CN106086242A - 一种用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒 - Google Patents

一种用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒。本发明提供的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，包括黄病毒属的特异性引物及探针，所述黄病毒属的特异性引物及探针包括登革病毒特异性引物和探针、寨卡病毒特异性引物和探针、黄热病毒特异性引物和探针、基孔肯雅病毒特异性引物和探针。本发明提供的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒具有检测速度快、检测和定量结果准确，一次可同时检测3种不同种类的黄病毒属病原体及1种可引起类似临床症状的披膜病毒病原体，可及时发现和确诊黄病毒属病原体感染的可疑病例，提高黄病毒属病原体感染的检测准确率。

Description

一种用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒
技术领域
本发明属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒。
背景技术
黄病毒属在全世界分布广泛，其主要是通过蚊虫叮咬人群而传播病毒，其具有传播速度快，病情严重的特点，对人类和社会造成严重的危害。随着国家贸易和旅游业的发展，出入境交通工具和货物激增，蚊媒传播疾病的潜在危险在逐步加大。黄病毒属种类众多，如何在最短时间内检测和鉴别出黄病毒的种类，对临床的诊断和出入境的检验检疫具有重要的意义。
传统对黄病毒属的诊断方法主要是通过血清学试验、核酸检测、病毒培养或免疫学检测方法进行检测，其中免疫学检测方法应用最为广泛。但是，上述的黄病毒属检测方法在检测的过程中均存在不同程度的缺陷，导致黄病毒属的检测结果准确率和重复性较低，不利于黄病毒属的临床诊断。
近年来，分子生物学的发展为微生物的分类鉴定工作提供了较简便和准确的方法，尤其对黄病毒属检测提供了一种新的检测。中国专利CN102277446B公开了黄热病毒荧光定量PCR检测新方法及黄热病毒检测PCR体系，可以特异性检测登革热病毒，而且与黄热病毒、乙型脑炎病毒无交叉反应。中国专利申请201510078267.7公开了一种登革病毒快速分型鉴别检测试剂盒，该试剂盒是利用快速多重实时荧光聚合酶链式反应技术一管反应即可鉴别出登革病毒四种血清型，可广泛应用于登革热临床早期诊断、重症病例预警、口岸检验检疫、疫情防控、媒介控制及科学研究等多个领域。
然而，上述对黄病毒属的检测均是针对单一的病毒进行检测，不能同时检测不同种类的黄病毒属，无法满足临床诊断、出入境检验检疫和疫病监测防控的需求。
中国专利CN103305633B公开了一种多重荧光PCR检测试剂盒及其应用，所述利用多重荧光PCR法对登革热、基孔肯亚和黄热病毒在单管同时进行检测的引物、探针及试剂盒。虽然该检测试剂盒可以同时检测三种黄病毒属，但是，还是不能满足临床对黄病毒属的检测需求。
发明内容
为了解决现有技术中黄病毒属的检测方法存在的不足，本发明的目的是提供一种用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，以解决上述问题。
本发明提供了一种用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的引物及探针，所述引物及探针包括登革病毒特异性引物和探针、寨卡病毒特异性引物和探针、黄热病毒特异性引物和探针、基孔肯雅病毒特异性引物和探针；
所述登革病毒特异性的正向和反向引物的序列分别为：5’-CCGCACAACAACAAACAGC-3’(SEQIDNO.1)和5’-TTCAACAGCACCATTCCATT-3'(SEQIDNO.2)，所述登革病毒特异性探针的序列为：5’-TCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCC-3'(SEQ ID NO.3)；
所述寨卡病毒特异性的正向和反向引物的序列分别为：5’-GGTGCAGTATGCAGGGAC-3’(SEQ ID NO.4)和5’-GATGGGATTTGCCGTTAT-3'(SEQ ID NO.5)，所述寨卡病毒特异性探针的序列为：5’-CCTGCAAGGTCCCAGCCCAGAT-3’(SEQ ID NO.6)；
所述黄热病毒特异性正向和反向引物的序列分别为：5'-GCAGCGAGGTGTTGGAGTG-3'(SEQ ID NO.7)和5'-GAACCAGTTTCTTTCCATTCC-3'(SEQ ID NO.8)，所述黄热病毒特异性探针的序列为：5'-CTTCCACACAATGTGGCATGTCAC-3'(SEQ ID NO.9)；
所述基孔肯雅病毒特异性的正向和反向引物的序列分别为：5'-TTCAGCCTGGACACCTTTC-3'(SEQ ID NO.10)和5'-ATTGTCCTGGTCTTCCTGC-3'(SEQ IDNO.11)，所述基孔肯雅病毒特异性探针的序列为：5'-ATAACATGGACTACCCGCCCTTTGG-3'(SEQ IDNO.12)；
所述登革病毒特异性探针、寨卡病毒特异性探针、黄热病毒特异性探针和基孔肯雅病毒特异性探针的5'端的荧光基团标记选自FAM、VIC、TAMRA、NED、JOE、Texas Red、HEX、Cy5和Cy3荧光基团中的一种；所述登革病毒特异性探针、寨卡病毒特异性探针、黄热病毒特异性探针和基孔肯雅病毒特异性探针的3'端的荧光淬灭基团标记选自BHQ1、BHQ2、Eclipse荧光淬灭基团中的一种。
优选的，所述登革病毒特异性探针5'端结合荧光发生基团FAM，3'端结合荧光淬灭基团BHQ1；所述寨卡病毒特异性探针5'端结合荧光发生基团HEX，3'端结合荧光淬灭基团Eclipse；所述黄热病毒特异性探针5'端结合荧光发生基团Texas Red，3'端结合荧光淬灭基团Eclipse；所述基孔肯雅病毒特异性探针的5'端结合荧光发生基团Cy5，3'端结合荧光淬灭基团Eclipse。
另外，本发明还提供了一种用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，包括反应液I和反应液II，所述反应液I含有权利要求1所述的登革病毒特异性引物和探针、寨卡病毒特异性引物和探针、黄热病毒特异性引物和探针、基孔肯雅病毒特异性引物和探针。
进一步地，所述反应液I中正向和反向引物浓度为50-200mmol/L，探针浓度为20-100mmol/L；优选地，所述反应液I中正向和反向引物浓度为100mmol/L，探针浓度为50mmol/L。
进一步地，所述反应液II由4-8U抗体修饰热激Taq酶、2-4U FAST逆转录酶、0.25-0.45mmol dNTPs、20-100mmol/L Tris-HCl缓冲液、3-8mmol/L MgCl2和150-350mmol/L KCl组成。所述抗体修饰热激Taq酶购于Sigma-Aldrich公司，产品名称为JumpStart Taq DNAPolymerase，货号为D9307；所述FAST逆转录酶购于ThermoFisher Scientific公司，产品名称为SuperScript IV逆转录酶，货号为18090010。
进一步地，所述反应液II中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.8-8.8。优选地，所述反应液II由6U抗体修饰热激Taq酶、3U FAST逆转录酶、0.3mmol dNTPs、50mmol/L Tris-HCl缓冲液、4.5mmol/L MgCl2和220mmol/L KCl组成，所述反应液II中Tris-HCl缓冲液的pH值为8.2。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品、阳性质控品和定量参考品。
进一步地，所述阴性质控品为DEPC水，所述阳性质控品为整合了登革病毒靶基因片段、寨卡病毒靶基因片段、黄热病毒靶基因片段和基孔肯雅靶病毒基因片段的人工质粒。
进一步地，所述整合了登革病毒靶基因片段、寨卡病毒靶基因片段、黄热病毒靶基因片段和基孔肯雅靶病毒基因片段的人工质粒的浓度为1.0×104～1.0×107copies/mL。
进一步地，所述整合了登革病毒靶基因片段、寨卡病毒靶基因片段、黄热病毒靶基因片段和基孔肯雅靶病毒基因片段的人工质粒的浓度优选为1.0×106copies/mL。
进一步地，所述整合了登革病毒靶基因片段、寨卡病毒靶基因片段、黄热病毒靶基因片段和基孔肯雅靶病毒基因片段的人工质粒的制备方法为：将登革病毒基因片段、寨卡病毒基因片段、黄热病毒基因片段和基孔肯雅病毒基因片段人工连接后转入pMT28大肠杆菌载体中，接着提取质粒稀释到1.0×104～1.0×107copies/mL，即得。
进一步地，所述定量参考品为整合了登革病毒靶基因片段、寨卡病毒靶基因片段、黄热病毒靶基因片段和基孔肯雅靶病毒基因片段的人工质粒，通过测定OD值进行计算得到初始质粒浓度，并稀释至1.0E07copies/mL、1.0E06copies/mL、1.0E05copies/mL、1.0E04copies/mL，作为定量参考品。
进一步地，PCR扩增的条件为：阶段1：50℃5min；阶段2：95℃2min；阶段3：94℃3s；阶段4：60℃12s；40个循环；在4℃贮存。
本发明提供的登革病毒特异性引物及探针可特异性地检测登革病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅳ型；所述黄热病毒特异性引物及探针可特异性地检测黄热病毒野生型，对黄热病毒D17疫苗株无交叉反应。
本发明提供的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒方法是利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术原理，利用登革病毒、寨卡病毒、黄热病毒、基孔肯亚病毒的特异性保守区，针对保守区设计靶核苷酸引物和探针。将这4对特异性引物和探针放在同一体系中采用多重实时荧光定量PCR进行扩增，不仅可以鉴定黄病毒属病原体的类型，同时还可以得到病毒载量结果。
本发明提供的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒中进行待检标本检测时需要同时进行两种质控品的检测，只有当阳性质控品检测时FAM、HEX、Texas Red及CY5通道荧光信号均呈阳性，阴性质控品检测四个通道荧光信号均呈阴性时，待检标本的检测结果才算是有效。
本发明提供的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒是在多重实时荧光PCR基础上，应用特殊抗体修饰Taq酶、FAST逆转录酶，以及经过优化处理后的反应Buffer，其完成的多重快速实时荧光PCR扩增时间与普通实时荧光PCR相比从100-120min可缩短至30-40min，大大提高了检测效率；另外各色荧光的增长信号与相应PCR产物的增长量成等比关系，可通过设定定量参考品实现对待检病原体进行定量的目的。
本发明提供的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒不仅可以节约时间、减少样本量需求、直接得到病毒载量结果，还可以在短时间内判断疑似病例或可疑媒介是否感染登革病毒、黄热病毒、寨卡病毒、基孔肯亚病毒，便于临床及时采取必要的防控和治疗措施，提高重症病例的治愈率，对出入境检验检疫、疫病监测防控等都具有重大意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒可以一次可同时检测3种不同种类的黄病毒属病原体及1种可引起类似临床症状的披膜病毒病原体，而且检测结果特异性好、准确性高，还具有高通量、操作简便、成本低的优点，对黄病毒属病例病程的确认、跟踪治疗效果具有重大指导作用。
附图说明
图1为寨卡病毒感染病例的血清、尿液样本的检测结果图，其中，横坐标为循环次数(Ct值)，纵坐标为荧光信号值；
图2为寨卡病例发病第2、3、4、5天唾液样本的检测结果图，其中，横坐标为循环次数(Ct值)，纵坐标为荧光信号值；
图3为登革病毒四种血清型样本检测结果图，其中，横坐标为循环次数(Ct值)，纵坐标为荧光信号值；
图4为基孔肯亚热病例样本、黄热病例样本检测结果图，其中，横坐标为循环次数(Ct值)，纵坐标为荧光信号值；
图5为麻疹病毒、汉滩病毒、汉城病毒、发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒感染样本核酸、黄热病毒疫苗株核酸结果图，其中，横坐标为循环次数(Ct值)，纵坐标为荧光信号值。
具体实施方式
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
实施例1、引物和探针
本发明提供一种用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的引物及探针。
表1本发明提供的引物和探针
实施例2、用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒的检测方法
1、制备包括下列组成成分的试剂盒：反应液I(20μl/管)1管，检测反应II(280μl/管)，阳性质控品(20μl/管)1管，阴性质控品(20μl/管)1管，定量参考品S1～S4(20μl/管)各1管。
2、标本类型：临床采集的血清、尿液、唾液样本。
3、核酸提取：
可采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集到20～30μl RNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
4、实时荧光快速PCR及定量检测：
每管完整的检测体系应包括1μl反应液I、14μl反应液II、5μl质控品或定量参考品或待检样本核酸。具体可按照以下操作步骤进行检测：
4.1试剂准备：每管扩增管中加入1μl反应液I、14μl反应液II，也可以根据检测所需总反应数N(包括待检样本数、1份阴性质控品、1份阳性质控品、4份定量参考品)，计算所需两种反应液的总量，混匀后再分装到PCR扩增管中。
4.2加样：向已分装有试剂的PCR扩增管中，加入阴性质控品，加入阳性质控品，加入定量参考品，加入样本RNA溶液，加样量均为5μl，盖紧管盖，放入仪器样品槽。
4.3上机扩增检测：采用ABI Prism 7500FAST荧光定量PCR仪，软件版本V2.0.6进行检测，选择仪器运行模块为“7500FAST(96Wells)”，实验类型为“Quantitation-StandardCurve”，试剂类型选择“TaqMan Reagents”，仪器运行速度类型选择“FAST(～40minutes tocomplete a run)”。在“Plate Setup”界面的“Define Targets and Samples”子界面下设置四个New Target，Target Name、Reporter、Quencher、Colour分别为：DV、FAM、None、默认；ZV，HEX、None、默认；YFV、Texas Red、None、默认；CHIKV、Cy5、None、默认。在“AssigenTargets and Samples”子界面下，选择加样为定量参考品或阳性质控品的孔位，设置Task为“S”(Standard)，阴性质控品孔位设置为“N”(Negative)、待测标本加样孔位为“U”(Unknow)，设置完成后点击“Define and Set Up Standards”。继续在“Run Method”界面下设置“Graphical View”为“Holding Stage1”:50℃5min；“Holding Stage2”:95℃2min；“Cycling Stage”:95℃3sec,60℃12sec(默认采集荧光)；Number ofCycles为40。在“Reaction Setup”和“Materials List”界面使用默认设置。所有设置完成后保存文件，在“RUN”主界面下点击“START”运行。
4.4结果分析：
反应结束后保存检测数据文件，查看各样品标准曲线情况，在样本孔可查看相应检测和定量结果。
实施例3、应用黄病毒属快速鉴别及病毒载量检测的试剂盒检测临床样品
1、选取经临床和病毒培养方法确诊的寨卡病毒感染阳性病例的血清、尿液样本各1例，寨卡病毒感染阳性病例发病第2、3、4、5天的唾液样本各1例，经临床和病毒培养方法鉴定为基孔肯雅病毒、登革病毒I型、登革病毒II型、登革病毒III型、登革病毒IV型、黄热病毒感染的阳性病例血清样本各1例，以及麻疹病毒、汉滩病毒、汉城病毒、发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒感染的阳性病例血清样本各1例，黄热病毒疫苗株1例。对所有样本进行核酸提取，上机扩增检测及结果分析步骤参照实施例2进行，同时进行质控品及定量参考品的检测。
2、检测结果：
2.1、阴性质控品无扩增曲线，阳性质控品FAM通道、VIC通道、Texas Red通道和Cy5通道四个检测通道均为典型S型曲线，说明上述四个检测通道正常，定量参考品FAM通道、VIC通道、Texas Red通道和Cy5通道四个检测通道均为典型S型曲线，且标准曲线相关系数分别为0.985、0.992、0.994、0.980，均达到0.97以上，说明上述四个检测通道的样本定量值准确。质控品及定量参考品均符合质控要求，因此待检标本的检测结果是有效和准确的。
2.2、(1)由待检标本的检测结果可知试剂盒检测寨卡病毒病例样本检测均为阳性，定量值分别为血清1.38×104copies/mL、尿液6.98×103copies/mL(如图1所示)，寨卡病毒病例样本发病第2、3、4、5天的唾液样本检测定量值分别为1.14×106copies/mL、1.27×105copies/mL、6.79×103copies/mL、6.23×102copies/mL(如图2所示)；
(2)检测登革病毒四种血清型均为阳性，定量值分别为4.57×107copies/mL、8.36×103copies/mL、5.37×106copies/mL、2.24×104copies/mL(如图3所示)；
(3)检测基孔肯亚热病例样本、黄热病例样本均为阳性，定量值分别为3.63×105copies/mL、6.54×103copies/mL(如图4所示)；
(4)检测麻疹病毒、汉滩病毒、汉城病毒、发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒感染样本核酸、黄热病毒疫苗株核酸均为阴性(如图5所示)。
本次试验中9例临床样本的检测结果与分离培养等鉴定结果完全吻合，说明本试剂盒可以检测及鉴别以上几种常见黄病毒感染，且定量检测结果对辅助临床病程判断、跟踪治疗效果有指导意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市第八人民医院
<120> 一种用于黄病毒属病原体快速分型及病毒载量的试剂盒
<130>
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ataacatgga ctacccgccc tttgg 25

Claims (10)

1.一种用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的引物及探针，其特征在于，所述引物及探针包括登革病毒特异性引物和探针、寨卡病毒特异性引物和探针、黄热病毒特异性引物和探针、基孔肯雅病毒特异性引物和探针；
所述登革病毒特异性的正向和反向引物的序列分别为：5’-CCGCACAACAACAAACAGC-3’和5’-TTCAACAGCACCATTCCATT-3'，所述登革病毒特异性探针的序列为：5’-TCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCC-3'；
所述寨卡病毒特异性的正向和反向引物的序列分别为：5’-GGTGCAGTATGCAGGGAC-3’和5’-GATGGGATTTGCCGTTAT-3'，所述寨卡病毒特异性探针的序列为：5’-CCTGCAAGGTCCCAGCCCAGAT-3’；
所述黄热病毒特异性的正向和反向引物的序列分别为：5'-GCAGCGAGGTGTTGGAGTG-3'和5'-GAACCAGTTTCTTTCCATTCC-3'，所述黄热病毒特异性探针的序列为：5'-CTTCCACACAATGTGGCATGTCAC-3'；
所述基孔肯雅病毒特异性的正向和反向引物的序列分别为：5'-TTCAGCCTGGACACCTTTC-3'和5'-ATTGTCCTGGTCTTCCTGC-3'，所述基孔肯雅病毒特异性探针的序列为：5'-ATAACATGGACTACCCGCCCTTTGG-3'；
所述登革病毒特异性探针、寨卡病毒特异性探针、黄热病毒特异性探针和基孔肯雅病毒特异性探针的5'端的荧光基团标记选自FAM、VIC、TAMRA、NED、JOE、Texas Red、HEX、Cy5和Cy3荧光基团中的一种；所述登革病毒特异性探针、寨卡病毒特异性探针、黄热病毒特异性探针和基孔肯雅病毒特异性探针的3'端的荧光淬灭基团标记选自BHQ1、BHQ2、Eclipse荧光淬灭基团中的一种。
2.一种用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，其特征在于，包括反应液I和反应液Ⅱ，所述反应液I含有权利要求1所述的登革病毒特异性引物和探针、寨卡病毒特异性引物和探针、黄热病毒特异性引物和探针、基孔肯雅病毒特异性引物和探针。
3.如权利要求2所述的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，其特征在于，所述反应液I中正向和反向引物浓度为50-200mmol/L，探针浓度为20-100mmol/L。
4.如权利要求2所述的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，其特征在于，所述反应液II由4-8U抗体修饰热激Taq酶、2-4U FAST逆转录酶、0.25-0.45mmol dNTPs、20-100mmol/L Tris-HCl缓冲液、3-8mmol/L MgCl2和150-350mmol/L KCl组成。
5.如权利要求4所述的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，其特征在于，所述反应液II中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.8-8.8。
6.如权利要求2所述的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品、阳性质控品和定量参考品。
7.如权利要求6所述的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为DEPC水；所述阳性质控品为整合了登革病毒靶基因片段、寨卡病毒靶基因片段、黄热病毒靶基因片段和基孔肯雅靶病毒基因片段的人工质粒。
8.如权利要求7所述的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，其特征在于，所述整合了登革病毒靶基因片段、寨卡病毒靶基因片段、黄热病毒靶基因片段和基孔肯雅靶病毒基因片段的人工质粒的浓度为1.0×104～1.0×107copies/mL。
9.如权利要求6所述的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，其特征在于，所述定量参考品为整合了登革病毒靶基因片段、寨卡病毒靶基因片段、黄热病毒靶基因片段和基孔肯雅靶病毒基因片段的人工质粒，并稀释至1.0E07copies/mL、1.0E06copies/mL、1.0E05copies/mL、1.0E04copies/mL，作为定量参考品。
10.如权利要求2所述的用于黄病毒属快速分型及病毒载量检测的试剂盒，其特征在于，PCR扩增的条件为：阶段1：50℃5min；阶段2：95℃2min；阶段3：94℃3s；阶段4：60℃12s；40个循环；在4℃贮存。
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