BR102017007145A2 - oligonucleotídeo, conjunto de oligonucleotídeos, método para detecção simultânea de mayv, orov e orov-like, e, kit para diagnóstico e discriminação de infecção por mayv e orov/orov-like - Google Patents

Abstract

a presente invenção provê um método de rt-qpcr multiplex em tempo real que permite em uma única etapa a detecção simultânea de vírus oropouche (orov), oropouche-like e/ou mayaro. para isto, foram desenvolvidos iniciadores utilizados para amplificar regiões particulares dos genomas dos vírus. a presença dos vírus em uma amostra é indicada pela formação de fluorescência liberada pelas sondas específicas para cada vírus.

Description

“OLIGONUCLEOTÍDEO, CONJUNTO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS, MÉTODO PARA DETECÇÃO SIMULTÂNEA DE MAYV, OROV E OROV-LIKE, E, KIT PARA DIAGNÓSTICO E DISCRIMINAÇÃO DE INFECÇÃO POR MAYV E OROV/OROV-LIKE” Campo da invenção [0001] A invenção refere-se de forma geral à amplificação e detecção de ácidos nucleicos. Mais especificamente, são providos métodos, oligonucleotídeos e kit de diagnóstico para confirmar, quantificar e discriminar simultaneamente, em uma única uma etapa, os vírus Oropouche e vírus semelhantes a Oropouche (“Oropouche-like”) e vírus Mayaro. Antecedentes da Invenção [0002] Os arbovírus são vírus transmitidos ao homem por vetores artrópodes hematófagos e são designados “arthropod-borne viruses” não somente porque sua veiculação se dá através destes organismos (ex. mosquitos, carrapatos, percevejos, entre outros), mas também porque parte do seu ciclo replicativo neles ocorre. Cinco são as famílias virais: Bunyaviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Reoviridae e Rhabdoviridae [Rust (2012) Semin. Pediatr. Neurol., 19(3): 130-151]. Das mais de 545 espécies de arbovírus conhecidos, cerca de 150 causam doenças em humanos [Cleton et al. (2012) J. Clin. Virol., 55(3): 191-203], colocando-os entre as mais importantes causas de doenças infecciosas emergentes ou reemergentes no mundo, estando frequentemente associados a surtos ou epidemias.

[0003] A cada ano, as arboviroses acometem número maior de indivíduos, porém, grande parte delas permanece pouco conhecida e sem qualquer tipo de intervenção [Kuniholm et al. (2006) Am. J. Trop. Med. Hyg., 74(6): 1078-1083]. As pesquisas sobre arboviroses, sobretudo as de menor impacto em saúde púbbca, são reabzadas durante os períodos de surto ou epidemia, havendo pouca ou nenhuma informação a respeito da distribuição, incidência, prevalência e caracterização de seus vetores em períodos interepidêmicos [Travassos da Rosa et al. (1998) Arboviruses isolatcd in the Evandro Chagas Institute, including some described for the first time in the Brazilian Amazon region, their known host, and their pathology for man. br An overview of arbovirology in Brazil and neighbouring countries. Belém: Instituto Evandro Chagas, p. 19-31].

[004] Dentre as arboviroses de interesse em saúde pública destacam- se atualmente a Dengue, a Febre Amarela, a Zika e a Chikungunya. Porém, dados epidcmíológicos têm mostrado que outros dois arbovírus emergentes, conhecidos como Vírus Mayaro (MAYV) e Vírus Oroupoche (OROV) merecem atenção especial [Vasconcelos et al. (2009) J Clin Virol., 44(2): 129-133; Mourão et al. (2009) Emerg Infect Dis., 15(12): 2063-2064; Bastos et al. (2012) Am J Trop Med Hyg., 86(4): 732-735; Cardoso et al. (2015) Mem Inst Oswaldo Cruz., 110(6): 745-754].

[005] O Vírus Mayaro (MAYV) pertence ao gênero Alphavirus, família Togaviridae, o mesmo grupo do vírus Chikungunya. Estes são vírus envelopados de cerca de 60 a 70 nm de diâmetro, com um capsídeo icosaédrico e um genoma consistindo de um RNA linear de fita simples de polaridade positiva de cerca de 11,8 kb incluindo 8 (oito) genes. As infecções humanas por Alphavirus evoluem com sintomas clínicos não específicos, que são semelhantes àquelas causadas por outros arbovírus. Assim, a Febre de Mayaro é uma doença aguda que inclui febre, dor de cabeça, mialgia, rash cutâneo e artralgia que é classicamente descrita como severa nos casos em que as grandes articulações são afetadas [Taylor et al. (2005) South Med. J., 98:484-485]. A fase febril aguda geralmente dura 3-5 dias e termina com o aparecimento do rash. Após esta fase, a convalescença pode levar algumas semanas, com sintomas de fraqueza e artralgia [Azevedo et al. (2009) Emerg Infect Dis., 15(11): 1830-1832; Abad-Franch et al. (2012) PLoS Negl Trop Dis., 6(10): el846; Mourão et al. (2012) Vector Bornc Zoonotic Dis., 12(1): 42-46]. O seu principal vetor no ciclo silvestre é o mosquito do gênero Haemagogus. Com relação ao ciclo urbano, estudos ainda estão sendo realizados para determinar o vetor.

[006] O vírus Oropouche (OROV) pertence ao gênero Orthobunyavirus, na família Bunyaviridae, e é geralmente associado com surtos de doenças agudas febris semelhantes à Dengue (“dengue-Uke”). Estes são vírus que medem de 80 a 120 nm de diâmetro, apresentam capsídeo de simetria helicoidal circundado por um envoltório lipoproteico com espículas superficiais. O genoma viral é constituído por três segmentos de RNA de fita simples (Small - S, Médium - M. Large - L), lineares. A infecção por OROV é uma doença febril aguda, semelhante a dengue, apresentando sintomatologia com cefaleia, mialgia, artralgia, podendo ser acompanhada de meningite asséptica. Após o término do episódio febril inicial é comum observar a recorrência dos sintomas, mas em menor intensidade. Alguns pacientes podem exibir um quadro grave caracterizado por meningite linfoplasmocitária. [Figueiredo (1999) Medicina, Ribeirão Preto, 32:154-158]. No ciclo silvestre, os vetores são Aedes serratus, Culex quinquefasciatus e Culicoides paraensis (maruim). No ciclo urbano, os vírus são transmitidos de pessoa a pessoa por meio da picada do Culicoides paraensis.

[007] Por muitos anos, a Febre de Oropouche foi considerada a segunda doença arboviral mais comum no Brasil, ultrapassada apenas pela Dengue [Figueiredo (2007) Rcv. Soc. Bras. Mcd. Trop., 40(2):224-229; Vasconcelos et al. (2011) Emerg. Infect. Dis., 17(5): 800-806].

[008] No entanto, no contexto da cocirculação de diferentes arbovírus, este panorama modifica-se continuamente. Considerando-se que as arboviroses apresentam sintomatologias inespecíficas e sobrepostas e que o diagnóstico é baseado principalmente em exames clínicos, não é improvável que muitos diagnósticos sejam incorretos, resultando em distorções nos dados dos serviços de vigilância epidemiológica.

[009] As epidemias de arboviroses são de grande relevância na saúde pública, não só porque provocam impactos sociais e econômicos importantes, mas devido adicionalmente à diversidade de agentes infecciosos envolvidos, a pluralidade de manifestações clínicas, a sobreposição sintomática entre as infecções (o que impede ou dificulta cnormemente o diagnóstico correto) e a inexistência de terapia específica, relegando o tratamento das arboviroses ao controle sintomático das manifestações clínicas. Estes são motivos que levaram os presentes inventores a desenvolver um método diagnóstico laboratorial rápido, confiável e efetivo, conforme passará a ser descrito no pedido.

[0010] Dentro deste contexto, sabe-se que os testes de amplificação de ácidos nucleicos (“Nucleic Acid Amplification Tesís” - NAATs) têm melhorado o diagnóstico de doenças infecciosas, não apenas por sua sensibilidade e especificidade inerentemente superiores, quando otimizadas adequadamente, mas também devido à viabilidade de uso durante situações de epidemia.

[0011] Atualmente os protocolos moleculares disponíveis para a detecção do material genético dos vírus Mayaro e Oropouche são baseados na técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional. Para a realização desta técnica necessitam-se ao menos de três etapas após a obtenção do RNA, sendo elas a produção de uma fita de DNA completar, seguida de reação de amplificação do material genético. Alguns protocolos utilizam nested-?CR, que consiste em duas etapas de amplificação de DNA e, posteriormente, para visualização dos resultados, faz-se necessária a realização de eletroforese.

[0012] Tais protocolos são observados nos seguintes trabalhos: (1) Powers et al. (2006) The American Society of Tropical Medicine and Hygiene, 75(3): 461-469; (2) Moreli et al. (2002) Journal of Medicai Virology, 66:139-142; (3) Saeed et al. (2000) Journal of General Virology, % 81: 743-748. (4) Bastos et al. (2012) The American Society of Tropical Medicine and Hygiene, 86(4): 732-735.

[0013] A presente invenção consiste no desenho de iniciadores e sondas para detecção dos vírus Mayaro e Oropouche / Oropouche-like. Estes iniciadores e sondas compõem um protocolo para detecção simultânea dos vírus anteriormente citados, utilizando a metodologia de transcrição reversa acoplada a PCR em tempo real (RT-qPCR). Atualmente não existem protocolos para o diagnóstico simultâneo de MAYV e OROV e OROV-like baseados nesta metodologia.

[0014] Os inventores, até o presente momento, não têm conhecimento da existência de testes diagnósticos comerciais baseados em tecnologia de amplificação de ácidos nucleicos para diagnóstico simultâneo de MAYV e OROV. Assim, a implementação da tecnologia aqui descrita pode significar o atendimento à necessidade de metodologias para a conclusão segura do diagnóstico. (0015] A este respeito, os inventores apontam como vantagens da presente invenção: [0016] 1) É uma metodologia capaz de detectar simultaneamente vírus Oropouche e Oropouche-like e vírus Mayaro, em uma única reação.

[0017] 2) A discriminação entre os tipos virais é de fundamental importância, tanto para que haja o correto tratamento do paciente quanto para fins de vigilância epidemiológica. Ainda, na plataforma aqui desenvolvida, apenas uma reação é necessária para conclusão do diagnóstico, reduzindo significativamente o custo e tempo de realização do teste.

[0018] 3) Além disto, no processo de validação dos parâmetros analíticos, a definição da sensibilidade ou limite de detecção dos testes disponíveis foi realizada.

[0019] 4) Estudos de especificidade de métodos baseados na PCR foram realizados, e a especificidade para os vírus ORO/ORO-like e MAY foi analisada em face a outros arbovírus, a fim de identificar possíveis reações cruzadas com outros organismos.

[0020] A invenção passará a ser apresentada com maiores detalhes abaixo.

Sumário da Invenção [0021] Em um aspecto, a invenção provê um oligonucleotídeo capaz de se ligar à região do gene nsPl de Vírus Mayaro (MAYV) e ser adequado como iniciador, dito oligonucleotídeo compreendendo pelo menos de 10 a 15 nucleotídeos consecutivos das sequências selecionadas de SEQ ID Nos: 1 e 2. [0022] Em outro aspecto, a invenção provê um oligonucleotídeo capaz de se ligar ao segmento S de Vírus Oropouche (OROV) e Vírus semelhante a Oropouche (OROV-like) e ser adequado como iniciador, dito oligonucleotídeo compreendendo pelo menos de 10 a 15 nucleotídeos consecutivos das sequências selecionadas de SEQ ID Nos: 4 e 5.

[0023] Em um aspecto adicional, a invenção provê um oligonucleotídeo capaz de ser ligar à região do gene nsPl de Vírus Mayaro (MAYV) e ser adequado como sonda, dito oligonucleotídeo sonda compreendendo pelo menos de 8 a 15 nucleotídeos consecutivos da sequência selecionada de SEQ ID No: 3.

[0024] Em outro aspecto adicional, a invenção provê um oligonucleotídeo capaz de ser ligar ao segmento S de Vírus Oropouche (OROV) e Vírus semelhante a Oropouche (OROV-like) e ser adequado como sonda, dito oligonucleotídeo sonda compreendendo pelo menos de 8 a 15 nucleotídeos consecutivos da sequência selecionada de SEQ ID No: 6.

[0025] Em uma concretização, o oligonucleotídeo adequado como sonda é marcado com uma marcação detectável, preferencialmente, um grupamento fluorescente, compreendendo um par de fluoróforo doador e um quencher.

[0026] Em um aspecto adicional, a invenção também se refere a um conjunto dc oligonucleotídeos, que compreende pelo menos dois oligonucleotídeos selecionados de sequências compreendendo SEQ ID Nos: 1-6.

[0027] Em um outro aspecto adicional, é provido um método para detecção simultânea de MAYV, OROV e OROV-like, compreendendo as etapas de: a) produzir pelo menos um amplicon usando pelo menos dois oligonucleotídeos iniciadores, ditos oligonucleotídeos como definidos acima; b) detectar o amplicon através de pelo menos um oligonucleotídeo sonda.

[0028] Em uma concretização, a dita etapa de produzir pelo menos um amplicon compreende pelo menos um de amplificação por PCR multiplex, quantitativo, qualitativo, ou em tempo real.

[0029] Em outra concretização adicional, o método permite discriminar entre infecções por MAYV e OROV/OROV-Iike.

[0030] Um outro aspecto da invenção diz respeito a um kit para diagnóstico e discriminação de infecção por MAYV e OROV/OROV-like, compreendendo: a) pelo menos um oligonucleotídeo adequado como iniciador como acima definido; e/ou b) pelo menos um conjunto de oligonucleotídeos adequando como sonda como definido acima; e c) opcionalmente, instruções para uso.

[0031] Em uma concretização, o kit da invenção ainda inclui oligonucleotídeos iniciadores e sondas capazes de amplificar e discriminar vírus que não MAYV e OROV/OROV-like. Em uma concretização adicional, estes vírus são selecionados de vírus da dengue, vírus da zika, vírus da febre amarela e vírus da chikungunya.

[0032] Adicionalmente, em uma concretização, o kit da invenção ainda inclui um controle negativo e/ou um controle positivo de reação.

Breve Descrição das Figuras [0033] Figura 1. Representação esquemática de porção do plasmídeo H quimérico pOROV_MAYV. O plasmídeo pOROV_MAYV compreende as sequências-alvos de ambos MAYV e OROV em um contexto para a produção de RNA Zw vitro sob controle do promotor T7. Os sítios de anelamento dos iniciadores senso e antisenso, assim como os sítios de ligação das sondas, são representadas por caixas em cores azul, verde e vermelho, respectivamente. [0034] Figura 2. Reação de RT-PCR em tempo real com diluições seriadas do RNA quimérico transcrito in vitro, contendo ambos os alvos de OROV e MAYV. Gráficos de amplificação para MAYV (A) e OROV (B), e regressão linear para MAYV (C) e OROV (D) para diluições de dez vezes, 8-log, diluições de 20 a 2E+08 cópias em duplicata. A eficiência da reação em cadeia da polimerase em ensaio multiplex foi calculada com o Software StcpOnePlus Software v2.2 como 98,642% [Slope: -3,355, R2:l] para MAYV and 99,181% [Slope: -3.341, R2:l] para OROV. Ct = cycle threshold. Os valores de fluorescência foram exportados para MS Excel c Gráfico usando GraphPad Prism 6.0.

[0035] Figura 3. Alinhamento dos iniciadores e sondas de MAYV e OROV com seus moldes. (A) Iniciadores e sonda para detecção do MAYV. (B) Iniciadores e sonda para detecção do OROV e OROV-like. Azul (iniciadores forward), verde (iniciadores reverse), vermelho (sonda).

Descrição Detalhada da Invenção [0036] A não ser que sejam definidos de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. As técnicas convencionais de biologia molecular são bem conhecidas de um técnico no assunto, podendo ser encontradas, por exemplo, em Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. N.Y. (1987-2008), incluindo todos os suplementos; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). O νζ_ • · relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações. A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo “cerca de”. Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.

[0037] A invenção aqui descrita refere-se a novos oligonucleotídeos para amplificação, detecção, diferenciação e quantificação de vírus Oropouche (OROV), vírus semelhantes a Oropouche (“Oropouche-like”) e vírus Mayaro (MAYV), e métodos e kits relacionados. Mais especificamente, a presente invenção provê oligonucleotídeos, incluindo iniciadores e sondas, que são adequados para a detecção e discriminação de Oropouche (OROV)/vírus semelhantes a Oropouche (“Oropouche-like”) e vírus Mayaro (MAYV).

Oligonucleotídeos e kits de diagnóstico [0038] “Oligonucleotídeo” refere-se a qualquer polímero curto de nucleotídeos, em que os nucleotídeos podem ser ribonucleolídeos, deoxirribonucleotídeos, dideoxirribonucleotídeos, nucleotídeos degenerados, e similares. Ditos oligonucleotídeos são preferencialmente fita simples. O comprimento de ditos oligonucleotídeos pode variar, e é usualmcnte menor que 150 nucleotídeos (nt), preferencialmente na faixa de 10-100 nl, mais preferencialmente na 10-60 nt, ainda mais preferencialmente de 13-50 nt. Podem ainda apresentar modificações químicas, tais como uma etiqueta (“tag”) ou uma marcação, por exemplo, fluorescente, radioativa, biotinilada, DIG (digoxigenina), e similares. Os oligonucleotídeos da invenção podem ser tanto forward (senso) quanto reverso (antisenso).

[0039] Em um aspecto, os oligonucleotídeos de acordo com a presente invenção incluem iniciadores e sondas. A não ser que seja informado do contrário, as sequências são apresentadas na direção de 5’ para 3’. Ditos oligonucleotídeos podem estar em várias formas, por exemplo, em solução/suspensão em um solvente adequado e em uma concentração desejada, secos ou liofilizados. O técnico no assunto tem conhecimento dos solventes, concentrações e condições de estocagem adequadas para os oligonucleotídeos da invenção. Em particular, o técnico no assunto tem conhecimento de como preparar ditos oligonucleotídeos como soluções de estoque. Os oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem apresentar vários graus de pureza, que podem ser avaliados por um técnico no assunto, por exemplo, através de cromatografia por HPLC.

[0040] Além disto, deve ser aqui lembrado que, apesar das funções preferidas poderem ser mencionadas em relação a alguns oligonucleotídeos, é óbvio que um dado oligonucleotídeo pode assumir diversas funções, e pode ser utilizado em diferentes formas de acordo com a presente invenção. Como é de conhecimento do técnico no assunto, em algumas situações, a sequência de um iniciador pode ser usada como sonda e vice-versa, além de ser aplicável em procedimentos de hibridização, detecção etc. Assim, observa-se que os produtos de acordo com a presente invenção, especialmente, inter alia, os oligonucleotídeos, não estão limitados aos usos aqui mostrados, mas, ao contrário, os usos devem ser interpretados de forma ampla, independente do uso aqui indicado. Além disto, quando um oligonucleotídeo é descrito como sendo útil como sonda capaz de se ligar a um amplicon, o técnico no assunto também entende que a sequência complementar deste oligonucleotídeo é igualmcnte útil como uma sonda para se ligar ao mesmo amplicon. O mesmo ocorre com as sequências descritas como úteis como iniciadores. Adicionalmente, é também óbvio que qualquer iniciador adequado para um protocolo multiplex pode ser também, dentro do significado e escopo da % presente invenção, ser utilizado em um protocolo singleplex. O mesmo se aplica a um iniciador adequado para um protocolo de PCR em tempo real, que pode ser usado em um protocolo de PCR convencional, dentro do significado da presente invenção.

[0041] Os termos “hibridizar” e “anelar” são usados de forma intercambiável e significam a interação de pareamento de bases de um ácido nucleico com outro ácido nucleico que resulta na formação de uma fita dupla, tripla, ou outras estruturas mais complexas. Em algumas concretizações, a interação primária é específica, por exemplo, C/G e A/T, pela ligação por pontes de hidrogênio.

[0042] O técnico no assunto, a este respeito, entende que os oligonucleotídeos da presente invenção, isto é, os iniciadores e sondas, não precisam ser completamente complementares a uma parte da sequência do alvo. O iniciador pode apresentar complementaridade suficiente para hibridizar com a sequência alvo e desempenhar as funções intrínsecas de um iniciador. O mesmo se aplica a uma sonda, ou seja, uma sonda pode apresentar complementaridade suficiente para hibridizar com a sequência alvo e desempenhar as funções intrínsecas de uma sonda. Portanto, um iniciador ou uma sonda, em uma concretização, não necessita ser completamente complementar à sequência alvo. Em uma concretização, o iniciador ou a sonda pode se hibridizar ou anelar com uma parte do alvo para formar uma fita dupla. As condições de hibridização de um ácido nucleico são descritas por Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) e Haymes et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985). Assim, uma vez que não é necessário haver eomplementariedade completa para ocorrer anelamento, um técnico no assunto entenderá que as sequências de iniciadores e de sondas aqui descritas podem ser modificadas até certo grau sem a perda de suas utilidades como iniciadores e sondas específicas para Oropouche (OROV), vírus semelhante^· a Oropouche (“Oropouche-like”) e vírus Mayaro (MAYV).

[0043] No contexto da presente invenção, os “vírus semelhantes a Oropouche (OROV-like)” são vírus da família Bunyaviridae em que houve o fenômeno de reordenação do genoma [Briese et al. (2013) Virology, 446(1-2): 207-216] e passam a apresentar o segmento S de vírus Oropouche. Portanto, tais vírus podem também ser amplificados pelos iniciadores e detectados pelas sondas conforme aqui apresentados.

[0044] Com relação à definição de “iniciador”, um técnico no assunto sabe que inclui qualquer oligonucleotídeo fita simples capaz de se anelar a um molde alvo complementar, em condições de estringência adequada, e que serve como ponto de início para a síntese de um produto de extensão (amplicon) a partir do iniciador, pela elongação da fita por uma DNA polimerase em condições adequadas. Estas condições incluem 4 tipos diferentes de deoxinucleosídeos trifosfatos e DNA polimerase ou transcriptase reversa em condições de temperatura adequadas e em uma solução tampão adequada. O comprimento do iniciador pode variar de acordo com diversos fatores, mas o comprimento típico de um iniciador é de 5-50 nt, preferencialmente 15-30 nt, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nt. De acordo com a presente invenção, é preferível que cada iniciador lenha de 10-30 nt. Os iniciadores forward e reverse são iniciadores que se ligam, respectivamente, a uma extremidade 3’ e a uma extremidade 5’ de uma região específica do alvo que é amplificado pela reação de PCR.

[0045] Os iniciadores providos pela presente invenção são desenhados baseados nas sequências consensos do genoma total do MAYV e do segmento S completo de OROV disponíveis no banco GenBank, sendo um alinhamento para cada vírus alvo, usando o Software ClustalX [Jeanmougin et al. (1998) Trends Biochem. Sei., 23(10): 403-405]. . , % [0046] Preferencialmente, estes iniciadores sao, mas não limitados parlicularmente a um iniciador compreendendo pelo menos 10 a 15 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma das sequências descritas nas SEQ ID Nos: 1-2 e 4-5, e suas sequências complementares. Os iniciadores de SEQ ID Nos: 1 e 2 são capazes de amplificar uma região do gene nsPl de MAYV, enquanto que os iniciadores 4 e 5 são capazes de amplificar o segmento S de OROV e OROV-like. O iniciador também pode consistir de qualquer uma das sequências de SEQ ID Nos: 1-2 e 4-5, e suas sequências complementares. [0047] A definição de sonda também é conhecida por um técnico no assunto, e inclui qualquer oligonucleotídeo que seja capaz de hibridizar com uma sequência alvo complementar cm condições de hibridização adequadas. Uma vez que a sonda é marcada, ela pode ser usada para detectar a presença de determinadas sequências nucleotídicas. As sondas podem ser preparadas na forma de fita simples de DNA, fita dupla de DNA, de RNA ou híbrido DNA-RNA. O comprimento típico de uma sonda é de 10-60 nt, preferencialmente 15-55 nt, mais preferencialmente 20-50 nt, mais preferencialmente 30-45 nt, ainda mais preferencialmente 10-30 nt. Assim, de acordo com a presente invenção, a sonda pode incluir ou compreender pelo menos 8-15 nucleotídeos consecutivos das sequências descritas nas SEQ ID Nos: 3 e 7. A sonda também pode compreender ou consistir de qualquer uma das sequências de SEQ ID Nos: 3 e 7, e suas sequências complementares.

[0048] Vários formatos de sondas podem ser utilizados para realizar uma PCR em tempo real, como as sondas marcadas com fluorescência. Mais especificamenle, as sondas podem ser do tipo FRET {fluorescence resonance energy transfer) que incluem, mas não estão limitadas a sondas do tipo TaqMan™, Molecular Beacon™, Scorpion™, e LUX™. Em uma forma de concretização preferida, as sondas de acordo com a invenção são do tipo TaqMan™.

[0049] Mais especificamente, com relação à sonda TaqMan™, um oligonucleotídeo, cuja região 5’ terminal é modificada com um fluoróforo e a região 3’ terminal é modificada com um quencher, é adicionada à reação de PCR. Também se entende que é possível ligar o fluoróforo na região 3’ terminal e o quencher na região 5’ terminal. Os produtos de reação são detectados pela fluorescência gerada após a atividade exonuclease 5’ -> 3’ da DNA polimerase. Os fluoróforos, que se referem a compostos fluorescentes que emitem luz com a excitação por luz tendo um comprimento de onda mais curto que a luz que é emitida, podem ser, mas não estão limitados a, FAM, TAMRA, VIC, JOE, TET, HEX, ROX, RED610, RED670, NED, Cy3, Cy5, e Texas Red. Os quenchers podem ser, mas não estão limitados ao, 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 e MGB-NFQ. A escolha do par ft\xoxóioxo-quencher pode ser feita de forma que o espectro de excitação do quencher tenha uma sobreposição com o espectro de emissão do fluoróforo. Um exemplo é o par FAM-TAMRA, FAM-MGB, VIC-MGB e assim por diante. Um técnico no assunto saberá reconhecer outros pares apropriados.

[0050] Em uma forma de concretização preferencial de acordo com a invenção, as propriedades de espectro de ditas sondas são escolhidas de forma que uma sonda não interfira com a outra. Em particular, quando as sondas são usadas em reações multiplex, cada sonda terá o seu próprio fluoróforo sendo espectral e significativamente diferente de outra sonda, isto é, os espectros de absorção/emissão das diferentes sondas são essencialmente não-sobrepostos. Isto permite, de forma vantajosa, a detecção de cada sonda individualmente, já que os sinais individuais não interferem uns com os outros durante a detecção.

[0051] A fluorescência emitida durante a reação de amplificação do ácido nucleico alvo é medida com o objetivo de monitorar o acúmulo de produtos de amplificação específicos. O sinal de fluorescência é proporcional à quantidade do amplicon específico produzido. Na presença das sequências alvos de MAYV e OROV / OROV-like, a fluorescência irá aumentar. Na 4 ausência das sequências alvos, a fluorescência manter-se-á consistentemente baixa ao longo da reação. Um aumento na fluorescência ou um nível inalterado de fluorescência indica a presença ou ausência dos alvos de MAYV e/ou OROV e OROV-like.

[0052] Além disto, em uma forma de concretização, para prover um padrão (controle interno) para determinar a extração do ácido nucleico de uma amostra biológica a ser testada, potencialmente compreendendo a sequência alvo de MAYV, OROV/OROV-like ou para determinar a presença ou ausência de potenciais inibidores de reação, podem-se utilizar iniciadores capazes de amplificar, e sondas capazes de detectar, amplicons resultantes da amplificação de sequências endógenas humanas. Exemplo não-limitante é utilizar iniciadores que tenham como alvo, por exemplo, os RNAs da beta-globina humana, beta-actina, RNase e GAPDH.

[0053] Em outra forma de concretização, também para prover um controle interno de falsos-negativos devido à inibição da reação ou devido a eventual mau-funcionamento do equipamento utilizado no método, pode-se fazer uso de controles inseridos no mesmo tubo de reação, como por exemplo, iniciadores capazes de amplificar sequências de RNA do bacteriófago MS2, e sondas capazes de detectar os amplicons resultantes. O fago MS2 é um organismo facilmente repicado em laboratório e sem risco biológico (GRAS), viável para controle da reação de RT-PCR ou RT-qPCR [Rolfe et al. (2007) Journal of Clinicai Virology, 39(4): 318-321; Ninove et al. (2011) PLoS ONE 6(2):el6142]. Este fago possui genoma de RNA, recoberto por um capsídeo proteico que protege o genoma viral, mimetizando o que ocorre com os vírus Mayaro e Oropouche.

[0054] Nesta forma de concretização, o controle é inserido (“spikecT) nas amostras a serem testadas. No caso de métodos para detecção de RNA, existem alguns motivos que podem favorecer a escolha deste tipo de controle, quais sejam: (a) os ácidos nucleicos alvos (MAYV, OROV e OROV-like) são vírus de genoma de RNA, portanto, a escolha de um controle4 > bioquimicamente semelhante é interessante; (b) a quantidade do controle é conhecida e colocada de forma igual em cada amostra a ser testada, permitindo facilmente avaliar a eficiência da extração de ácidos nucleicos, pois os valores de cyde threshold (Ct) são conhecidos e esperados, diferentemente do observado em controles endógenos; (c) o uso de um RNA endogenamente expresso pelo hospedeiro é possível, porém devem ser observados alguns pontos, como utilizar como alvo a junção éxon-éxon, só existente no mRNA, para não amplificar o gene; tratar a amostra com DNase; considerar os diferentes níveis de expressão do gene constitutivo endógeno e a observância da necessidade de se considerar quem fornecerá a amostra a ser analisada (por exemplo, homem, animais, vetores).

[0055] O controle inserido fspikecr) pode ser interessante quando se deseja detectar e diferenciar patógenos que circulam em diferentes organismos, porque permite uma adaptabilidade do método para diferentes espécies que se deseja testar, não exigindo o desenho de iniciadores e sondas para amplificar e detectar o controle endógeno espécie-específico.

[0056] Particularmente, estes iniciadores para amplificação do controle endógeno MS2 são, mas não limitados particularmente a um iniciador compreendendo pelo menos 10 a 15 nucleotídeos consecutivos dc qualquer uma das sequências descritas nas SEQ ID Nos: 7 e 8, e suas sequências complementares. O iniciador também pode consistir de qualquer uma das sequências de SEQ ID Nos: 7 e 8, e suas sequências complementares. Por sua vez, a sonda pode incluir ou compreender pelo menos 8-15 nucleotídeos consecutivos da sequência descrita na SEQ ID No: 9. A sonda também pode compreender ou consistir da sequência de SEQ ID Nos: 9, e suas sequências complementares. Cabe aqui salientar que um técnico no assunto pode determinar outros iniciadores e sondas adequados direcionados a outras sequências úteis para este fim. % [0057] Finalmente, para prover um controle positivo para a amplificação dos alvos e/ou para facilitar a quantificação de uma carga viral em uma dada amostra biológica a ser analisada, um controle positivo externo pode ser incorporado. Na presente invenção, pode-se utilizar uma amostra de ácido nucleico contendo cópias dos alvos de MAYV e OROV, por exemplo, um cassete ou vetor compreendendo a sequência alvo a ser amplificada, ou uma determinada quantidade de amostra de ácido nucleico proveniente de uma linhagem celular humana contendo um número conhecido de inserções de sequências virais. llustrativamente, para este fim, os inventores construíram o plasmídeo quimérico aqui denominado pOROV_MAYV (SEQ ID NO: 10), cuja representação esquemática parcial está na Figura 1.

[0058] Da mesma forma, pode-se incorporar um controle negativo de reação. Este controle pode ser uma amostra de ácido nucleico que não contenha nenhuma cópia do alvo de MAYV e nem de OROV ou OROV-like, por exemplo, amostras extraídas de linhagem celular humana que não apresente inserções de sequências virais de MAYV e nem de OROV ou OROV-like.

[0059] Um outro aspecto da invenção é um kit usado para diagnosticar, diferenciar e quantificar infecções causadas por MAYV e/ou OROV/OROV-like, de forma simultânea, compreendendo pelo menos um conjunto de oligonucleotídeos. Por “conjunto de oligonucleotídeos” entende-se qualquer combinação compreendendo pelo menos um oligonucleotídeo, preferencialmente pelo menos dois, por exemplo, de 2 a 20 oligonucleotídeos. Dito conjunto pode, por exemplo, compreender pelo menos um iniciador e pelo menos uma sonda, ou pelo menos um par de iniciadores e pelo menos uma sonda, e assim por diante. Ditos oligonucleotídeos podem ser mantidos separados, ou parcialmente misturados, ou totalmente misturados.

[0060] Preferencialmente, dito kit compreende pelo menos um conjunto de oligonucleotídeos de acordo com a invenção, desenhados especificamente para MAYV e OROV. Ditos oligonucleotídeos podem séKJ{, mantidos tanto separadamente, ou parcialmente misturados, ou tolalmente misturados. Os oligonucleotídeos podem ser providos na forma seca, ou solubilizados em um solvente adequado, de acordo com o conhecimento da arte. Por exemplo, solventes adequados incluem TE, água ultrapura, e similares.

[0061] Em uma forma de concretização, o kit de acordo com a invenção pode também conter reagentes adicionais adequados para a reação de amplificação, incluindo água, água livre de nuclease, água livre de RNase, água livre de DNase, água ultrapura, sais (tais como sais de magnésio, potássio), tampões (como os tampões convencionais de PCR, conhecidos na arte), enzimas, incluindo polimerases termoestáveis, como Taq, Vent, Pwo, Pfu, transcriptase reversa, e similares, nucleotídeos como deoxinucleotídeos, dideoxinucleotídeos, dNTPs, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dUTP, outros reagentes, como aditivos, inibidores de RNase ou DNase, e polinucleotídeos tais como poliT, polidT, e outros oligonucleotídeos, como iniciadores e sondas para outros patógenos, por exemplo, HIV, HBV, HCV, HTLV-1, outros arbovírus, como vírus da dengue, ehikungunya, zika, e para controles internos, como um controle endógeno (ex. beta-globina humana) ou um fago (ex. MS2). Os reagentes podem ser providos em uma forma concentrada para diluição para uma concentração apropriada pelo usuário final. Ainda, pelo menos parte dos reagentes pode ser provida na forma de pré-mix.

[0062] Ditos reagentes podem estar acomodados em recipientes, que para os fins da presente invenção incluem, mas não se limitam a, microtubos, tubos, placas de PCR com diferentes quantidades de poços, chips, ou qualquer outro meio adequado e inerte onde a reação de amplificação possa ocorrer, e que não reaja com os fluidos e soluções da presente invenção. Além disto, o recipiente pode ser ainda rotulado e identificado, por exemplo, com cores, para evitar a confusão e prover facilidade de uso para um técnico no laboratório.

[0063] Ainda, em uma forma de concretização, o kit de acordo com a invenção contém instruções para o uso do mesmo. Ditas instruções podem estar em um folheto, cartão, ou similares. Ditas instruções podem estar sob duas formas: uma detalhada, trazendo informações exaustivas com relação ao kit e ao uso do mesmo, possivelmente também incluindo dados de literatura; e outra simples, na forma de um guia rápido, trazendo informações essenciais necessárias para o uso do kit.

[0064] Em uma forma preferida, dito kit é um kit de diagnóstico, especialmente um kit de diagnóstico in vitro, por exemplo, um kit de diagnóstico de arbovírus. Mais preferencialmente, o dito kit é um kit para diagnóstico e diferenciação de MAYV e OROV/OROV-like.

[0065] Em outra forma de concretização da presente invenção, o kit diagnóstico pode ainda incluir um kit para extração e isolamento de ácidos nucleicos a partir de uma amostra biológica. Dito kit para extração pode compreender um tampão de lise, um tampão de lavagem e um tampão de eluição. O kit de extração pode ainda ser provido com recipientes vazios e colunas de adsorção para extração e isolamento de ácidos nucleicos.

Extração do ácido nucleico a partir de amostras biológicas [0066] Polinucleotídeos de arbovírus, mais especificamente, MAYV e OROV/OROV-like, são os alvos ou a fonte do alvo para a reação de amplificação da presente invenção. A expressão “sequência alvo”, ou simplesmente “alvo”, se refere a uma sequência de ácido nucleico que serve como um molde para a amplificação em uma reação de PCR. Estas sequências de ácido nucleico podem conter deoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e/ou seus análogos. A sequência pode ser um gene ou fragmento de gene, mRNA, cDNA, DNA total isolado, RNA total isolado, e similares. Exemplos de sequências alvos incluem, mas não estão limitados a, DNA do provírus integrado de MAYV, OROV e OROV-like, cDNA de % MAYV, OROV e OROV-like presente em uma célula antes da integração^ viral no genoma do hospedeiro, RNA viral extraído de partículas virais ou a partir de células hospedeiras durante a replicação viral, transcritos de RNA primários de MAYV, OROV e OROV-like, mRNA processado por splicing, etc.

[0067] Mais especificamente, as sequências alvos da presente invenção estão são transcritas a partir do gene nsPl de MAYV e do segmento S de OROV e OROV-like.

[0068] Além disto, é possível utilizar uma sequência alvo humana como padrão ou controle da extração do ácido nucleico de uma amostra biológica. Exemplo não-limitante de alvo controle é o gene da beta-globina humana. Outra possibilidade é o uso de controle inserido (“spiked"), como o fago MS2. O técnico no assunto certamente saberá determinar outros alvos controles adequados.

[0069] Em uma concretização, a sequência alvo está presente em uma amostra de material biológico coletada a partir de um indivíduo. Por “amostra”, portanto, entende-se qualquer substância ou material biológico que possa conter um MAYV, OROV e/ou OROV-like, uma célula infectada pelo MAYV, OROV e/ou OROV-like, ou uma sequência alvo de MAYV, OROV e/ou OROV-like, e inclui, mas não está limitada a, sangue, plasma, soro, células sanguíneas, fluido seminal, secreções vaginais, leite materno, saliva, e similares. Mais preferencialmente, a amostra compreende ou consiste de células sanguíneas humanas e/ou sangue total.

[0070] Os procedimentos para a extração e purificação de ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Exemplos de métodos para extrair ácidos nucleicos a partir de sangue total são ensinados, por exemplo, em Casareale et al. (Genome Res., 2: 149-153, 1992) e na Patente U.S. n° 5,334,499. (0071] Além disto, vários kits comerciais estão disponíveis para o χ, isolamento de ácidos nucleicos a partir de sangue total. Exemplos de kits\ incluem, mas não estão limitados a, QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen); Spin Plus ReliaPrep™ Blood gDNA Miniprep System (Promega) e BIOPUR Kit Extração Mini Spin Plus (Biopur).

Amplificação de sequências alvos por PCR e métodos de diagnóstico [0072] Uma vez que os iniciadores estão preparados, a amplificação de ácido nucleico alvo pode ser realizada por uma variedade de métodos, incluindo, mas não se limitando a, PCR convencional, PCR em tempo real, RT-PCR, nested-PCR, PCR semi-quantitivo e outros. De forma preferencial, o método utilizado é PCR em tempo real.

[0073] "Amplificação" refere-se aos procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos utilizando iniciadores e polimerases que geram múltiplas cópias de um ácido nucleico alvo. Tais reações de amplificação são conhecidas pelo técnico no assunto como “PCR” (reação em cadeia da polimerase), que por sua vez, inclui, para fins desta invenção, qualquer método baseado em PCR, incluindo PCR convencional, qualitativo, semi-quantitativo, em tempo real, reação de transcrição reversa (RT-PCR), PCR singleplex, multiplex, e similares.

[0074] Um “amplicon” ou “produto de PCR”, os termos sendo usados de forma intercambiável, referem-se ao um ácido nucleico (ou coletivamente, a pluralidade de moléculas de ácido nucleico) que foi sintetizado durante os procedimentos dc amplificação. Um amplicon é tipicamente, mas não exclusivamente, um fragmento de DNA.

[0075] Por “transcrição reversa” (RT) entende-se o fenômeno em que uma cópia de cDNA é produzida a partir de uma molécula de RNA. O cDNA resultante pode ser usado como molde para PCR.

[0076] Por “RT-PCR” compreende-se uma reação em que uma molécula de RNA é transcrita reversamente para produzir um produto (cDNA) e o cDNA é subsequentemente amplificado em uma reação de PCR. r\UD Λ- Tipicamente, tanto a transcrição reversa quanto as reações de PCR da reação de RT-PCR são realizadas em um único tubo.

[0077] Por “PCR quantitativo” (qPCR), entende-se qualquer método baseado em PCR que permita a estimativa da quantidade inicial de uma determinada sequência alvo em uma dada amostra.

[0078] Por “PCR em tempo real” compreende-se qualquer método baseado em PCR que permita monitorar a fluorescência emitida durante a reação, como um indicador da produção do produto de PCR ou amplicon durante cada ciclo de PCR, ao contrário da detecção ao final da realização de todos os ciclos nos métodos de PCR convencionais.

[0079] Como usado aqui, “PCR multiplex''1 refere-se a qualquer reação de PCR que tenha por objetivo a amplificação simultânea de mais de um alvo. Por exemplo, a PCR multiplex inclui PCR hiplex (dois alvos), PCR tríplex (três alvos), e assim por diante. PCR multiplex inclui reações de PCR com mais do que um par de iniciadores, por exemplo, dois pares de iniciadores. Neste caso, poderá haver quatro iniciadores diferentes, mas também é possível que haja um iniciador em comum, por exemplo, o iniciador forward, e dois iniciadores reversos distintos. PCR multiplex também inclui reações de PCR com um único par de iniciadores, mas com mais de uma sonda. Ainda, como exemplos não limitantes, a amplificação multiplex inclui reações de amplificação de diferentes genes, diferentes alelos de um único gene e/ou diferentes fragmentos de um único gene.

[0080] Um “tampão” é uma composição adicionada à reação de amplificação, compreendendo um agente tamponante, que modifica a estabilidade, atividade e/ou longevidade de um ou mais componentes da reação de amplificação, através da regulagem do pH da reação de amplificação. Os agentes tamponantes da invenção são compatíveis com a atividade da polimerase a ser utilizada, qual seja, uma DNA polimerase. Agentes tamponantes são bem conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitados a Tris, Tricina, MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propano-sulfônico), e HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperazina-etanosulfônico).

[0081] Além disto, os tampões de PCR podem geralmente conter até cerca de 70 mM KC1 e cerca de 1,5 mM ou mais de MgC12, a cerca de 50-500 μΜ de cada um dos nucleotídeos dATP, dCTP, dGTP e dTTP.

[0082] Os tampões da invenção podem ainda conter aditivos. Um aditivo é um composto adicionado a uma composição que modifica a estabilidade, a atividade e/ou a longevidade de um ou mais componentes da composição. Em algumas concretizações, a composição é uma composição de amplificação. Em algumas concretizações, um aditivo inativa enzimas contaminantes, estabiliza o dobramento de proteínas e/ou diminui a agregação. De acordo com a invenção, aditivos podem ser adicionados para melhorar a seletividade do anelamento de um iniciador e/ou de uma sonda, desde que o aditivo não interfira com a atividade da DNA polimerase.

[0083] Exemplos de aditivos são, mas não estão limitados a, betaína, glicerol, formamida, KC1, CaCI2, MgOAc, MgC12, NaCI, NH4OAc, NaI, Na(CO3)2, LiCl, MnOAc, NMP, trealose, DMSO, etileno glicol, ditiotreitol (“DTT”), pirofosfatase (incluindo, mas nào limitado a pirofosfatase inorgânica de Thermoplasma acidophilum ("TAP")), albumina de soro bovino (“BSA”), propileno glicol, glicinamida, CHES, Percoll™, ácido aurintricarboxílico, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO, Mackernium, LDAO (N-dodecil-N,N-dimetilamino-N-óxido), Zwittergente 3-10, Xwittergente 3-14, Xwittergente SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, SSB de E. coli, RecA, 7-deazaG, dUTP, UNG, detergentes aniônicos, detergentes catiônicos, detergentes não-iônicos, zwittergente, esteróis, cátions, e quaisquer outros químicos, proteínas, ou cofatores que podem alterar a eficiência da amplificação.

[0084] Como aqui usado, o termo “termoestável”, quando aplicado à enzima, refere-se a uma enzima que retém sua atividade biológica em temperaturas elevadas (por exemplo, a 55°C ou mais), ou retém sua atividade biológica após ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento. Polimerases de nucleotídeos termoestáveis são particularmente preferidos para a presente invenção, uma vez que eliminam a necessidade de adicionar enzima antes de cada ciclo dc PCR.

[0085] A “atividade de polimerase” refere-se a uma atividade enzimática que catalisa a polimcrização de deoxirribonucleotídeos. Geralmente, a enzima irá iniciar a síntese na extremidade 3’ do iniciador anelado à sequência alvo, e irá prosseguir em direção à extremidade 5’ da fita molde. Em determinadas concretizações, essa enzima é uma DNA polimerase termoestável.

[0086] Exemplos não limitantes de DNA polimerases termoestáveis incluem, mas não se limitam a, polimerases isoladas de Thermus aquaticus (Taq polimerase), Thermus thermophilus (Tth polimerase), Thermococcus litoralis (Tli ou VENT™ polimerase), Pyrococcus furiosus (Pfu ou DEEPVENT™ polimerase), Pyrococcus woosii (Pwo polimerase) e outras espécies de Pyrococcus, Bacillus stearothermophilus (Bst polimerase), Sulfolobus acidocaldarius (Sac polimerase), Thermoplasma acidophilum (Tac polimerase), Thermus rubber (Tru polimerase), Thermus brockianus (DYNAZYME™ polimerase) (Tne polimerase), Thermotoga maritime (Tma) e outras espécies de Thermotoga genus (Tsp polimerase), e \4ethanobacterium thermoautotrophicum (Mth polimerase).

[0087] A reação de PCR pode conter mais do que uma enzima polimerase termoestável com propriedades complementares, resultando em amplificação mais eficiente das sequências alvos. Por exemplo, uma polimerase com alta habilidade de amplificar segmentos grandes de nucleotídeos pode ser complementada com outra polimerase com capacidade de corrigir erros ocorridos durante a elongação da sequência de ácido nucleico <3f alvo, assim criando uma reação de PCR que pode amplificar uma sequência alvo longa com alta fidelidade. A polimerase termoestável pode ser usada em sua forma selvagem, ou, alternativamente, a polimerase pode ser modificada para conter um fragmento de uma enzima ou para conter uma mutação que forneça propriedades benéficas para facilitar a reação de PCR. Em uma concretização, a polimerase pode ser a Taq polimerase. Muitos variantes da Taq polimerase com propriedades melhoradas são conhecidas e incluem, mas não são limitadas a AmpliTaq™, fragmento Stoffel, SuperTaq™, SuperTaq™ plus, LA Taq™, LApro Taq™, e EX Taq™.

[0088] Como já mencionado mais acima, a expressão “condições de hibridização” refere-se às condições que permitem que o iniciador ou sonda se anelem à sequência nucleotídica de interesse. Estas condições são dependentes da temperatura e da força iônica da solução na qual a hibridização ocorre. Estas são as condições de estringência. Como é compreendido por um técnico no assunto, a estringência de anelamento pode ser alterada de forma a identificar ou detectar sequências de polinucleotídeo idênticas ou relacionadas. Como será apreciado por um técnico no assunto, a temperatura de melting, Tm, pode ser calculada por fórmulas conhecidas na arte, dependendo de diversos parâmetros, como o comprimento do iniciador ou sonda em número de nucleotídeos, ou ingredientes presentes no tampão e condições. Para tanto, ver, por exemplo, T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982 e J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). [0089] De forma ilustrativa, para a determinação de condições de hibridização, basicamente as seguintes fórmulas são usadas: para o cálculo básico de Tm para sequências mais longas que 13 nt, a seguinte fórmula pode ser usada: ■<, <sr em que “w”, “x”, “y” e “z” são os números de bases A, T, G e C riáK sequência, respectivamente (Marmur e Doty. J Mol Biol 5:109-118, 1962). Esta equação assume que o anelamento ocorre sob condições padrões de 50 nM iniciador, 50 mM Na+, e pH 7,0.

[0090] Para o cálculo básico de Tm ajustado por sal, a seguinte equação pode ser usada: em que “w”, “x”, “y” e “z” são os números de bases A, T, G e C na sequência, respectivamente.

[0091] O termo 16.6*loglO([Na+]) ajusta a Tm para mudanças na concentração de sal (vide para informações adicionais, por exemplo, Howley et al., J. Biol. Chem. 254, 4876-4883, 1979).

[0092] As faixas de temperatura de anelamento podem variar de cerca de 50°C e 65°C, mas os iniciadores podem ser desenhados para serem ótimos em cerca de 58°C a 62°C. Uma consideração adicional ao desenhar os iniciadores é o conteúdo de guanina e de citosina. Geralmente, o conteúdo de GC para um iniciador pode ser de cerca de 30-70%, mas pode ser menor e pode ser ajustado de forma apropriada por um técnico no assunto. O anelamento de oligonucleotídeos complementares ou parcialmente complementares a um determinado alvo pode ser obtido pela modificação das condições de anelamento visando o aumento ou diminuição da estringência, por exemplo, ajustando a temperatura ou a concentração de sal no tampão. Tais modificações para manter a especificidade ao vírus Oropouche (OROV), vírus Oropouche-like (OROV-like) e/ou vírus Mayaro (MAYV) podem ser realizadas de forma rotineira por um técnico no assunto.

[0093] Para a amplificação, um par de iniciadores de um tipo específico pode ser usado sozinho (por exemplo, um iniciador forward e um iniciador reverse de vírus Oropouche (OROV); um iniciador forward e um iniciador reverse de vírus Mayaro (MAYV); ou um iniciador fonvard e um ou dois iniciadores reversos de vírus Mayaro (MAYV), e assim por diante). A amplificação multiplex pode ser usada para amplificar regiões de vírus Oropouche (OROV), vírus Oropouche-like e vírus Mayaro de forma concomitante. As concentrações finais dos iniciadores podem ser ajustadas de forma apropriada, variando de cerca de 50 nM a cerca de 2000 nM, preferencialmente de cerca de 100 nM a cerca de 1000 nM, mais preferencial mente de cerca dc 200 nM a cerca de 600 nM, mais preferencialmcnte de cerca de 250 nM a cerca de 500 nM, de cada um dos iniciadores representados por SEQ ID Nos: 1-2, 4-5.

[0094] As concentrações finais das sondas também podem ser ajustadas de forma apropriada por um técnico no assunto, variando de cerca de 50 nM a 1000 nM. Mais preferencialmente, a concentração final varia de cerca de 100 cerca de 300 nM, mais preferencialmcnte, de 150 a 250 nM de cada uma das sondas representadas por SEQ ID Nos: 3 e 6.

[0095] Em um outro aspecto da invenção, é provido um método para detectar a presença de vírus Oropouche (OROV), vírus Oropouche-like e/ou vírus Mayaro, de forma simultânea, a partir de ácidos nucleicos extraídos dc uma amostra biológica, compreendendo a etapa dc misturar em um recipiente adequado os dNTPs, a DNA polimerase, tampão, pelo menos um iniciador e pelo menos uma sonda conforme descritos no presente pedido, o ácido nucleico extraído da amostra biológica, e submeter o recipiente contendo a mistura a incubação em um termociclador.

[0096] Em um outro aspecto, a invenção provê um método para detectar a presença de vírus Oropouche (OROV), vírus Oropouche-like e vírus Mayaro, compreendendo realizar uma reação de polimerase em cadeia usando pelo menos um ou um conjunto de iniciadores selecionados do grupo de iniciadores forward de SEQ ID Nos: 1 e 4, e pelo menos um ou um conjunto de iniciadores selecionados do grupo de iniciadores reversos de SEQ % ID Nos: 2 e 5.0 técnico no assunto tem conhecimento das condições de reação de PCR, em particular, as condições de ciclagem termal, por exemplo, temperaturas, duração, número de ciclos, taxa de aquecimento/resfriamento, etc. Em uma concretização preferida, as condições de reação de PCR incluem condições adequadas para uma PCR multiplex. Em uma outra concretização preferida, ditas condições incluem aquelas adequadas para uma PCR multiplex quantitativa em tempo real. Em outra concretização, dito método compreende a etapa de colocar a amostra na presença de sonda(s) em condições adequadas ao anelamento de dita(s) sonda(s) ao amplicon.

[0097] Em outra concretização preferida, o método compreende a etapa de detectar pelo menos um amplicon em tempo real, permitindo a avaliação da presença ou ausência de vírus Oropouche (OROV), vírus Oropouche-like e/ou vírus Mayaro na amostra. Isto é atingido de forma vantajosa pelas medições de intensidade de fluorescência.

[0098] Os procedimentos de medição de fluorescência são conhecidos na arte. Resumidamente, a amostra é iluminada em cerca da onda de excitação do fluoróforo, e a intensidade de emissão é medida. Em outra concretização, dito método compreende a etapa de medir pelo menos uma vez, e mais preferivelmente em tempo real, a quantidade de sonda que se anela ao amplicon. Em outra concretização preferida, dito método compreende a etapa de estimar pelo menos uma vez o número de cópias do alvo inicialmente presente na amostra. O técnico no assunto sabe como realizar dita etapa. Por exemplo, isto pode ser realizado usando padrões de calibração e/ou controles internos. Preferivelmente, esta etapa inclui a determinação do chamado cycle threshold (Ct) para cada amostra, que correlaciona com o número de cópias do alvo molde inicialmente presente em cada amostra.

[0099] Em uma concretização preferida, pelo menos uma etapa, preferencialmente várias etapas, mais preferencialmentc a maioria das etapas, é realizada em uma placa de PCR, incluindo aquelas com 24 poços, 48 poços, 96 poços e 384 poços. O uso de placas garante, de forma vantajosa, que as amostras possam ser processadas em paralelo durante a reação. Além disto, permite que o método seja realizado em larga escala, o que economiza tempo. [00100] Em outra forma preferida, pelo menos uma etapa, preferivelmente várias etapas, mais preferivelmente a maioria das etapas é realizada em um termociclador. Dito termociclador pode ser equipado com um espectrofluorofotômelro, por exemplo, Mx3000p (Stratagene), Chromo 4 (BioRad), RocheLightcycler 480, ABI 7900, 7500 e 7300r Real-time PCR Systems (Applied Biosystems).

[00101] Os iniciadores da presente invenção para a detecção e diferenciação de vírus Mayaro, vírus Oropouche (OROV) / vírus Oropouche-like estão identificados na Tabela 1 como SEQ ID Nos: 1-2 e 4-5, respectivamente. Estes iniciadores foram desenhados de forma a anelarem em uma região localizada no vírus Oropouche (OROV), vírus Oropouche-like e/ou vírus Mayaro.

[00102] A presente invenção é ilustrada pelos exemplos abaixo, que têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma. As várias modificações ou sugestões à luz dos mesmos que podem ser sugeridas por um técnico no assunto estão incluídas no espírito e no escopo das reivindicações. Em particular, apesar de serem adequados para a detecção via protocolos multiplex e/ou em tempo real, os métodos, oligonucleotídeos, conjuntos de oligonucleotídeos e kits da presente invenção são, obviamente, também adequados para protocolos singleplex, duplex, tríplex e similares, qualitativo, quantitativo, PCR convencional e combinações dos mesmos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Análise in silico para definição da região alvo - Desenho dos iniciadores e sondas [00103] Para definição da região gênica viral foram realizados·, alinhamentos múltiplos com as sequências de genoma total do MAYV e do segmento S completo de OROV disponíveis à época do depósito no banco GenBank, sendo um alinhamento para cada vírus alvo, usando o Software ClustalX [Jeanmougin et al. (1998) Trends Biochem. Sei., 23(10): 403-405]. [00104] Regiões conservadas foram selecionadas e analisadas para o desenho dos iniciadores e sondas com Primer Express™ 3.0 (Applied Biosystems, Thermo Scientific, CA, USA), sob parâmetros padrão.

[00105] Dois conjuntos de iniciadores e sondas foram desenhados, de acordo com as penalidades mais baixas no score do Primer Express™ 3.0, e lendo como alvos a sequência codificante de NSP1 de MAYV e o segmento S de OROV.

[00106] Os conjuntos de iniciadores selecionados foram também submetidos a uma análise de Primer-BLAST [Ye et al. (2012) BMC Bioinformatics, 13:134] contra o banco de dados GencBank inteiro, sob parâmetros padrão, exceto o tamanho mínimo do produto de PCR (50bp), e para especificidade do par de iniciador: banco (nr) e organismo (all).

[00107] Uma terceira sonda TaqMan foi desenhada como descrito acima, tendo como alvo o gene da proteína do capsídeo (cp) do fago MS2 de Enterobacteria (ATCC 15597-B1), usado como o controle positivo interno (Tabela 1).

[00108] O sistema MGB (minor groove binder) foi utilizado para o desenho das sondas.

[00109] Os iniciadores e sondas TaqMan™ dirigidos para as regiões virais escolhidas mostraram-se adequados. As sequências nucleotídicas dos iniciadores e sondas aqui usados são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Iniciadores e sondas para a detecção do OROV, OROV-like e MAYV._________________ ______________ Os números de início/fim referem-se à posição de nucleotídeo das sequências dc referência no GenBank de NSP2 de MAYV, segmento S dc OROV e do fago MS2 de Enterobacteria (NC Ü03417.1; NC_0()5777.1 e NC_001417.2, respectivamente). O último dígito em cada nome de iniciador identifica o iniciador forward (F) ou reverse (R), assim como (P) identifica a sonda. • Os oligonucleotídeos foram otimizados para funcionar a aproximadamente 60°C, de acordo com o software Primer Express 3.0.

[00110] Na Tabela 1, a sonda de SEQ ID NO: 3 foi marcada com VIC na extremidade 5’ e MGB na extremidade 3’, a sonda de SEQ ID NO: 6 foi marcada com FAM na extremidade 5’ e MGB na extremidade 3’ e a sonda de SEQ ID NO: 9 foi marcada com NED na extremidade 5’e MGB na extremidade 3’. O amplicon gerado para OROV/OROV-like tem 63 pares de bases e para MAYV, 60 pares de bases.

Exemplo 2: Controle positivo externo [00111] Uma vez que os iniciadores e sondas foram escolhidos, um controle positivo externo compreendendo ambas as regiões alvo de MAYV e OROV (Figura 1) foi obtido. Tal controle positivo externo é um plasmídeo quimérico, que foi denominado pOROVMAYV. O alvo da RT-qPCR está localizado a jusante do sítio do promotor T7 RNA polimerase, que permite obter moléculas de RNA quiméricos contendo ambos os alvos com o Kit TranscriptAid™ T7 High Yield Transcription (Fermentas UAB, Thermo Scientific, Vilnius, Lituânia), de acordo com as instruções do fabricante. [00112] Antes da transcrição de RNA z« vitro, o inserto, assim como o sítio do T7, foram amplificados (tamanho do amplicon: 925 pb) para limitar o tamanho do molde para aumento da transcrição de RNA in vitro.

[00113] Os amplicons gerados foram precipitados com polietileno glicol 8000 para biologia molecular (20% p/v) (Promega, WI, USA) para remoção de iniciadores e dNTPs. RNA transcrito in vitro digerido com DNase foi quantificado com o Kit QubitR RNA HS Assay em Fluorômetro QubitR 2.0 (Invitrogen, Thermo Scientific, CA, USA). A quantificação dBfy RNA e sua sequência foram usados para calcular o exato número de cópias do alvo com auxílio de servidor Endmemo em http://www.endmemo.com/bio/dnacopynum.php. O RNA transcrito m vitro foi usado em todas as etapas de otimização do protocolo, incluindo a titulação de iniciadores e sondas.

Exemplo 3: Produção de controles negativos [00114] Para o controle negativo das reações de qPCR, pode-se obter amostras biológicas obtidas a partir de candidatos à doação de sangue, que sejam comprovadamente negativas para os vírus pesquisados (por exemplo, não devem apresentar reatividade sorológica a teste imunoenzimático para os vírus e, tampouco, apresentar resultado de amplificação (PCR) positiva). As amostras biológicas podem ser misturadas para formar um pool, aliquotadas em tubos de polipropileno de 1,5 mL de maneira que cada tubo permaneça com um volume determinado e armazenadas a -20°C. A cada extração de DNA das amostras biológicas a serem examinadas de acordo com a presente invenção, o controle negativo pode ser incluído no processo.

Exemplo 4: Controle interno de amplificação (Cl) [00115] O controle interno (Cl) é uma sequência de DNA que está presente na mesma reação de qPCR, na qual as amostras teste são amplificadas. Esta sequência é co-amplificada simultaneamente com a sequência alvo e tem como objetivo monitorar todo o processo, desde a extração de ácidos nucleicos até a análise final dos dados, validando as reações negativas e demonstrando a presença de inibidores ou falhas nos processos pré-analíticos e analíticos das amostras. Para tanto, pode-se utilizar como Cl um alvo endógeno, como por exemplo, o gene da beta-globulina. Pode-se também fazer uso de controles internos a serem inseridos no mesmo tubo de reação, como por exemplo, sequências de RNA do bacteriófago MS2. Exemplo 5: Reações de RT-qPCR '•f ’ / [00116] Foi utilizado o TaqManR Fast Virus 1-Step master mix (Applied Biosystems) para amplificações de RT-qPCR com os parâmetros de ciclagem recomendados, 50°C durante 5 minutos para a transcrição reversa, 95°C durante 20 segundos para a inativação da RT/desnaturação inicial, seguido por 45 ciclos de 95°C por 3 segundos e 60°C por 30 segundos.

[00117] 2 microlitros de RNA obtidos no Exemplo 2 foram utilizados como molde em uma reação de 20pL, e todos os ensaios foram realizados em StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems). A eficiência do ensaio de amplificação foi calculada pelo método de curva padrão [Svec et al. (2015) Biomol Detect Quantif., 3: 9-16] usando uma diluição seriada de 10 vezes, 8-log, começando em 2x10s cópias de RNA/μΙ, cada ponto em duplicata.

Exemplo 6: Análise de especificidade analítica [00118] A especificidade analítica corresponde à habilidade do teste em identificar exclusivamente a substância alvo ou organismo ao invés de substâncias ou organismos semelhantes em uma amostra. Para tanto, testes in vitro e in silico foram realizados.

[00119] Para as análises in vitro, as especificidades de iniciadores e sondas foi avaliada contra um painel de arbovírus de RNA no Laboratório de Referência Nacional para Arbovírus, no Instituto Evandro Chagas.

[00120] O RNA viral de MAYV e OROV, assim como de outros 15 arbovírus de três famílias diferentes: Flaviviridae (vírus da dengue sorotipos 1, 2, 3 e 4, vírus Ilhéus, vírus Rocio, vírus Saint Louis, e vírus Zika); Togaviridae (vírus Chikungunya, vírus Trocara, e vírus da encefalite equina do leste) e Bunyaviridae (vírus Caraparu, vírus Catu, vírus Icoaraci, vírus Jatobal , vírus Tacaiuma, vírus Trocara e vírus Utinga) foram extraídos, de cérebro ou fígado de camundongos em amamentação previamente infectados, com Trizol LS (Invitrogen) conforme recomendações do fabricante.

[00121] Além disto, foram utilizados sobrenadantes de cultura de linhagens celulares não-infectados (C6/36 e Vero), comumente utilizadas para isolamento de arbovírus.

[00122] Não foi observada amplificação usando-se como molde para o RT-qPCR o sobrenadante e o RNA dos vírus acima identificados, exceto para o vírus Jatobal, um OROV reordenado (isto é, um vírus que após um evento de reagrupamento genético passou a carrear o segmento S do vírus Oropouche), que foi amplificado com o conjunto de iniciadores para OROV. [00123] Nestas amostras negativas, apenas a curva para amplificação do MS2 foi consistentemente observada.

[00124] Os vírus da família Bunyaviridae, possuem um genoma segmentado incluindo três segmentos de RNA nomeados L (large), M (médium) e S (small). Esta característica de genoma segmentado, também encontrado em influcnza e reovírus, dá a estes vírus a chance de se modificar via reordenação de segmentos, que pode culminar com a geração de novos vírus [Briese et al. (2013) Virology, 446(1-2): 207-216]. Este fenômeno foi observado em pelo menos quatro vírus desta família que têm o segmento S de OROV. Portanto, o vírus semelhante a OROV (OROV-like) Jatobal, que tem um segmento S com mais de 95% de similaridade com o protótipo OROV [Saeed et al. (2001) Virus Res., 77(1): 25-30], o vírus Madre de Dios [Ladner et al. (2014) J Gen Virol., 95(5): 1055-1066], o vírus Iquitos [Aguilar et al. (2011) PLoS Negl Trop Dis., 5(9): el315] e o vírus Perdoes [Tilston-Lunel et al. (2015), J Gen Virol., 96(7): 1636-1650], que compartilham os segmentos S e L de OROV, podem também ser amplificados pelos iniciadores e detectados pelas sondas conforme aqui apresentados.

[00125] A validação in silico foi realizada pelo confronto das sequências dos iniciadores contra um banco de dados público, a fim de verificar possíveis homologias com outros organismos.

[00126] A análise por Primer-BLAST com os iniciadores de OROV resultou em 104 sequências de OROV com pareamento perfeito, assim como outras 10 sequências de vírus Jatobal, vírus Iquitos, vírus Madre de Dios e vírus Perdoes sem nenhuma falta de pareamento de base. Outras 36 sequências de OROV mostraram uma ou duas faltas de pareamento de base relacionado com as sequências dos iniciadores. Com relação aos iniciadores de MAYV, a análise de Primer-BLAST retornou 37 sequências com pareamento perfeito e 12 com uma falta de pareamento de base. Para ambos os conjuntos de iniciadores de OROV e MAYV, não foi observado pareamento inespecífico.

[00127] As reações não apresentaram reatividade cruzada com os tipos virais testados e os resultados acima demonstram que os iniciadores da invenção são adequados para o ensaio.

Exemplo 7: Análise de sensibilidade [00128] Após as etapas de otimização para determinar as melhores concentrações de iniciadores e sondas, foram utilizados 300nM de cada iniciador e lOOnM de cada sonda TaqMan MGB.

[00129] De acordo com os resultados de curva padrão, e considerando como positivo um valor de cyde threshold (Ct) menor que 38, o ensaio multiplex mostrou limite de detecção entre 2 e 20 cópias (valor de Ct médio 34.9 - 38.3 e 34.8 - 38.1 para MAYV e OROV, respectivamente). Não foi observada perda de sensibilidade no formato multiplex em comparação com as reações em formato singleplex. De fato, as eficiências de amplificação de ambos MAYV e OROV mostraram excelentes resultados e reprodutibilidades no formato multiplex (Figura 2).

[00130] Os resultados mostraram que o ensaio é preciso e altamente sensível, com uma eficiência de amplificação superior a 98% para ambos os alvos e um limite de detecção entre 2 a 20 cópias.

Exemplo 8: Testes com amostras de pacientes [00131] 584 amostras de pacientes com quadro clínico sugestivo de infecção por arbovírus (isto é, pacientes apresentando sintomas como febre, exantema, mialgia e cefaleia) foram testadas quanto a infecção por MAYV e OROV utilizando a invenção aqui reivindicada.

[00132] O plasma desses pacientes foi utilizado inicialmente para extração de RNA com o QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen - Cat No./ID: 52906) seguindo orientações do fabricante. Posteriormente, estes RNAs foram submetidos à reação de PCR em tempo real para o diagnóstico de MAYV e OROV utilizando os conjuntos de iniciadores e sondas aqui reivindicados. Dentre as 584 amostras testadas, 82 foram positivas para OROV e 2 para MAYV.

[00133] Visando confirmar os dados obtidos acima, 10 amostras positivas para Oropouche (ou Oropouche-like), escolhidas de forma aleatória, e as duas amostras positivas para Mayaro, foram submetidas à reação de sequenciamento nucleotídico. As 10 amostras positivas para Oropouche, foram inicialmente amplificadas por um protocolo de PCR convencional, também desenvolvido pelos presentes inventores, e submetidas ao sequenciamento capilar. As sequências obtidas foram utilizadas para uma busca em bases de dados internacionais (GenBank, DDBJ e EMBL) através da ferramenta BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Os resultados destas análises comprovaram indubitavelmente se tratar de amostras do vírus Oropouche, ou um outro Bunyavírus que contém o segmento S do vírus Oropouche (Oropouche-like).

[00134] Não houve sucesso no sequenciamento das amostras positivas para Mayaro, uma vez que não foi observada amplificação por protocolos de PCR convencional, etapa necessária antes da reação de sequenciamento. No entanto, os valores de Ct (“cycle threshold”), detectados com a utilização do da metodologia aqui reivindicada, eram tardios (35,8 e 36,2), compatíveis com amostras de baixa carga viral, e na fase de remissão da doença. A baixa carga viral pode explicar a baixa sensibilidade em ensaios de PCR convencional. θ' q, J00135] Os resultados obtidos comprovaram a capacidade de detecção^ de MAYV e OROV/OROV-like a partir de amostras clínicas, utilizando a metodologia reivindicada. Ainda, importa enfatizar que a mesma se apresentou específica para os alvos e sensível, detectando os alvos inclusive em amostras com baixa carga viral. Tais resultados comprovam a aplicabilidade e a vantagem técnica da metodologia reivindicada para o uso com amostras de sangue e/ou outros fluidos coletados de pessoas com suspeita de infecção por arbovírus.

[00136J É evidente que os exemplos acima foram apresentados apenas em caráter ilustrativo, e que modificações e variações dos mesmos, óbvias para os técnicos no assunto, são consideradas como inclusas no escopo da presente invenção, tal como definida nas reivindicações a seguir. % REIVINDICAÇÕES

Claims (14)

1. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de ser capaz de se ligar à região do gene nsPl de Vírus Mayaro (MAYV) e ser adequado como iniciador, dito oligonucleotídeo compreendendo pelo menos de 10 a 15 nucleotídeos consecutivos das sequências selecionadas de SEQ ID Nos: 1 e 2.

2. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de ser capaz de se ligar ao segmento S de Vírus Oropouche (OROV) e Vírus semelhante a Oropouche (OROV-like) e ser adequado como iniciador, dito oligonucleotídeo compreendendo pelo menos de 10 a 15 nucleotídeos consecutivos das sequências selecionadas de SEQ ID Nos: 4 e 5.

3. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de ser capaz de ser ligar à região do gene nsPl de Vírus Mayaro (MAYV) e ser adequado como sonda, dito oligonucleotídeo sonda compreendendo pelo menos de 8 a 15 nucleotídeos consecutivos da sequência selecionada de SEQ ID No: 3.

4. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de ser capaz de ser ligar ao segmento S de Vírus Oropouche (OROV) e Vírus semelhante a Oropouche (OROV-like) e ser adequado como sonda, dito oligonucleotídeo sonda compreendendo pelo menos de 8 a 15 nucleotídeos consecutivos da sequência selecionada de SEQ ID No: 6.

5. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de ser marcado com uma marcação detectável, preferencialmente, um grupamento fluorescente.

6. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato e que o grupamento fluorescente compreende um par de fluoróforo doador e um quencher.

7. Conjunto de oligonucleotídeos, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos dois oligonucleotídeos selecionados de sequências compreendendo SEQ ID Nos: 1-6.

8. Método para detecção simultânea de MAYV, OROV e % OROV-like, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) produzir pelo menos um amplicon usando pelo menos dois oligonucleotídeos, ditos oligonucleotídeos como definidos nas reivindicações 1 e 2, e b) detectar o amplicon através de pelo menos uma sonda como definida nas reivindicações 3 e 4.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de produzir pelo menos um amplicon compreende pelo menos um de amplificação por PCR multiplex, quantitativo, ou em tempo real.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de permitir discriminar entre infecções por MAYV c OROV/OROV-like.

11. Kit para diagnóstico e discriminação de infecção por MAYV e OROV/OROV-like, caracterizado pelo fato de compreender: a) pelo menos um oligonucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-2; e/ou b) pelo menos um conjunto de oligonucleotídeos como definido em qualquer uma das reivindicações 3-4; e c) opcionalmente, instruções para uso.

12. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de adicionar incluir oligonucleotídeos iniciadores e sondas capazes de amplificar e discriminar vírus que não MAYV e OROV/OROV-like.

13. Kit de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os vírus que não MAYV e OROV/OROV-like são selecionados de vírus da dengue, vírus da zika, vírus da febre amarela e vírus da chikungunya.

14. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-13, caracterizado pelo fato de ainda incluir um controle negativo e/ou um controle positivo de reação.