CN101440411A - 一种检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒和核苷酸序列 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒和核苷酸序列，属于检验检疫领域。一组检验三种鱼类弹状病毒的寡核苷酸序列，为序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.9所示的寡核苷酸序列。本发明的优点是：实时荧光RT－PCR技术被应用到IHNV、VHSV和SVCV的检测中，进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测。通过反应条件的优化，该三重实时荧光RT－PCR最低可检测至102拷贝/反应的病毒量。该方法还对病毒混合感染EPC细胞(Epithelioma papulosum cyprini)和攻毒斑马鱼进行了检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的病毒检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒和核苷酸序列，更具体地说，是一种三重实时荧光RT-PCR检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒及其引物与探针，属于检验检疫领域。
背景技术
鱼传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic neCrosis virus，IHNV)，鱼病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)和鲤春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus，SVCV)是同属弹状病毒科(Rhabdoviridae)的三种鱼类病毒，也是影响水产养殖业的三种重要病毒。其中，IHNV和VHSV属于粒外弹状病毒属(Novirhabdovirus)，SVCV属于水泡病毒属(Vesiculovirus)，它们均是单链负股RNA病毒。这三种病毒广泛分布于欧洲、美洲和亚洲的许多地区，可感染多种鱼类，尤其是对鱼苗和幼鱼，能引起较高的死亡率，严重时均可达到90％以上。分别由这三种病毒引起的鱼传染性造血器官坏死病(Infectious hematopoietic necrosis，IHN)，鱼病毒性出血性败血症(Viral hemorrhagicsepticemia，VHS)和鲤春病毒血症(Spring Viraemia of Carp，SVC)一旦爆发，将会给水产养殖业带来灾难性的损失，所以它们是世界各国积极进行防制的三种鱼类疫病。
目前，常用的病毒检测方法是细胞培养分离病毒法、血清学方法以及聚合酶链反应(PCR)。细胞培养分离病毒法结果可靠，但检测周期长，不适用于快速鉴别诊断，而且往往还需要其他方法进行后继检测，才能确定病毒种类。普通PCR技术的应用，提高了检测的特异性和灵敏度，缩短了检测时间，取得了一定的效果。Williams等(1999年)还报到了使用多重RT-PCR检测IPNV、IHNV和VHSV的研究，大大提高了多种病毒检测时的工作效率。但是普通PCR方法检测病毒，需要后继的处理过程，步骤繁琐，耗时也较长，尤其是在检测几种病毒的时候，工作量仍然较大。
Zongxiao Liu等(Zongxiao Liu，Yong Teng，Hong Li，et al.Simultaneous detection ofthree fish rhabdoviruses using multiplex real-time quantitative RT-PCR assay.J VirolMethod，2008，149(1)：103-109.)(Zongxiao Liu，Yong Teng，Hong Li等人，多重实时荧光定量RT-PCR方法检测三种鱼类弹状病毒的研究。J Virol Method，2008，149(1)：103-109。)报道了以Taqman探针为基础的多重实时荧光RT-PCR同时检测IHNV、VHSV和SVCV的方法，他们混合三种不同浓度的病毒RNA作为模板，进行了干扰性实验，此实验并不能够完全排除探针之间的相互干扰，而且由于操作中可能存在的误差，也不能够保证相同模板量得到完全相同的Ct值，故而以此判断模板浓度对效率的影响也是不准确的。Zongxiao Liu等将其设计的多重实时荧光RT-PCR方法应用于临床检测样本分析，效果较好，但其文章中关于对病料的检测，并没有提到检测同时存在几种病毒的情况，因而也就不能够完全说明该方法在实际应用中对几种病毒同时检测的可行性及效果问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组作为引物或探针使用的、检测三种鱼类弹状病毒的寡核苷酸序列。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一组检验三种鱼类弹状病毒的寡核苷酸序列，为序列表SEQ ID No.1至序列表SEQID No.9所示的寡核苷酸序列；其中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为检验传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)的引物对，SEQ ID No.3为检验传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)的探针序列；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为检验病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的引物对，SEQ ID No.6为检验病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的探针序列；SEQ ID No.7和SEQ ID No.8为检验鲤春病毒血症病毒(SVCV)的引物对，SEQ ID No.9为检验鲤春病毒血症病毒(SVCV)的探针序列。详见表1。
所述探针序列SEQ ID No.3的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
所述探针序列SEQ ID No.6的5’端标记荧光报告基团VIC，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
所述探针序列SEQ ID No.9的5’端标记荧光报告基团NED，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
表1.探针和引物序列
在探针的选择上，Taqman MGB探针比常规Taqman探针更具有优势。TaqmanMGB探针在其寡核苷酸链的3’端标记了一种称为小沟结合物(minor groove binder，MGB)的非荧光性淬灭基团，它吸收报告基团的能量后本身不发出荧光，大大降低了本底荧光信号的干扰；而且MGB还可以提高探针的退火温度，缩短了探针长度，一方面使荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好；另一方面也进一步提高了探针的特异性。另外，进行多重实时荧光RT-PCR，对标记探针的荧光报告基团的选择也非常关键，在选择荧光报告基团时，要考虑所选荧光报告基团的发射波长之间的差距，最好应在20nm以上，例如我们选择的FAM、VIC和NED的组合就符合这个条件，而且，干扰性实验也证明，各探针和引物之间无相互干扰。
一种检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒，50tests/盒，保存于-20℃，由以下试剂组成：
(1)TRIZOL裂解液，购自INVITROGEN公司；
(2)DEPC水；自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，电阻率≥18.0MΩ.cm；
(3)RT-PCR反应液：14μl/检测，其组分为：含15mM Mg2+的M-MLV5×反应缓冲液，10mM dNTP，IHNV引物对IHNV FP/IHNV RP，各10μM，VHSV引物对VHSV FP/VHSV RP，各10μM，SVCV引物对SVCV FP/SVCV RP，各10μM，10μMIHNV探针，10μM VHSV探针，10μM SCVC探针，DEPC水；
(4)RNase抑制剂，40U/μl：购自普洛麦格公司；
(5)M-MLV反转录酶，200U/μl：购自安发玛西亚公司，货号27-9259-01；
(6)Taq DNA聚合酶，5U/μl：购自上海普洛麦格公司；
(7)阴性对照：DEPC水；
(8)阳性对照：IHNV、SVCV、VHSV三种病毒体外转录的RNA片段。
所述RT-PCR反应液中，IHNV FP为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，IHNVRP为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，VHSV FP为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，VHSV RP为序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，SVCV FP为序列表SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，SVCV RP为序列表SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，IHNV探针为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB，VHSV探针为序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB，SCVC探针为序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
本发明中本发明人以三重实时荧光RT-PCR对单种病毒模板进行检测，一方面，验证了三重方法的特异性，另一方面也排出了三种探针和相应引物之间的干扰性。而且多重和单重实时荧光RT-PCR的比较实验的结果也表明，单重实时荧光RT-PCR和多重实时荧光RT-PCR在相同模板检测上并没有明显差异，这也从另外一个方面说明探针和引物之间不存在相互干扰现象。
本发明人以体外转录的RNA进行敏感性实验，这样更能接近RNA病毒的真实情况。实验结果显示，多重实时荧光RT-PCR最低可以检测到102拷贝/反应的RNA模板量，具有较高的灵敏度。我们对三种病毒混合感染的EPC细胞和含有三种病毒的攻毒斑马鱼病料分别进行了检测，三重实时荧光RT-PCR可以对检测样本中的三种病毒做出准确的检测。由此我们也可以得出结论，在大批量多病毒样本检测中，完全可以用三重实时荧光RT-PCR取代单重实时荧光RT-PCR，以达到减少工作量，提高工作效率，减少检测成本的目的。
本研究在IHNV、VHSV和SVCV病毒基因序列比对分析的基础上，在病毒基因的高保守区域设计了三条分别针对该三种病毒的新型Taqman MGB探针，并选择三种无相互干扰的荧光报告基团进行标记，建立了三重实时荧光RT-PCR的检测方法，并与单重实时荧光RT-PCR进行了比较。同时，还对病毒混合感染的EPC细胞(Epithelioma papulosum cyprini)及攻毒斑马鱼进行了检测。该方法不仅具有单重实时荧光RT-PCR的特异性强，灵敏度高等诸多优点，而且通过一个RT-PCR反应就可以对几种病毒做出检测，大大减少了大批量病料样本多种病毒检测的工作量，提高了工作效率，节省了检测成本。
本发明的优点是：实时荧光RT-PCR技术被应用到IHNV、VHSV和SVCV的检测中，进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测。通过反应条件的优化，该三重实时荧光RT-PCR最低可检测至102拷贝/反应的病毒量。该方法还对病毒混合感染EPC细胞(Epitheliomapapulosum cyprini)和攻毒斑马鱼进行了检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的病毒检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为以优化的反应体系进行实时荧光RT-PCR，得到的三条分别代表IHNV、VHSV和SVCV的特异性扩增曲线。
图2为检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒的干扰性试验结果。
图3为三重和单重实时荧光RT-PCR检测方法的比较。
图4为检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒的特异性试验结果。
图5为检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒的灵敏度检测结果。
图6为混合感染细胞的检测结果。
图7为斑马鱼样品的检测结果。
具体实施方式
本发明所用病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)、传染性造血组织坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)、鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)、禽流感病毒(H5N1)和狂犬病病毒，以及EPC细胞系(Epitheliomapa pulosum cyprini)均为北京出入境检验检疫局技术中心鱼病检测室保存。斑马鱼购自北京市官园观赏鱼市场。
实施例1：Taqman MGB探针和引物的设计与合成
根据Genbank中登录的IHNV、VHSV和SVCV三种病毒的相关基因序列，用DNAMAN软件进行比对分析，分别选择三种病毒基因组中高度保守的区域，用PrimerExpress V2.0软件，分别设计出针对三种病毒的Taqman MGB探针和引物。分别用FAM、VIC、NED三种荧光报告基团标记三种探针的5’端，同表1。
引物和探针由上海基康生物技术有限公司合成。
实施例2：IHNV、VHSV和SVCV三种病毒RNA的提取
用TRIZOL裂解液(购自INVITROGEN公司)分别从感染IHNV、VHSV和SVCV的EPC细胞中提取三种病毒的RNA。
具体操作如下：
①向指管中加入600μl TRIZOL裂解液，然后加入感染病毒的EPC细胞悬液200μl，吹打混匀
②加入200μl氯仿，振荡混匀15sec，然后4℃，13,000rpm，离心15min
③将上清液移至500μl异丙醇中，颠倒混匀，然后置-20℃沉淀10min
④4℃，13,000rpm，离心15min
⑤吸弃上清液，向指管中加入75％乙醇600μl，颠倒洗涤
⑥4℃，13,000rpm离心10min，弃上清液
⑦4,000rpm，离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥1-5min。
⑧加入适当DEPC水，溶解管壁上的RNA，所得即为提取的RNA溶液。
实施例3：三重实时荧光RT-PCR的建立
对探针和引物浓度、镁离子浓度和酶浓度分别进行了优化，建立了三重实时荧光RT-PCR的反应体系。按照实施例2方法获得IHNV、VHSV和SVCV三种病毒的RNA，以IHNV、VHSV和SVCV的混合RNA做为模板，各病毒模板浓度约为104-106拷贝/微升，进行三重实时荧光RT-PCR，优化反应体系。
(1)探针和引物浓度的优化
对三种病毒的探针和引物分别进行优化。从0.1μM至0.8μM以0.1μM间距递增的引物浓度和从0.1μM至0.5μM以0.1μM间距递增的探针浓度交叉配比，进行实时荧光RT-PCR，以选择最适的引物和探针浓度。反应体系件见表2，所用引物和探针序列见表1：
表2 条件优化反应体系组成
(2)镁离子浓度的优化
通过加入MgCl2溶液(25mM)进行镁离子浓度的优化，分别以3.0mM，3.5mM，4.0mM，4.5mM，5.0mM的镁离子浓度进行实时荧光RT-PCR，以确定反应体系中镁离子的最适浓度。反应体系中其它条件见表3，所用引物探针序列见表1。
表3 条件优化反应体系组成
(3)DNA聚合酶用量的优化
分别以1.25U，2.5U，3.75U，5U的Taq DNA聚合酶的用量，进行实时荧光RT-PCR，以确定反应体系中Taq DNA聚合酶的最适用量。反应体系的其它条件同表3
以上实验采用的反应条件为：
42℃：30min，95℃：5min，1个循环；
95℃：15sec，60℃：1min(收集荧光信号)，40个循环。
二.结果：
经过多次试验最终引物浓度确定为0.6μM，探针浓度确定为0.2μM；不需要额外加入MgCl2溶液(25mM)，反应体系中M-MLV5×反应缓冲液(Mg2+，15mM)所含有的镁离子浓度为最终的浓度，即镁离子浓度确定为3.0mM；而Taq DNA聚合酶用量为1.25U/反应。
图1为以优化的反应体系进行实时荧光RT-PCR，得到的三条分别代表IHNV、VHSV和SVCV的特异性扩增曲线。
实施例4：检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒及其使用
一、试剂盒的组成(50tests/盒，保存于-20℃)
(1)TRIZOL裂解液：40ml×1管，购自INVITROGEN公司，货号10296；
(2)DEPC水：1ml×1管，自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，电阻率≥18.0MΩ.cm；
(3)RT-PCR反应液，750μl×1管，14μl/检测，每14μl RT-PCR反应液组成如下：
表4 RT-PCR反应液组成
| 组分 | 体积 |
| M-MLV5×反应缓冲液(Mg2+，15mM) | 5.0μl |
| 10mM dNTP | 0.5μl |
| IHNV引物对(IHNV FP/IHNV RP，各10μM) | 1.5μl |
| VHSV引物对(VHSV FP/VHSV RP，各10μM) | 1.5μl |
| SVCV引物对(SVCV FP/SVCV RP，各10μM) | 1.5μl |
| 10μM IHNV探针 | 0.5μl |
| 10μM VHSV探针 | 0.5μl |
| 10μM SCVC探针 | 0.5μl |
| DEPC水 | 2.5μl |
M-MLV5×反应缓冲液(Mg2+，15mM)，10mM dNTP购自普洛麦格公司，引物和探针序列见表1，均委托上海基康生物技术有限公司合成；
(4)RNase抑制剂：40U/μl，30μl×1管，购自普洛麦格公司；
(5)M-MLV反转录酶：200U/μl，15μl×1管，购自安发玛西亚公司；
(6)Taq DNA聚合酶：5U/μl，15μl×1管，购自上海普洛麦格公司；
(7)阴性对照：以DEPC水作为阴性对照；
(8)阳性对照：750μl×1管，以IHNV、SVCV、VHSV三种病毒体外转录的RNA片段为阳性对照。
所述IHNV、SVCV、VHSV三种病毒阳性对照用的标准品的制备：
(1)用随机引物(pdN6)(购自大连宝生物工程有限公司)分别对三种病毒RNA进行反转录，反应体系(25μl)如下：M-MLV5×反应缓冲液(Mg2+，15mM)2.5μl，dNTP(10mM)1.5μl，随机引物(pdN6，50μM)1.0μl，RNase抑制剂(40U/μl)0.5μl，M-MLV反转录酶(200U/μl)1.0μl，DEPC水8.5μl，模板RNA10μl(按照实施例2方法获得IHNV、VHSV和SVCV三种病毒的RNA)。反应条件为：37℃1h，95℃5min，4℃保存。
(2)对上述反转录产物再分别用特异性引物对(IHNV F1/R1，VHSV F1/R1，SVCVF1/R1，见表5，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)进行PCR扩增。PCR反应体系(25μl)如下：10×PCR反应缓冲液2.5μl，MgCL2溶液(25mM)3μl，dNTP(10mM)0.5μl，上游引物F1(25μM)1μl，下游引物R1(25μM)1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，DEPC水16.5μl，反转录产物1μl。反应条件为：
95℃ 5min；1个循环；
95℃ 45sec，60℃ 45sec(病毒SVCV退火温度为55℃)，72℃ 1min 45sec；32个循环；
72℃ 10min，1个循环；4℃保存。
(3)电泳鉴定
分别回收相应目的片段，然后将回收的目的片段与
-T Easy载体(pGEM-TEasy Vector system，购自Progema公司)连接。连接产物分别转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒，用EcoR I分别进行酶切鉴定和测序鉴定。在用Mlu I分别对三种质粒进行酶切，纯化回收线性片段作为模板，分别用Promega RiboMAXTM LargeScale RNA Production System—T7试剂盒(购自普洛麦格公司)进行体外转录。反应体系(50μl)如下：5×T7转录缓冲液10μl，rNTPs(25mM ATP，CTP，GTP，UTP)15μl，线形DNA模板12μl，DEPC处理水8μl，T7RNA聚合酶5μl。混匀，置37℃，温育4h，然后向反应体系中加入1μl RQ1 DNA酶，37℃温育30min，除去DNA模板。然后用TRIZOL试剂提取纯化。将体外转录得到的三种病毒RNA片段纯化后，用分光光度计分别检测样品在260nm波长处的OD值，计算得到RNA浓度，然后将三种病毒的RNA样品稀释到相同浓度，混合后进行10倍系列稀释，得到三种病毒RNA浓度均为108，107，106，105，104，103，102，10，1.0拷贝/微升的混合RNA溶液，阳性对照用的混合RNA溶液浓度约为104-105拷贝/微升。
表5：阳性标准品制备引物
二、试剂盒的使用
(1)提取样品的RNA，即模板RNA；
①向指管中加入600μl TRIZOL裂解液，然后加入组织或细胞悬液200μl，吹打混匀
②加入200μl氯仿，振荡混匀15sec，然后4℃，13,000rpm，离心15min
③将上清液移至500μl异丙醇中，颠倒混匀，然后置-20℃沉淀10min
④4℃，13,000rpm，离心15min
⑤吸弃上清液，向指管中加入75％乙醇600μl，颠倒洗涤
⑥4℃，13,000rpm离心10min，弃上清液
⑦4,000rpm，离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥1-5min
⑧加入适当DEPC水，溶解管壁上的RNA，所得即为提取的RNA溶液(2)进行实时荧光RT-PCR反应，最适反应体系如下：
表6 实时荧光RT-PCR反应体系组成
| 组分 | 体积 |
| RT-PCR反应液(其组成如表4) | 14.0μl |
| 40U/μl RNase抑制剂 | 0.5μl |
| 200U/μl M-MLV反转录酶 | 0.25μl |
| 5U/μl Taq DNA聚合酶 | 0.25μl |
| 模板RNA | 10μl |
(3)最适反应条件：
42℃：30min，95℃：5min，1个循环；
95℃：15sec，60℃：1min(收集荧光信号)，40个循环。
(4)结果的判定标准：
阴性为：无Ct值或无扩增曲线；
阳性为：出现典型的“S”形扩增曲线。
实施例5：检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒的干扰性试验
一.方法
用三重反应体系分别检测IHNV、VHSV和SVCV的病毒RNA模板，以确定三种病毒的探针、引物之间是否存在相互干扰现象。
(1)按照实施例2方法获得IHNV、VHSV和SVCV三种病毒的RNA，作为模板RNA；
(2)用实施例4所建立的试剂盒和方法分别检测IHNV、VHSV和SVCV的病毒RNA模板。
二.结果
结果见图2所示，A、B、C分别为检测IHNV、VHSV和SVCV的病毒RNA模板的扩增曲线，均只有一种特异性探针发生水解，得到一条扩增曲线，另外两种探针检测显示为阴性，说明各探针、引物之间无相互干扰现象。
实施例6：三重和单重实时荧光RT-PCR检测方法的比较
一.方法
将三种病毒的RNA(按照实施例2方法获得IHNV、VHSV和SVCV三种病毒的RNA)溶液混合后，进行10倍系列梯度稀释，共10-1，10-2，10-3，10-4四个稀释度，然后分别用单重实时荧光RT-PCR和多重实时荧光RT-PCR进行检测，以确定单重和多重实时荧光RT-PCR之间的差异。单重反应体系(25μl)如下：M-MLV5×反应缓冲液(Mg2+，15mM)5μl，dNTP(10mM)0.5μl，RNase抑制剂0.5μl，M-MLV反转录酶(200U/μl)0.25μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.25μl，上游引物(10μM)1.5μl，下游引物(10μM)1.5μl，探针(10μM)0.5μl，DEPC处理水5μl，模板RNA10μl。三重反应体系(25μl)同表6，反应条件为：
42℃：30min，95℃：5min，1个循环；
95℃：15sec，60℃：1min(收集荧光信号)，40个循环。
二.结果
将三种病毒的RNA混合稀释后做为模板，分别进行单重和多重实时荧光RT-PCR检测，结果见图3，A、B、C分别为IHNV、VHSV和SVCV单重和多重检测的比较，从左至右依次为10-1，10-2，10-3，10-4倍稀释的病毒RNA溶液作为模板的扩增曲线。结果显示，在相同探针引物浓度、镁离子浓度和酶浓度，以及相同的反应条件下，单重和多重实时荧光RT-PCR的检测结果一致，三重和单重实时荧光RT-PCR检测无明显差异，同时这也说明，各探针和引物间无相互干扰。
实施例7：检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒的特异性试验
一.方法
提取禽流感病毒和狂犬病病毒RNA做为模板，用实施例4所建立的试剂盒和方法分别对禽流感病毒和狂犬病病毒RNA进行三重RT-PCR检测，以确定检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒的特异性。
二.结果
结果见图4。结果显示，除阳性外，其他结果均为阴性，说明该方法有较强特异性。
实施例8：检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒的敏感性试验
一.方法：
用实施例4所建立的试剂盒和方法对实施例4所述的三种病毒的混合稀释的阳性标准品进行三重实时荧光RT-PCR检测，以确定反应的灵敏度。混合稀释后，得到三种病毒RNA浓度分别为108，107，106，105，104，103，102，10，1.0拷贝/微升的混合RNA溶液。
二.结果
对三种病毒的混合稀释的阳性标准品(108-1拷贝/微升)进行三重实时荧光RT-PCR检测，结果如图5所示。A、B、C分别为IHNV、VHSV和SVCV的灵敏度检测结果。如结果所示，三重实时荧光RT-PCR对系列梯度稀释的阳性标准品(从左至右分别为109-10拷贝/反应对应的结果)进行检测，在模板浓度为102拷贝/反应时，成弱阳性反应，10拷贝/反应的模板浓度结果接近阴性。故三重实时荧光RT-PCR对三种病毒RNA模板最低可检测至102拷贝/反应。
实施例9：细胞培养病毒的检测
一.方法
1.细胞及病毒的培养
用199培养液(含10％胎牛血清，800-1000单位/ml的青霉素和链霉素)按常规方法对EPC细胞进行传代培养，接种2块24孔板，每孔2ml，25℃，培养24h，至细胞铺成单层。分别取三种病毒的EPC细胞培养悬液100μl，加至700μl细胞维持液中，然后对此液进行10倍系列梯度稀释至10-4倍。另外，分别对三种病毒悬液进行10倍系列梯度稀释至10-4倍。取10-2-10-4倍系列梯度稀释的混和病毒悬液，接种24孔板，每个浓度接种3个细胞孔，每孔100μl，同时分别接种三种病毒的单独系列梯度稀释悬液(10-2-10-4倍稀释)和细胞维持液作为阳性和阴性对照。将接种病毒的2块24孔板，一块置于15℃培养箱，另一块置于18℃培养箱，培养7天，观察细胞病变情况。
2.病变细胞的检测
细胞培养7天以后，18℃培养的24孔板上，除阴性孔外，各接毒孔均有病变出现。而置于15℃培养的24孔板，单独接种SVCV的三个细胞孔没有病变出现。取18℃培养24孔板，-20℃冻融两次后，接种混合病毒悬液的各孔分别取200μl提取RNA，最后以100μl DEPC水溶解RNA沉淀。以提取的RNA作为模板，使用实施例4所述的“三种鱼类弹状病毒的检测试剂盒”进行三重实时荧光RT-PCR检测。
二.结果
对在18℃下培养的混合感染细胞孔内的病毒悬液提取RNA进行三重实时荧光RT-PCR检测，结果见图6。由结果可见，各混合孔中均可检测出三种病毒，虽然在接种时病毒悬液经过稀释，但是在培养一段时间后，不同稀释度各孔测得Ct值无明显差异。
实施例10：斑马鱼攻毒实验
一.方法
斑马鱼共34条，分为3个攻毒组，每种病毒一个组，每组10条，另设4条斑马鱼作为阴性对照组。适应性饲养2天，然后分别向三个攻毒组中投入IHNV、VHSV和SVCV病毒悬液，使其浓度维持在106TCID50(用Reed-Muench法测得)左右，三天后，各组斑马鱼再进行腹腔注射108TCID50左右的病毒悬液20μl进行强化攻毒，饲养两天后，取感染不同病毒的三条鱼的内脏和脑组织混为一个样品，提取RNA，进行三重实时荧光RT-PCR检测，同时取阴性对照组的4条斑马鱼的内脏和脑组织作为一个样品，提取RNA作为阴性对照。
二.结果
对三个攻读组的斑马鱼，分别取感染不同病毒的三条鱼的内脏和脑组织混为一个样品，提取RNA，进行三重实时荧光RT-PCR检测，同时取阴性对照组的4条斑马鱼的内脏和脑组织作为一个样品，提取RNA作为阴性对照，检测结果见图7。如图所示，除阴性对照组的检测结果为阴性外，每个阳性样品均成功检测到三种病毒。
序列表
<110>中华人民共和国北京出入境检验检疫局
<120>一种检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒和核苷酸序列
<130>
<160>15
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成IHNV FP
<400>1
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成IHNV RP
<400>2
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工合成IHNV Probe
<400>3
<210>4
<211>24
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<211>22
<212>DNA
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<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成VHSV Probe
<400>6
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<211>23
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<213>人工合成SVCV FP
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<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工合成SVCV RP
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<211>17
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<400>9
<210>10
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<213>人工合成IHNV F1
<400>10
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<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成SVCV R1
<400>15
Claims (5)
1.一组检验三种鱼类弹状病毒的寡核苷酸序列，其特征在于：为序列表SEQ IDNo.1至序列表SEQ ID No.9所示的寡核苷酸序列；其中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为检验传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)的引物对，SEQ ID No.3为检验传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)的探针序列；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为检验病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的引物对，SEQ ID No6为检验病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的探针序列；SEQ ID No.7和SEQ ID No.8为检验鲤春病毒血症病毒(SVCV)的引物对，SEQ ID No.9为检验鲤春病毒血症病毒(SVCV)的探针序列。
2.根据权利要求1所述的一组检验三种鱼类弹状病毒的寡核苷酸序列，其特征在于：所述探针序列SEQ ID No.3的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
3.根据权利要求1所述的一组检验三种鱼类弹状病毒的寡核苷酸序列，其特征在于：所述探针序列SEQ ID No.6的5’端标记荧光报告基团VIC，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
4.根据权利要求1所述的一组检验三种鱼类弹状病毒的寡核苷酸序列，其特征在于：所述探针序列SEQ ID No.9的5’端标记荧光报告基团NED，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
5.一种检测三种鱼类弹状病毒的试剂盒，50tests/盒，由以下试剂组成：
(1)TRIZOL裂解液；
(2)DEPC水；
(3)RT-PCR反应液：14μl/检测，其组分为：含15mM Mg2+的M-MLV 5×反应缓冲液，10mM dNTP，IHNV引物对IHNV FP/IHNV RP，各10μM，VHSV引物对VHSV FP/VHSV RP，各10μM，SVCV引物对SVCV FP/SVCV RP，各10μM，10μM IHNV探针，10μM VHSV探针，10μM SCVC探针，DEPC水；
(4)RNase抑制剂，40U/μl；
(5)M-MLV反转录酶，200U/μl；
(6)Taq DNA聚合酶，5U/μl；
(7)阴性对照：DEPC水
(8)阳性对照：IHNV、SVCV、VHSV三种病毒体外转录的RNA片段。
RT-PCR反应液中，IHNV FP为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，IHNVRP为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，VHSV FP为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，VHSV RP为序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，SVCV FP为序列表SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，SVCV RP为序列表SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，IHNV探针为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB，VHSV探针为序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB，SCVC探针为序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，其5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
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2008
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