CN106884057A - 一种寨卡病毒的可视化检测方法 - Google Patents

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李耿
张威
陈思泰
吴建国
赖小平
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Abstract

本发明涉及一种寨卡病毒的可视化检测方法，该方法包括提取寨卡病毒核酸、采用环介导的扩增体系扩增寨卡病毒NS5基因的RNA片段和采用含待测样品的核酸层析试纸条检测的三个步骤。本发明所述的方法具有特异性好，灵敏度高，快速高效，无污染，能准确、快速检测寨卡病毒的优点，可广泛应用于寨卡感染以及混合感染寨卡病毒的早期鉴别诊断、疫情防控、检验检疫等多个领域，尤其是寨卡病毒流行爆发期大样本量的检测。

Description

一种寨卡病毒的可视化检测方法
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及包含核酸、酶或微生物的测定或检验方法，特别是涉及寨卡病毒的检测方法。
背景技术
寨卡病毒属于黄病毒科，黄病毒属，单股正链RNA病毒，其主要的传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊。1947年首次在乌干达从恒河猴体内被发现寨卡病毒，1952年在乌干达和坦桑尼亚的人体中分离到。2007年以前，世界仅报告14例ZIKV病散发病例，2007年首次在太平洋岛国密克罗尼西亚的雅普岛发现寨卡病毒暴发疫情之后，出现ZIKV感染病例和暴发疫情的国家及地区增加明显，已经在非洲、东南亚和美洲等地造成多次暴发流行。2015年5月，巴西报告首例寨卡病毒感染病例；当年10月份，巴西报告新生儿小头畸形数量处于明显上升，时空分布与寨卡病毒流行区相吻合。截至2016年1月2日，巴西卫生部官方统计数据显示，巴西因寨卡病毒所致的疑似新生儿小头畸形病例已达3174例，其中已有38例死亡，2月初该数字已达4783例。研究表明，除了引起小头畸形以外，寨卡病毒感染还和格林-巴利综合征有也有着密切的联系。疫情的快速蔓延以及与小头畸形之间的可能因果关系，引起了国际社会的广泛关注。
寨卡病毒全基因长度约为11Kb，直径40～70nm，有包膜，包含10794个核苷酸，编码3419个氨基酸，寨卡病毒基因编码3个结构蛋白：衣壳蛋白(C)、膜前体蛋白(prM)和包膜蛋白(M)，以及7个非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。目前，国内外对寨卡病毒的诊断方法，主要还是依靠病毒培养、血清学试验、常规的RT-PCR检测及实时荧光定量PCR，其中，血清学试验、组织培养具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点；而RT-PCR也存在容易污染、耗时长的不足，实时荧光PCR技术因为其仪器设备昂贵，不利于一般检测机构的检测及大样本量检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种寨卡病毒的可视化检测方法，该方法具有准确、快速和直观的优点。
本发明解决上述问题的技术方案如下：
一种寨卡病毒的可视化检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)取寨卡病毒，按北京全式金生物科技有限公司生产的Easy Pure Viral DNA/RNA Kit的说明书提取寨卡病毒核酸；
(2)以步骤(1)得到的寨卡病毒核酸为模板，采用环介导恒温扩增方法(LAMP)扩增寨卡病毒NS5基因的RNA片段，获得核酸扩增产物；所述的环介导恒温扩增方法的引物由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，其中，
所述的一对外引物为：
Zika-F3：5’-TGGGATGTGGTGACTGGA-3’(SEQ NO.1)；
Zika-B3：5’-TGCATTGCTACGAACCTTGT-3’(SEQ NO.2)；
所述的一对内侧引物为：
Zika-BIP：5’-GTCTGGCACCCTAGTGTCCACTCACAGGAATAGCCATGACCG-3’(SEQ NO.3)；
Zika-FIP：5’-AGGCACTCGTCAGGTTATGAGCTACAGACTCGTGGCCGTT-3’(SEQ NO.4)；
所述的一对环引物为：
Zika-LF：5’-TGACCATACGGTGTGGTGT-3’(SEQ NO.5)；
Zika-LB：5’-ATGGTCTCTTCCTGGTTGTGG-3’(SEQ NO.5)；
上述环引物Zika-LB5’端标记生物素(Biotin)，环引物Zika-LF5’端标记6-羧基荧光素(6-FAM)；
(3)将核酸层析试纸垂直插入所述的核酸扩增产物中，层析5-10min，然后按以下方法判读结果：阳性(+)：核酸层析试纸条的检测区和质控区分别出现一条红色条带；阴性(-)：核酸层析试纸条的质控区出现一条红色条带，而检测区则没有条带；无效：核酸层析试纸条的检测区和质控区均未出现条带；其中，
所述的核酸层析试纸条包括条状的塑料支撑片，该塑料支撑片的一表面自一头至另一头依次设有样品垫、聚酯纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述聚酯纤维素膜上喷涂有一层由氯金酸制成的胶体金颗粒上制得的链霉亲和素包被的AuNPs金纳米粒子；所述硝酸纤维素膜上分布有检测区和质控区，其中检测区是在硝酸纤维素膜上喷涂生物素亲和蛋白形成，质控区是在硝酸纤维素膜上喷涂6-羧基荧光素抗体形成。
上述方案中，所述的环介导恒温扩增方法的反应体系为：12.5μL2×反应缓冲液(RM)，1μL酶溶液(EM)，浓度为10μM的一对外引物各0.5μL、浓度为10μM的一对内引物各4μL，浓度为10μM的一对环引物各2μL，RNA模板1μL；所述的环介导恒温扩增方法的反应条件为：65℃温育60min，85℃温育5min。
本发明所述的方法将环介导恒温扩增技术与核酸层析试纸条联合使用，因此具有特异性好，灵敏度高，快速高效，无污染，能准确、快速检测寨卡病毒的优点，可广泛应用于寨卡感染以及混合感染寨卡病毒的早期鉴别诊断、疫情防控、检验检疫等多个领域，尤其是寨卡病毒流行爆发期大样本量的检测。
附图说明
图1是本发明实施例提供的寨卡病毒LAMP反应产物在浊度仪引物考察结果示意图。
图2是本发明实施例提供的寨卡病毒LAMP反应产物引物考察结果可视化示意图。
图3是本发明实施例提供的寨卡病毒LAMP反应产物在浊度仪温度考察结果示意图。
图4是本发明实施例提供的寨卡病毒LAMP反应产物温度考察结果可视化示意图。
图5是本发明实施例提供的寨卡病毒LAMP检测特异性试验示意图。
图6是本发明实施例提供的寨卡病毒LAMP检测特异性试验结果可视化示意图。
图7是本发明实施例提供的寨卡病毒LAMP检测灵敏度示意图。
图8是本发明实施例提供的寨卡病毒LAMP检测灵敏度结果可视化示意图。
图9是本发明实施例提供的寨卡病毒One-StepRT-PCR特异性和灵敏度电泳图。
图10是本发明实施例提供的寨卡病毒临床样品血清的检测结果可视化图。
图11和12是本发明所述核酸层析试纸条的结构示意图，其中图11为主视图，图12为俯视图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合寨卡病毒实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明建立寨卡病毒环介导等温扩增快速检测方法，针对寨卡病毒NS5基因序列设计并合成特异性LAMP引物，优化反应条件，分析其灵敏度和特异性，结果表明所建立的寨卡病毒快速检测检测方法，对登革病毒4种血清型流感病毒H1N1无检出，可检出稀释至10-6(浓度为120fg/μl)的RNA，特异性、灵敏度及稳定性良好。此方法简单、快速，恒温水浴锅65℃反应60min即可完成。反应时，加入的环引物为荧光标记引物，产物进行浊度法检测和横向流核酸层析试纸条检测，比较两者检测结果，验证横向流核酸层析试纸条检测的准确、特异、灵敏性能。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
如图1所示，本发明实施例的快速检测寨卡病毒的方法包括以下步骤：
(1)获取寨卡病毒(武汉大学病毒研究所提供)、4种血清型登革病毒(广东省疾病预防控制中心提供)，将病毒原液接种到长满C6/36细胞的培养瓶中，待细胞病变率达到90％时，收集培养液上清，1500r离心15min，将上清分装，-80℃保存，待用；H1N1流感病毒(广东省疾病预防控制中心提供)，用A549细胞培养。
(2)按照EasyPureViralDNA/RNAKit(Lot#K200633；北京全式金生物科技有限公司)提取寨卡病毒核酸；
(3)设计引物：通过查阅文献和BLAST软件分析筛选出寨卡病毒NS5基因的保守特异性区段，采用PrimerExplorerV4，针对区段设计LAMP引物，分别是Zika-F3(SEQ NO.1)和Zika-B3(SEQ NO.2)、Zika-FIP(SEQ NO.3)和Zika-BIP(SEQ NO.4)、Zika-LB(SEQ NO.5)和Zika-LF(SEQ NO.6)，进行引物稀释，-20℃保存备用；
(4)标记引物：在环引物Zika-LB5’端标记生物素(Biotin)，环引物Zika-LF5’端标记6-羧基荧光素(6-FAM)，并确保两种标记物可同时整合到双链的扩增产物上；
反应体系：LAMP反应体系为26.5μL：12.5μL2×反应缓冲液(RM)，1μL酶溶液(EM)，浓度为10μM的外引物F3、B3各0.5μL、浓度为10μM的内引物FIP、BIP各4μL，浓度为10μM的环引物LB、LF各2μL，RNA模板1μL；
(5)反应条件：61～65℃温育60min，85℃温育5min；
(6)设计横向流核酸层析试纸条：参见图11和12，核酸层析试纸条(简称试纸条)包括条状的塑料支撑片7，该塑料支撑片7的上表面自一头至另一头依次设有样品垫1、聚酯纤维素膜2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4，其中，所述聚酯纤维素膜上喷涂有一层由氯金酸制成的胶体金颗粒上制得的链霉亲和素包被的AuNPs金纳米粒子，其颗粒大小为18～20nm，呈深红色。所述硝酸纤维素膜3上分布有条状的检测区5和质控区6，其中检测区5是在硝酸纤维素膜3上喷涂生物素亲和蛋白形成，质控区6是在硝酸纤维素膜3上喷涂6-羧基荧光素抗体形成。
(7)产物检测：将装有LAMP反应产物的PCR管放入一次性核酸反应检测装置(内置有上述核酸层析试纸条，委托杭州优思达生物科技有限公司定制)中，将装置竖立在水平操作台上，15-30min内判读结果。按照一次性核酸反应检测装置说明书，阳性(+)：试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区6，一条位于检测区5。阳性结果表明样本中含有待检测的核酸片段，且其数量达到或高于试纸条的最低检出量。阴性(-)：试纸条质控区6出现一条红色条带，检测区5没有条带。阴性结果表明样本中不含目的核酸，或其数量低于试纸条的最低检出量。无效：试纸条质控区6和检测区5均未出现条带，提示所用的试纸条和扩增试剂可能已损坏、失效或者操作有误(参见图11和12)。
下面结合试验对本发明的应用效果作进一步的说明。
1.1仪器和试剂
台式H1850高速冷冻离心机，购自湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；LA-500Loopamp实时浊度检测系统，租自北京蓝谱生物科技有限公司；HH-S型恒温水浴锅，购自巩义市予华仪器有限责任公司；
核糖核酸扩增试剂盒(逆转录环介导等温扩增法)(批号：57005)，购自荣研生物科技(中国)有限公司；一次性核酸检测装置内置有上述核酸层析试纸条，委托杭州优思达生物技术有限公司定制(批号：20160801-31)。
1.2细胞与病毒及临床血清样本
寨卡病毒(武汉大学病毒研究所提供)，H1N1病毒和4种血清型登革病毒(DENV-1,DENV-2,DENV-3和DENV-4)(由广东省疾病预防控制中心提供)，临床血清样本由广东省疾病预防控制中心，共11份，均为寨卡病毒感染患者血清
1.3引物的设计与合成
LAMP技术稳定性的关键在于3对特异性引物，根据LAMP引物设计原理，本试验采用PrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/e/)在线软件，针对寨卡病毒NS5基因序列设计和筛选3对LAMP引物，分别是外引物ZIka-F3(SEQ NO.1)和Zika-B3(SEQ NO.2)、内引物Zika-FIP(SEQ NO.3)和Zika-BIP(SEQ NO.4)、环引物Zika-LF(SEQ NO.5)、Zika-LB(SEQNO.6)，引物由华大基因科技有限公司合成，按合成说明书进行引物稀释，-20℃保存备用。
1.4LAMP反应条件的优化
LAMP反应在26.5μL体系中进行，反应条件优化如下：引物考察，寨卡病毒LAMP反应产物温度优化，在为60℃～65℃进行温度优化，在多次反复试验后确定最佳反应条件。同时使用浊度仪和横向流层试纸条进行检测。
1.5LAMP灵敏度检测
将提取到的寨卡病毒RNA原液，依次进行10倍梯度稀释，设置8个梯度，备用，探索检测灵敏度。用如上所述优化后的LAMP检测方法，分别对终浓度为100～10-8的RNA进行试验，同时使用浊度仪和横向流层试纸条进行检测，探索检测方法的检测限。
1.6LAMP特异性试验
H1N1流感病毒、登革病毒4种血清型无扩增结果显示，表明该方法对寨卡病毒具有很好的特异性。用建立的LAMP扩增寨卡病毒核酸，同时使用浊度仪和横向流层试纸条进行检测，以此评估该方法的特异性。
1.7One-StepRT-PCR检测
采用RT-PCR一步法试剂盒进行RT-PCR反应。反应体系如下：外引物F3、B3(10μM)各0.4μL，10μL2xOne-StepReactionMix，0.4μLOne-StepEnzymeMix，1μLRNA模板，补足RNase-freeWater至20μL.。反应条件为：45℃，30min；94℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，1min，共40循环；72℃10min。反应结束后，取1μL反应液，置2％琼脂糖凝胶的点样孔中，电压120V，电泳35min。
1.8寨卡病毒血清临床样本检测
针对11个寨卡病毒感染的病人的血清提取核酸，进行可视化检测验证。
1.9LAMP产物检测
将LAMP反应管中置于浊度仪里反应，阳性反应有扩增曲线出现，反之阴性反应不会出现，引物设计最优者，温度最佳者，曲线达峰时间最短。将反应产物置于一次性核酸反应装置里反应，阳性(+)：试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区6，一条位于检测区5。阳性结果表明样本中含有待检测的核酸片段，且其数量达到或高于试纸条的最低检出量。阴性(-)：试纸条质控区6出现一条红色条带，检测区5没有条带。阴性结果表明样本中不含目的核酸，或其数量低于试纸条的最低检出量。无效：试纸条质控区6和检测区5均未出现条带(参见图11和12)。
2.0LAMP反应条件的确立
经过多次反应条件的优化，确立LAMP最佳反应体系总量为26.5μL：浓度为10μM的外引物Zika-F3(SEQ NO.1)、Zika-B3(SEQ NO.2)各0.5μL、浓度为10μM的内引物Zika-FIP(SEQ NO.3)、Zika-BIP(SEQ NO.4)各4μL，浓度为10μM的环引物Zika-LB(SEQ NO.5)、Zika-LF(SEQ NO.6)各0.5μL，RNA模板1μL；65℃温育60min，85℃温育5min；将LAMP反应管中放入浊度仪里反应，阳性反应有扩增曲线出现，反之阴性反应不会出现。证实构建的LAMP方法的成功性(见图1，图2，图3，图4)。
2.1寨卡病毒LAMP可视化检测
进行寨卡病毒LAMP可视化检测。取出反应管，在一次性核酸反应装置里反应，阳性(+)：试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区6，一条位于检测区5。阳性结果表明样本中含有待检测的核酸片段，且其数量达到或高于试纸条的最低检出量。阴性(-)：试纸条质控区6出现一条红色条带，检测区5没有条带。阴性结果表明样本中不含目的核酸，或其数量低于试纸条的最低检出量。无效：试纸条质控区6和检测区5均未出现条带(参见图11和12)。
2.2 LAMP灵敏性试验
用已经建立的寨卡病毒LAMP进行灵敏度试验。结果表明LAMP方法可以检测到10-7的寨卡病毒RNA(见图5、图6)，表明所建立的寨卡病毒LAMP检测方法具有较好的敏感性。
2.3 LAMP特异性试验
在寨卡病毒特异性检测的试验中，分别用建立的LAMP方法对寨卡病毒进行检测。可以清晰的看到寨卡病毒LAMP阳性产物在浊度仪出现扩增曲线和一次性核酸检测装置里试纸条有条带，而寨卡病毒并无条带的出现(见图7、图8)。证实该方法对寨卡病毒具有良好的特异性。
2.4 RT-LAMP与RT-PCR检测比较
与RT-PCR相比，RT-LAMP检测体系表现出良好的特异性和更高的灵敏度。其中，寨卡病毒RNA被稀释106倍后(浓度为120fg/μl)，RT-LAMP检测方法仍可观察到阳性结果，与RT-PCR相比，灵敏度高出102倍(见图9)。
2.5临床样本检测
11个临床样本检测皆成阳性，与其他检测方法所测结果一致(见图10)。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州中医药大学
<120> 一种寨卡病毒的可视化检测方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgggatgtgg tgactgga 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgcattgcta cgaaccttgt 20
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtctggcacc ctagtgtcca ctcacaggaa tagccatgac cg 42
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aggcactcgt caggttatga gctacagact cgtggccgtt 40
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgaccatacg gtgtggtgt 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggtctctt cctggttgtg g 21

Claims (2)

1.一种寨卡病毒的可视化检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)取寨卡病毒，按北京全式金生物科技有限公司生产的Easy Pure Viral DNA/RNAKit的说明书提取寨卡病毒核酸；
(2)以步骤(1)得到的寨卡病毒核酸为模板，采用环介导恒温扩增方法扩增寨卡病毒NS5基因的RNA片段，获得核酸扩增产物；所述的环介导恒温扩增方法的引物由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，其中，
所述的一对外引物为：
Zika-F3：5’-TGGGATGTGGTGACTGGA-3’(SEQ NO.1)；
Zika-B3：5’-TGCATTGCTACGAACCTTGT-3’(SEQ NO.2)；
所述的一对内侧引物为：
Zika-BIP：5’-GTCTGGCACCCTAGTGTCCACTCACAGGAATAGCCATGACCG-3’(SEQ NO.3)；
Zika-FIP：5’-AGGCACTCGTCAGGTTATGAGCTACAGACTCGTGGCCGTT-3’(SEQ NO.4)；
所述的一对环引物为：
Zika-LF：5’-TGACCATACGGTGTGGTGT-3’(SEQ NO.5)；
Zika-LB：5’-ATGGTCTCTTCCTGGTTGTGG-3’(SEQ NO.5)；
上述环引物Zika-LB5’端标记生物素(Biotin)，环引物Zika-LF5’端标记6-羧基荧光素(6-FAM)；
(3)将核酸层析试纸垂直插入所述的核酸扩增产物中，层析5-10min，然后按以下方法判读结果：阳性(+)：核酸层析试纸条的检测区和质控区分别出现一条红色条带；阴性(-)：核酸层析试纸条的质控区出现一条红色条带，而检测区则没有条带；无效：核酸层析试纸条的检测区和质控区均未出现条带；其中，
所述的核酸层析试纸条包括条状的塑料支撑片，该塑料支撑片的一表面自一头至另一头依次设有样品垫、聚酯纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述聚酯纤维素膜上喷涂有一层由氯金酸制成的胶体金颗粒上制得的链霉亲和素包被的AuNPs金纳米粒子；所述硝酸纤维素膜上分布有检测区和质控带区，其中检测区是在硝酸纤维素膜上喷涂生物素亲和蛋白形成，质控区是在硝酸纤维素膜上喷涂6-羧基荧光素抗体形成。
2.根据权利要求1所述的一种寨卡病毒的可视化检测方法，其特征在于，所述的环介导恒温扩增方法的反应体系为：12.5μL2×反应缓冲液，1μL酶溶液，浓度为10μM的一对外引物各0.5μL、浓度为10μM的一对内引物各4μL，浓度为10μM的一对环引物各2μL，RNA模板1μL；所述的环介导恒温扩增方法的反应条件为：65℃温育60min，85℃温育5min。
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