CN103773896A - 西尼罗病毒的荧光定量rt-pcr检测试剂、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，所述检测试剂是针对以西尼罗病毒E基因的保守片段为靶目标的，包括一对特异性引物、一条特异性探针和一条内标探针。试剂盒包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、DEPC-H2O、阳性质控品、阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液；其中PCR混合液中含有一对特异性引物、一条特异性探针和一条内标探针。检测方法包括：总RNA提取、反应组分配制、标准品稀释制作标准曲线、扩增、结果判定。本发明的试剂和试剂盒特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对低含量西尼罗病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，检测方法快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法。
背景技术
西尼罗病毒病是一种烈性人畜共患传染病，会导致严重的公共卫生问题。西尼罗河病毒可以通过蚊或蜱等血媒介传播，大多缺乏有效的治疗和预防措施，给疾病控制提出了严峻的挑战。西尼罗病毒血清学诊断方法较多，但这些方法都有一定得局限性。比如ELISA不是特异诊断方法，只能用于病毒抗体的筛查，不能进行确诊；特异的蚀斑减少中和试验操作较繁，费时费力，难以应用于大规模普查。西尼罗病毒核酸检测方法主要有普通RT-PCR方法，但是其在检马脑组织病料时，敏感性差。此方法还有一个很大的缺点：就是易污染、易出现假阳性现象。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对低含量西尼罗病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂和西 尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
本发明进一步要解决的问题在于，提供一种快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，所述检测试剂是针对以西尼罗病毒E基因的保守片段为靶目标的，包括：
引物：WNV-PF909：5′-CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3′
WNV-PR999：5′-GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3′
探针：WNV-PB941：5′-CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3′
内标探针：WNV-PBIC：5′-CTGCAGGCAACGCAGCCGTCACC-3′，
所述探针和内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。
所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂中，还包括作为内标的假病毒，用于制作所述假病毒的内标核苷酸序列为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCC GTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、DEPC-H2O、阳性质控品、阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液；
其中，所述PCR混合液中包含：
引物：WNV-PF909：5′-CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3′
WNV-PR999：5′-GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3′
探针：WNV-PB941：5′-CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3′
所述假病毒内标溶液中包含：内标核苷酸序列制作的假病毒；
所述探针和内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团；
所述引物和探针对应于西尼罗病毒E基因的保守片段，所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒中，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒中，用于制作假病毒的内标核苷酸序列为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒中，优选各种试剂的含量为：
一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，采用上述试剂盒，检测方法具体包括以下步骤：
（1）、总RNA提取：在待测样品中加入假病毒内标溶液后，提取待测样品的RNA，得到模板RNA溶液；
（2）、反应组分配制：分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、模板RNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、阳性质控品和DEPC-H2O制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、阴性质控品和DEPC-H2O制成阴性对照物；
（3）、标准品稀释制作标准曲线：对定量用标准品进行多种比例的稀释 后制作标准曲线；
（4）、扩增：分别将检测物、阳性对照物和阴性对照物放入PCR仪进行扩增，首先50℃下反转录20min，接着95℃预变性3min，95℃下变性10sec，在60℃下退火延伸45sec，采集荧光信号，进行40个PCR循环；
（5）结果判定：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果；当内标检测结果的Ct值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效；若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时结果无效，需重复此样品的检测。
所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，所述步骤（5）中，判定结果包括定性结果判定和定量结果判定；
所述定性结果判定为：
Ct值＞40.0或无扩增曲线，表示样品中无西尼罗病毒；
Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在西尼罗病毒；
Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲
线者为阴性，否则为阳性。
所述定量结果判断为：
先根据标准品稀释制作标准曲线，对定量用标准品进行多种比例的稀释后与未知样品同时做荧光PCR检测；然后根据已知量，计算出各个浓度对应的核酸拷贝数；以标准品的核酸拷贝数的对数值为Y轴，荧光PCR检测的Ct值为X轴作回归曲线，获得标准曲线；将样品的检测Ct值代入标准曲线公式算出未知样品的核酸浓度。
本发明的检测试剂选用了针对西尼罗病毒E基因的保守片段为靶目标的引物和探针，与常规的PCR相比较，采用这种引物和探针的检测试剂具有快速、特异、敏感、可定量、无污染、高通量、且可同时检测大量样品的特性。 本发明的试剂尤其可对样品中低含量的西尼罗病毒、隐性感染或者是持续带毒宿主进行准确检测，是一种用于西尼罗病毒检测的良好试剂。在检疫、诊断、分子流行病学研究具有重要的实际应用价值。本发明的检测试剂可对细胞培养物、分泌物、血液、组织等多种样品中的西尼罗病毒进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安全的优点。
本发明的试剂盒将进行荧光定量PCR检测的各种试剂置放在一个试剂盒中，其中试剂盒中的试剂---PCR混合液含有针对西尼罗病毒E基因的保守片段进行检测的特殊引物和探针，含有该引物和探针的PCR混合液与其他试剂配合，可在收到样品后4小时内做出定性、定量检测结果，快速、便捷。该荧光定量PCR试剂盒是一种检测临床样品中西尼罗病毒的敏感和可靠的试剂盒。
本发明制备和使用RNA假病毒作为检测试剂的阳性对照品和内部标准品（内标）。在设立外部对照品的同时，通过内标对样品的核酸提取和检测过程进行监控，最大程度避免假阴性结果的发生，提高检测结果的可靠性。同时，RNA假病毒制品不易降解，稳定性远高于其他RNA对照品（如体外转录RNA）。本发明在检疫、诊断、分子流行病学研究具有重要的实际应用价值。
本发明的检测方法采用具有特性的检测试剂和试剂盒，该方法可以减少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险，比常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析。克服了常规RT-PCR和RT-巢式产生的产物须电泳检测、费时、不敏感和不能定量的缺点。与常规PCR相比，本发明的荧光定量PCR可以作出一个定量的、客观的估计，对检测样品能进行出阳性、阴性和可疑的准确判定。其中Ct值为40.00可确定为阳性和阴性的临界值（cut-off)。更重要的是本发明荧光定量PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的 检测。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例的第一情况的扩增曲线；
图2是本发明实施例的第二情况的扩增曲线；
图3是本发明实施例的第三情况的扩增曲线；
图4是本发明实施例的标准曲线。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。
一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，所述检测试剂是针对以西尼罗病毒E基因的保守片段为靶目标的，包括：
引物：序列1WNV-PF909：5′-CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3′
序列2WNV-PR999：5′-GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3′
探针：序列3WNV-PB941：5′-CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3′
内标探针：序列4WNV-PBIC：5′-CTGCAGGCAACGCAGCCGTCACC-3′，所述探针和内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。
所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列（序列5）为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTT GCAAAGTTCCTATC。
所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂还包括假病毒，用于制作假病毒的内标核苷酸序列（序列6）为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、DEPC-H2O、阳性质控品、阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液；
其中，所述PCR混合液中包含：
引物：序列1WNV-PF909：5′-CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3′
序列2WNV-PR999：5′-GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3′
探针：序列3WNV-PB941：5′-CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3′
所述假病毒内标溶液中包含：
内标探针：序列4WNV-PBIC：5′-CTGCAGGCAACGCAGCCGTCACC-3′，
所述探针和内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团；
所述引物和探针对应于西尼罗病毒E基因的保守片段，所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列（序列5）为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒中，用于制作所述假病毒的内标核苷酸序列（序列6）为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒中各种试剂的含量为：
一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，采用上述试剂盒，检测 方法包括以下步骤：
（1）、总RNA提取：在待测样品中加入假病毒内标溶液后，提取待测样品的RNA，得到模板RNA溶液；
（2）、反应组分配制：分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、模板RNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、阳性质控品和DEPC-H2O制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、阴性质控品和DEPC-H2O制成阴性对照物；
（3）、标准品稀释制作标准曲线：对定量用标准品进行多种比例的稀释后制作标准曲线；
（4）、扩增：分别将检测物、阳性对照物和阴性对照物放入PCR仪进行扩增，首先50℃下反转录20min，接着95℃预变性3min，95℃下变性10sec，在60℃下退火延伸45sec，采集荧光信号，进行40个PCR循环；
（5）结果判定：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果；当内标检测结果的Ct值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效；若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时，结果无效，需重复此样品的检测。
所述步骤（5）中，判定结果包括定性结果判定和定量结果判定。
所述定量结果判断为：先根据标准品稀释制作标准曲线，对定量用标准品进行多种比例的稀释后与未知样品同时做荧光PCR检测；然后根据已知量，计算出各个浓度对应的核酸拷贝数；以标准品的核酸拷贝数的对数值为Y轴，荧光PCR检测的Ct值为X轴作回归曲线，获得标准曲线；将样品的检测Ct值代入标准曲线公式算出未知样品的核酸浓度。
标准品稀释制作标准曲线：对定量用标准品进行多种比例的稀释后制作标准曲线；本实施例中对定量用标准品进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释，然后根据已知量，计算出各个浓度对应的绝对模板数。做荧光定量PCR检测，以拷贝数的对数为Y轴，Ct值为X轴作回归曲线，获得标准曲线。
定量用的标准品扩增曲线：出现典型的扩增曲线，指数区较明显，7个点具良好的线性范围，平台区汇于一起，相关系数在0.98以上。并根据标准曲线对每个具体实施例作出定量。
定性结果判定：
Ct值＞40.0或无扩增曲线，表示样品中无西尼罗病毒；
Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在西尼罗病毒；
Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲
线者为阴性，否则为阳性。
以下通过具体的实施例对于检测试剂、检测试剂盒和检测方法进行详细描述。
一、在西尼罗病毒中，本发明选择E基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列（序列5）为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC；
对西尼罗病毒E基因RNA假病毒表达质粒的构建：
按照《分子克隆实验指南第三版》，进行西尼罗病毒E基因克隆和测序，将E基因克隆至RNA假病毒表达载体pAR中，将重组质粒命名为pAR-WNV， 该方法为常规技术，在此不再赘述。
二、引物和探针的设计和制备：
针对上述西尼罗病毒E基因的保守片段，应用primer Express软件和primer prepre5.0软件设计引物和探针：
引物：序列1WNV-PF909：5′-CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3′
序列2WNV-PR999：5′-GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3′
探针：序列3WNV-PB941：5′-CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3′
所述探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。涉及到本发明，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；
引物、探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成，在探针合成同时进行两端荧光标记。设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选后，初步定候选引物和探针。
引物和探针检测试剂的制备和选择：
检测试剂的制备都采用常规技术手段，在此不再赘述。本发明通过检测样品用标准样品及一系列经过稀释的引物和探针样品，选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探针终浓度，采用矩阵法优选引物探针的最佳浓度，制成引物和探针溶液，该溶液作为检测试剂。
本发明上述引物和探针是经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量的临床样品的评估才得到的，该引物和探针具有高扩增效率和特异性好的特点。
三、内标溶液的制备：
根据以下内标序列制备假病毒内部标准品(假病毒内标溶液)：用于对病毒样品的核酸提取和PCR检测过程进行监控：
序列6：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC；
对应的内标探针为：
序列4WNV-PBIC：5′-CTGCAGGCAACGCAGCCGTCACC-3′，
所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1，可以记录为：
序列4：(HEX)5′-CTGCAGGCAACGCAGCCGTCACC-3′(BHQ1)。
人工合成假病毒内标RNA序列：合成方法同西尼罗病毒E基因RNA假病毒表达质粒的构建。将内标序列克隆至表达载体pAR中，构建内标表达载体pAR-WNVIC。并转化大肠杆菌，经过诱导表达和纯化制备成RNA假病毒IC。
四、试剂盒：
本发明的试剂盒包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、DEPC-H2O、阳性质控品、阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液。
其中，PCR混合液：具体参见引物和探针设计和制备，其余为常规技术，在此不再赘述。
Taq DNA聚合酶、AMV酶、DEPC-H2O为现有技术。
阴性质控品：采用水为阴性对照；
WNV阳性质控品：采用靶基因RNA序列包裹在假病毒内代替常规的质粒做 为阳性质控品。具体为：将构建好的质粒pAR-WNV转化大肠杆菌BL21（DE3）。挑取重组菌的单菌落，接入2mL含Amp（100μg/ml）的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；取500μl过夜培养物接入50mL含Amp（100ug/ml）的LB液体培养基中，37℃振荡培养2.0h至细菌对数生长期；在培养物中加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L，继续振荡培养16h（过夜）后取出；将诱导后的菌液移至10ml离心管，5000rpm收集菌体，每10ml菌液用3ml PBS洗两次，最后用1ml PBS悬浮菌体；超声破碎后加入DNAse和RNase A消化2h。在100μl假病毒粗提物中加入700μlPBS和200μl5M NaCl，混匀，冰上放置1h。再加入0.1g PEG6000，充分溶解后，在冰上继续放置2h。12000rpm4℃离心20min，移弃上清，加入500μl SM，在室温下涡旋振荡3min，放置5min后于12000rpm离心5min，转移上清至新的离心管。加入300μl氯仿，在室温下涡旋振荡1min，12000rpm离心2min，转移上清至已标记的新离心管中，并加入1/10体积的无菌甘油，充分混匀。制备成假病毒阳性对照品母液。将此对照品10倍梯度稀释至10-8，通过西尼罗病毒标准品对此稀释液进行定量，从而得到假病毒内部标准品。
定量用标准品：重组质粒pMD19T-WNV依次进行10-1012稀释,使用SHIMADZM公司BI0-SPECMINDNA分析仪对各稀释度质粒质量进行测定,并按照如下公式将质粒质量换算成拷贝数:(6.02×1023)×(ng/μl×10-9)/(DNA length×660)=copies/μl。质粒重组为常规技术，在《分子克隆实验指南》第三版中可详细的操作方法，在此不再赘述。
本实施例中，试剂盒组成(25μL反应×50次):根据上述试验结果，按照反应条件优选、对比试验和验证试验确定的反应条件，配制如下试剂盒组份:
| 溶液A(2×PCR混合液，含引物和探针) | 400μL |
| 溶液B(Taq DNA聚合酶，5U/μL) | 25μL |
| 溶液C(AMV酶，5U/μL) | 25μL |
| 溶液D(DEPC-H2O) | 1mL |
| 溶液E(阳性质控品) | 1.2mL |
| 溶液F(阴性质控品) | 1.2mL |
| 溶液G(定量用标准品，108个拷贝μL) | 2mL |
| 溶液H（假病毒内标溶液） | 500μL |
一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，具体包括以下步骤：
（1）、总RNA提取：在待测样品中加入假病毒内标溶液后，提取待测样品的RNA，得到模板RNA溶液；
本实施例中，每个待测样品加入10μL假病毒内标溶液，采用酚、氯仿核酸抽提法提取RNA，用无DEPC水溶解总RNA；也可从生物试剂公司购买商品化的动物组织基因RNA提取和纯化试剂盒，提取样品RNA。可用实验室常用的Trizol方法提取样品RNA。
提取后稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50的每个反应管；如果是组织、血液（抗凝血）、血清和细胞组织等材料可直接提取RNA，荧光RT-PCR和普通RT-PCR实验用同批次提取的RNA。
（2）、反应组分配制：分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、模板RNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、阳性质控品和DEPC-H2O制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、阴性质控品和DEPC-H2O制成阴性对照物；
具体本实施例，取一支0.2ml光学PCR反应管，根据不同的PCR仪选择 反应管，本实施例中，选择ABI7500荧光定量PCR仪，反应总体积为25μL,向反应管中加入下列反应物：
每次检测时，设立用水代替病毒RNA样品的4个阴性对照（或正常组织、细胞阴性对照）；设立相当于1000、100、10、1TCID50/每反应管的WNV标准各4个对照；每个样品检测做3管平行试验。
（3）、标准品稀释制作标准曲线：对定量用标准品进行多种比例的稀释后制作标准曲线；本实施例中对定量用标准品进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释，然后根据已知量，计算出各个浓度对应的绝对模板数。做荧光定量PCR检测，以拷贝数的对数为Y轴，Ct值为X轴作回归曲线，获得标准曲线。
（4）、扩增：分别将检测管、阳性对照管和阴性对照管放入PCR仪进行扩增，首先50℃下反转录20min，接着95℃预变性3min，95℃下变性10sec，在60℃下退火延伸45sec，采集荧光信号，进行40个PCR循环；
（5）结果判定：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果。
直接读取检测结果，基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
当内标检测结果的CT值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效。若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时，结果无效，需重复此样品的检测，并根据标准曲线作出定量。
判定结果包括定性结果判定和定量结果判定；
所述定量结果判定为：根据标准曲线得到Ct值，作出定量结果判定。定量结果判断：
先根据标准品稀释制作标准曲线，对定量用标准品进行多种比例的稀释后与未知样品同时做荧光PCR检测；然后根据已知量，计算出各个浓度对应的核酸拷贝数；以标准品的核酸拷贝数的对数值为Y轴，荧光PCR检测的Ct值为X轴作回归曲线，获得标准曲线；将样品的检测Ct值代入标准曲线公式算出未知样品的核酸浓度。
定量用的标准品:荧光PCR结果出现典型的扩增曲线，指数区较明显，制作的标准曲线的7个点具良好的线性范围，相关系数在0.98以上。
定性结果判定：
Ct值＞40.0或无扩增曲线，表示样品中无西尼罗病毒；
Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在西尼罗病毒；
Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。
阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线，一直为水平线。
阳性对照的Ct值应小于30.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，特别是在Threshold(荧光临界值)附近。否则，此次实验视为无效。
内标探针与靶基因检测探针是竞争性的与样品核酸结合，因此，对阳性 样品的检测会出现以下三种情况：阳性浓度较小时，可明显看到阳性样品中靶基因和内标的扩增曲线，如图1所示，随着阳性浓度的增加，内标的荧光增量会明显降低，如图2所示，当阳性浓度增加到一定浓度时，内标的荧光增量会非常低，以至于没有出见明显的扩增曲线如图3所示。
特异性比较检测试验：
用WNV荧光定量RT-PCR对西尼罗病毒（WNV）、新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡贫血病毒(CAV)以及鸡胚、野外采集鸡的组织样品和血清进行特异性比较检测。在每份待检样品中加入10ul内标溶液，然后对样品进行病毒RNA纯化和荧光PCR检测。具体步骤同上，在此不再赘述。当内标检测结果的CT值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效。若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时，结果无效，需重复此样品的检测。
阳性样品的Ct值均小于或等于35.0，阴性对照品的Ct值均大于40.0或无Ct值，试验特异性强。经对大量阳性和阴性样品检测结果的统计分析，确定了Ct值40.0可作为是阳性和阴性的临界值。Ct值大于40可判为阴性，Ct值小于或等于35.0可判为阳性，在35.0～40.0之间为可疑，须重新试验。
结果分析：
实验结果如下表所示，非洲猪瘟样品的检测结果为阳性，Ct值为28.3内标为32.4，其余样品的检测结果均为阴性。
从上述试验结果可以看出：本发明的试剂和试剂盒具有良好的特异性。
常规RT-PCR的上游引物和下游引物与荧光定量RT-PCR相同，扩增目标片段长度为112bp，按常规方法进行扩增。检测用3%琼脂糖电泳分析，阳性扩增结果出现一条112bp特异性条带。
测量精密度：
配制三个批次试剂盒，分别用107copies/ml和103copies/ml2个浓度水平的样品各重复检测6次，计算Ct值的平均值和变异系数（CV,%）。根据用西尼罗病毒实时荧光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序，配制相应的反应液对样品RNA进行上机检测，具体步骤同上，在此不再赘述。
结果分析：
从实验结果可看出高低两个浓度的检测结果的批间和批内变异系数基本都在1％左右，表明本实验建立的方法具有较好的稳定性和重复性。
灵敏度试验
将阳性样品提取后稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50的核酸浓度；每个浓度重复检测6次。根据用西尼罗病毒实时荧光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序，配制相应的反应液对样品RNA进行上机检测，具体步骤同上，在此不再赘述。从实验结果可看出该方法可检测出0.1TCID50浓度的样品。
标准曲线绘制：
如下表标准浓度与Ct值，绘制如图4所示的标准曲线。
| 标准浓度(10n) | 平均Ct值 |
| 7 | 14.12 |
| 6 | 18.79 |
| 5 | 22.52 |
| 4 | 26.22 |
| 3 | 29.9 |
| 2 | 32.42 |
| 1 | 35.56 |
<110>深圳澳东检验检测科技有限公司
<120>西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法
<130>
<160> 5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CGTCTGTTCA AAGGCTTTCA A 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
GATAGGAACT TTGCAAGGTC CA 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>3
CTCCCGCAGA CACAGGTCAC GGC 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>4
CTGCAGGCAA CGCAGCCGTC ACC 23
<210>5
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>5
CGTCTGTTCA AAGGCTTTCA AGTTTCTTGG GACTCCCGCA GACACAGGTC ACGGCACTGT GGTGTTGGAA TTGCAGTACA CTGGCACGGA TGGACCTTGC AAAGTTCCTA TC 112
<210>6
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>6
CGTCTGTTCA AAGGCTTTCA AGTTTCTTGG GACTGCAGGC AACGCAGCCG TCACCACTGTG GTGTTGGAATT GCAGTACACTG GCACGGATGG ACCTTGCAAA GTTCCTATC 109
Claims (9)
1.一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂是针对以西尼罗病毒E基因的保守片段为靶目标的，包括：
引物：WNV-PF909：5′-CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3′
WNV-PR999：5′-GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3′
探针：WNV-PB941：5′-CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3′
内标探针： WNV-PBIC ：5′-CTGCAGGCAACGCAGCCGTCACC-3′，
所述探针和内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团；
所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
2.根据权利要求1所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
3.根据权利要求1所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括作为内标的假病毒，用于制作所述假病毒的内标核苷酸序列为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
4.一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、DEPC-H2O、阳性质控品、阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液；
其中，所述PCR混合液中包含：
引物：WNV-PF909：5′-CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAA-3′
WNV-PR999：5′-GATAGGAACTTTGCAAGGTCCA-3′
探针： WNV-PB941：5′-CTCCCGCAGACACAGGTCACGGC-3′
所述假病毒内标溶液中包含：内标核苷酸序列制作的假病毒；
所述探针和内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团；
所述引物和探针对应于西尼罗病毒E基因的保守片段，所述西尼罗病毒E基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
5.根据权利要求4所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
6.根据权利要求5所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，用于制作假病毒的内标核苷酸序列为：
CGTCTGTTCAAAGGCTTTCAAGTTTCTTGGGACTGCAGGCAACGCAGCCGTCACCACTGTGGTGTTGGAATTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATC。
7.根据权利要求5所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中各种试剂的含量为：
PCR混合液 400μL
Taq DNA聚合酶（5U/μL） 25μL
AMV酶 25μL
DEPC-H2O 1mL
阳性质控品 1.2mL
阴性质控品 1.2mL
定量用标准品 2 mL
假病毒内标溶液 500μL。
8.一种西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，采用权利要求4的试剂盒，检测方法包括以下步骤：
（1）、总RNA提取：在待测样品中加入假病毒内标溶液后，提取待测样品的RNA，得到模板RNA溶液；
（2）、反应组分配制：分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、模板RNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、阳性质控品和DEPC-H2O制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、AMV酶、阴性质控品和DEPC-H2O制成阴性对照物；
（3）、标准品稀释制作标准曲线：对定量用标准品进行多种比例的稀释后制作标准曲线；
（4）、扩增：分别将检测物、阳性对照物和阴性对照物放入PCR仪进行扩增， 首先50℃下反转录20min，接着95℃预变性3min，95℃下变性10sec，在60℃下退火延伸45sec，采集荧光信号，进行40个PCR循环；
（5）结果判定：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果；当内标检测结果的Ct值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效；若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时结果无效，需重复此样本的检测。
9.根据权利要求8所述的西尼罗病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中，判定结果包括定性结果判定和定量结果判定；
所述定性结果判定为：
Ct值＞40.0或无扩增曲线，表示样品中无西尼罗病毒；
Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在西尼罗病毒；
Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性；
所述定量结果判断为：先根据标准品稀释制作标准曲线，对定量用标准品进行多种比例的稀释后与未知样品同时做荧光PCR检测；然后根据已知量，计算出各个浓度对应的核酸拷贝数；以标准品的核酸拷贝数的对数值为Y轴，荧光PCR检测的Ct值为X轴作回归曲线，获得标准曲线；将样品的检测Ct值代入标准曲线公式算出未知样品的核酸浓度。
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