CN110964855A - 一种检测风疹病毒的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括PCR反应液、内标、阳性质控品和阴性质控品，所述PCR反应液包括用于检测风疹病毒RNA的上游引物、下游引物和荧光探针，所述内标和阳性质控品分别为含沙眼衣原体色氨酸合成酶β亚基编码基因的RNA假病毒和含风疹病毒特异性保守基因片段的RNA假病毒。本发明试剂盒可以检测我国风疹流行病学中公布的风疹病毒所有基因型，采用假病毒作为内标，能够真实有效地对可能造成的假阴性检测结果进行质控，大大提高了其检测灵敏度、准确度和稳定性。

Description

一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒基因检测领域，尤其涉及一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

风疹病毒(Rubella virus，RV)是披膜病毒科(Togaviridae)风疹病毒属(Rubellavirus genus)中的唯一成员，与披膜病毒科的其它病毒无交叉抗原。RV是单股正链RNA病毒，经呼吸道传染，人是其唯一的自然宿主，呈世界性分布。风疹本身并不严重，但RV对公众健康最大的威胁是它的致畸性。孕妇，特别是妊娠早期的孕妇，感染风疹病毒可导致胎儿先天性风疹综合症(Congenital rubella syndrome，CRS)。风疹病毒会通过胎盘引起胎儿感染，可在胎儿的某些组织细胞中进行繁殖，但并不杀死细胞，最终导致胎儿组织器官分化、形成发生异常，引起风疹综合征，如白内障、视网膜色素沉着、小眼球、角膜浑浊、神经性耳聋、先天性心脏病、小头、前囟门不闭合、智力低下等先天畸形；并导致胎儿死亡几率增大、宫内生长迟缓、出生时体重低、出生后发育缓慢、孤僻等不良后果。显而易见，风疹病毒的感染与优生有着密切的关系。因此研究该病毒的基因结构及其感染特征并对患者作出早期、及时、准确、快速的诊断，对于推行优生优育、提高人口素质和搞好妇幼保健都是极其重要的，是优生优育的重要课题。

目前最常用的风疹病毒检测方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)，它是基于抗原抗体反应的特异性和酶促反应的敏感性而建立的现代免疫学方法，用于快速检测患者血清中风疹病毒特异性IgM抗体，可用来确定急性风疹感染。但对未注射风疹疫苗及对再次风疹感染的病人，无法确定IgM抗体滴度增高的原因，同时对于初次急性期感染的诊断和控制传染源的扩散不利。为提高风疹IgM抗体检测的准确性，应该在出疹后8～28天采集血清，而在出疹1～4天内的检出率较低。因此，ELISA检测风疹病毒IgM抗体存在一定的漏诊，尤其是无法判断胎儿的感染情况(胎儿在妊娠期18～20周之前通常不产生IgM抗体)，以及某些免疫抑制病人或先天性感染病人也可能不产生IgM抗体。并且风疹疫苗的推广使用或在再次风疹感染期IgM抗体滴度比较高，不利于初次急性期感染的诊断和控制；而在自身免疫性疾病病人中抗体检测有可能产生假阳性。

随着现代核酸技术的发展，建立在基因水平上的实时荧光定量PCR技术由于其高灵敏性和高特异性，在临床检测中得到广泛应用。荧光定量PCR技术主要包括核酸提取和扩增两个部分，其中核酸提取是至关重要的第一步。病毒是核酸与蛋白的复合体，蛋白质外壳里面装有DNA或RNA遗传物质。病毒核酸的提取都有一个裂解的过程，而纯的核酸像PCR产物、克隆的质粒、人工合成的核酸片段是不经过这一过程的，所以无法真正体现病毒核酸的提取过程，也就不能够真正实现质控品的意义。

现有的运用荧光定量PCR方法进行风疹病毒检测技术的缺点主要有以下几点：(1)没有涵盖我国常见风疹病毒的所有基因型，因此存在漏诊的情况；(2)大多数情况下样本反应管中未设置内对照(内标)以对管内抑制扩增可能造成的假阴性结果进行质控，即使设置了内标，也一般为质粒DNA，不能真实有效地反映病毒RNA的提取过程；(3)扩增产物容易受到实验室气溶胶污染，检测结果会有出现假阳性。

发明内容

有鉴于此，为克服现有技术缺陷，本发明提出了一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，可检测出我国风疹流行病学中公布的所有基因型，操作简便快捷，检测灵敏度高、检测范围广，为诊断风疹感染提供可靠的实验依据。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供了一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液、内标、阳性质控品和阴性质控品，所述PCR反应液包括用于检测风疹病毒的上游引物1、下游引物1和荧光探针1：

上游引物1碱基序列为5’-TGCAGATGGCGCCCAGAGTGAG-3’(SEQ ID NO.1)，

下游引物1碱基序列为5’-ACCGGCGTGGTGTATGGCACAC-3’(SEQ ID NO.2)；

荧光探针1碱基序列为5’-TGGGCAGCAGCCCACTCCGCCC-3’(SEQ ID NO.3)，

荧光探针1的5’端标记第一荧光基团，荧光探针1的3’端标记能够淬灭第一荧光基团发射的荧光信号的第一淬灭基团；

所述内标为含沙眼衣原体色氨酸合成酶β亚基编码基因的RNA假病毒。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述内标核酸碱基序列如序列表中SEQ IDNO.7所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述PCR反应液还包括用于检测内标的上游引物2、下游引物2和荧光探针2：

上游引物2碱基序列为5’-ACGAGCCTTTTATACATTAGCCA-3’(SEQ ID NO.4)，

下游引物2碱基序列为5’-TGTGAAGACTCCAATGCAGGA-3’(SEQ ID NO.5)；

荧光探针2碱基序列为5’-CCACCGATGAAGAGGCGTTACGAGC-3’(SEQ ID NO.6)，

荧光探针2的5’端标记第二荧光基团，荧光探针2的3’端标记能够淬灭第二荧光基团发射的荧光信号的第二淬灭基团。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述阳性质控品为含风疹病毒特异性保守基因片段的RNA假病毒。

进一步，优选的，所述阳性质控品核酸碱基序列如序列表中SEQ ID NO.8所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述上游引物1与荧光探针1浓度比以及下游引物1与荧光探针1浓度比均为(1-4):1。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述上游引物1和下游引物1浓度均为0.2-0.5μM，所述荧光探针1浓度为0.1-0.3μM。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述PCR反应液还包括逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶和dNTPs，所述逆转录酶浓度为1-3U/μL，所述RNA酶抑制剂浓度为0.2-1U/μL，所述Taq DNA聚合酶浓度为0.1-0.3U/μL，所述dNTPs浓度为0.1-4mM。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述PCR反应液还包括UNG酶和dUTP，所述UNG酶浓度为0.004-0.1U/μL，所述dUTP浓度为0.1-4mM。

本发明的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明通过NCBI在线对我国风疹流行病学中公布的所有风疹病毒基因型(1E型、1F型、2A型、2B型)的序列进行比对分析，选择其高度保守区域，设计了特异性引物和探针，确保能够检测全部我国出现的RV基因型，适用于定性或定量检测全血、血清、血浆或羊水等多种样本类型中的风疹病毒RNA；

(2)病毒检测最理想的质控品就是它本身，但由于其具有致病性，考虑到生物安全性问题，不可能直接采用病毒作为质控品，所以本发明模拟天然病毒的形态，通过基因工程手段构建出含有目的核酸片段与包装蛋白形成的复合体(假病毒)，首次在RV荧光检测中引入了RNA假病毒的内标和外标，RNA是非常不稳定的，在提取过程中极容易降解，让内标与待测样本同时参与核酸提取过程，能够真实反映待测样本病毒核酸的提取过程，对核酸提取过程和提取效率进行监控，防止出现假阴性，提高检测结果的可靠性，另外，由于假病毒是核酸片段与包装蛋白形成的复合体，它能耐受核酸酶，在血液等物质中可以长期稳定的存在，易于保存；

(3)本发明试剂盒还提供了UNG酶和dUTP，在PCR扩增反应前加入UNG酶，就可以破坏反应液中含有dU的PCR产物，但对天然核酸不起作用，随后将UNG酶灭活，再进行扩增，这样就可以有效地防止实验室内扩增产物形成的气溶胶的污染，避免假阳性的出现。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2中风疹病毒1E型、风疹病毒1F型、风疹病毒2A型和风疹病毒2B型样本的检测结果图。

图2为实施例2中阳性质控品和阴性质控品的检测结果图，其中颜色较浅的未标注曲线代表内标扩增曲线。

图3为实施例3中特殊样本风疹病毒的检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，可以参考《分子克隆实验指南》(第四版)。实施例中所用的引物和荧光探针委托宝生物工程(大连)有限公司合成，所用的pSE380质粒载体购自Invitrogen公司。

实施例1

本实施例提供了一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，它包括PCR反应液、内标、阳性质控品和阴性质控品。

PCR反应液包括用于检测风疹病毒的上游引物1、下游引物1和荧光探针1，用于检测内标的上游引物2、下游引物2和荧光探针2，逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、UNG酶、dUTP和dNTPs。

上游引物1碱基序列为5’-TGCAGATGGCGCCCAGAGTGAG-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物1碱基序列为5’-ACCGGCGTGGTGTATGGCACAC-3’(SEQ ID NO.2)；

荧光探针1碱基序列为5’-TGGGCAGCAGCCCACTCCGCCC-3’(SEQ ID NO.3)，其5’端标记荧光基团FAM，3’端标记能够淬灭FAM荧光信号的淬灭基团。

上游引物2碱基序列为5’-ACGAGCCTTTTATACATTAGCCA-3’(SEQ ID NO.4)，下游引物2碱基序列为5’-TGTGAAGACTCCAATGCAGGA-3’(SEQ ID NO.5)；

荧光探针2碱基序列为5’-CCACCGATGAAGAGGCGTTACGAGC-3’(SEQ ID NO.6)，其5’端标记荧光基团HEX，3’端标记能够淬灭HEX荧光信号的淬灭基团。

上游引物1、2和下游引物1、2浓度均为0.2μM，荧光探针1、2浓度均为0.1μM，逆转录酶浓度为1U/μL，RNA酶抑制剂浓度为0.2U/μL，Taq DNA聚合酶浓度为0.1U/μL，UNG酶浓度为0.004U/μL，dUTP和dNTPs浓度均为0.1mM。

内标为含沙眼衣原体色氨酸合成酶β亚基编码基因的RNA假病毒，内标核酸碱基序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；阳性质控品为含风疹病毒特异性保守基因片段的RNA假病毒，阳性质控品核酸碱基序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；阴性质控品为DPEC水。本发明是利用装甲RNA(Armored RNA)技术，即由MS2噬菌体外壳蛋白包裹重组RNA的技术，用以制备内标和阳性质控品(即外标)的RNA假病毒。根据NCBI公布的序列，对RV不同基因型序列进行比对分析，其中E1蛋白编码基因具有高度保守性，并选取沙眼衣原体色氨酸合成酶β亚基编码基因序列作为内标序列，不会对RV检测产生干扰，分别扩增这两种基因的特异性保守区域，然后分别与pSE380-MS2重组质粒连接，转入宿主大肠杆菌BL21中进行表达，表达产物即为包裹有目的RNA的假病毒颗粒，破碎菌种BL21提取表达产物，三氯甲烷法纯化得到含有目的RNA的假病毒颗粒，即RV病毒RT-PCR检测的外标及内标。

本发明试剂盒根据我国风疹流行病学中公布的所有基因型的高度保守区域，设计了特异性的引物和探针，通过实时荧光PCR可以检测我国风疹流行病学中公布的所有基因型。本发明试剂盒提供了RV检测的内标和质控品(外标)，并且内标和质控品全程参与样本核酸的提取纯化，可真实有效地监控风疹病毒RNA的提取过程，以对整个PCR反应过程、试剂/设备交叉污染等环节进行了合理的质量控制，防止样本检测假阴性。该试剂盒还设置了UNG酶+dUTP防污染措施，有效杜绝了假阳性的出现。本发明试剂盒检测的灵敏度和准确度高，稳定性好。

实施例2

本实施例采用实施例1所述试剂盒检测样本中风疹病毒RNA，待测样本可以为全血、血清、血浆或羊水任意一种形式的样本，具体操作步骤如下：

S1、提取样本RNA

吸取200μL待测样本加入5μL内标后进行核酸提取；取阳性质控品和阴性质控品各25μL，分别加入5μL内标后补加生理盐水至200μL进行核酸提取。

采用百泰基因的病毒核酸提取试剂盒(鄂汉械备20170246号)提取待测样本(含内标)、阳性质控品(含内标)和阴性质控品(含内标)中核酸，具体操作方法参见该试剂盒说明书。

S2、上样

取25μL PCR反应液置室温溶解后，5000r/min离心数秒，将PCR反应液沉至管底，然后分别加入步骤S1得到的RNA(包括待测样本、阳性质控品和阴性质控品)上清液各25μL，盖紧PCR反应管，短暂离心片刻后上机检测。

S3、荧光定量PCR反应

(1)将各PCR反应管放入PCR扩增仪样品槽中，按对应顺序设置检测样品名称。

(2)荧光检测通道选择：选择FAM通道检测RV，选择HEX通道检测内标。

(3)荧光定量PCR反应条件如下表：

(4)质量控制

RV阴性质控品FAM检测通道检测结果应为阴性且无Ct值，同时HEX检测通道检测结果应为阳性，有扩增曲线且Ct值≤36.00；

RV阳性质控品FAM检测通道检测结果应为有扩增曲线且Ct值≤30.00，同时HEX检测通道检测结果应为阳性，有扩增曲线且Ct值≤36.00。

(5)结果分析

①对于待测样本FAM通道和HEX通道检测结果均有扩增曲线呈S型且Ct值≤36.00，则判断待测样本为RV RNA阳性(如图1和图2所示)；

②对于待测样本FAM通道检测结果扩增曲线不呈S型且无Ct值或者Ct值＞36.00，同时HEX检测通道检测结果扩增曲线呈S型且Ct值≤36.00，则判断待测样本为RV RNA阴性；

③若待测样本HEX通道检测结果Ct值>36.00或无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。

实施例3

选择临床上已知浓度的RV阳性的血清样本，平均分成2份，其中一份加入RV阴性的正常血清编号为样本1，另一份加入RV阴性的重度溶血(血红素浓度大于5.0g/L)血清编号为样本2，采用硅胶膜法分别提取其核酸作为模板，使用本发明设计的引物和探针进行实时荧光PCR反应，其扩增结果见图3。

如图3所示，样本1及其内标扩增Ct值均在规定范围内，且扩增曲线良好，但标本2扩增Ct值比标本1的明显推后，且标本2内标扩增Ct值超出了规定范围，扩增曲线不呈现S型、扩增效率低下、荧光信号差，说明样本本身不合格或整个核酸提取过程和PCR反应过程不正常(效率极低)，样本检测结果判定不可靠。这是因为重度溶血样本中血红素含量很高，而血红素可以通过其卟啉环与Taq DNA聚合酶不可逆结合，从而抑制Taq DNA聚合酶的活性。因此，需要重新采集/提取样本进行实验，待内标扩增曲线呈现S型且扩增Ct值在规定范围之内才能得到准确的结果。实验结果表明，本试剂盒内标能有效地监控核酸提取过程和PCR反应过程，检测结果更准确可靠。

因此，本发明可快速检测国内常见的风疹病毒所有基因型；首次引入了RNA假病毒内标和外标质控病毒RNA提取过程，检测结果准确性和重复性好；且能够有效防止实验室气溶胶污染，杜绝假阳性的出现。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉百泰基因工程有限公司

<120> 一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

tgcagatggc gcccagagtg ag 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

accggcgtgg tgtatggcac ac 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

tgggcagcag cccactccgc cc 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

acgagccttt tatacattag cca 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

tgtgaagact ccaatgcagg a 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

ccaccgatga agaggcgtta cgagc 25

<210> 7

<211> 99

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

acgagccttt tatacattag ccaccgatga agaggcgtta cgagcttttt tcctgcttac 60

tagaaacgag gggattattc ctgcattgga gtcttcaca 99

<210> 8

<211> 109

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

tgcagatggc gcccagagtg agctgccacc aatgggcagc agcccactcc gcccaggtct 60

gccgggtctc cgacacagcg gtggtgtgtg tgccatacac cacgccggt 109

Claims (9)

1.一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液、内标、阳性质控品和阴性质控品，其特征在于，所述PCR反应液包括用于检测风疹病毒的上游引物1、下游引物1和荧光探针1：

上游引物1碱基序列为5’-TGCAGATGGCGCCCAGAGTGAG-3’，

下游引物1碱基序列为5’-ACCGGCGTGGTGTATGGCACAC-3’；

荧光探针1碱基序列为5’-TGGGCAGCAGCCCACTCCGCCC-3’，

荧光探针1的5’端标记第一荧光基团，荧光探针1的3’端标记能够淬灭第一荧光基团发射的荧光信号的第一淬灭基团；

所述内标为含沙眼衣原体色氨酸合成酶β亚基编码基因的RNA假病毒。

2.如权利要求1所述的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述内标核酸碱基序列如序列表中SEQ ID NO.7所示。

3.如权利要求1所述的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括用于检测内标的上游引物2、下游引物2和荧光探针2：

上游引物2碱基序列为5’-ACGAGCCTTTTATACATTAGCCA-3’，

下游引物2碱基序列为5’-TGTGAAGACTCCAATGCAGGA-3’；

荧光探针2碱基序列为5’-CCACCGATGAAGAGGCGTTACGAGC-3’，

荧光探针2的5’端标记第二荧光基团，荧光探针2的3’端标记能够淬灭第二荧光基团发射的荧光信号的第二淬灭基团。

4.如权利要求1所述的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为含风疹病毒特异性保守基因片段的RNA假病毒。

5.如权利要求4所述的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品核酸碱基序列为如序列表中SEQ ID NO.8所示。

6.如权利要求1所述的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述上游引物1与荧光探针1浓度比以及下游引物1与荧光探针1浓度比均为(1-4):1。

7.如权利要求6所述的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述上游引物1和下游引物1浓度均为0.2-0.5μM，所述荧光探针1浓度为0.1-0.3μM。

8.如权利要求1所述的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液还包括逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶和dNTPs，所述逆转录酶浓度为1-3U/μL，所述RNA酶抑制剂浓度为0.2-1U/μL，所述Taq DNA聚合酶浓度为0.1-0.3U/μL，所述dNTPs浓度为0.1-4mM。

9.如权利要求1所述的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液还包括UNG酶和dUTP，所述UNG酶浓度为0.004-0.1U/μL，所述dUTP浓度为0.1-4mM。

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