CN105296669A - 传染性造血器官坏死病毒（ihnv）的rt-lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）？RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶、逆转录酶和对照；试剂盒还可以有显色剂。其检测方法是通过提取待检病毒RNA，利用逆转录酶的逆转录活性，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对样品RNA模板进行扩增，可检测到纯病毒RNA的pg级，其鉴定采用加入SYBR？Green？I？ESE-Quant-tube？Scanner仪器检测或者利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化判断扩增与否，确定待检样品是否含有传染性造血器官坏死病毒RNA。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。

Description

传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

传染性造血器官坏死病（Infectioushaematopoieticnecrosis，IHN）是OIE规定需要通告的3种弹状病毒(rhabdovirus)性疾病之一。IHN最初流行于北美西部地区，主要存在于溯河产卵的鲑鱼群中。上世纪70年代，传染性造血器官坏死病毒（IHNV）感染成为了美国人工养殖的虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)的重要病原。接着IHN随着污染了病毒的鱼卵传到了西欧以及东亚的不少国家。虹鳟在这些国家是一种引进品种，IHN对虹鳟养殖造成了严重的经济损失。同弹状病毒（Rhabdoviridae）科粒弹状病毒（Novirhabdovirus）属的其他成员相似的是，IHNV为单负股RNA病毒，病毒基因组由11000个核苷酸组成，编码6个蛋白，病毒粒子呈子弹状。遗传进化分析显示，北美地区分离到的IHNV毒株的基因变异程度较低。而在欧洲、日本以及韩国的虹鳟中分离到的IHNV毒株的差异却较大，这显示出病毒在引入上述几个地区之后是各自独立遗传进化的。IHNV出现的基因变化被认为同宿主特异性和毒力的改变有关。传染性造血器官坏死病（IHNV）最初在造血组织内增殖，其后侵袭到其他内脏器官。经解剖可观察到，鱼的鳃丝褪色呈苍白色，显著贫血，肝、脾、肾也褪色，贫血。病鱼初期呈昏睡状，游动迟缓，有时沉底；随水流漂浮在水面上的病鱼体色发黑，眼球突出，腹部膨大，鳍基充血，不透明，粘液状管型粪便悬挂于肛门，体侧肌肉组织如背鳍区和一些鳍基部的骨胳肌中有“V”形出血斑块的症状。

培养分离传染性造血器官坏死病毒一般需要15天以上才能得出结果，检测周期太长，不适应口岸快速检测和大通关的时代要求。

因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。

利用恒温扩增技术原理研究开发的IHNV检测方法与检测试剂盒能快速、准确地检测传染性造血器官坏死病（IHNV），便于在基层水产养殖站受实验条件限制，无法承受昂贵的仪器费用环境下，为鱼类的传染性造血器官坏死病进行诊断、确诊提供依据，以便及时采取相应措施，防止大面积传播。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种传染性造血器官坏死病毒的RT-LAMP检测引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种传染性造血器官坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供传染性造血器官坏死病毒的RT-LAMP检测方法。

本发明所采用的技术方案如下：

一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

IHNV-F3：CTATCTAGACGAACTGGTGAAG（SEQIDNO:1）；

IHNV-B3：GTGAAGTTGGTAGCGTGAT（SEQIDNO:2）；

IHNV-FIP：ATGCGGAGATCGGAACTTGGGCACGCCGAGATAATATCAA（SEQIDNO:3）；

IHNV-BIP：TCTACGCTATGCACAAAGGCTCTCCTGTCCTTGGATACCTC（SEQIDNO:4）；

IHNV-LF：ATAGGAGGTATGGAGTCACACT（SEQIDNO:5）；

IHNV-LB：CATGACGGTCGTTGTGGA（SEQIDNO:6）。

一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其包括权利要求1所述的检测引物组。

一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，包括以下成分：（1）权利要求1所述的引物组；（2）逆转录酶；（3）DNA聚合酶；（4）RT-LAMP反应液；（5）阳性对照和阴性对照。

上述检测试剂盒，其引物组中外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1：8：4。

上述检测试剂盒，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；所述逆转录酶为AMV逆转录酶。

上述检测试剂盒，所述RT-LAMP反应液含有：10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2。

上述检测试剂盒，所述阳性对照为含有传染性造血器官坏死病毒（IHNV）囊膜糖蛋白基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC水。

本发明的检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为荧光染料SYBRGreenI。

利用上述的试剂盒检测传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的方法，包括如下步骤

（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA；

（2）恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：IHNV-F30.2μM，IHNV-B30.2μM，IHNV-FIP1.6μM，IHNV-BIP1.6μM，IHNV-LF0.8μM，IHNV-LB0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA1~100ng，用DEPC水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应60～90min，并在80℃持续2min；

（3）结果判断：通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。

在试剂盒中含有显色剂的情况下，往反应管中加入10×SYBRGreenI0.5μl，然后将反应管中置于ESE-QuantTubeScanner中，根据仪器所实时读取的荧光信号来判断扩增结果。

本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果：

（1）快速高效：整个扩增只用60～90min即可完成，扩增产量可达10⁹～10¹⁰个拷贝；

（2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；

（3）高特异性：

本发明根据传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的囊膜糖蛋白基因（glyG基因，GenBank登录号为DQ164100.1）设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；

（4）高灵敏度：最低检测极限可达到3.6ng/反应；

（5）鉴定简便：可通过观察加入SYBRGreenI颜色变化或者是否存在焦磷酸镁沉淀来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。

附图说明

图1-3是实施例4的检测结果，图1：（1、2：无RNase水对照；3、4：IHNVRNA；5、6：SVCVRNA；7、8：VHSVRNA）；图2：（1、2：IHNVRNA；3、4：HRVRNA；5、6：PFRVRNA；7、8：无RNase水对照）；图3：（1、2：无RNase水对照；3、4：IHNVRNA；5、6：IPNVRNA）

图4是实施例5的检测结果图（IHNVRNA，1：10⁰倍稀释；2：10¹倍稀释；3：10²倍稀释；4：10³倍稀释；5：10⁴倍稀释；6：10⁵倍稀释；7：10⁶倍稀释；8：DEPC水对照）。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1传染性造血器官坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒的建立

传染性造血器官坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒，包括RT-LAMP引物组、RT-LAMP反应液、BstDNA聚合酶、AMV逆转录酶、阳性对照和阴性对照。

（1）RT-LAMP引物设计：以传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的囊膜糖蛋白基因（glyG基因，GenBank登录号为DQ164100.1）为靶基因，利用在线设计软件PrimerExplorerversion4(http://primerexplorer.jp/e)进行LAMP引物的设计。引物序列见表1。

表1引物序列表

（2）RT-LAMP反应液：含有10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2。

（3）阳性对照为含有传染性造血器官坏死病毒（IHNV）囊膜糖蛋白基因片段的T载体克隆，其制备方法为：以分离鉴定的传染性造血器官坏死病毒为模板，利用表1中的外引物（SEQIDNO:1和SEQIDNO:2）对IHNVRNA进行反转录，得到含靶基因序列的cDNA，后再用外引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2）扩增，所得基因片段长度为297bp，序列如SEQIDNO:7所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。

（4）阴性对照为DEPC水。

实施例2使用浊度仪建立传染性造血器官坏死病毒RT-LAMP检测方法：

利用实施例1的试剂盒检测传染性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤：

（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA；

（2）恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：IHNV-F30.2μM，IHNV-B30.2μM，IHNV-FIP1.6μM，IHNV-BIP1.6μM，IHNV-LF0.8μM，IHNV-LB0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，AMV逆转录酶1U，BstDNA聚合酶8U，待检RNA1~100ng，用DEPC水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应60～90min，并在80℃持续2min；

（3）结果判断：通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。如果出现沉淀则为阳性，无沉淀则为阴性。

实施例3ESE-Quanttubescanner检测

试剂盒中除增加实施例1中没有的显色剂（SYBRGreenI）外，其余同实施例1。

用上述试剂盒按以下方法对待测传染性造血器官坏死病毒（IHNV）进行检测：

（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取纯化待测样品RNA；

（2）恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：IHNV-F30.2μM，IHNV-B30.2μM，IHNV-FIP1.6μM，IHNV-BIP1.6μM，IHNV-LF0.8μM，IHNV-LB0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，AMV逆转录酶1U，BstDNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检RNA1~100ng，用DEPC水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，于65℃反应60min，并在80℃持续2min；

（3）结果判断：将反应管放置在ESE-QuanttubeScanner中进行反应，观察ESE-TubeScanner软件判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。

实施例4特异性实验

用实施例3的方法分别对分离纯化的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）RNA、鲤春病毒血症病毒病毒（SVCV）RNA、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）RNA，以及牙鲆弹状病毒（HRV）、狗鱼幼鱼弹状病毒（PFRV）、传染性胰坏死病毒（IPNV）RNA进行检测。

鉴定结果显示：以传染性造血器官坏死病毒（IHNV）RT-LAMP引物为引物，IHNVRNA正常扩增，阴性水对照及SVCV、IHNV没有扩增，显示出良好的特异性（见图1）。IHNVRNA正常扩增，阴性水对照及HRV、PFRV没有扩增，显示出良好的特异性（见图2）。IHNVRNA正常扩增，阴性水对照及IPNVRNA没有出现扩增，显示出良好的特异性（见图3）。

实施例5灵敏度实验

将已纯化的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）RNA作10倍梯度稀释，用实施例2的操作方法分别对稀释后的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）RNA进行检测。

鉴定结果显示：以IHNVLAMP引物为引物，10⁰~10⁶倍稀释IHNVRNA，10⁰、10¹、10²、10³、10⁴倍稀释RNA发生扩增，10⁵、10⁶倍稀释及阴性水对照没有扩增。经RNA含量的测量，得到传染性造血器官坏死病毒（IHNV）引物能检测到ng级IHNVRNA（见图4）。

以上实施例表明，本发明的方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。

SEQIDNO:1

GCACGCCGAGATAATATCAA；

SEQIDNO:2

TCTGGAATAATGGTGGTGTTG；

SEQIDNO:3

GAGCCTTTGTGCATAGCGTAGAAGTGTGACTCCATACCTCC；

SEQIDNO:4

ATGACGGTCGTTGTGGACGGTGAAGTTGGTAGCGTGAT；

SEQIDNO:5

GATGCGGAGATCGGAACTT；

SEQIDNO:6

GATGCGGAGATCGGAACTT；

SEQIDNO:7

gtcttgaggcgcacgccgagataatatcaacaaacagtgtgactccatacctcctatccaagttccgatctccacatcccggaataaatgacgtctacgctatgcacaaaggctccatctatcacgggatgtgcatgacggtcgctgtggacgaggtatccaaggacaggacgacgtacagggcccatcgcgctaccagcttcacgaaatgggaacgaccctttggggatgagtgggagggctttcacggattgcacggaaacaacaccaccattattccagacctggagaaatacg

Claims (10)

1.一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

IHNV-F3：CTATCTAGACGAACTGGTGAAG（SEQIDNO:1）；

IHNV-B3：GTGAAGTTGGTAGCGTGAT（SEQIDNO:2）；

IHNV-FIP：ATGCGGAGATCGGAACTTGGGCACGCCGAGATAATATCAA（SEQIDNO:3）；

IHNV-BIP：TCTACGCTATGCACAAAGGCTCTCCTGTCCTTGGATACCTC（SEQIDNO:4）；

IHNV-LF：ATAGGAGGTATGGAGTCACACT（SEQIDNO:5）；

IHNV-LB：CATGACGGTCGTTGTGGA（SEQIDNO:6）。

2.一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组。

3.根据权利要求2所述的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：（1）权利要求1所述的引物组；（2）逆转录酶；（3）DNA聚合酶；（4）RT-LAMP反应液；（5）阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求3所述的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1：8：4。

5.根据权利要求3所述的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；所述逆转录酶为AMV逆转录酶。

6.根据权利要求3所述的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述RT-LAMP反应液含有：10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2。

7.根据权利要求3所述的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：阳性对照为含有传染性造血器官坏死病毒（IHNV）囊膜糖蛋白基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC水。

8.利用权利要求2～7任一项所述的试剂盒检测传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的方法，包括如下步骤：

（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA；

（2）恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：IHNV-F30.2μM，IHNV-B30.2μM，IHNV-FIP1.6μM，IHNV-BIP1.6μM，IHNV-LF0.8μM，IHNV-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA1~100ng，用DEPC水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应60～90min，并在80℃持续2min；

（3）结果判断：通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。

9.根据权利要求3所述的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：还含有显色剂SYBRGreenI。

10.利用权利要求9所述的试剂盒检测传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的方法，包括如下步骤：

（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取纯化样品RNA；

（2）恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：IHNV-F30.2μM，IHNV-B30.2μM，IHNV-FIP1.6μM，IHNV-BIP1.6μM，IHNV-LF0.8μM，IHNV-LB0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检RNA1~100ng，用DEPC水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应60～90min，并在80℃持续2min；

（3）结果判断：将上述反应管中置于ESE-QuantTubeScanner中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。