CN103397106A

CN103397106A - 杂交鳢弹状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103397106A
Application number: CN2013103027139A
Authority: CN
Inventors: 刘春�; 曾伟伟; 李凯彬; 王庆; 王芳; 常藕琴; 梁慧丽; 梁惜梅; 吴淑勤
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Hunan Zhenye Animal Inspection Co., Ltd
Priority date: 2013-07-18
Filing date: 2013-07-18
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-07-18
Also published as: CN103397106B

Abstract

本发明公开了杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，试剂盒中含有特异性引物HSHRV-2F、HSHRV-2R和探针HSHRV-2probe，将该试剂盒用于检测杂交鳢弹状病毒，具有灵敏度高、重复性强、特异性好的特点，能够快速、准确地对杂交鳢弹状病毒进行定性和定量，对于杂交鳢病毒病的早期诊断、分子流行病学研究以及防控技术研究等具有重要意义。

Description

杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于病原微生物的检测领域，特别涉及杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

杂交鳢（Channa maculata♀×C. argus♂）是以斑鳢为母本，乌鳢为父本，通过杂交获得的子一代，杂交鳢综合了亲本的优点，在实际生产过程中具有生长速度快、抗逆性强、成活率高、耐运输、易驯食人工配合饲料等优点。由于杂交鱧的养殖经济效益明显，近年在全国范围内养殖规模不断扩大，已逐步替代乌鳢、斑鳢等鱧科鱼类成为主要的养殖品种。然而，2012年的7月以来，广东省的广州、佛山、中山、清远等多个地方养殖场暴发杂交鳢大规模死亡的流行性疾病，造成巨大的经济损失。杂交鳢弹状病毒病是近年新发的流行性疾病，该病发病迅速、死亡率高，给鳢科鱼类养殖业造成了重大的经济损失，目前还没有该病的致病机理和流行病学研究相关的报道。由于发病初期鱼体没有明显的表观症状，快速准确地诊断以及病毒病原的定量检测对于该病的预警与防控技术研究十分重要。

本实验室从细菌学和病毒学两方面对患病鱼进行分析，确认引起养殖鱼暴发性死亡的疾病为弹状病毒病，其病原为杂交鳢弹状病毒(Hybrid Snakehead rhabdovirus，HSHRV)。

弹状病毒为线性负义单链RNA病毒，病毒粒子长100～430nm，直径45～100nm，形态似棒状或子弹状，通常具有5种主要结构蛋白（L，G，N，P，M）。弹状病毒科包括175种以上的成员，可感染脊椎动物、无脊椎动物及植物。鱼类弹状病毒因感染宿主广、毒株种类多、毒力强，严重危害各种淡水和海水鱼。迄今报道感染鱼类的弹状病毒已有二十多种，其中危害较大的有鲤春病毒血症病毒（SVCV）、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、牙鲆弹状病毒（HRV）和鳜鱼弹状病毒（SCRV）等。弹状病毒科分为6个属，即水泡性病毒属（Vesiculovirus）、狂犬病毒属（Lyssavirus）、短暂热病毒属（Ephemerovirus）、诺拉弹状病毒属（Novirhabdovirus）、质型弹状病毒属（Cytorhabdovirus）和细胞核弹状病毒属（Nucleorhabdovirus）。HSHRV是弹状病毒科水泡性病毒属成员，与20世纪八十年代国外报道的诺拉弹状病毒属的乌鳢弹状病毒（SHRV）亲缘关系较远，二者全基因核苷酸序列同源性仅为45.3%；与SCRV亲缘关系较近，全基因核苷酸序列同源性高达94.9%。本实验室研究发现引起广东省杂交鳢死亡的HSHRV主要流行株为C1207株，该毒株能在多种鱼类细胞中复制，人工感染杂交鱧死亡率高达90%。为了及早发现养殖鱼类是否被HSHRV感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。

目前，传统病毒病诊断需进行病毒分离，细胞转染、电镜观察以及普通PCR检测等方法，缺乏可对病毒进行快速、准确、定量分析的检测预警方法。荧光定量PCR方法具有操作简单、快速，不易出现假阳性，随时对扩增产物进行精确定量分析等优点，正逐渐应用于病原微生物的检测与研究中。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组份：（1）荧光定量PCR引物HSHRV-2F、HSHRV-2R和探针HSHRV-2 probe；（2）荧光定量PCR反应液；（3）阳性对照；（4）阴性对照；其中，所述荧光定量PCR引物和探针的核苷酸序列如下：

HSHRV-2F：5'-CACCAGTCATATCAATCC-3' （SEQ ID NO.3）；

HSHRV-2R：5'-CGGACTTAAACCTCATTC-3' （SEQ ID NO.4）；

HSHRV-2 probe：5'-ACCTCTCCGCACATTGACATCT-3' （SEQ ID NO.5）。

优选的，所述阳性对照，其制备方法包括以下步骤：提取杂交鳢弹状病毒总RNA，反转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以P1、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物作为阳性对照；其中，引物P1的核苷酸序列为5'-CGCGGATCCATCATGAAATCAATCATTGCACT-3'（SEQ ID NO.1），引物P2的核苷酸序列为5'-CATCTGCAGAATTGATACTGCTGCAAAGGG-3'（SEQ ID NO.2）。

优选的，将扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照。

优选的，所述荧光定量PCR反应液含有Premix Ex Taq^TM，ROX Reference Dye Ⅱ。

优选的，所述阴性对照为ddH₂O。

优选的，所述探针的5'端标记荧光染料FAM，3'端标记淬灭基团BHQ。

杂交鳢弹状病毒的检测方法，包括以下步骤：

1) 提取待检样本的总RNA，反转录获得cDNA；

2) 以cDNA为模板，用杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行特异性RT-PCR扩增；

3) 反应结束，根据待检样本的Ct值判断其为杂交鳢弹状病毒阳性或阴性；

其中，杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒如上所述。

优选的，所述步骤2）的扩增反应体系为：10μL的Premix Ex Taq^TM；0.4μL的50×ROX Reference Dye Ⅱ；0.3μmol/L的引物HSHRV-2F；0.3μmol/L的引物HSHRV-2R；0.24μmol/L的探针HSHRV-2 probe；2μL的cDNA模板；加ddH₂O补足体积至20μL。

优选的，所述步骤2）的扩增反应程序为：94℃ 2min； 94℃ 15s，55℃15 s，72℃ 20s，5个循环；94℃ 5s，55℃ 35s ，40个循环。

本发明的有益效果是：

本发明提供了杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，试剂盒含有特异性引物HSHRV-2F、HSHRV-2R和探针HSHRV-2 probe，将该试剂盒用于检测杂交鳢弹状病毒，具有灵敏度高、重复性强、特异性好的特点，能够快速、准确地对杂交鳢弹状病毒进行定性和定量，对于杂交鳢病毒病的早期诊断、分子流行病学研究以及防控技术研究等具有重要意义。

附图说明

图1为阳性对照标准曲线；

图2为特异性引物HSHRV-2F、HSHRV-2R传统PCR扩增结果；

图3为HSHRV荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏度试验结果；

图4为HSHRV荧光定量PCR检测试剂盒的重复性试验结果；

图5为HSHRV荧光定量PCR检测试剂盒的特异性试验结果。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明内容。

实施例中所用细胞与病毒：鲤鱼上皮细胞系（EPC）购自武汉大学细胞典藏中心；HSHRV-C1207、草鱼呼肠孤病毒 (GCRV)、大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)、锦鲤疱疹病毒（KHV）、尖塘鳢虹彩病毒（MSGIV）、IHNV均由发明人所在实验室分离保存。

实施例中所用主要试剂：大肠杆菌DH5α由发明人所在实验室保存；Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、PrimeScript^TM RT reagent Kit（TaKaRa）试剂盒、DNA Taq酶、dNTP、限制性内切酶、pMD18-T载体、T4连接酶、DNA分子Marker、Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR）购自宝生物工程（大连）有限公司；Plasmid Mini Kit I 购自Omega公司；M199培养基、犊牛血清、胰酶为Gibco公司产品；Trizol Reagent购于Invitrogen公司；其他试剂均为国产分析纯。

实施例1

引物和探针的制备：

第一对引物( P1、P2)扩增产物长度为1560bp，用于构建重组质粒，为制作阳性对照标准曲线提供模板；第二对引物（HSHRV-2F、HSHRV-2R）和探针（HSHRV-2probe）用于荧光定量PCR扩增，扩增产物长度为143bp。引物和探针由广州吉格生物科技有限公司合成。引物和探针序列如下：

P1：5'-CGCGGATCCATCATGAAATCAATCATTGCACT-3' （SEQ ID NO.1）；

P2：5'-CATCTGCAGAATTGATACTGCTGCAAAGGG-3' （SEQ ID NO.2）；

HSHRV-2F：5'-CACCAGTCATATCAATCC-3' （SEQ ID NO.3）；

HSHRV-2R：5'-CGGACTTAAACCTCATTC-3' （SEQ ID NO.4）；

HSHRV-2 probe：5'-ACCTCTCCGCACATTGACATCT-3' （SEQ ID NO.5）；

HSHRV-2 probe的5'端标记荧光染料FAM，3'端标记淬灭基团BHQ。

实施例2

杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒的建立和检测方法的优化：

1、标准品模板制备

1) 用HSHRV感染EPC，待细胞出现病变后收集细胞毒材料，按Trizol Reagent说明书提取病毒总RNA，经DNase I RNase-free（Fermentas）处理后，分别测量RNA 样品在260nm和280nm波长下的吸光度值，计算RNA样品的浓度和纯度。

2) 利用PrimeScript^TM RT reagent Kit（TaKaRa）试剂盒进行反转录得到cDNA。以获得的cDNA为模板，P1、P2为引物进行PCR 扩增。反应参数为94℃预变性3min，94℃ 30s， 55℃ 30s，72℃ 90s，共30个循环，最后72℃延伸10min。同时设立无模板的阴性对照。

3) PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得1500 bp左右的目的片段。扩增产物经胶回收纯化后与pMD18-T载体（TaKaRa）连接，转化到大肠杆菌DH5α中，PCR检测阳性克隆后送生工生物工程(上海)有限公司测序，证实与预期插入片段相同。

4) 重组质粒提取后经分光光度计测定浓度为185μg/mL，A260/A280 值为1.91。根据以下方法计算重组质粒的DNA 拷贝数。分子拷贝数(copies /μL)= 6.02×1 0²³（copies·mol^-1）×质粒浓度（g·μL^-1）/质粒分子量（g·mol^-1）。用EASY Dilution(for Real Time PCR)对标准品进行10倍比稀释，用于构建标准曲线。

2、反应体系、反应条件的优化

将重组质粒采用荧光定量PCR引物HSHRV-2F、HSHRV-2R进行普通PCR扩增后，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，在150bp左右有一条特异性条带，与预期片段长度（143bp）基本一致，表明该引物可用于荧光定量PCR反应。

采用TaqMan探针技术，将引物HSHRV-2F、HSHRV-2R、探针HSHRV-2 probe、Premix（Takara）Ex Taq^TM和ROX Reference Dye Ⅱ（50×）加入到反应体系中，用7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）进行PCR扩增。对各组分浓度和反应程序进行优化，对引物和探针浓度进行筛选，以获得最低的Ct值和最高的荧光强度增加值标准。选用0.2、0.4、0. 6、0.8μmol/L的引物浓度和0.06、0.12、0.24、0.48μmol/L的探针浓度，筛选引物和探针的最佳浓度。分别选取53℃、55℃、57℃、59℃为退火温度，筛选最佳退火温度。

经过荧光定量PCR 反应条件的优化，最终确定反应体系为：Premix Ex Taq^TM 10μL，ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4μL，引物HSHRV-2F和HSHRV-2R各0.4μL（终浓度均为0.3μmol/L），探针HSHRV-2 probe 0.8μL（终浓度为0.24μmol/L），cDNA模板1μL，ddH₂O 7μL，总体系为20μL。三步法PCR扩增程序：第一步，94℃ 2min；第二步，5个循环，94℃ 15s，55℃15 s，72℃ 20s；第三步，40个循环，94℃ 5s，55℃ 35s（收集FAM荧光信号）。

3、标准曲线的建立

将重组质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度依次为1×10⁸～1×10²copies /μL作为标准品模板，每个稀释度设3个平行。在优化的反应体系和条件下进行实时荧光定量PCR扩增，反应结束后绘制标准曲线，以重组质粒拷贝数为X 轴、Ct 值为Y 轴作图，得到一条标准曲线（Y=-3.290x + 38.292），其相关系数为0.999，扩增效率为98.578%，说明实时荧光定量PCR 在10⁸～10²范围内有较好的线性关系（见图1）。

4、建立的杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒包括如下组份：

（1）荧光定量PCR引物HSHRV-2F（SEQ ID NO.3）、HSHRV-2R（SEQ ID NO.4）和探针HSHRV-2 probe（SEQ ID NO.5）；

（2）荧光定量PCR反应液，含有Premix Ex Taq^TM，ROX Reference Dye Ⅱ；

（3）阳性对照，为步骤1中制备的标准品模板——重组质粒，或为以P1、P2为引物进行PCR扩增后回收纯化的产物；

（4）阴性对照，为ddH₂O。

试剂盒的保藏温度为-20℃。

实施例3

杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒的敏感性、重复性和特异性试验：

1、将阳性对照重组质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度依次为1×10⁶～1 copies /μL作为标准品模板，以灭菌的ddH₂O代替模板作为阴性对照，采用实施例2建立的杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒和优化的反应体系、条件进行荧光定量PCR反应，根据样品拷贝数与Ct值之间的线性关系和相关系数确定最小检测量。同时用引物HSHRV-2F、HSHRV-2R进行普通PCR反应，计算出2种方法所能检测出的最低模板浓度，比较两种方法的敏感性。

结果显示，传统PCR方法最低在1×10³处能检测到条带（见图2）；荧光定量PCR对重组质粒进行扩增，最低可检测10个病毒核酸分子拷贝数（见图3）。两种方法阴性对照均检测不到。可见，本发明试剂盒的HSHRV荧光定量PCR方法，比传统PCR方法灵敏100倍，易于在疾病发生的早期发现病毒感染，及时做出预警预测，为该病的防控赢取时间。

2、同步骤1方法，对同一阳性样品在一次实验中重复38次进行实时荧光定量PCR检测，通过组内的Ct值变异系数来初步评估该方法的重复性。

结果表明，同一次实验内的38个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本上重合（见图4），Ct值读数范围为15.04～15.58，标准偏差为0.13，变异系数为0.84%。

3、采用Trizol Reagent分别提取重组质粒、HSHRV-C1207、GCRV、LMBV、KHV、MSGIV、IHNV的总RNA，分别用PrimeScript^TM RT reagent Kit（TaKaRa）试剂盒进行反转录获得cDNA。以获得的cDNA为模板，用杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒和建立的HSHRV实时荧光定量PCR方法进行特异性扩增，同时设灭菌的ddH₂O为阴性对照。

结果表明，重组质粒和HSHRV-C1207样品有典型扩增曲线，荧光信号值高，检测结果为阳性，而其余病毒和阴性对照无扩增曲线（见图5），未发生扩增反应，本发明方法具有较好特异性。

实施例4

杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒检测临床样品：

从2012 年7 月到2013 年6 月在广东省各地采集的21份病鱼样品，同时采用本发明实施例2建立的杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒、建立的HSHRV实时荧光定量PCR方法和传统PCR方法进行检测。结果显示，传统PCR方法检测到13份阳性样品，阳性率为61.9%；本发明方法检测到18份阳性样品，阳性率为85.7%（表1），比传统PCR 检测方法高23.8%。对所有样品进行了细胞分离和电镜观察，确认的阳性样品与荧光定量PCR方法检测到的阳性样品相同，符合率为100%。证实本发明检测试剂盒及检测方法在临床检测应用中具有高度的可靠性。

表1用本发明试剂盒和传统PCR检测临床疑似病样结果

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcggatcca tcatgaaatc aatcattgca ct 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catctgcaga attgatactg ctgcaaaggg 30

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccagtcat atcaatcc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggacttaaa cctcattc 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acctctccgc acattgacat ct 22

Claims

1.杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组份：（1）荧光定量PCR引物HSHRV-2F、HSHRV-2R和探针HSHRV-2 probe；（2）荧光定量PCR反应液；（3）阳性对照；（4）阴性对照；其中，所述荧光定量PCR引物和探针的核苷酸序列如下：

HSHRV-2F：5'-CACCAGTCATATCAATCC-3' （SEQ ID NO.3）；

HSHRV-2R：5'-CGGACTTAAACCTCATTC-3' （SEQ ID NO.4）；

HSHRV-2 probe：5'-ACCTCTCCGCACATTGACATCT-3' （SEQ ID NO.5）。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照，其制备方法包括以下步骤：提取杂交鳢弹状病毒总RNA，反转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以P1、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物作为阳性对照；其中，引物P1的核苷酸序列为5'-CGCGGATCCATCATGAAATCAATCATTGCACT-3'（SEQ ID NO.1），引物P2的核苷酸序列为5'-CATCTGCAGAATTGATACTGCTGCAAAGGG-3'（SEQ ID NO.2）。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：将扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量PCR反应液含有Premix Ex Taq^TM，ROX Reference Dye Ⅱ。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为ddH₂O。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的5'端标记荧光染料FAM，3'端标记淬灭基团BHQ。

7.杂交鳢弹状病毒的检测方法，包括以下步骤：

1)提取待检样本的总RNA，反转录获得cDNA；

2)以cDNA为模板，用杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行特异性RT-PCR扩增；

3)反应结束，根据待检样本的Ct值判断其为杂交鳢弹状病毒阳性或阴性；

其中，杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒如权利要求1～6任意一项所述。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2）的扩增反应体系为：10μL的Premix Ex Taq^TM；0.4μL的50×ROX Reference Dye Ⅱ；0.3μmol/L的引物HSHRV-2F；0.3μmol/L的引物HSHRV-2R；0.24μmol/L的探针HSHRV-2 probe；2μL的cDNA模板；加ddH₂O补足体积至20μL。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述步骤2）的扩增反应程序为：94℃ 2min； 94℃ 15s，55℃15 s，72℃ 20s，5个循环；94℃ 5s，55℃ 35s ，40个循环。