CN109423526A - 蚊媒传染病病原体预混荧光pcr检测试剂及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂和含有本发明蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂的试剂盒。本发明蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂包括蚊媒传染病病毒特异性引物和探针，还包括荧光PCR所需的基础反应液和反应酶，且所述基础反应液和反应酶以及所述蚊媒传染病病毒特异性引物和探针是混合在一起。使得本发明蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂整个体系可以达到预混效果和保持效期内稳定性，如保存6个月以上，从而在PCR时可以直接使用，并保证了PCR反应稳定，检测结果准确。

Description

蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂及试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂及试剂盒。

背景技术

蚊媒传染病，是由病媒蚊子传播的自然疫源性疾病，常见的有流行性乙型脑炎、疟疾、登革热、寨卡、黄热病、基孔肯雅热等危害性较强的传染病。蚊媒传染病在我国每年传染病总发病病例中约占5％-10％，但其病死数则占传染病总病死数的30％-40％。新发蚊媒传染病是新发传染病的重要组成部分，在全球呈现加剧化形势。2014年，中国爆发登革热病毒疫情，截至2014年10月21日零时，2014年广东全省共有20个地级市累计报告登革热病例38753例，其中重症病例20例，死亡病例6例。寨卡病毒病目前主要流行于美洲、非洲、东南亚和太平洋岛国等国家和地区。截至2016年2月底，美洲、大洋洲、亚洲、非洲等36个国家和地区报告本地感染寨卡病毒病例，该病毒在东南亚等地区有逐步蔓延的趋势。我国南方地区温暖潮湿极适合蚊子的繁殖生长，故蚊媒传染病长期处于高发状态，威胁人员健康和造成较大经济损失。

蚊媒传染病严重危害人类健康，药物治疗效果不好且代价巨大，寻找有效的快速诊断方法对于蚊媒传染病的预防控制和研究工作具有重要意义，蚊媒传染病的快速诊断对于疫情的传播扩散控制起关键作用。该类疾病发病初期的临床症状相似，因此，建立快速、简易的实验室检测方法对及时进行临床诊断救治、开展流行病学调查并最终控制其传播流行具有重要意义。

目前，在蚊媒传染病的检测方法方面，通常使用免疫学方法、电镜检测、病原体培养和核酸检测等方法进行检测。

其中，病原体分离培养最为经典，过去常作为金标准，但存在操作繁琐，检测时间较长，耗时，耗力，不能及时指导临床治疗，而且还存在特异性低，容易污染，不能分型等缺点，特别是病毒，标本内所含病毒数量少可出现假阴性。

电镜虽可检测病毒颗粒，但检测具有设备昂贵，操作复杂，操作要求高不适用于临床。

因此，所以目前临床检测部分蚊媒传染病主要以免疫学方法和以荧光PCR为代表的核酸检测方法为主。但是免疫学方法存在窗口期、特异性和灵敏度低等缺点。

具体地，病毒特异性抗体检测是临床常见的检测病毒感染的指标，但特异性IgG阳性只能表明有相应病毒感染，不能用于早期感染判断和疗效监测，IgM类抗体是感染早期或潜伏病毒活化时产生的，但婴幼儿可因免疫反应较弱而出现假阴性，且病毒特异性抗体检测一次只能检测一种病原体。因此，虽然抗原检测较抗体检测更敏感，是快速而又准确的方法，被广泛引用于蚊媒病原体感染的快速诊断，但结果并不稳定，而且有些病毒株不容易被特异性单克隆抗体检测到。

病毒核酸检测灵敏度高，但实验条件严格，容易被污染。

与上述传统方法比较，实时荧光PCR方法主要优点在于：检测时间短、灵敏度高、特异性强、通量高，反应体系全封闭。实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用，其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图1所示，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。

但是目前针对蚊媒病原体的荧光PCR诊断试剂种类较少，大多针对单一病原体，PCR检测体系和程序差异较大，很难实现高通量检测。然而对多种病原的检测和筛查工作带来较大工作负担，且现有检测方案和检测试剂分为引物探针混合液，PCR反应液，混合酶液等多个组分，需现配现用，增加了工作负担。几种组分如果预混到一起稳定性较差，通常几个小时内检测性能就会大幅衰减。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂及试剂盒，以解决现有检测蚊媒传染病病原体的方法只能针对单一病原体，且检测试剂配液工作复杂繁琐，时间长，容易产生操作失误和误差；混合试剂稳定性较差等的技术问题。

为了实现上述发明目的，一方面，本发明提供了一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂。所述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂包括蚊媒传染病病毒特异性引物和探针，还包括荧光PCR所需的基础反应液和反应酶，且所述基础反应液和反应酶以及所述蚊媒传染病病毒特异性引物和探针是混合在一起。

另一方面，本发明提供了一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒。所述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液为本发明蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂。

与现有技术相比，本发明蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂将蚊媒传染病病毒特异性引物和探针与荧光PCR所需的基础反应液和反应酶混合在一起，这样，使得本发明蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂整个体系可以达到预混效果和保持效期内稳定性，如保存6个月以上，从而在PCR时可以直接使用，并保证了PCR反应稳定，检测结果准确，有效避免了传统荧光PCR检测试剂需要将引物和探针与其他PCR检测试剂分开保存只在使用时临时配制而导致的复杂繁琐操作和由于操作失误与误差导致的荧光PCR检测试剂不稳定以及临时配制的荧光PCR检测试剂不稳定需要及时PCR操作的问题。

本发明蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒所含的PCR反应液为本发明蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂。因此，本发明试剂盒能将所含的PCR反应液直接进行分装和长达6各月稳定保存，待测时直接使用，避免了临时配液操作，缩短了检测时间，避免了人工配液产生的误差，能够对蚊媒传染病病毒快速检测，而且灵敏度和检测结果准确度高。

附图说明

图1是提供的实时荧光定量PCR扩增曲线示意图；

图2是利用本发明实施例提供的蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒进行的PCR检测方法示意图；

图3是利用本发明实施例提供的蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒进行的PCR检测阳性结果和阴性结果示意图；

图4是利用本发明实施例4提供的蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒进行PCR检测结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例中，对下述名词作出如下解释。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。

实时荧光PCR法：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性定量分析的方法。

Ct值：每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

一方面，本发明实施例提供了一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂。蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂包括蚊媒传染病病毒特异性引物和探针，还包括荧光PCR所需的基础反应液和反应酶，且所述基础反应液和反应酶以及所述蚊媒传染病病毒特异性引物和探针是混合在一起。

其中，一实施例中，上述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂所含的所述基础反应液可以包括DEPC水、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、dNTP、甘油、牛血清白蛋白、二甲基亚砜。该基础反应液构成了上述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂基础溶液体系，能够有效保证与其混合的蚊媒传染病病毒特异性引物和探针和反应酶的稳定性，从而保证整个蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂体系的稳定性。

在另一实施例中，上述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂所含的所述反应酶为TTH酶。采用TTH酶替代传统的逆转录酶和taq酶，采用单酶体系替代传统的双酶体系，从而有效解决了传统逆转录酶在与反应体系其他组分混合后稳定性较差的问题，提高了上述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂的稳定性，使得所述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂分装工艺更加简单和稳定。

在又一实施例中，上述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂所含的所述蚊媒传染病病毒特异性引物和探针包括登革热病毒异性引物和探针、寨卡病毒异性引物和探针、黄热病病毒异性引物和探针和基孔肯雅热病毒异性引物和探针。将该四种蚊媒传染病病的引物和探针一起与荧光PCR所需的基础反应液和反应酶混合，使得上述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂为多重荧光PCR检测试剂，从而能够经过一次PCR处理后实现对四种病毒进行同时检测，因此，可应用于四种主要蚊媒传染病病毒的快速检测，早期快速诊断及时指导临床治疗。

在上述各实施例的基础上，一实施例中，上述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂所含的组分和含量如下：

一实施例中，上述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂所含的组分和含量如下：

上述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂通过对各组分含量和种类的控制和调整，使得上述各实施例中蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂整个体系可以达到双酶扩增体系的性能和达到预混效果而保持效期内稳定性。

另外，上述各实施例中所述登革热病毒异性引物和探针、寨卡病毒异性引物和探针、黄热病病毒异性引物和探针和基孔肯雅热病毒异性引物和探针均可以按照各病毒特异性基因进行设计出相应的引物和探针。该4种病毒的各自特异性基因可以直接查阅相关文献获得。一实施例中，所述登革热病毒异性引物和探针、寨卡病毒异性引物和探针、黄热病病毒异性引物和探针和基孔肯雅热病毒异性引物和探针分别如下，具体如下述表1所示：

所述登革热病毒(DG)引物，其上游引物：SEQ ID NO：1，下引物：SEQ ID NO：2；

所述登革热病毒探针：SEQ ID NO：3；

所述寨卡病毒(ZK)引物，其上游引物：SEQ ID NO：4，下引物：SEQ ID NO：5；

所述寨卡病毒探针：SEQ ID NO：6；

所述黄热病病毒(YF)引物，其上游引物：SEQ ID NO：7，下引物：SEQ ID NO：8；

所述黄热病病毒探针：SEQ ID NO：9；

所述基孔肯雅热病毒(CK)引物，其上游引物：SEQ ID NO：10，下引物：SEQ ID NO：11；

所述基孔肯雅热病毒探针：SEQ ID NO：12。

上述各蚊媒传染病病毒的引物能够与目标基因的互补性高，从而能够与目标基因特异性结合来指导聚合酶合成所要的片段。上述各蚊媒传染病病毒的探针序列能够有效识别并杂交待测目的基因，而且在连接酶催化与目标基因进行特异互补。而且上述各蚊媒传染病病毒的引物和探针还能够在蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂中保持稳定性和活性。

当然，上述各探针含有标记基团，如在5’端含有荧光基团，在3’端含有淬灭基团。而且，各探针所含的荧光基团和淬灭基团可以分别是荧光PCR中常用的荧光基团和淬灭基团。为了能够实现快速辨别登革热、寨卡、黄热病、基孔肯雅热病毒，一实施例中，上述4条探针SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所含的荧光基团彼此不同。如在一实施例中，所述登革热病毒探针SEQ ID NO：3的5’端连接的所述荧光基团为FAM，所述寨卡病毒探针SEQ ID NO：6的5’端连接的所述荧光基团为HEX、VIC、JOE中的任一种，所述黄热病病毒探针SEQ ID NO：9的5’端连接的所述荧光基团为ROX，所述基孔肯雅热探针SEQ IDNO：12的5’端连接的所述荧光基团为CY5。如下述表1中所示。

表1

组分	序列(5’-3’)	序列号
			引物DGF	5-CTCTGATGAACAACCAACG-3	SEQ ID NO：1
引物DGR	5-CAGTTGACACACGGTTTCTC-3	SEQ ID NO：2
			探针DGA	5-FAM--TCAATATGCTGAAACGC-MGB-3	SEQ ID NO：3
引物ZKF	5-AAGTTTGATCTGGAGAATGAAGC-3	SEQ ID NO：4
			引物ZKR	5-CAGCTGGTCTGAGRACCTTTACC-3	SEQ ID NO：5
探针ZKH	5’-(HEX)AAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC(BHQ1)-3’	SEQ ID NO：6
			引物YFF	5-GTTCCCACCACTTCCATGAAC-3	SEQ ID NO：7
引物YFR	5-TTCCTCTCCCAATGAGCTCG-3	SEQ ID NO：8
			探针YFX	5-FAM-CGGCAAGGCACCACAATCCTCCTG-BHQ1-3	SEQ ID NO：9
引物CKF	5-CCAAGGAAATAACATCACTGTA-3	SEQ ID NO：10
			引物CKR	5-TCCAGGCTGAAGACATTG-3	SEQ ID NO：11
探针CKY	5-CY5-CGACCATGCCGTCACAGTTAAGGAC-3-BHQ1	SEQ ID NO：12

因此，上述各实施例蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂整个体系可以达到预混效果而且保持效期内稳定性，如保存6个月以上，从而在PCR时可以直接使用，并保证了PCR反应稳定，检测结果准确，而且还可以实现多重检测，提高了检测的效率。有效克服了传统荧光PCR检测试剂无法实现引物和探针与其他PCR检测试剂的预混合和保存时间段的问题，也即避免了传统荧光PCR检测试剂的临时配液操作，缩短了检测时间，避免了人工配液产生的误差。

另一方面，基于上述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂，本发明实施例还提供了一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒。所述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒包括PCR反应液，且所述PCR反应液为上文所述的蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂。这样，本实施例蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒能将所含的PCR反应液直接进行分装如分装在至PCR八联管中和长达6各月稳定保存，待测时直接使用，能够对蚊媒传染病病毒快速检测和多重检测，而且灵敏度和检测结果准确度高。同时，上述试剂盒使用方便，避免了如现有的荧光PCR反应试剂的PCR试剂盒需要在使用时临时对反应液、引物探针和酶液三个组分进行计算配液和分装以及人工配液产生的误差，从而显著节省配制反应液的时间，更有利用临床的大量样本检测，省时方便，而且检测结果正确性高。

另外，根据需要，可以将蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒所含的PCR反应液装设于试剂管中，如在上述试剂盒中设置8管×6条，20μl/管的PCR反应液。每管中的PCR反应液如上述表2中所示的含量组分和含量。每一试剂盒中所含的PCR反应液上述表2中所示的含量组分和含量。

表2

因此，本发明实施例蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒由于含有上文所述的蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂，由此，上述试剂盒能够快捷实现蚊媒传染病病毒进行检测，特别是能够对登革热、寨卡、黄热病、基孔肯雅热病毒四种病毒同时进行快速检测，而且检测的灵敏度和准确性高。具体的是通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系的荧光扩增曲线图，当扩增曲线图Ct值≤40，并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值＞40或无Ct值，结果表现为阴性。

一实施例中，上述荧光扩增反应条件为：

55-60℃：10-30min；

94-95℃：2-3min；

94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；(45循环)。

因此，为了形成对照，在进一步实施例中，上述蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒还可以设置阳性对照品和阴性对照品。应当理解的是，该阳性对照品和阴性对照品是与所含的PCR反应液是分开装设的。一实施例中，所述阳性对照品为根据登革热病毒、寨卡病毒、黄热病病毒和基孔肯雅热病毒检测区域分别合成序列后体外转录的RNA。如具体的，该阳性对照品是将登革热病毒、寨卡病毒、黄热病病毒和基孔肯雅热病毒四种蚊媒病毒检测区域合成序列后体外转录为RNA，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)稀释后冷冻保存，如可以包装0.6ml普通带盖离心管。另一实施例中，所述阴性对照品为Tris-EDTA缓冲液，如可以包装0.6ml普通带盖离心管。

应当理解，应不同实验需要，上述各实施例中的蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒所含的各试剂，如PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品各试剂所含的组分可依照上述含量进行调整，如PCR反应液各组分可以根据表2中所示的含量调整。为了避免操作时取错组分或实验过程中由于混淆瓶盖造成的标品交叉污染，本发明实施例优选采用不同类型和/或颜色的盖子对不同样品进行区分，具体的，所述PCR反应液采用无色透明PCR反应管；阴性对照使用紫色透明带盖离心管；阳性对照使用橙红色透明带盖离心管。

基于上述各实施例中的蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒，利用上述各实施例中的蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒检测登革热、寨卡、黄热病、基孔肯雅热病毒的方法可以按照如图2所示的如下方法进行：

S01.标本处理及加样；

S02.实时荧光PCR检测；

S03.结果判断。

具体的，上述步骤S01中，所述标本处理可以使用合格的商品化提取试剂盒处理，具体可以按照相应试剂盒的使用说明书进行操作提前病毒核酸，如RNA。

上述步骤S02包括取待检样本RNA，加入RT-PCR反应液，上机检测。值得注意的是，每次试验设置有阴性对照和阳性对照，否则该次试验视为无效试验。本发明实施例中，用于蚊媒传染病病毒四重PCR检测的荧光定量PCR仪包括但不限于：ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon 2)、Stratagene MX系列、Cepheid SmartCycler、Corbett Rotor-Gene。

其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：

50-55℃：5-10min；

94-95℃：2-3min；

94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；45个循环。

上述步骤S03中，根据检测的荧光强度结果进行分析判断，当扩增曲线图Ct值≤40，并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性，如图3A所示；当扩增曲线图Ct值＞40或无Ct值，结果表现为阴性，如图3B所示。本发明实施例中，通过不同的通道(采用不同荧光基团标记)得到的结果可进行判定，具体采用表1中探针检测结果按照下述表3所示通道进行判断。

表3

因此，上述各实施例中的蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒除了如上述的能够对四种蚊媒传染病病毒进行同时检测、灵敏和安全性高、PCR反应液的稳定性之外，还能将PCR所需的试剂统一混合至PCR反应液中，有效提高了PCR反应液的稳定性，经测得，上述试剂盒所含的PCR反应液可以稳定保存6个月以上。同时，上述试剂盒使用方便，避免了如现有的分装PCR反应试剂的PCR试剂盒需要在使用时临时配置，从而显著节省配制反应液的时间，更有利用临床的大量样本检测，省时方便，而且检测结果正确性高。

下面结合具体实施例进行说明。

1.蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂实施例

实施例1

本实施例提供一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂，其包括DEPC水、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、dNTP、TTH酶、甘油、牛血清白蛋白和二甲基亚砜以及所述登革热病毒异性引物和探针、寨卡病毒异性引物和探针、黄热病病毒异性引物和探针和基孔肯雅热病毒异性引物和探针，各成分的浓度如下表4：

表4

实施例2

本实施例提供一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂，其包括DEPC水、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、dNTP、TTH酶、甘油、牛血清白蛋白和二甲基亚砜以及所述登革热病毒异性引物和探针、寨卡病毒异性引物和探针、黄热病病毒异性引物和探针和基孔肯雅热病毒异性引物和探针，各成分的浓度如下表5：

表5

2.蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒实施例

实施例3

本实施例提供一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒。本实施例试剂盒包括如下试剂：

(1)PCR反应液：所述PCR反应液包括上述实施例1中蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂；

规格：8管×6条，20μl/管；

(2)阴性对照

规格：1管，40μl/管

成分：Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)；

包装：0.6ml普通带盖离心管(紫色透明)；

(3)阳性对照

规格：1管，40μl/管

成分：四种蚊媒病毒检测区域合成序列后体外转录为RNA，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)稀释后冷冻保存；

包装：0.6ml普通带盖离心管(橙红色透明)。

实施例4

本实施例提供一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒。本实施例试剂盒包括如下试剂：

(1)PCR反应液：所述PCR反应液包括上述实施例2中蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂；

规格：8管×6条，20μl/管(无色透明)；

(2)阴性对照

规格：1管，40μl/管

成分：Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)；

包装：0.6ml普通带盖离心管(紫色透明)；

(3)阳性对照

规格：1管，40μl/管

成分：四种蚊媒病毒检测区域合成序列后体外转录为RNA，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)稀释后冷冻保存；

包装：0.6ml普通带盖离心管(橙红色透明)。

3.蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测方法

采用上述实施例3、4蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒同时对待测样本进行检测，检测方法如下：

取待检样本4例分别用培养法，四种病毒单通道荧光PCR检测试剂盒以及上述实施例4提供的登革热、寨卡、黄热病、基孔肯雅热病毒四重PCR检测试剂盒分别进行对比检测试验。

具体检测方法

培养法：由湖北省疾控中心传防所培养确定提供登革热、寨卡、黄热病、基孔肯雅热病毒各一株；

四种病毒单通道荧光PCR检测试剂盒(对比试剂盒)：

由深圳生科原生物股份有限公司提供的登革热病毒(通用型)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)；寨卡病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)；黄热病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)；基孔肯亚热病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)。

检测结果

检测结果如下表6所示，本实施例4提供的登革热、寨卡、黄热病、基孔肯雅热病毒四重PCR检测试剂盒PCR扩增图谱如图4所示：

表6

由上述表6结果看出得出以下结论：

采用本发明实施例4提供的登革热、寨卡、黄热病、基孔肯雅热病毒蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒检出结果与传统培养法结果一致，而试剂盒检出只需要约5小时，培养法则需要15天以上。相对于单重检测试剂来说，本方案提高了检测通量，可以在1个反应体系中同时检测出四种主要蚊媒病原体。相对于其他荧光PCR检测试剂来说，本方案将基础反应液，引物探针混合液和反应酶液三个组分预混，并且分装到PCR八联管中，检验人员只要进行加样步骤就可以上机检测，极大地节省了检验人员的工作量和时间，避免了配液产生的误差。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市生科源技术有限公司

<120> 深圳市生科源技术有限公司

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210>1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 登革热上游引物

<400> 1

CTCTGATGAA CAACCAACG 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 登革热下游引物

<400> 2

CAGTTGACAC ACGGTTTCTC 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 登革热探针

<400> 3

TCAATATGCT GAAACGC 17

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寨卡上游引物

<400> 4

AAGTTTGATC TGGAGAATGA AGC 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寨卡下游引物

<400> 5

CAGCTGGTCT GAGRACCTTT ACC 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寨卡探针

<400> 6

AAGCTGTTCA GTCACTGCTA TACC 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 黄热病上游引物

<400> 7

GTTCCCACCA CTTCCATGAA C 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 黄热病下游引物

<400> 8

TTCCTCTCCC AATGAGCTCG 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 黄热病探针

<400> 9

CGGCAAGGCA CCACAATCCT CCTG 24

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基孔肯雅热病毒上游引物

<400> 10

CCAAGGAAAT AACATCACTG TA 22

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基孔肯雅热病毒下游引物

<400> 11

TCCAGGCTGA AGACATTG 18

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基孔肯雅热病毒探针

<400> 12

CGACCATGCC GTCACAGTTA AGGAC 25

Claims (10)

1.一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂，其特征在于：包括蚊媒传染病病毒特异性引物和探针，还包括荧光PCR所需的基础反应液和反应酶，且所述基础反应液和反应酶以及所述蚊媒传染病病毒特异性引物和探针是混合在一起。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述基础反应液包括DEPC水、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、dNTP、甘油、牛血清白蛋白、二甲基亚砜；和/或

所述反应酶为TTH酶；和/或

所述蚊媒传染病病毒特异性引物和探针包括登革热病毒异性引物和探针、寨卡病毒异性引物和探针、黄热病病毒异性引物和探针和基孔肯雅热病毒异性引物和探针。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述DEPC水、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、dNTP、TTH酶、甘油、牛血清白蛋白和二甲基亚砜以及所述蚊媒传染病病毒特异性引物和探针包括在所述试剂中的浓度为如下：

或

4.根据权利要求2或3所述的试剂，其特征在于，所述登革热病毒引物：上引物：SEQ IDNO：1，下引物：SEQ ID NO：2；所述登革热病毒探针：SEQ ID NO：3；

所述寨卡病毒引物：上游引物：SEQ ID NO：4，下引物：SEQ ID NO：5；所述寨卡病毒探针：SEQ ID NO：6；

所述黄热病病毒引物：上游引物：SEQ ID NO：7，下引物：SEQ ID NO：8；所述黄热病病毒探针：SEQ ID NO：9；

所述基孔肯雅热病毒引物：上游引物：SEQ ID NO：10，下引物：SEQ ID NO：11；所述基孔肯雅热病毒探针：SEQ ID NO：12。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于：所述登革热病毒探针、所述寨卡病毒探针、所述黄热病病毒探针和所述基孔肯雅热病毒探针的5’端还连接有荧光基团，且四条所述探针5’端连接的所述荧光基团彼此不同。

6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于：所述登革热病毒探针5’端连接的所述荧光基团为FAM，所述寨卡病毒探针5’端连接的所述荧光基团为HEX、VIC、JOE中的任一种，所述黄热病病毒探针5’端连接的所述荧光基团为ROX，所述基孔肯雅热探针5’端连接的所述荧光基团为CY5。

7.一种蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液，所述PCR反应液为权利要求1-6所述的蚊媒传染病病原体预混荧光PCR检测试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品为根据所述登革热病毒、所述寨卡病毒、所述黄热病病毒和所述基孔肯雅热病毒检测区域分别合成序列后体外转录的RNA；和/或

所述阴性对照品为Tris-EDTA缓冲液。

10.根据权利要求7-9任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒进行PCR时的反应条件为：

55-60℃：10-30min；

94-95℃：2-3min；

94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；(45循环)；和/或

所述试剂盒进行PCR反应后测得的扩增曲线图Ct值≤40，并有明显指数增长时为阳性结论，所述试剂盒进行PCR反应后测得的扩增曲线图Ct值＞40或无Ct值时为阴性结论。