CN103866050B - 猪流行性腹泻病毒荧光定量pcr检测方法及其引物 - Google Patents

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Abstract

一种生物技术领域的猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法及其引物，通过PCR扩增、克隆获得阳性重组质粒，然后以已知浓度的目的基因作为模板进行荧光定量PCR反应，作出标准曲线图以及标准曲线，用于测算出待测样品中的病毒含量；通过样品检测结果与标准曲线对比，确定样品中试剂的目的基因拷贝数，同时也可以作为实验室检测PEDV增殖曲线的一种手段。该方法适用于病毒样品的临床检测，检测只需在2小时内即可完成，大大缩短了检测时间，能为我国PEDV疫情的防控起到很好的应用作用。

Description

猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法及其引物
技术领域
本发明涉及的是一种生物基因检测技术领域的方法及检测引物，具体是一种猪流行性腹泻病毒N基因Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法及其引物。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种对猪群具有强感染性的病毒，可引起猪群出现水样腹泻、呕吐、厌食消瘦的症状，尤其对初生仔猪的发病率和致死率可达90-100％。该病毒引起的猪流行性腹泻病(Porcine epidemicdiarrhea,PED)1971年首次在比利时爆发，之后在捷克、中国、韩国、越南及美国等国家均有爆发。自2010年10月以后，由新的流行株所引起的PED开始在我国和美国等地爆发，给我国和世界养猪业造成了重大经济损失。因此建立快速、灵敏、成本低又操作方便的检测方法十分必要。
PEDV编码四种结构蛋白，分别为纤突(S)蛋白、小膜(E)蛋白、膜内蛋白(M)和核衣壳(N)蛋白，其中N蛋白是长度为441个氨基酸，可以广泛磷酸化，是病毒核糖核蛋白的组成部分，含有3个相对保守的结构域，有6-7个潜在的磷酸化位点。N蛋白的主要功能是在病毒RNA合成过程中发挥重要作用，可以参与病毒基因组的转录，它能与细胞膜和磷脂结合，促进病毒核心的形成以及病毒RNA的组装。由于N蛋白高度保守，且随着病毒复制过程表达量较高，在猪感染PEDV的早期，即可以检测到针对N蛋白的抗体。因此N蛋白所有这些特征使得病毒得到准确和尽早诊断提供了可能，可以利用N蛋白来建立针对PEDV分子生物学诊断技术。目前已经建立了许多PEDV的荧光定量PCR检测法，但均与本方法有所不同。
中国专利文献号CN103667531A公开(公告)日2014.03.26，公开了一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)的ORF3保守基因序列为参考，设计、优化出一对特异的PCR引物，建立一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的SYBRGreenI实时荧光PCR方法。该方法检测灵敏度比RT-PCR高100倍，并且避免了常规PCR电泳检测所带来的高污染率。因此，该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点，该方法可用于猪场PEDV快速检测。但该技术假阳性率较高，敏感性较低，精确性较差。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法及其引物，根据猪流行性腹泻病毒的N基因序列设计引物，通过对荧光定量(RT-PCR)反应条件的优化，具有较好的特异性和重复性，比普通PCR检测方法敏感794倍的同时可以广泛用于PEDV的快速检测。
本发明可以相对定量地检测目的基因，该方法适用于病毒样品的临床检测，能为我国PEDV疫情的防控起到很好的应用作用。由于探针法荧光定量PCR方法的假阳性率低于SYBR Green染料法，检测结果更加准确。可以通过样品检测结果与标准曲线对比，确定样品中试剂的目的基因拷贝数，同时也可以作为实验室检测PEDV增殖曲线的一种手段。
该方法能够同时适用与对PEDV流行株与经典毒株的检测。该引物的扩增产物为169bp的引物对，并以此设计荧光探针寡核苷酸序列。根据设计的引物及探针，建立并优化荧光定量PCR方法，并通过构建阳性质粒，设置标准品为109-103拷贝数加至反应体系中，扩增得到标准曲线，标准曲线的线性良好，并且所得的相关系数为0.999。通过进一步验证，发现该方法特异性、敏感性及重复性结果较好。说明该方法在临床应用上能够有更高的准确性。同时，与传统的TCID50法测定病毒增殖曲线相比，本方法所测定的PEDV增殖曲线符合病毒增殖规律，可以作为一种快速的测定增殖曲线的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒的引物，包括如Seq ID No.1所示的上游引物序列PEDV-P1、如Seq ID No.2所示的下游引物序列PEDV-P2及如Seq ID No.3所示的探针PEDV-MGB。
本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法，PCR扩增、克隆获得阳性重组质粒，然后以已知浓度的目的基因作为模板进行荧光定量PCR反应，作出标准曲线图以及标准曲线，用于测算出待测样品中的病毒含量。
所述的PCR扩增、克隆是指：采用上述上、下游引物进行PCR扩增目的片段，鉴定为阳性的PCR产物，克隆到pMD18-T载体并转化到DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆。
所述的标准曲线是指质粒浓度与Ct值的比例曲线，该标准曲线通过以下步骤获得：由质粒提取试剂盒提取重组质粒，用紫外分光光度计测定OD260nm值，并将质粒浓度换算成拷贝数/μL，对模板进行定量RT-PCR反应，并在每一循环的延伸温度结束时采集荧光信号进行实时检测；最后进行熔解曲线分析PCR扩增产物的特异性。
所述的模板是指：已知病毒拷贝数的标准DNA模板，经10倍系列稀释，且同一稀释梯度做重复孔对照，优选为每个模板浓度做3个重复，取平均值计算变异系数。
所述的荧光定量PCR反应体系总体积为25μL，包括：10×EX Taq Buffer(Mg2+plus)2.5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)2.5μL、250μM的上、下游引物各1μL、5U/μL的Ex Taq 0.2μL、10pmol/μL的探针0.5μL、质粒模板1μL、DEPC水16.3μL。
所述的荧光定量PCR反应条件如下：94℃预变性2min，再以40个循环进行PCR扩增，每循环以94℃变性20s，50℃延伸20s，最后72℃延伸10min。
技术效果
本发明检测样本病毒滴度在106-100.1TCID50之间，Ct值与质粒拷贝数的对数之间呈现很好的线性关系，相关系数R2＝0.999。以不同病毒(猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒由本发明室采集保存，猪瘟病毒疫苗株和猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗株均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)的DNA作为模板，同时设阴性和阳性对照，进行荧光定量PCR检测。结果显示只有阳性对照出现扩增曲线，其他均未出现扩增曲线，表明该方法特异性强。在同一反应体系进行批间重复，每个样品3个重复，Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)变异系数分别为：0.94％、0.72％、0.54％，均小于5％。表明误差都非常小，扩增效率稳定。
与现有技术相比，本发明的技术效果在于，可以相对定量地检测目的基因，由于探针法荧光定量PCR方法的假阳性率低于SYBR Green染料法，检测结果更加准确。可以通过样品检测结果与标准曲线对比，确定样品中试剂的目的基因拷贝数，同时也可以作为实验室检测PEDV增殖曲线的一种手段。该方法适用于病毒样品的临床检测，能为我国PEDV疫情的防控起到很好的应用作用。本发明采用TaqMan荧光定量PCR，相比普通PCR检测方法特异性高，假阳性低，扩增与检测一步完成，不易污染，不需要对产物进行电泳等后期处理，操作更简便，检测只需在2小时内即可完成，大大缩短了检测时间。
附图说明
图1为本发明荧光定量PCR扩增动力学曲线示意图。
图2为本发明荧光定量PCR标准曲线示意图。
图3为本发明普通PCR检测方法电泳图；
图中M：分子量标准DL2000；1-7泳道从左到右依次加入模板病毒的毒价分别为107、106、105、104、103、102、101TCID50。
图4为本发明PEDV N基因荧光定量PCR方法特异性实验示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1)设计、合成引物和探针
根据本发明室保存的PEDV毒株HLJ/2011的N基因序列，比对GenBank中PEDVCV777、Br1/87、CH/S、ZJCZ4、CHGD1、BJ-2012-1毒株的N基因设计特异性引物，扩增目的片段大小为169bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
上游引物如Seq ID No.1所示，下游引物如Seq ID No.2所示。
2)N基因的克隆
待VERO细胞长到单层约90％密度时，将培养基弃去并用PBS溶液漂洗2次，按照MOI:0.5的量将PEDV-HLJ/2011病毒液加入T25培养瓶中，并补充含10μg/mL胰酶的无血清DMEM培养基至1mL。将培养瓶放入37℃培养箱中孵育2h，在孵育过程中每隔15min轻轻晃动培养瓶，待孵育结束后加入4mL细胞维持液(含有10μg/mL胰酶、2％的DMEM)后继续培养约4-5d，每天观测细胞病变(CPE)情况，待80％的VERO细胞出现CPE后，将培养瓶放入-80℃冰箱，反复冻融3次后，将病毒液取出，以9000g离心5min，取上清-80℃保存备用。病毒RNA提取按照QIAGEN试剂盒的说明书，将250μL已离心好的病毒液上清进行总RNA提取。
按照Thermo ReverAid First strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的说明书反转录，总cDNA样品保存至-80℃。采用25μL的PCR反应体系，反应条件为：94℃预变性2min，再以40个循环进行PCR扩增，每循环以94℃变性20s，50℃延伸20s，最后72℃延伸10min。PCR扩增完成后，取10μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用Omega琼脂糖核酸凝胶回收试剂盒纯化回收，克隆到pMD18-T载体并转化到DH5α平板，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，并进行测序鉴定。
3)标准曲线的建立
重组质粒由质粒提取试剂盒提取，用紫外分光光度计定量，标准品系列稀释为终浓度在1.53×109-103拷贝数/μL。定量RT-PCR反应体系为25μL，包括：10×EX Taq Buffer(Mg2+plus)2.5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)2.5μL、250μM的上、下游引物各1μL、5U/μL的ExTaq 0.2μL、10pmol/μL的探针0.5μL、质粒模板1μL、DEPC水16.3μL。
在每一循环的延伸温度结束时采集荧光信号进行实时检测。最后进行熔解曲线分析PCR扩增产物的特异性。每个模板浓度做3个重复，取平均值计算变异系数，实验均设阴性对照。
将计算好拷贝数的标准DNA模板以10倍系列稀释，同一稀释梯度做重复孔对照，进行实时定量PCR扩增，该方法可以检测到的最低浓度为100.1TCID50病毒滴度。在稀释的线性浓度范围内，模板量与对应的Ct值相应之间线性相关，相关系数为0.999。Ct值分别为27.28，24.32，20.63，17.16，14.08，10.76，7.15，标准曲线的斜率为-3.358，截距为37.49，直线方程为Y＝-3.358LogX+37.49。
3)敏感性试验
普通PCR最低能检测到103TCID50病毒滴度(图3)，而荧光定量方法能检测的最低模板量为100.1TCID50病毒滴度，比普通PCR检测方法敏感794倍。
4)特异性试验
利用本发明建立的实时定量PCR检测方法，分别检测了PEDV、PRRSV疫苗株、TGEV疫苗株、CFSV疫苗株，PoRV疫苗株。结果显示只有猪流行性腹泻病毒(PEDV)毒株呈阳性反应，其它病毒均呈阴性(图4)。
5)稳定性试验
取拷贝数为107,106,105的模板分别做3次重复试验，无论是批内还是批间Ct值变异系数均小于5％，说明该方法具有较好的重复性(见下表)。
荧光定量PCR方法重复性实验结果
实施例2
1)临床粪便样品的采集，临床粪便样品加2倍体积的PBS，冻融3次，取上清作为提取备用液-80℃保存备用。病毒RNA提取按照QIAGEN试剂盒使用说明操作。
2)PCR体系为：10×EX Taq Buffer(Mg2+plus)2.5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)2.5μL、250μM的上、下游引物各1μL、5U/μL的Ex Taq 0.2μL、10pmol/μL的探针0.5μL、DNA模板1μL、DEPC水16.3μL。
3)反应条件：94℃预变性2min，再以40个循环进行PCR扩增，每循环以94℃变性20s，50℃延伸20s，最后72℃延伸10min。
4)根据荧光定量PCR结果和标准曲线计算样品中病毒的含量。
5)荧光定量PCR结果，荧光定量PCR仪会自动显示样品的浓度。

Claims (2)

1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒，即PEDV的引物和探针，其特征在于，由如Seq IDNo.1所示的上游引物序列PEDV-P1、如Seq ID No.2所示的下游引物序列PEDV-P2及如SeqID No.3所示的探针PEDV-MGB组成。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征是，所述的检测猪流行性腹泻病毒是指：通过PCR扩增、克隆获得阳性重组质粒，然后以已知浓度的目的基因作为模板进行荧光定量PCR反应，作出用于测算出待测样品中的病毒含量的标准曲线图以及标准曲线；
所述的PCR扩增、克隆是指：采用权利要求1中所述上、下游引物进行PCR扩增目的片段，鉴定为阳性的PCR产物，克隆到pMD18-T 载体并转化到DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆；
所述的标准曲线为：Y= -3.358LogX +37.49，其中：Y表示Ct值，X表示病毒数量，单位为拷贝数/mL；
所述的模板是指：已知病毒拷贝数的标准DNA模板，经10倍系列稀释，且同一稀释梯度做重复孔对照；每个模板浓度做3个重复，取平均值计算变异系数；
所述的荧光定量PCR反应体系总体积为25μL，包括：10倍含Mg2+的EX Taq Buffer 2.5μL、dNTP Mixture 2.5μL、250μM的权利要求1中所述上、下游引物各1μL、5U/μL的Ex Taq 0.2μL、10pmol/μL的探针 0.5μL、质粒模板 1μL、DEPC 水 16.3μL；
所述的荧光定量PCR反应条件如下：94℃预变性2min，再以40个循环进行PCR扩增，每循环以94℃变性20s，50℃延伸20s，最后72℃延伸10min。
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