CN110305985B - 一种利用三重实时荧光定量rt-pcr检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种利用三重实时荧光定量RT‑PCR检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法。本发明结合相关蚊媒病原体出现的几率、流行的风险和实验室检测过程的可操作性，采用马雅罗病毒替代现有常用组合检测方案中的登革病毒，形成以寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒为检测靶标的新的检测方案。本发明提供了可同时鉴别经伊蚊传播、引发疾病临床症状相似的病毒性病原体寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的特异性引物、探针以及三重实时荧光定量RT‑PCR检测方法，该方法具有较高的特异性和灵敏性，可重复性好，检测简便快速、节约成本，可与传统检测方案互补，具有较高的应用价值。

Description

一种利用三重实时荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒、基孔肯雅 病毒和马雅罗病毒的方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于三重实时荧光定量RT-PCR同时检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的特异性引物和探针，本发明还涉及利用特异性引物、探针进行三重实时荧光定量RT-PCR同时检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法和试剂盒。
背景技术
蚊传病毒病，尤其是伊蚊传播的病毒病，是全球当前危害最严重的传染病，引发疾病主要包括登革热、寨卡病毒病、基孔肯雅热和马雅罗病毒病等，引起全球广泛关注。
寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flaviviruses)，其直径约为42-52nm，是有包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约10.7kb，包含有单一的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码三种结构蛋白(衣壳蛋白C，前膜蛋白PrM/膜蛋白M和包膜蛋白E)和七种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)，编码顺序为：5’-UTR-C-PrM/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3’。系统发生分析显示，ZIKV分为两个亚型，分别为Africa Lineage和Asian Lineage。其中，在2015年以来美洲地区发生的病例大部分属于Asian Lineage。2016年2月，因巴西密集出现的新生儿小头症病例和其他神经系统病变，WHO宣布寨卡病毒病为“国际关注的突发公共卫生事件”，反映了该病的潜在危害的严重性。
基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)和马雅罗病毒(Mayaro virus，MAYV)同属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)，直径约60-70nm，是不分节段的有包膜的单股正链RNA病毒，基因组长度约为11-12kb。其RNA链上有两个ORF，中间由长度约68个核苷酸的非编码区相连接，靠近5’端的ORF编码4种非结构蛋白(NS1，NS2，NS3和NS4)，靠近3’端的ORF编码5种结构蛋白(衣壳蛋白C，包膜蛋白E3，包膜蛋白E2，6K和包膜蛋白E1)，基因的编码顺序为5’-UTR-NS1-NS2-NS3-NS4-(junction region)-C-E3-E2-6K-E1-UTR-3’。系统发生分析显示，CHIKV有三个亚型，分别为West Lineage、East/Central/SouthAfrica(ECSA)和Asian Lineage，其中，在2006年以来印度洋区域(Indian Ocean)暴发的病例起源于ECSA，属于ECSA.IOL。MAYV主要发生在南美洲，有三个基因亚型，分别为GenetypeL、Genetype D和Genetype N，L基因亚型主要发生于巴西地区，D基因亚型广泛分布于美洲地区，N基因亚型目前仅在Peru发现一株。
而登革病毒属黄病毒科黄病毒属，有4个血清型(DENV-1、DENV-2DENV-3和DENV-4)，均可感染人，引发疾病。登革热患者、隐性感染者和带毒的媒介伊蚊是主要的传染源。主要通过伊蚊叮咬传播，传播媒介主要为埃及伊蚊和白纹伊蚊，与寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒相同。全球热带及亚热带地区，尤其是在东南亚、太平洋岛屿和加勒比海等100多个国家和地区均有发生。人群普遍易感，登革病毒感染后，人体可对同型病毒产生持久免疫力，但对异型病毒感染不能形成有效保护，若再次感染异型或多个不同血清型病毒，机体可能发生免疫反应，从而导致严重的临床表现。可表现为无症状隐性感染、非重症感染及重症感染等。及时的分型诊断对于登革热的防控具有重要作用。但相比于登革热，寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒在中国和周边地区相对少见。目前，实验室检测常采用登革热、寨卡病毒病和基孔肯雅热单独或组合检测的方法，主要缺陷在于这些病毒的可见几率差别显著，组合检测后仍需对登革病毒进行分型检测，因此优化实验室检测方案是十分必要的。
病毒病实验室检测主要依靠于病毒分离、血清学检测和病毒核酸检测。病毒分离是实验室确诊的金标准，但所需时间长，灵敏度低。血清学检测方法确诊往往需要对急性期和恢复期血清中的抗体滴度进行测定比较，恢复期血清抗体滴度较急性期血清抗体滴度呈4倍及以上增高具有确诊意义，且容易受与其它病毒产生交叉反应的影响。病毒核酸检测主要是基于PCR技术，实时荧光定量RT-PCR有着快速、高灵敏度和特异度的优点，是目前运用较多的实验室检测方法。该方法基于荧光共振能量迁移的原理，通过对荧光强度变化监测产物量的变化，随着反应时间的进行，将监测到的荧光信号的变化绘制一条曲线。该方法全程闭管操作，降低了污染的风险；对PCR产物除了可以进行定性分析，也可通过绘制标准曲线进行定量分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏、特异，可同时检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)中检索下载寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的基因组序列，选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列和基因亚型明确的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的N碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。将序列文件保存成FASTA格式，使用软件嵌入的Clustal W分析模块进行整体比对分析，确定各基因序列的分类。根据序列比对分析结果，同时结合病毒基因组序列中DNA聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析，筛选确定在各病毒基因型中高度保守的靶序列，根据靶序列分别设计特异性引物和探针，经大量筛选和人工优化获得序列分别如SEQ ID NO.1-6、SEQ ID NO.7-9所示的分别针对寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的三对特异性引物和三条特异性探针，获得同时检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒检测的三重实时荧光定量RT-PCR的引物探针组合，并基于此开发了同时检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒检测的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。
具体地，本发明的技术方案如下：
本发明提供用于寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的三重实时荧光定量RT-PCR检测的引物探针组合，其含有三对特异性引物和三条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7-9所示。
上述特异性引物和特异性探针中，针对寨卡病毒的特异性引物的序列如SEQ IDNO.1-2所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.7所示；针对基孔肯雅病毒的特异性引物的序列如SEQ ID NO.3-4所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.8所示；针对马雅罗病毒的特异性引物的序列如SEQ ID NO.5-6所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.9所示。其中，如SEQ IDNO.8所示的序列中Y代表T或C；M代表A或C；R代表A或G。
作为优选，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团，所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LC RED640、LC RED705中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。
进一步优选地，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.9所示的特异性探针的5’端标记Texas Red荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团。采用上述荧光组合能够更好地避免寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒检测的相互干扰，保证寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒同时检测的准确性。
本发明还提供所述引物探针组合在制备用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的试剂盒中的应用。
本发明还提供所述引物探针组合在检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒中的应用。
本发明还提供一种用于寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒检测的试剂盒，其包含序列分别如SEQ ID NO.1-9所示的引物探针组合。
作为优选，所述试剂盒还包含寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的阳性对照标准品。
所述寨卡病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ ID NO.10所示的DNA序列对应的RNA或由该RNA包装而成的假病毒颗粒，或者为寨卡病毒RNA，或者为已确定为寨卡病毒的灭活病毒。
所述基孔肯雅病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ ID NO.11所示的DNA序列对应的RNA或由该RNA包装而成的假病毒颗粒，或者为基孔肯雅病毒RNA，或者为已确定为基孔肯雅病毒的灭活病毒。
所述马雅罗病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ ID NO.12所示的DNA序列对应的RNA或由该RNA包装而成的假病毒颗粒，或者为马雅罗病毒RNA，或者为已确定为马雅罗病毒的灭活病毒。
进一步优选地，所述试剂盒还包含其它为实现实时荧光定量RT-PCR检测的试剂，包括但不限于反应缓冲液、酶和水等。
本发明所述引物探针组合或所述试剂盒在进行三重实时荧光定量RT-PCR检测时的反应程序为：50℃预变性30min；95℃变性10min；95℃退火10s，60℃延伸45s，45个循环。采用上述反应程序，能够更好地保证寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的高效扩增检测。
本发明所述引物探针组合或所述试剂盒在进行三重实时荧光定量RT-PCR检测时的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，20μmol/L上、下游特异性引物各0.25μL，20μmol/L特异性探针各0.125μL，25×RT-PCR逆转录酶和DNA聚合酶1μL，RNA模板5μL，无RNA水解酶的去离子水补足至25μL。
本发明还提供用于马雅罗病毒检测的特异性靶序列，其序列如SEQ ID NO.12所示或为如SEQ ID NO.12所示序列的互补序列。
上述用于马雅罗病毒检测的特异性靶序列可用于制备用于马雅罗病毒检测的标准品。
本发明还提供一种利用三重实时荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒方法，其为以待测样品的RNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物和如SEQ ID NO.7-9所示的特异性探针进行三重实时荧光定量RT-PCR，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒。
上述提取待测样品的RNA的方法可采用本领域常规方法，如离心柱提取法。
作为优选，所述三重实时荧光定量RT-PCR的反应程序为：50℃预变性30min；95℃变性10min；95℃退火10s，60℃延伸45s，45个循环。
作为优选，所述三重实时荧光定量RT-PCR的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，20μmol/L上、下游特异性引物各0.25μL，20μmol/L特异性探针各0.125μL，25×RT-PCR逆转录酶和DNA聚合酶1μL，RNA模板5μL，RNase Free Water补足至25μL。
作为优选，上述根据扩增曲线判断待测样品中是否含有寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法如下：
有效结果判定：阳性对照(或检测管内标)Ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或CT值>38；
若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且Ct<35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或Ct>38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35<Ct<38，为可疑，建议复检，若复检结果Ct<38则可判样品为阳性，若复检结果无扩增曲线或Ct≥38，可判样品为阴性；
无效结果的判定：若检测样品为阴性，则反应体系的阳性对照(或检测管内标)必须为阳性，否则该检验管结果无效，需进行复检。
上述结果判定中，所述寨卡病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.10所示的DNA序列对应的RNA或由该RNA包装而成的假病毒颗粒，或者为寨卡病毒RNA，或者为已确定为寨卡病毒的灭活病毒。所述基孔肯雅病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.11所示的DNA序列对应的RNA或由该RNA包装而成的假病毒颗粒，或者为基孔肯雅病毒RNA，或者为已确定为基孔肯雅病毒的灭活病毒。所述马雅罗病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ ID NO.12所示的DNA序列对应的RNA或由该RNA包装而成的假病毒颗粒，或者为马雅罗病毒RNA，或者为已确定为马雅罗病毒的灭活病毒。
上述结果判定中，阴性对照可为健康人捐献的血清或血浆或可为水。
本发明所述的寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的三重实时荧光定量RT-PCR检测反应体系适用于所有的实时荧光定量PCR仪。
本发明的有益效果在于：
本发明结合相关蚊媒病原体出现的几率、流行的风险和实验室检测过程的可操作性，采用马雅罗病毒替代现有组合检测方案中的登革病毒，形成以寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒为检测靶标的新的组合检测方案。
本发明通过大量序列比对分析确定了寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒各基因型之间高度保守的靶序列，针对确定的靶序列通过大量筛选和优化，分别获得了适用于实时荧光定量RT-PCR检测的特异性引物和探针，该引物和探针在寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的各个基因型中具有很好的普适性。
本发明建立了同时检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法在一个实时荧光定量RT-PCR反应体系内，同时引入分别针对寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的三对特异性引物和不同标记的探针，通过实时荧光信号的动态变化，对未知样本进行定性分析；也可通过标准参考品的检测，绘制标准曲线，实现对未知模板的定量分析。与其它检测方法相比，本发明提供的检测方法具有高灵敏性和特异性、操作简便、检测时间短、所需样本量少、低污染等优点，可直接对未知样本里提取的RNA进行检测，在病毒的快速检测中具有较高的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中寨卡病毒的全基因组系统发育树。
图2为本发明实施例1中基孔肯雅病毒的全基因组系统发育树。
图3为本发明实施例1中马雅罗病毒的全基因组系统发育树。
图4为本发明实施例2中普通PCR扩增马雅罗病毒目的基因的鉴定结果图，其中M为DNA marker，MAYARO为马雅罗病毒目的基因。
图5为本发明实施例3中三重实时荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的特异性分析结果。
图6为本发明实施例4中单重实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的寨卡病毒核酸的扩增曲线图。
图7为本发明实施例4中单重实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的基孔肯雅病毒核酸的扩增曲线图。
图8本发明实施例4中单重实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的马雅罗病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。
图9为本发明实施例4中三重实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的寨卡病毒核酸的扩增曲线图。
图10为本发明实施例4中三重实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的基孔肯雅病毒核酸的扩增曲线图。
图11为本发明实施例4中三重实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的马雅罗病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。
图12为本发明实施例5中三重实时荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒的可重复性分析结果图。
图13为本发明实施例5中三重实时荧光定量RT-PCR检测基孔肯雅病毒的可重复性分析结果图。
图14为本发明实施例5中三重实时荧光定量RT-PCR检测马雅罗病毒的可重复性分析结果图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的特异性引物和探针的设计
1、引物和探针的设计和筛选
在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)中检索下载寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的基因组序列。选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列和基因亚型明确的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的N碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。将序列文件保存成FASTA格式，使用软件嵌入的Clustal W分析模块进行整体比对分析，确定各基因序列的分类，其中，寨卡病毒的全基因组系统发育树如图1所示，基孔肯雅病毒的全基因组系统发育树如图2所示，马雅罗病毒的全基因组系统发育树如图3所示。根据序列比对分析结果筛选确定在寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的各个基因型中高度保守的靶序列。
针对上述靶序列设计特异性引物和探针，同时结合病毒基因组序列中DNA聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析进行特异性引物和探针的设计和筛选。，本发明经过大量设计、筛选和对比实验发现，并非单单满足普通引物设计原则或采用引物设计软件所设计出的引物就能够实现高效特异灵敏的三重实时荧光定量RT-PCR同时检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒。本发明针对引物、探针与靶序列的亲和力和错配率、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构以及引物的GC含量、Tm值、长度和扩增片段长度等进行了大量人工优化设计和筛选，最终得到如下分别针对寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的特异性引物对和特异性探针：
寨卡病毒：
特异性引物：
ZIKVE-F：AGCCGCTGCCCAACACAAG(SEQ ID NO.1)
ZIKVE-R：ACCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT(SEQ ID NO.2)特异性探针：
ZIKV-P：AAGCCTACCTTGACAAGCAGTCAGACACTCAA(SEQ ID NO.7)
基孔肯雅病毒：
特异性引物：
CHIKV-F：AGAGCATACGGTTACGCAGATAG(SEQ ID NO.3)
CHIKV-R：TRCTGGTGACACATGGTGGTTTC(SEQ ID NO.4)特异性探针：
CHIKV-P：AACGAGTMATCTGCGTAYTGGGACGYA(SEQ ID NO.8)
马雅罗病毒：
特异性引物：
MAYV-F：TAAGCTCTTCCTCTGCATTGC(SEQ ID NO.5)
MAYV-R：ATGCTGGAAACGCTCTCTGTA(SEQ ID NO.6)
特异性探针：
MAYV-P：AGGCCGAGAGCCCGTTTTTAAAATCAC(SEQ ID NO.9)
上述探针中，Y代表T或C；M代表A或C；R代表A或G。
2、引物和探针的合成
上述引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成，其中，寨卡病毒的ZIKV-P探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；基孔肯雅病毒的简并探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；马雅罗病毒的MAYV-P探针的5’端标记Texas Red荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团。
实施例2三重实时荧光定量RT-PCR同时检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的检测方法的建立
1、待测病毒核酸的提取
收集待测病毒的细胞培养上清，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒核酸。
2、阳性对照标准品的制备
对于马雅罗病毒，通过合成马雅罗病毒基因的保守区(如SEQ ID NO.12所示)作为阳性对照标准品，将合成的目的基因克隆至pET-28a(+)载体中，基因合成与质粒克隆由北京天一辉远生物公司完成。用thermo公司2×PCR Mix试剂对克隆质粒中含有的目的基因进行普通PCR扩增，扩增的上游引物为TAATACGACTCACTATAGGGCAAGT(SEQ ID NO.13)，下游引物为TGCTAGTGAGTGTGTCTTTTTC(SEQ ID NO.14)。PCR扩增结果如图4所示。采用Qian公司GelExtraction Kit试剂盒回收纯化PCR产物，Nanodrop紫外可见分光光度计对回收的DNA模板定量。采用Promega公司Ribomaxtm large scale RNA production system-sf6and T7试剂盒进行目的基因的RNA体外转录，Qian公司RNeasy mini kit对RNA体外转录产物回收。上述操作均按照试剂盒说明进行。
寨卡病毒和基孔肯雅病毒的阳性对照标准品分别为序列如SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示的DNA逆转录得到的RNA，可采用常规方法制备得到。
3、实时荧光定量RT-PCR检测
采用AgPath-ID One Step RT-PCR Kit(Ambion)试剂盒进行单重和三重实时荧光定量RT-PCR反应，利用实施例1最终获得的特异性引物(序列如SEQ ID NO.1-6所示)和探针(序列如SEQ ID NO.7-9所示)进行实时荧光定量RT-PCR检测。
本发明通过优化实施例1获得的用于三种病毒检测的特异性引物和探针的反应条件，使其能够实现高效的组合检测，具体反应条件如下：
25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，20μmol/L上、下游特异性引物各0.25μL，20μmol/L探针各0.125μL，25×RT-PCR逆转录酶和DNA聚合酶1μL，RNA模板5μL，RNase FreeWater补齐至25μL；
反应程序为：50℃预变性30min；95℃变性10min；95℃退火10s，60℃延伸45s，45个循环。
4、结果分析和判断
检测结果需根据反应体系中所设置的阳性对照标准品(或检测管内标)、阴性对照的扩增结果和扩增曲线进行判断。各病毒的阳性对照标准品如上述步骤2中所述；阴性对照为以水为模板。
有效结果判定：阳性对照标准品(或检测管内标)Ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或CT值>38。
若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且Ct<35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或Ct>38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35<Ct<38，为可疑，建议复检，若复检结果Ct<38则可判样品为阳性，若复检结果无扩增曲线或Ct≥38，可判样品为阴性。
无效结果的判定：若检测样品为阴性，则反应体系的阳性对照(或检测管内标)必须为阳性，否则该检验管结果无效，需进行复检。
实施例3三重实时荧光定量RT-PCR检测方法的特异性分析
以寨卡病毒、基孔肯雅病毒RNA和马雅罗病毒体外转录合成的RNA标准品作为阳性对照，将登革Ⅰ-Ⅳ型、汉城病毒、汉滩病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒作为对照病毒，对实施例2提供的检测方法进行特异性分析。收集寨卡病毒、基孔肯雅病毒以及各对照病毒的细胞培养上清，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒核酸。
采用实施例2的检测方法进行实时荧光定量RT-PCR检测，具体处理组设计如下：以寨卡病毒、基孔肯雅病毒提取的RNA和马雅罗病毒体外转录合成的RNA标准品(浓度为1×108copies/uL)为阳性对照；以登革Ⅰ-Ⅳ型、汉城病毒、汉滩病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒共7种病毒的RNA组成的模拟其他病毒感染样品为阴性对照(共计40份样本)；健康人体检血清标本100份进行特异性验证。
结果如图5所示，登革Ⅰ-Ⅳ型、汉城病毒、汉滩病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒等7种病毒及100份健康人体检血清中均未出现非特异性扩增，表明实施例2的检测方法具有高度特异性。
实施例4三重实时荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度(检测限)分析
对上述提取获得的寨卡病毒、基孔肯雅病毒核酸和体外转录的马雅罗病毒RNA进行定量，根据如下公式计算RNA拷贝数：Y(copies/μL)＝X(g/μL)×6.02×1023/RNA的片段长度(Transcript length in nucleotides)×340，其中Y为RNA拷贝数，X为RNA的浓度。对上述已知浓度的RNA进行10倍系列稀释，其中，对提取获得的寨卡病毒、基孔肯雅病毒核酸稀释成1×108copies/μL至1×101copies/μL共8个浓度梯度，对体外转录的马雅罗病毒标准品RNA稀释成1×108copies/μL至1×100copies/μL共9个浓度梯度。
以上述梯度稀释的不同浓度的RNA为模板，采用实施例2中的检测方法进行实时荧光定量RT-PCR检测，对每个反应设立三组平行实验，确定实施例2的检测方法的检测限。
以不同浓度样本的拷贝数为横坐标，循环阈值(CT)为纵坐标，制作标准曲线，通过所得标准曲线对三种病毒各自的单重实时荧光RT-PCR与三重实时荧光定量RT-PCR的灵敏性进行比较，结果分别如图6-11所示，通过单重实时荧光RT-PCR(如图6、7、8所示)与三重实时荧光定量RT-PCR(如图9、10、11所示)比较可知，寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的最低检出限之间无明显差异(结果见表1)，说明实施例2的检测方法具有良好的灵敏度。
表1寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的单重和三重实时荧光定量RT-PCR结果
Figure BDA0002102843250000151
实施例5三重实时荧光定量RT-PCR检测方法的可重复性分析
分别选取稀释度为1×107copies/μL、1×105copies/μL、1×103copies/μL的三个不同浓度梯度的寨卡病毒、基孔肯雅病毒核酸以及稀释度为1×106copies/μL、1×104copies/μL、1×102copies/μL的三个不同浓度梯度的马雅罗病毒体外转录RNA标准品为模板，分别进行20次平行重复实验验证实施例2提供的检测方法的稳定重复性。
结果如图12-14所示，寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒各次检测实验的标准差均控制在0.5以内，变异系数在2％以下(结果见表2)，说明实施例2的检测方法具有较好的稳定性和可重复性
表2寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒三重实时荧光定量RT-PCR检测方法的稳定性评价
Figure BDA0002102843250000161
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120> 一种利用三重实时荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法
<130> KHP191112686.5
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agccgctgcc caacacaag 19
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accactaacg ttcttttgca gacat 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagcatacg gttacgcaga tag 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
trctggtgac acatggtggt ttc 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taagctcttc ctctgcattg c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgctggaaa cgctctctgt a 21
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagcctacct tgacaagcag tcagacactc aa 32
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacgagtmat ctgcgtaytg ggacgya 27
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggccgagag cccgttttta aaatcac 27
<210> 10
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgaggcatca atatcagaca tggcttcgga cagccgctgc ccaacacaag gtgaagccta 60
ccttgacaag caatcagaca ctcaatatgt ctgcaaaaga acgttagtgg acagaggctg 120
gggaaatgga tgtggacttt ttggcaaagg gagcctggtg acatgcgcta agtttgcatg 180
ctccaagaaa atgaccggga 200
<210> 11
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actgctcaaa ccgggtggct ctctattgat cagagcatac ggttacgcag atagaaccag 60
tgaacgagta atctgcgtac tgggacgtaa gtttagatca tccagagcat tgaaaccacc 120
atgtatcacc agtaatactg agatgttttt cctattcagc agttttgaca atggcagaag 180
gaattttaca acgcatgtca 200
<210> 12
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcaagtgaca cttgttccgc cggtcgtctc taagctcttc ctctgcattg caagagtcta 60
ccactcatta tgtcgaaagt ctttgtagat atcgaggccg agagcccgtt tttaaaatca 120
ctacagagag cgtttccagc atttgaagtg gaagcacagc aggttacacc aaatgaccat 180
gctaacgcca gagcattctc gcatctggct actaaattga tagagcaaga gaccgaaaaa 240
gacacactca 250
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taatacgact cactataggg caagt 25
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgctagtgag tgtgtctttt tc 22

Claims (9)

1.用于寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的三重实时荧光定量RT-PCR检测的引物探针组合，其特征在于，由三对特异性引物和三条特异性探针组成，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7-9所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；
所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LCRED640、LC RED705中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQID NO.9所示的特异性探针的5’端标记Texas Red荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团。
4.权利要求1～3任一项所述的引物探针组合在制备用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的试剂盒中的应用。
5.一种用于寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的引物探针组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在进行三重实时荧光定量RT-PCR检测时的反应程序为：50℃预变性30min；95℃变性10min；95℃退火10s，60℃延伸45s，45个循环。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在进行三重实时荧光定量RT-PCR检测时的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，20μmol/L上、下游特异性引物各0.25μL，20μmol/L特异性探针各0.125μL，25×RT-PCR逆转录酶和DNA聚合酶1μL，RNA模板5μL，用无RNA酶去离子水补至25μL。
8.一种非疾病诊断目的的利用三重实时荧光定量RT-PCR检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒方法，其特征在于，以待测样品的RNA为检测模板，利用如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物和如SEQ ID NO.7-9所示的特异性探针进行三重实时荧光定量RT-PCR，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述三重实时荧光定量RT-PCR的反应程序为：50℃预变性30min；95℃变性10min；95℃退火10s，60℃延伸45s，45个循环；
所述三重实时荧光定量RT-PCR的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，20μmol/L上、下游特异性引物各0.25μL，20μmol/L特异性探针各0.125μL，25×RT-PCR逆转录酶和DNA聚合酶1μL，RNA模板5μL，RNase Free Water补足至25μL。
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