CN102952897A

CN102952897A - 一种风疹病毒rt-pcr荧光检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102952897A
Application number: CN2012103943412A
Authority: CN
Inventors: 徐昌平; 卢亦愚; 冯燕; 吴华森; 钟淑玲
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2012-10-17
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2013-03-06

Abstract

本发明提供了一种风疹病毒RT-PCR荧光检测试剂盒，主要包括RT-PCR反应试剂以及特异性引物和探针，所述特异性引物和探针如下：上游引物：5’-CCCAGCACTCCACGCAAT-3’下游引物：5’-TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’荧光探针：FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1；本发明试剂盒对风疹病毒的检测有高度的特异性，与麻疹、腮腺炎病毒、流感及其他病毒均无交叉反应；本发明试剂盒检测的灵敏度达0.01TCID₅₀，可直接从疑似风疹患者的含漱液标本中检测风疹病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右，非常适用于风疹病毒感染引起突发疫情的实验室早期诊断。

Description

一种风疹病毒RT-PCR荧光检测试剂盒及检测方法

（一）技术领域

本发明涉及一种风疹病毒RT-PCR荧光检测试剂盒及检测方法。

（二）背景技术

风疹是由风疹病毒（Rubella virus，RV）感染引起的急性出疹性呼吸道传染病。妇女在妊娠的前3个月感染RV易引起胎儿先天性风疹综合症（Congenital Rubella Syndromes，CRS），导致流产、死产、胎儿畸形智力低下等。在临床症状上，RV引起的风疹与轻型麻疹以及一些肠道病毒感染所引起的出疹性疾病不易区分。

因此对于以优生优育为目的的产前诊断或临床诊断来讲，建立快速、敏感、准确的RV检测方法是十分必要的。近年荧光PCR 技术在病毒等微生物检测领域得到广泛的应用，它利用PCR技术对DNA的高效扩增并结合探针技术的高特异性和敏感性，克服了常规血清学和普通PCR方法的不足，是一种很有应用价值的诊断方法。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种风疹感染实验室应急检测的风疹病毒荧光逆转录-聚合酶链反应快速检测试剂盒及方法。

本发明采用的技术方案是：

一种风疹病毒RT-PCR荧光检测试剂盒，主要包括RT-PCR反应试剂以及特异性引物和探针，所述特异性引物和探针如下：

上游引物：5’-CCCAGCACTCCACGCAAT-3’

下游引物：5’-TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’

荧光探针：FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1；

其中，R为A或G，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

本发明关键在于特异性引物和探针的设计，试剂盒内的其他组分，为本领域常规用于RT-PCR的试剂，如dNTP mix、MgCl₂、buffer、酶等，本领域普通技术人员可根据常识进行选择，可自行配制，也可选用市购商品，如Roche公司的RT-PCR system 1938823试剂盒等。

本发明还涉及一种利用所述检测试剂盒检测风疹病毒的方法，所述方法包括：

（1）提取待测样品RNA；所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。

（2）以待测样品RNA为模板，加入特异性引物和探针，以及RT-PCR反应试剂，配成RT-PCR反应体系，进行扩增反应；

所述特异性引物和探针如下：

上游引物：5’-CCCAGCACTCCACGCAAT-3’

下游引物：5’-TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’

荧光探针：FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1；

其中，R为A或G，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；

（3）荧光RT-PCR检测以Ct值﹤37并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则；其中Ct值<35且扩增曲线良好可直接判定为阳性；Ct值在35～37之间需重复实验，两次实验均能得到良好S型扩增曲线方则判定为阳性。

所述扩增反应的条件为：42℃ 30min进行逆转录，95℃ 2min变性，然后94℃ 10s，60℃ 1min，在60℃进行单点荧光检测，共进行40个循环。

RV能诱发急性呼吸道疾病，常在托幼机构和中小学校中出现流行或爆发，严重危害青少年健康。传统风疹临床检验常用病毒分离培养法、免疫学方法和普通RT-PCR法等。病毒分离培养由于技术复杂、费时，不适合用于早期快速诊断的需要。免疫学方法虽然操作简便，但其灵敏度较差，且容易出现假阳性和假阴性结果。普通RT-PCR和巢式PCR方法，方法较为简便、敏感，但由于需进行琼脂糖凝胶电泳分析，有容易发生交叉污染的缺点。近年来新发展起来的荧光定量PCR检测技术，具有灵敏度高、检测速度快、特异性强和高通量等优点，已在病原体快速诊断中得到了较广泛的应用。

国内有建立了荧光RT-PCR检测RV方法，但敏感性仅10³拷贝/μl，相对较低，且探针位点设置在RV的E1基因区域，由于 RV E1基因容易变异常被用于风疹基因的分型，目前变异已达8%～9% 变异，该设计可能存在着实验的不确定性，容易使检测产生假阴性结果。

本申请发明人从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的风疹病毒毒株，对其进行了同源性比较，在风疹病毒的非结构蛋白p150基因保守区设计若干对引物与Taqman探针，对该区域进行特异性扩增，从中筛选出最佳的引物和探针，并对荧光RT-PCR方法进行优化，验证其敏感性、特异性和重复性。经风疹病毒Gos株、麻疹病毒沪191株、腮腺炎病毒TL株、呼吸道合胞病毒Long株以及流感病毒株与近期风疹爆发疫情疑似患者含漱液样本的检测比较，该方法具有高特异性，只能检出风疹病毒，与麻疹、腮腺炎病毒、流感及其他病毒均无交叉反应，而且比常规RT-PCR 和巢式PCR法更敏感、快速和简便。本方法从核酸提取至完成检测，仅需3 h左右，能同时完成多个疑似患者临床样本的高通量检测，敏感度达0.01 TCID₅₀，比普通PT-PCR高100倍，比巢式PCR高10倍，可直接从风疹患者的含漱液中检测风疹病毒核酸。此外，对同一病毒样品进行4次重复试验，结果具有很好的重现性。用建立的新方法，对近期浙江省疑似风疹爆发疫情疑似患者10份临床样本进行实验室早期快速诊断，获得了令人满意的结果，为该病及时采取控制措施发挥了很好的作用。

本发明的有益效果主要体现在：本发明试剂盒对风疹病毒的检测有高度的特异性，与麻疹、腮腺炎病毒、流感及其他病毒均无交叉反应；本发明试剂盒检测的灵敏度达0.01TCID₅₀，可直接从疑似风疹患者的含漱液标本中检测风疹病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右；本发明方法是一种快速检测风疹病毒特异、敏感的方法，非常适用于风疹病毒感染引起突发疫情的实验室早期诊断。

（四）附图说明

图1为荧光RT-PCR法检测风疹病毒的灵敏度结果；A~E分别代表不同的病毒浓度，从A至E依次为100、10、1、0.1 、0.01TCID₅₀；

图2为荧光RT-PCR法检测对疑似风疹患者临床样本的检测结果。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1 材料与方法

1.1病毒株与临床标本：

风疹病毒Gos株、麻疹病毒沪191株、腮腺炎病毒TL株以及呼吸道合胞病毒Long株，由上海生物制品研究所与中国药品生物制品检定所提供。流感病毒株甲1/北京/56/97、甲3/悉尼/5/97、乙型/深圳/12/97由中国疾病预防控制中心提供。风疹临床疑似患者的标本由浙江省各地市疾病预防控制中心在风疹爆发疫情中，采集疑似患者含漱液标本送检。

1.2 引物与探针

从美国GenBank下载不同年代与地区的20余株风疹病毒全基因组序列，用生物学软件软件进行同源性比较，在风疹病毒的非结构蛋白p150基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针，序列为：

Rubella-F：5’-CCCAGCACTCCACGCAAT-3’

Rubella-R：5’-TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’

Rubella-Pb：FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1

引物和探针委托宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.3 病毒定量标准与病毒RNA的提取：

风疹标准毒株采用Vero细胞进行病毒效价滴定后（10^6.3TCID₅₀/ml）作为参考株，将其稀释至100、10、1、0.1、0.01、0.001TCID₅₀/管，分别提取RNA，病毒RNA提取采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit ,按试剂盒说明书进行提取，得到病毒RNA，备用。

1.4 荧光RT-PCR反应体系和条件的优化：

选用Roche公司的RT-PCR system 1938823试剂盒，按说明书操作，反应。各反应物的终浓度为：dNTP mix 0.2 mM、MgCl₂ 7.5 mM、Taq酶和逆转录酶混合物0.5μl（5U/μl）、模板RNA 10μl、引物和探针浓度分别为0.8μM与0.4μM，最后用DEPC水补至25μl。

用ABI 7500 Real Time PCR System按下列参数进行：

42℃逆转录30min，95℃变性2min，以94℃ 10s、60℃ 1min 扩增40 个循环，在60℃进行单点荧光检测。

结果判断：荧光RT-PCR检测以Ct值﹤37并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则。其中Ct值<35且扩增曲线良好可直接判定为阳性；Ct值在35～37之间需重复实验，两次实验均能得到良好S型扩增曲线方可判定为阳性。

体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，选用不同浓度的引物和探针，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度与比例，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ΔRn）选择最佳引物和探针浓度。Mg²⁺的浓度高低对Taq酶的活性与扩增的特异性密切相关，在同一反应体系条件下改变Mg²⁺浓度，对Mg²⁺浓度进行优化。采用MJ Research OpticonTM2荧光定量PCR仪上的温度梯度功能，在Tm值（48℃～62℃）下进行检测，选择最佳Tm温度。

1.5 荧光RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验

选择风疹病毒Gos株、麻疹病毒沪191株、腮腺炎病毒TL株、呼吸道合胞病毒Long株以及流感病毒株与近期风疹爆发疫情疑似患者含漱液样本，对上述病毒株和样本分别提取核酸，用风疹病毒荧光RT-PCR方法进行检测，验证方法的特异性；对已标定TCID₅₀的风疹毒株稀释后分别提取核酸，平行进行荧光RT-PCR、RT-PCR反应和巢式PCR法，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的病毒稀释液作4次重复检测，得到的Ct值计算变异系数，验证方法的重复性。

2 结果

2.1 荧光RT-PCR反应体系及条件

采用Roche公司的RT-PCR system 1938823试剂盒，反应体系为25μl。优化后的反应体系Mg²⁺浓度为7.5 mM，Tm温度60℃，矩阵法优选后引物探针的最佳浓度分别为0.8μM和0.4μM。各反应物的终浓度为： dNTP mix 0.2 mM、MgCl₂ 7.5 mM、Taq酶和逆转录酶混合物0.5μl（5U/μl）、模板RNA 10μl、引物和探针浓度分别为0.8μM与0.4μM，最后用DEPC水补至25μl。用ABI 7500 Real Time PCR System按下列参数进行：42℃逆转录30min，95℃变性2min，以94℃ 10s、60℃ 1min 扩增40 个循环，在60℃进行单点荧光检测。

2.2特异性试验

本发明建立的荧光 RT-PCR方法对风疹病毒具有较好的特异性，麻疹、腮腺炎病毒、流感及其他病毒均无交叉反应。

2.3 敏感性试验

风疹标准毒株采用Vero细胞进行病毒效价滴定后（106.3TCID₅₀/ml）作为参考株，将其稀释至100、10、1、0.1、0.01、0.001TCID₅₀/管，分别提取RNA，同时进行荧光RT-PCR，普通RT-PCR和巢式PCR检测（上下游引物均与荧光RT-PCR相同）。结果荧光RT-PCR方法敏感性可达0.01 TCID₅₀/管（见图1），比普通PT-PCR高100倍，比巢式PCR高10倍（见表1）。

表1：三种PCR方法检测RV的灵敏度比较

2.4重复性试验

对已稀释至100、10、1、0.1、0.01、0.001TCID₅₀/管的风疹病毒浓度，分别作4次重复检测，得到的Ct值采用Microsoft Excel 2003计算变异系数，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值变异系数分别为0.795%、0.801%、0.435%、0.526%，表明检测方法具有较好的稳定性（表2）。

表2：荧光RT-PCR重复性实验结果

2.5临床样本的检测

以普通RT-PCR方法，巢式PCR方法和TaqMan荧光PCR方法同时对两起疫情爆发中10例患者的含漱液样本进行检测。结果荧光RT-PCR 检测阳性3份（结果见图2），普通RT-PCR 检测阳性2份，巢式PCR 检测阳性2份。普通RT-PCR 与巢式PCR为阳性的标本，荧光RT-PCR 检测也均为阳性。

Claims

1.一种风疹病毒RT-PCR荧光检测试剂盒，主要包括RT-PCR反应试剂以及特异性引物和探针，其特征在于所述特异性引物和探针如下：

上游引物：5’-CCCAGCACTCCACGCAAT-3’

下游引物：5’-TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’

荧光探针：FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1；

其中，R为A或G，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

2.利用权利要求1所述检测试剂盒检测风疹病毒的方法，所述方法包括：

（1）提取待测样品RNA；

所述特异性引物和探针如下：

上游引物：5’-CCCAGCACTCCACGCAAT-3’

下游引物：5’-TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’

荧光探针：FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1；

其中，R为A或G，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述扩增反应的条件为：42℃30min进行逆转录，95℃ 2min变性，然后94℃ 10s，60℃ 1min，在60℃进行单点荧光检测，共进行40个循环。