプ
ライマーセット。 ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣ−３’ ５’−ＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＴＡＴＣ−３’ - 【請求項１０】 請求項１に記載の方法で使用するため
の、Ｃ型肝炎ウイルスを検出するための下記の４種のプ
ライマーセット。 ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＡＣ−３’ ５’−ＧＧＧＣＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＡＴＣ−３’ - 【請求項１１】 請求項１に記載の方法で使用するため
の、Ｃ型肝炎ウイルスを検出するための下記の４種のプ
ライマーセット。 ５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧ−３’ ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧ−３’ ５’−ＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣ−３’ ５’−ＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ−３’
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22218492A JPH0646900A (ja) | 1992-07-29 | 1992-07-29 | 単一容器内での逆転写酵素介在二段階遺伝子増幅反応によるｒｎａ遺伝子の増幅検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22218492A JPH0646900A (ja) | 1992-07-29 | 1992-07-29 | 単一容器内での逆転写酵素介在二段階遺伝子増幅反応によるｒｎａ遺伝子の増幅検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646900A true JPH0646900A (ja) | 1994-02-22 |
Family
ID=16778478
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22218492A Pending JPH0646900A (ja) | 1992-07-29 | 1992-07-29 | 単一容器内での逆転写酵素介在二段階遺伝子増幅反応によるｒｎａ遺伝子の増幅検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646900A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006528002A (ja) * | 2003-05-19 | 2006-12-14 | ブランデイズ ユニバーシティー | 核酸プロセシング方法、キット、及び装置 |
| WO2021221109A1 (ja) | 2020-04-30 | 2021-11-04 | タカラバイオ株式会社 | Ｒｎａウイルスの検出方法 |
-
1992
- 1992-07-29 JP JP22218492A patent/JPH0646900A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006528002A (ja) * | 2003-05-19 | 2006-12-14 | ブランデイズ ユニバーシティー | 核酸プロセシング方法、キット、及び装置 |
| JP4836795B2 (ja) * | 2003-05-19 | 2011-12-14 | ブランデイズ ユニバーシティー | 核酸プロセシング方法、キット、及び装置 |
| US9279121B2 (en) | 2003-05-19 | 2016-03-08 | Lawrence J Wangh | Nucleic acid processing kits and devices |
| WO2021221109A1 (ja) | 2020-04-30 | 2021-11-04 | タカラバイオ株式会社 | Ｒｎａウイルスの検出方法 |
| KR20230005897A (ko) | 2020-04-30 | 2023-01-10 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | Rna 바이러스의 검출 방법 |
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