TWI754967B - 屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組及方法與茲卡病毒的檢測套組及方法 - Google Patents

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Abstract

屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組包括對屈公病毒具專一性的第一引子組及對茲卡病毒具專一性的第二引子組。第一引子組包括具SEQ ID NO：1序列的順向引子及具SEQ ID NO：2序列的逆向引子。第二引子組包括具SEQ ID NO：4序列的順向引子、具SEQ ID NO：5序列的順向引子、及具SEQ ID NO：6序列的逆向引子。套組也包括對屈公病毒具專一性且具SEQ ID NO：3序列的探針，及對茲卡病毒具專一性且具SEQ ID NO：7序列的探針。套組更包括由軟腐細菌之proA基因體外轉錄所得RNA之內部控制模板、具SEQ ID NO：8序列的順向引子、具SEQ ID NO：9序列的逆向引子、及具SEQ ID NO：10序列的探針。

Description

屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組及方法與茲卡病毒的 檢測套組及方法
本案係關於屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測，尤指用於屈公病毒及茲卡病毒多重檢測的套組及方法。
屈公病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是一種蟲媒病毒，分類學上屬於阿爾發病毒(Alphavirus)屬、披衣病毒(Togaviridae)科。此病毒經由攜帶病毒的斑蚊(Aedes mosquitoes)的叮咬而在人與人之間傳播。此病毒於1953年首次從血清和斑蚊中分離出來。
屈公病通常發生在非洲及亞洲，然由於氣候變化及全球化現象，在歐洲及美洲也爆發了疫情。此疾病的症狀從無症狀到極度病態。屈公病通常始於高達40℃的急性發熱期，且持續數天至一周，接著是長期的關節疾病，會影響四肢的關節，且由關節的屈公病毒感染引起的疼痛會持續數週或數月。據信「屈公」一詞源自非洲當地方言(馬康德語「彎曲」)，描述患者因此病遭受極度關節痛而扭曲的姿勢。其他非特異性症狀可能包括頭痛、結膜炎、消化系統不適、和輕微的畏光。
茲卡病毒是一種經由蚊子傳播的黃病毒，於1947年在烏干達首次於猴子中發現，之後於1952年在烏干達和坦桑尼亞聯合共和國於人類中發現。此病毒經由攜帶病毒的斑蚊(Aedes mosquitoes)的叮咬而在人與人之間傳播。
在2015年之前，茲卡病毒爆發通常發生在非洲，東南亞及太平洋島嶼。然而，由於全球化現象，2015年3月發生了最嚴重的疫情，從巴西開始爆發，不久便蔓延到了美洲、非洲、亞洲和歐洲。此疾病的症狀從無症狀到輕度症狀，例如發燒、皮疹、頭痛、關節痛、以及結膜炎和肌肉痛。通常，輕度症狀會持續幾天到一周，且感染者甚至可能沒有意識到自己已被感染。然而，根據最近的發現，茲卡病毒感染可引起神經系統疾病，例如格林-巴利症候群(Guillain-Barré syndrome)，以及稱為先天性茲卡症候群(congenital Zika syndrome)的嚴重先天性缺陷，其在感染母親的新生兒中，最明顯的症狀就是會有嚴重的小頭畸形。
目前常用於這些病毒診斷的三種技術為病毒分離(針對茲卡病毒)、血清學檢測、和即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR)，這些技術分別透過病毒檢測、對病毒具專一性的抗體檢測、以及病毒RNA檢測來確認病毒的感染。病毒分離須在細胞培養中使用活病毒，且觀察由病毒引起的細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)，再利用對屈公病毒具專一性的抗血清來中和CPE，以確認CPE。此診斷方法的主要缺點是必須在3級生物安全實驗室中進行，且需要1-2週才能完成檢測。血清學檢測雖然可以在15分鐘到2-3天內提供確定結果，但此方法涉及檢測病人血清中的IgM及IgG抗體，而這些抗體僅在臨床症狀(例如發燒)發生幾天後才出現。另外，由於會有其他蟲媒病毒與IgM發生交叉反應而產生假陽性的可能性，特別是如果病人先前有其他黃病毒的感染史，使得血清學檢測的專一性仍受到質疑。即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應是一種較新的診斷法，可解決上述 方法的缺點。由於具有較高的靈敏度，即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應可以更快速地檢測屈公病毒基因體及茲卡病毒基因體，即使在感染初期也是如此，且由於具有較高的專一性，假陽性的可能性也較低。
儘管近年來屈公病毒及茲卡病毒檢測的靈敏度和專一性已經提高了，但是現行的即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應檢測所提供的速度仍然不足，因為典型的逆轉錄聚合酶鏈鎖反應處理時間幾乎為一個半小時。因此，目前仍迫切需要提供一種即時就地照護(Point-of-Care，POC)診斷方法，以靈敏且專一地檢測屈公病毒及茲卡病毒，且提供較快的處理時間。
本案實施例的目的在於提供一種屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測，其具高靈敏度、高專一性、以及縮短的反應時間。
本案實施例的另一目的在於提供一種屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測，以在同一反應中同時檢測屈公病毒及茲卡病毒。
為達上述目的，本案之一實施例提供一種屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組，包括對屈公病毒具專一性的第一引子組及對茲卡病毒具專一性的第二引子組的至少其中之一。第一引子組選自：(a)具有SEQ ID NO：1之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：2之核苷酸序列的一逆向引子；以及(b)具有與SEQ ID NO：1有至少90%一致性之核苷酸序列的一順向引子及具有與SEQ ID NO：2有至少90%一致性之核苷酸序列的一逆向引子。第二引子組選自：(a)具有SEQ ID NO：4之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的一逆向引子；(b)具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的一逆向引子；(c)具有SEQ ID NO：4之核苷酸序列的一第一順向引子、具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列的一第二順向引子、及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的一逆向引子；以及(d)具有與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5之序列有至少90%一致性之核苷酸序列的至少一順向引子及具有與SEQ ID NO：6有至少90%一致性之核苷酸序列的一逆向引子。
在一實施例中，多重檢測套組更包括對屈公病毒具專一性的一探針，其中該探針具有選自下列群組的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO：3之核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO：3互補之核苷酸序列；以及(c)與SEQ ID NO：3或其互補序列有至少90%一致性之核苷酸序列。探針的5’端接上報導染劑，且3’端接上淬滅劑。
在一實施例中，多重檢測套組更包括對茲卡病毒具專一性的一探針，其中該探針具有選自下列群組的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO：7之核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO：7互補之核苷酸序列；以及(c)與SEQ ID NO：7或其互補序列有至少90%一致性之核苷酸序列。探針的5’端接上報導染劑，且3’端接上淬滅劑。
在一實施例中，多重檢測套組更包括一內部控制模板，其為由軟腐細菌(Pectobacterium carotovorum)之proA基因體外轉錄所得之RNA。
在一實施例中，多重檢測套組更包括對proA基因具專一性的一控制引子組，其中該控制引子組選自：(a)具有SEQ ID NO：8之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：9之核苷酸序列的一逆向引子；以及(b)具有與SEQ ID NO：8有至少90%一致性之核苷酸序列的一順向引子及具有與SEQ ID NO：9有至少90%一致性之核苷酸序列的一逆向引子。
在一實施例中，多重檢測套組更包括對proA基因具專一性的一探針，其中該探針具有選自下列群組的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO：10之核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO：10互補之核苷酸序列；以及(c)與SEQ ID NO：10或其互補 序列有至少90%一致性之核苷酸序列。探針的5’端接上報導染劑，且3’端接上淬滅劑。
為達上述目的，本案之另一實施例為提供屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測方法，包括步驟：(a)將生物樣本與前述多重檢測套組接觸；(b)從生物樣本中擴增屈公病毒及/或茲卡病毒的核酸；以及(c)檢測屈公病毒及/或茲卡病毒之擴增核酸的存在。
在一實施例中，此方法於步驟(a)之前更包括從生物樣本萃取核酸的步驟。
在一實施例中，此方法之步驟(b)包括子步驟：(b1)將病毒基因體RNA逆轉錄成互補DNA；以及(b2)利用即時聚合酶鏈鎖反應擴增互補DNA。
當用語「一」在申請專利範圍及/或說明書中與用語「包括/包含」結合使用時，可能表示「一」，但也與「一或更多」、「至少一」、及「一或大於一」的含義一致。
在申請專利範圍中的用語「或」意指「及/或」，除非明確指出僅指替代方案或替代方案是互斥的，即使揭露內容支持僅指替代方案與「及/或」的定義。
藉由以下詳細說明，本發明的其他目的、特徵及優點將變得顯而易見。然應理解的是，儘管詳細說明及特定範例指出本發明的特定實施例，但這些特定實施僅為說明例示之用，因為通過此詳細說明，在本發明的精神和範圍內的各種變化及修飾對於熟悉本技藝人士而言是顯而易見的。
第1圖顯示屈公病毒之非結構蛋白1基因的部分cDNA序列，以及順向引子、逆向引子及探針於序列上的黏合位置。
第2圖顯示茲卡病毒之套膜基因的部分cDNA序列，以及順向引子、逆向引子及探針於序列上的黏合位置。
第3圖顯示軟腐細菌之proA基因的部分cDNA序列，以及順向引子、逆向引子及探針於序列上的黏合位置。
第4圖及第5圖分別顯示屈公病毒及茲卡病毒專一性分析的結果。
第6A圖及第6B圖顯示屈公病毒及茲卡病毒共同檢測的結果。
第7圖顯示從不同拷貝數的屈公基因體RNA所產生的擴增曲線。
第8圖顯示由第7圖結果產生的屈公檢測標準曲線。
第9圖顯示從不同拷貝數的茲卡基因體RNA所產生的擴增曲線。
第10圖顯示由第9圖結果產生的茲卡檢測標準曲線。
第11圖顯示本案多重檢測與兩市售屈公檢測套組的比較。
第12圖顯示本案多重檢測與兩市售茲卡檢測套組的比較。
體現本案特徵與優點的一些實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖式在本質上為說明之用，而非用以限制本案。
本案提供屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測，以同時檢測屈公病毒及茲卡病毒，且具高靈敏度、高專一性、以及縮短的反應時間。本案實施例係利用即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，簡稱real-time RT-PCR)，又稱定量逆轉錄聚合酶鏈鎖反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，簡稱qRT-PCR)，配合探針偵測系 統(probe-based detection)來對人類的屈公病毒及茲卡病毒感染進行快速、靈敏及專一的診斷。即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應(real-time RT-PCR)主要包括兩個步驟，第一個步驟乃將屈公病毒或茲卡病毒的病毒基因體RNA(genomic RNA，簡稱gRNA)逆轉錄成互補DNA(complementary DNA，cDNA)，接著於第二個步驟利用即時聚合酶鏈鎖反應(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)配合對屈公病毒或茲卡病毒具專一性的引子對來將cDNA進行擴增。特別是，在即時聚合酶鏈鎖反應(real-time PCR)中，具有專一性的順向引子、逆向引子及探針會雜合到屈公病毒或茲卡病毒的cDNA目標上，其中探針的5’端接上報導染劑(reporter dye)，3’端接上淬滅劑(quencher)。在PCR擴增反應過程中，探針會被切割，使得報導染劑與淬滅劑分離，即可偵測到報導染劑所發出的螢光。
本案實施例提供了屈公病毒檢測套組及茲卡病毒檢測套組，這兩個套組可單獨使用以分別檢測屈公病毒及茲卡病毒，也可以合併使用為可同時檢測屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組。以下將詳細說明這些套組中所採用的引子及探針的設計。
屈公病毒為單股RNA病毒，具有11826個鹼基(S27病毒株；NCBI參考序列資料庫NC_004162.2)。在本案實施例中，屈公病毒的非結構蛋白1基因(nonstructural protein 1(nsP1)gene)係被選為檢測目標。屈公病毒檢測套組包括一順向引子及一逆向引子，且可額外包括一探針。
第1圖顯示屈公病毒之非結構蛋白1基因的部分cDNA序列(以SEQ ID NO：11標示，對應NC_004162.2基因序列第1051至1225個位置)，以及順向引子、逆向引子及探針於非結構蛋白1基因序列上的黏合位置。順向引子具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列(5’-GCGACCATTTGTGATCAAATGACC-3’)，起始於基因序列第1082個位置，大小為24-mer。逆向引子具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列(5’-GTTCTGCCGTTAACCACTATTCTCTG-3’)，起始於基因序列第1191個位 置，大小為26-mer。探針為逆向探針，具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列(5’-AGCTTCTGTGCATCCTCCGGCGTGAC-3’)，起始於基因序列第1149個位置，大小為26-mer。利用前述順向引子及逆向引子將可擴增產生大小為110-bp的擴增子(amplicon)。
茲卡病毒為單股RNA病毒，具有10675個鹼基(PRVABC59病毒株；NCBI參考序列資料庫KU501215.1)。在本案實施例中，茲卡病毒的套膜基因(envelope(E)gene)係被選為檢測目標。茲卡病毒檢測套組包括至少一順向引子及一逆向引子，且可額外包括一探針。
第2圖顯示茲卡病毒之套膜基因的部分cDNA序列(以SEQ ID NO：12標示，對應KU501215.1基因序列第2101至2275個位置)，以及順向引子、逆向引子及探針於套膜基因序列上的黏合位置。第一順向引子具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列(5’-GGAGTGGCAGCACCATTG-3’)，起始於基因序列第2181個位置，大小為18-mer。第二順向引子具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列(5’-GGAGTGGCAGTACCATTG-3’)，同樣起始於基因序列第2181個位置，大小為18-mer。逆向引子具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列(5’-CAGGCTGTGTCTCCCAAGA-3’)，起始於基因序列第2262個位置，大小為19-mer。探針為逆向探針，具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列(5’-TTCTCTTGGCACCTCTCACAGTGGCTTCAA-3’)，起始於基因序列第2237個位置，大小為30-mer。利用前述順向引子(具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之序列)及逆向引子將可擴增產生大小為82-bp的擴增子。
具有SEQ ID NO：5之序列的第二順向引子相較於具有SEQ ID NO：4之序列的第一順向引子只有一個核苷酸的改變，且第一順向引子及第二順向引子可能可用於檢測不同的茲卡病毒株。在一實施例中，茲卡病毒檢測套組包括具有SEQ ID NO：4之序列的第一順向引子、以及具有SEQ ID NO：6之序列的逆向 引子。在另一實施例中，茲卡病毒檢測套組包括具有SEQ ID NO：5之序列的第二順向引子、以及具有SEQ ID NO：6之序列的逆向引子。或在另一實施例中，茲卡病毒檢測套組包括具有SEQ ID NO：4之序列的第一順向引子、具有SEQ ID NO：5之序列的第二順向引子，以及具有SEQ ID NO：6之序列的逆向引子。
為確認所採用的引子及探針對屈公病毒具有專一性，每一個引子及探針(SEQ ID NO：1至3)皆利用NCBI BLAST系統對人類基因體加轉錄(human genomic plus transcript)及核苷酸收集(nucleotide collection)等兩個資料庫進行比對，且比對結果顯示沒有其他相近的物種具有與本案設計的引子及探針完全相同的序列片段。此結果顯示本案設計的引子及探針對屈公病毒的專一性非常高，且可用於擴增及檢測屈公病毒的非結構蛋白1基因。在本案之一實施例中，前述引子及探針僅可用於擴增及檢測屈公病毒的非結構蛋白1基因。
為確認所採用的引子及探針對茲卡病毒具有專一性，每一個引子及探針(SEQ ID NO：4至7)皆利用NCBI BLAST系統對人類基因體加轉錄(human genomic plus transcript)及核苷酸收集(nucleotide collection)等兩個資料庫進行比對，且比對結果顯示沒有其他相近的物種具有與本案設計的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、及SEQ ID NO：7完全相同的序列片段，然而，SEQ ID NO：6則與登革熱病毒第三血清型(Dengue serotype 3)具有100%相似度。由於引子和探針係成組進行檢測，故即使逆向引子(SEQ ID NO：6)可與登革熱病毒第三血清型的基因體材料結合，順向引子(SEQ ID NO：4或5)和逆向探針(SEQ ID NO：7)也不會與登革熱病毒第三血清型的基因體材料結合。亦即，本案實施例的引子及探針組合不會對登革熱病毒第三血清型產生假陽性檢測結果，並仍可專一地檢測茲卡病毒的套膜基因。換句話說，本案設計的引子及探針對茲卡病毒的專一性非常高，且可用於擴增及檢測茲卡病毒的套膜基因。在本案之一實施例中，前述引子及探針僅可用於擴增及檢測茲卡病毒的套膜基因。
此外，本案實施例更提供了用於檢測內部控制模板(internal control template)的套組，此模板係由軟腐細菌(Pectobacterium carotovorum SCRI121菌株；NCBI參考序列資料庫HM157163.1)之proA基因體外轉錄所得之RNA(in vitro transcribed RNA，簡稱IVT-RNA)。proA內部控制檢測套組包括一順向引子及一逆向引子，且可額外包括一探針。
第3圖顯示proA基因的部分cDNA序列(以SEQ ID NO：13標示，對應HM157163.1基因序列第291至490個位置)，以及順向引子、逆向引子及探針於proA基因序列上的黏合位置。順向引子具有SEQ ID NO：8的核苷酸序列(5’-CTGCTGGTCAATCAACGTATCG-3’)，起始於基因序列第301個位置，大小為22-mer。逆向引子具有SEQ ID NO：9的核苷酸序列(5’-GGTCGTTAGAAAGCCATTCATCG-3’)，起始於基因序列第478個位置，大小為23-mer。探針為順向探針，具有SEQ ID NO：10的核苷酸序列(5’-TCCATGCCAGTCCTTCAGCGATGCCTTA-3’)，起始於基因序列第377個位置，大小為28-mer。利用前述順向引子及逆向引子將可擴增產生大小為178-bp的擴增子。
在一實施例中，屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組包括屈公病毒檢測套組、茲卡病毒檢測套組、以及proA內部控制檢測套組。在此多重檢測套組中所採用的引子及探針列示於表1。
Figure 109120487-A0305-02-0012-1
Figure 109120487-A0305-02-0013-2
在一些實施例中，本案之引子及探針不限於與SEQ ID NO：1至10有完全相同序列者。值得注意的是，進行雜合的序列並不需要完美的互補性才能提供穩定的雜合體，在很多情況下，當鹼基不匹配的比例小於10%時，仍能形成穩定的雜合體。此外，特定的屈公病毒株或茲卡病毒株也可能存在基因變異。因此，具有與SEQ ID NO：1至10有至少90%一致性的序列的引子及探針可能具有與原本序列相似的專一性，因此也可用於屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測。
在一些實施例中，由於由對應的順向引子及逆向引子所組成的引子對可專一地檢測屈公病毒(SEQ ID NO：1及2)、茲卡病毒(SEQ ID NO：4至6)、或proA內部控制(SEQ ID NO：8及9)，故只要是位於對應的順向引子及逆向引子位置之間的序列，皆可設計為探針序列，因此，探針序列不受限於前述探針序列(SEQ ID NO：3、7及10)。此外，由於探針可選擇雜合至DNA的任一股上，故相同位置的互補序列皆可做為探針序列，因此，與前述探針序列(SEQ ID NO：3、7及10)互補的序列亦可分別做為檢測屈公病毒、茲卡病毒、及proA內部控制的探針序列。
根據上述，本案實施例提供一種屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組，包括對屈公病毒具專一性的第一引子組及對茲卡病毒具專一性的第二引子組的至少其中之一。第一引子組選自：(a)具有SEQ ID NO：1之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：2之核苷酸序列的一逆向引子；以及(b)具有與SEQ ID NO：1有至少90%一致性之核苷酸序列的一順向引子及具有與SEQ ID NO：2有至少90%一致性之核苷酸序列的一逆向引子。第二引子組選自：(a)具有SEQ ID NO：4之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的一逆向引 子；(b)具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的一逆向引子；(c)具有SEQ ID NO：4之核苷酸序列的一第一順向引子、具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列的一第二順向引子、及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的一逆向引子；以及(d)具有與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5之序列有至少90%一致性之核苷酸序列的至少一順向引子及具有與SEQ ID NO：6有至少90%一致性之核苷酸序列的一逆向引子。
在一實施例中，屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組更包括對屈公病毒具專一性的一探針，其中該探針具有選自下列群組的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO：3之核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO：3互補之核苷酸序列；以及(c)與SEQ ID NO：3或其互補序列有至少90%一致性之核苷酸序列。
在一實施例中，屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組更包括對茲卡病毒具專一性的一探針，其中該探針具有選自下列群組的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO：7之核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO：7互補之核苷酸序列；以及(c)與SEQ ID NO：7或其互補序列有至少90%一致性之核苷酸序列。
在一實施例中，屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組更包括一內部控制模板，其為由軟腐細菌(Pectobacterium carotovorum)之proA基因體外轉錄所得之RNA。據此，屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組更包括對proA基因具專一性的一控制引子組，其中該控制引子組選自：(a)具有SEQ ID NO：8之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：9之核苷酸序列的一逆向引子；以及(b)具有與SEQ ID NO：8有至少90%一致性之核苷酸序列的一順向引子及具有與SEQ ID NO：9有至少90%一致性之核苷酸序列的一逆向引子。又，屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組更包括對proA基因具專一性的一探針，其中該探針具有選自下列群組的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO：10之核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO： 10互補之核苷酸序列；以及(c)與SEQ ID NO：10或其互補序列有至少90%一致性之核苷酸序列。
前述特定的引子及探針係設計來雜合及擴增目標基因。因此，本案也提供了屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測方法，此方法包括步驟：(a)將生物樣本與前述多重檢測套組接觸；(b)從生物樣本中擴增屈公病毒及/或茲卡病毒的核酸；以及(c)檢測屈公病毒及/或茲卡病毒之擴增核酸的存在。
在一實施例中，此方法於步驟(a)之前更包括從生物樣本萃取核酸的步驟。
在一實施例中，此方法之步驟(b)包括子步驟：(b1)將病毒基因體RNA逆轉錄成互補DNA；以及(b2)利用即時聚合酶鏈鎖反應擴增互補DNA。
用於即時聚合酶鏈鎖反應的探針係於5’端接上報導染劑，且3’端接上淬滅劑。在PCR擴增反應過程中，探針會被切割，使得報導染劑與淬滅劑分離，即可偵測到報導染劑所發出的螢光。在不同目標基因的多重檢測中，用來檢測屈公病毒、茲卡病毒、及proA內部控制的不同探針可由具有可區別之螢光顏色的不同報導染劑標記，以利於觀察檢測結果。在一實施例中，報導染劑可分別選自ROX、FAM、HEX、Cy5、TET、及Texas Red等螢光染劑，但不以此為限。在一實施例中，淬滅劑為暗淬滅劑(dark quencher)，例如Iowa black FQ淬滅劑或Black Hole淬滅劑，但不以此為限。
本案實施例所提供之引子及探針係優化用於透過即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應來快速檢測屈公病毒及茲卡病毒，且此即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應係以快速循環模式(fast cycling mode)進行。表2顯示快速循環模式下即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應的溫度曲線。在一實施例中，快速循環模式係指即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應的溫度曲線架構如下：(1)42℃ 5分鐘的逆轉錄保持階段；接著(2)95℃ 10秒的酶活化保持階段；再接著45個循環的(3)PCR階段，此階段係於95℃ 變性5秒，及60℃黏合/延伸18秒。因此，本案實施例之即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應的總反應時間為23分鐘。然而在市售競爭產品中，其逆轉錄需時20分鐘，酶活化需時2分鐘，再加上45個循環的PCR階段，此階段係於變性需時15秒，黏合需時45秒，延伸需時15秒，故總反應時間約為77分鐘。
Figure 109120487-A0305-02-0016-3
在本案實施例之快速循環模式下，以下四個方面可節省大量時間。首先，黏合/延伸時間縮短為18秒而節省了時間，反觀市售競爭產品通常需要60秒。第二，變性時間縮短為5秒而節省了時間，反觀市售競爭產品通常需要15秒。第三，反轉錄時間縮短為5分鐘，反觀市售競爭產品通常需要20分鐘。第四，酶活化時間縮短為10秒，反觀市售競爭產品通常需要2分鐘。
因此，在相同類型的熱循環儀上，採用本案實施例的引子及探針的快速循環模式所節省的時間，使得總反應時間相較於標準逆轉錄聚合酶鏈鎖反應縮短至少70%，故本案實施例能夠在不到30分鐘的時間內完成屈公病毒及茲卡病毒的檢測。換句話說，透過優化設計減少每個循環的變性/黏合/延伸時間，減少逆轉錄時間以及減少酶活化時間，造成總反應時間縮短至少70%，使得本案實施例的引子及探針可藉由即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應達成屈公病毒及茲卡病毒的快速多重檢測，且這些都是在不影響屈公病毒及茲卡病毒檢測的靈敏度和專一性的前提下實現的。
以下將說明本案實施例之屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測實例，其中反應混合物如表3所示。即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應利用上述的快速循環模式來進行，且反應混合物包括購自Takara的One Step PrimeScriptTM RT-PCR套組(Perfect Real Time；#RR064A)、500nM的順向引子(SEQ ID NO：1)、500nM的逆向引子(SEQ ID NO：2)、200nM的探針(SEQ ID NO：3)、500nM的順向引子(SEQ ID NO：4)、500nM的順向引子(SEQ ID NO：5)、500nM的逆向引子(SEQ ID NO：6)、200nM的探針(SEQ ID NO：7)、250nM的順向引子(SEQ ID NO：8)、250nM的逆向引子(SEQ ID NO：9)、100nM的探針(SEQ ID NO：10)、1000拷貝的proA內部控制IVT-RNA、及適量的RNA萃取樣本，且總體積為20μL。然而，反應混合物並不限於上述的酶和緩衝系統。
Figure 109120487-A0305-02-0017-4
Figure 109120487-A0305-02-0018-5
為了進一步以實驗確認在多重檢測中引子及探針對屈公病毒及茲卡病毒的專一性，本案檢驗了引子及探針與幾種常見的蚊媒病毒的交叉反應性，包括登革熱病毒第一至第四血清型(Dengue virus serotypes 1 to 4)，且此實驗是在大量基因體RNA(約介於106至107拷貝的gRNA)存在的情況下進行。第4圖及第5圖分別顯示屈公病毒及茲卡病毒專一性分析的結果，其中CHIK、DEN1至DEN4、以及ZIKA表示分別來自屈公病毒、登革熱病毒第一至第四血清型、以及茲卡病毒的基因體RNA樣本，而NTC表示無模板對照組。在屈公病毒檢測螢光通道中，如第4圖所示，除了屈公基因體RNA樣本有擴增反應外，其他組皆未觀察到擴增反應。同樣地，在茲卡病毒檢測螢光通道中，如第5圖所示，除了茲卡基因體RNA樣本有擴增反應外，其他組皆未觀察到擴增反應。換言之，此實驗中沒有交叉反應發生，因此證實了本案引子及探針在多重檢測中的專一性。
本案實施例能夠在不到30分鐘的時間內，在多重檢測中檢測到每個反應僅有數個拷貝的屈公基因體RNA。每個反應中含有1、3、5、8、10及15個拷貝的屈公基因體RNA的反應分別進行6重複分析，且陽性檢測的臨界值設定為Ct值38。結果顯示，每個反應中含有1、3、5、8、10及15個拷貝的反應的陽性檢出率分別為3/6、5/6、5/6、6/6、6/6及6/6。換言之，在每個反應中含有8、10及15個拷貝的反應中，6重複皆檢測到屈公病毒。因此，在多重檢測中屈公病毒的檢測底線(limit for detection，簡稱LoD)可預測約為8至10個拷貝，顯示出相當高的靈敏度。此外，檢測底線的確認係進一步以每個反應中含有10個拷貝屈公基因體RNA的反應來進行20重複分析，結果20重複全部得到陽性檢測結果， 因此確認檢測底線為每反應10個拷貝(基於20/20的陽性檢測率有大於95%的可信度)。
本案實施例也能夠在不到30分鐘的時間內，在多重檢測中檢測到每個反應僅有數個拷貝的茲卡基因體RNA。每個反應中含有1、3、5、8、10及15個拷貝的茲卡基因體RNA的反應分別進行6重複分析，且陽性檢測的臨界值設定為Ct值38。結果顯示，每個反應中含有1、3、5、8、10及15個拷貝的反應的陽性檢出率分別為3/6、2/6、5/6、3/6、6/6及6/6。換言之，在每個反應中含有10及15個拷貝的反應中，6重複皆檢測到茲卡病毒。因此，在多重檢測中茲卡病毒的檢測底線(limit for detection，簡稱LoD)可預測約為10至15個拷貝，顯示出相當高的靈敏度。此外，檢測底線的確認係進一步以每個反應中含有10個拷貝茲卡基因體RNA的反應來進行20重複分析，結果20重複中有19個反應得到陽性檢測結果，因此確認檢測底線為每反應10個拷貝(基於19/20的陽性檢測率有95%的可信度)。
本案實施例可在同一個即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應中共同檢測屈公病毒及茲卡病毒。茲在多重檢測中分析兩個反應，其中一個反應具有100個拷貝的屈公基因體RNA及100個拷貝的茲卡基因體RNA，而另一個反應具有10個拷貝的屈公基因體RNA及10個拷貝的茲卡基因體RNA。第6A圖及第6B圖顯示屈公病毒及茲卡病毒共同檢測的結果。如第6A圖及第6B圖所示，當100個拷貝的屈公基因體RNA及100個拷貝的茲卡基因體RNA同時存在反應中時，多重檢測可同時檢測到屈公病毒及茲卡病毒。而當10個拷貝的屈公基因體RNA及10個拷貝的茲卡基因體RNA同時存在反應中時，多重檢測在2重複分析中皆檢測到屈公病毒，並在2重複分析中的其中之一檢測到茲卡病毒。因此，即使病毒RNA含量低，多重檢測也能夠同時檢測屈公病毒及茲卡病毒。
本案實施例能夠在不到30分鐘的時間內定量屈公基因體RNA。第7圖顯示從不同拷貝數的屈公基因體RNA所產生的擴增曲線。採用本案實施例的引子及探針，並對每反應具有連續稀釋拷貝數(107至10個拷貝)的屈公基因體RNA樣本分別進行測試，以確定多重檢測中屈公檢測的線性度。第8圖顯示由第7圖結果產生的屈公分析標準曲線。根據所得的標準曲線，擴增效率為102%，R2值為1.00。由於R2值為最佳理論值1.0，故此多重檢測可以擴展為定量分析，以在POC檢測時估算屈公基因體RNA的數量。
本案實施例也能夠在不到30分鐘的時間內定量茲卡基因體RNA。第9圖顯示從不同拷貝數的茲卡病毒基因體RNA所產生的擴增曲線。採用本案實施例的引子及探針，並對每反應具有連續稀釋拷貝數(2x106至20個拷貝)的茲卡基因體RNA樣本分別進行測試，以確定多重檢測中茲卡檢測的線性度。第10圖顯示由第9圖結果產生的茲卡分析標準曲線。根據所得的標準曲線，擴增效率為104%，R2值為1.00。由於R2值為最佳理論值1.0，故此多重檢測可以擴展為定量分析，以在POC檢測時估算茲卡基因體RNA的數量。
本案實施例之屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測更進一步與兩市售屈公檢測套組或兩市售茲卡檢測套組進行比較。比較實驗是以少量病毒RNA來進行，例如每個反應10或100拷貝的基因體RNA。第11圖顯示本案多重檢測與兩市售屈公檢測套組的比較，第12圖則顯示本案多重檢測與兩市售茲卡檢測套組的比較。
如第11圖所示，當少量的屈公RNA添加於反應中時，針對100個拷貝基因體RNA的檢測，本案多重檢測、市售套組1、及市售套組2的平均Ct值分別為31.673、34.055、及33.196；而針對10個拷貝基因體RNA的檢測，本案多重檢測、市售套組1、及市售套組2的平均Ct值分別為34.415、37.617、及36.461。因此，本案多重檢測可以較早的Ct檢測到屈公病毒，故在檢測少量的屈公RNA 時，本案多重檢測更優於兩市售套組。此外，本案多重檢測、市售套組1、及市售套組2的即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應的總反應時間分別為23分鐘、77分鐘、及62分鐘，故與市售套組相比，本案多重檢測花費了明顯較短的時間來完成即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應。
如第12圖所示，當少量的茲卡RNA添加於反應中時，針對100個拷貝基因體RNA的檢測，本案多重檢測、市售套組1、及市售套組2的平均Ct值分別為31.953、33.711、及32.101；而針對10個拷貝基因體RNA的檢測，本案多重檢測、市售套組1、及市售套組2的平均Ct值分別為35.983、36.304、及35.480。因此，本案多重檢測可以較早的Ct或不相上下的Ct檢測到茲卡病毒，故在檢測少量的茲卡RNA時，本案多重檢測更優於或可比擬兩市售套組。此外，本案多重檢測、市售套組1、及市售套組2的即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應的總反應時間分別為23分鐘、77分鐘、及62分鐘，故與市售套組相比，本案多重檢測花費了明顯較短的時間來完成即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應。
綜上所述，本案實施例提供屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組及方法，其係利用即時逆轉錄聚合酶鏈鎖反應及具有專一性的引子及探針來進行檢測。本案實施例之多重檢測套組及方法具有可以高靈敏度及高專一性同時檢測屈公病毒及茲卡病毒的優點。本案實施例之多重檢測套組及方法可檢測低拷貝數的屈公及茲卡RNA，且可用於定量檢測。本案實施例之多重檢測套組及方法更具有減少反應時間的優點，且是在不影響靈敏度和專一性的前提下實現的。因此，本案提供了快速、靈敏、專一且可同時檢測屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測，可藉以有效治療感染並預防傳播。
縱使本發明已由上述實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004

Claims (22)

  1. 一種屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測套組，包括對屈公病毒具專一性的一第一引子組及對茲卡病毒具專一性的一第二引子組，其中該第一引子組包括具有SEQ ID NO：1之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：2之核苷酸序列的一逆向引子；其中該第二引子組選自：(a)具有SEQ ID NO：4之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的一逆向引子；(b)具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的一逆向引子；以及(c)具有SEQ ID NO：4之核苷酸序列的一第一順向引子、具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列的一第二順向引子、及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的一逆向引子。
  2. 如請求項1所述的多重檢測套組，更包括對屈公病毒具專一性的一探針，其中該探針具有SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與SEQ ID NO：3互補之核苷酸序列。
  3. 如請求項2所述的多重檢測套組，其中該探針的5’端接上報導染劑，且3’端接上淬滅劑。
  4. 如請求項1所述的多重檢測套組，更包括對茲卡病毒具專一性的一探針，其中該探針具有SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與SEQ ID NO：7互補之核苷酸序列。
  5. 如請求項4所述的多重檢測套組，其中該探針的5’端接上報導染劑，且3’端接上淬滅劑。
  6. 如請求項1所述的多重檢測套組，更包括一內部控制模板，其為由軟腐細菌(Pectobacterium carotovorum)之proA基因體外轉錄所得之RNA。
  7. 如請求項6所述的多重檢測套組，更包括對該proA基因具專一性的一控制引子組，其中該控制引子組包括具有SEQ ID NO：8之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：9之核苷酸序列的一逆向引子。
  8. 如請求項7所述的多重檢測套組，更包括對該proA基因具專一性的一探針，其中該探針具有SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與SEQ ID NO：10互補之核苷酸序列。
  9. 如請求項8所述的多重檢測套組，其中該探針的5’端接上報導染劑，且3’端接上淬滅劑。
  10. 一種屈公病毒及茲卡病毒的多重檢測方法，包括步驟：(a)將一生物樣本與如請求項1所述的該多重檢測套組接觸；(b)從該生物樣本中擴增屈公病毒及茲卡病毒的核酸；以及(c)檢測屈公病毒及茲卡病毒之擴增核酸的存在。
  11. 如請求項10所述的多重檢測方法，其中於步驟(a)之前更包括從該生物樣本萃取核酸的步驟。
  12. 如請求項10所述的多重檢測方法，其中步驟(b)包括子步驟：(b1)將病毒基因體RNA逆轉錄成互補DNA；以及(b2)利用即時聚合酶鏈鎖反應擴增該互補DNA。
  13. 如請求項10所述的多重檢測方法，其中該多重檢測套組更包括對屈公病毒具專一性的一第一探針及對茲卡病毒具專一性的一第二探針，其中該第一探針具有SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與SEQ ID NO：3互補之核苷酸序列，且該第二探針具有SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與SEQ ID NO：7互補之核苷酸序列。
  14. 如請求項13所述的多重檢測方法，其中該第一探針及該第二探針皆於5’端接上報導染劑，且3’端接上淬滅劑。
  15. 如請求項14所述的多重檢測方法，其中該第一探針及該第二探針的5’端接上不同的報導染劑。
  16. 如請求項10所述的多重檢測方法，其中該多重檢測套組更包括包括一內部控制模板，其為由軟腐細菌(Pectobacterium carotovorum)之proA基因體外轉錄所得之RNA。
  17. 如請求項16所述的多重檢測方法，其中該多重檢測套組更包括對該proA基因具專一性的一控制引子組，其中該控制引子組包括具有SEQ ID NO：8之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：9之核苷酸序列的一逆向引子。
  18. 如請求項17所述的多重檢測方法，其中該多重檢測套組更包括對該proA基因具專一性的一探針，其中該探針具有SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與SEQ ID NO：10互補之核苷酸序列。
  19. 如請求項18所述的多重檢測方法，該探針的5’端接上報導染劑，且3’端接上淬滅劑。
  20. 一種茲卡病毒的檢測套組，包括對茲卡病毒具專一性的一引子組，其中該引子組選自：(a)具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列的一順向引子及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的一逆向引子；以及(b)具有SEQ ID NO：4之核苷酸序列的一第一順向引子、具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列的一第二順向引子、及具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的一逆向引子。
  21. 如請求項20所述的檢測套組，更包括對茲卡病毒具專一性的一探針，其中該探針具有SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與SEQ ID NO：7互補之核苷酸序列。
  22. 一種茲卡病毒的檢測方法，包括步驟：(a)將一生物樣本與如請求項20或21所述的該檢測套組接觸；(b)從該生物樣本中擴增茲卡病毒的核酸；以及(c)檢測茲卡病毒之擴增核酸的存在。
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