CN102286642B - 大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒有如下组分：无菌双蒸水、10×Taq反应缓冲液、2.5mmol/L dNTPs、荧光定量反应液，其特征在于：荧光定量反应液含有引物和荧光探针，引物为正向引物和反向引物，正向引物为，反向引物为，荧光探针序列为，荧光探针5′端标记FAM，3′端标记ROX，5U/μL Taq DNA聚合酶，标准阳性模板pMCP是含有大鲵虹彩病毒MCP基因1392个核苷酸片段构成的pMD19-T载体，该载体在大肠杆菌E.coli DH5a中增殖。试剂盒在大鲵虹彩病毒病原检测中的应用。该试剂盒定量准确，检测速度快，仅1小时，加上DNA提取的制备，共仅需2-3小时；方法易行，操作简便；可同时进行高通量的样品检测，准确率高达98％。

Description

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用

技术领域

本发明属于大鲵病害检测技术领域，更具体涉及一种大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪器，更重要的是能快速地对大鲵虹彩病毒进行定量检测。同时还涉及一种大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒的用途。

技术背景

大鲵(Andrias davidiamus)俗称娃娃鱼，是国家二级保护动物，并且被列入CITES公约(濒危野生动植物种国际贸易公约)种类目录中，是现存个体最大的两栖类动物，有很重要的科研价值及药用和营养价值。但是，由于人为捕猎和自然环境的改变，野生大鲵数量急剧下降(Wang X M，Zhang K J，Wang Z H，et al.The decline of the Chinese giant salamander Andrias davidianus and implications forits conservation[J].Cambridge Journal，2004，38：197-202.)基于保护和开发利用的目的，目前兴起了大鲵的人工养殖。人工养殖很难完全模仿自然状态下大鲵的生活环境，加之对大鲵的一些生活习性尚不清楚，所以在饲养过程中出现了诸多问题，其中疾病是影响大鲵养殖业发展的重要因素之一。已往在大规模养殖过程中出现的主要疾病都是由细菌引起(陈祥云，陈新民.大鲵病害研究综述[J].渔业现代化，2006(5)：25-267.)但2010年曾令兵利用EPC细胞在国内外首次成功地从患典型出血病的大鲵幼鱼、成鱼体内分离到病毒。从患病鱼体内分离的病毒感染细胞培养物，细胞可发生典型的细胞病变效应，病毒可通过连续传代进行培养。病毒核酸特异性PCR反应可扩增出与预期大小一致的DNA片段，对扩增产物进行测序与比对分析，其序列与蛙虹彩病毒序列的同源性达到了99％以上，被初步确认为大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus，GSIV)。

目前大鲵的人工养殖发展迅速，已形成经济价值巨大的产业。但是，大鲵虹彩病毒造成的影响随着大鲵养殖规模与范围的不断扩大而日趋严重，造成巨大经济损失，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法对其进行监控，保证大鲵养殖业的健康发展。近年来，实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)以其特异性高、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，在医学领域、微生物和动植物疾病检疫方面得到了广泛应用(Petersen E，Edvinsson B，Lundgren B，et al.Diagnosis of pulmonary infection with Toxoplasmagondii in immunocompromised HIV-positive patients by real-ime PCR[J].Eur J ClinMicrobiol Infect Dis，2006，25(6)：401-404.；Goldschmidt P，Rosne H，Saint-jean C，et al.Effects of topical anaesthetims and fluorescein Oil the real-time PCR used forthe diagnosis of Herpesviruses and Acanthamoeba keratitis[J].Br J ophthalmol，2006，90(11)：1354-1356.；Regis S，Grossi，Laldi S，et al.Diagnosis ofPelizaeus-Merzbacher disease：detection of proteolipid protein gene copy numher byreal-time PCR[J].Neurogenetics，2005，6(2)：73-78.；Lobetti R G，Tasker S.Diagnosis of feline haemoplasma infection using a real-time PCR assay[J].J S AfrVet Assoc，2004，75(2)：94-99.；Ordinaire I，Simon A，Frealle E，et al.Real-timequantitative PCR for toxoplasmosis diagnosis[J].Ann Biol Clin，2005，63(1)：67-73.；Ovarnstrom Y，James C，Xayavong M，et al.Comparison of real-time PCR protocolsfor differential laboratory diagnosis of amebiasis[J].J Clin Microbiol，2005，43(11)：5491-5497.；Knorr L，Fox J D，Tilley P A，et al.Evaluation of real-time PCR fordiagnosis of Bordetella pertussis infection[J].BMC Infect Dis，2006(6)：62-64.；Vanden B R，Kuijper E J，Vancopdenraer C L，et al.Rapid diagnosis oftoxinogenicClostridium difficile in faeeal samples with internally controlled real-time PCR[J].Ciin Microbiol Infect，2006，12(2)：184-186.；Machida U，Kami M，FukuI T，et al.Real-time automated PCR for early diagnosis and monitoring of cytomegalovirusinfection after bone marrow transplantation[J].J Clin Microbiol，2000，38(7)：2536-2542.)笔者建立了检测大鲵虹彩病毒的实时荧光定量PCR检测方法，旨在对大鲵虹彩病毒进行定性和定量检测。而传统的PCR法约需7个小时左右才能完成。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪器，更重要的是能快速地对大鲵虹彩病毒进行定量检测。一次可检测32-384个(由定量检测仪的型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。

本发明的另一个目的是在于提供了一种大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒在大鲵虹彩病毒病原检测中的应用，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2-4个小时就能完成，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括如下组分构成：a)无菌双蒸水、b)10×Taq反应缓冲液、c)2.5mmol/L dNTPs、d)荧光定量反应液，其特征是：荧光定量反应液含有引物和荧光探针，引物为正向引物(SEQ ID NO：1)和反向引物(SEQ ID NO：2)，正向引物为5′-GCGGTTCTCACACGCAGTC-3′，反向引物为5′-ACGGGAGTGACGCAGGTGT-3′，荧光探针序列为5′-AGCCGACGGAAGGGTGTGTGAC-3′(SEQ ID NO：3)，荧光探针5′端标记FAM(荧光报告基团)，3′端标记ROX(荧光淬灭基团)，e)5U/μL Taq DNA聚合酶、f)标准阳性模板pMCP是含有大鲵虹彩病毒MCP基因1392个核苷酸片段构成的pMD19-T载体(购于Takara公司)，且该载体可在大肠杆菌E.coli DH5a(购于Promega公司)中增殖。

在本发明的一个优选方案中，荧光定量反应液是由正向引物和反向引物，荧光探针，PCR 10×buffer溶液，dNTPs溶液，Taq DNA聚合酶和无菌双蒸水组成；在本发明的一个具体方案中，荧光定量反应液由10×Taq反应缓冲液2μL、2.5mmol/L dNTPs 0.4μL、50μmol/L正向引物和反向引物各0.4μL、25μmol/L探针e 0.4μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL、无菌双蒸水14μl组成。其中荧光探针为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，荧光探针5′端标记FAM，3′端标记ROX。

在本发明的一个优选方案中，标准阳性模板是含有大鲵虹彩病毒MCP基因1392个核苷酸片段连接入pGEM-T载体(请见编号为：PromegaCorporation，Technical Manual，NO：042：1-30，1999年修订版)构成的。且该载体可在大肠杆菌E.coli DH5a中增殖。该质粒转化大肠杆菌E.coli DH5a增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀(所测样品在吸收波长为260nm紫外线照射下的光密度)的定量并稀释至1×10⁹拷贝/微升，-20℃保存。

在本发明提供大鲵虹彩病毒快速定量检测大鲵虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒中，有一条两端标记有荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5′-3′外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的FRET(荧光共振能量转移)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对大鲵虹彩病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环圈数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

在本发明提供检测大鲵虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒中，针对大鲵虹彩病毒检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测系统相结合，将其用于大鲵虹彩病毒定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了检测大鲵虹彩病毒荧光定量PCR方法，并研制出检测大鲵虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出100拷贝数，完全可以满足快速鉴别诊断大鲵虹彩病毒的要求。

一种用于大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒，其中含有：无菌双蒸水、10×Taq反应缓冲液、2.5mmol/L dNTPs、荧光定量反应液、荧光定量反应液含有引物和荧光探针、引物为正向引物和反向引物、正向引物为5′-GCGGTTCTCACACGCAGTC-3′、反向引物为5′-ACGGGAGTGACGCAGGTGT-3′、荧光探针序列为5′-AGCCGACGGAAGGGTGTGTGAC-3′、荧光探针5′端标记FAM、3′端标记ROX、5U/μL Taq DNA聚合酶、标准阳性模板pMCP是含有大鲵虹彩病毒MCP基因1392个核苷酸片段构成的pMD19-T载体，该载体在大肠杆菌E.coli DH5a中增殖。一种大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒在大鲵虹彩病毒病原检测中的应用，其步骤如下：

A)用标准阳性模板制备阳性标准品，并用紫外分光光度计定量；

B)用DNA裂解液从待测标本中提取DNA；

C)分别取B)步中的DNA和同样量的系列稀释的A)步中的阳性标准品加入到含Taq DNA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测；

D)通过比较待测样品和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。

在本发明中提供的大鲵虹彩病毒快速定量检测大鲵虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒可对大鲵虹彩病毒进行定量检测，并可替代一直沿用的传统的PCR检测方法。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、定量准确；

2、检测速度快，仅1小时，加上DNA提取的制备，共仅需2-3小时；

3、方法易行，操作简便；

4、可同时进行高通量的样品检测，准确率高达98％。

附图说明

图1为大鲵虹彩病毒实时荧光定量PCR检测标准曲线图。

结果：拷贝数(x)与Ct的关系为：Ct＝-3.218lgX+37.766，相关系数(R²)达到0.99019，斜率为-3.218；

图2为致鲤鱼上皮瘤细胞出现病变的核酸提取物的扩增曲线图。

结果：为阳性；

图3为荧光定量PCR检测湖北荆州、浙江温州样品的扩增曲线图。

结果：全为阳性；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

大鲵虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒组成与配制。

A).试剂组成：

10×Taq反应缓冲液、2.5mmol/L dNTPs、5U/μL Taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司。

B).荧光定量反应液：

10×Taq反应缓冲液2μL、2.5mmol/L dNTPs 0.4μL、50μmol/L正向引物和反向引物各0.4μL、25μmol/L探针GSIV probe 0.4μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL、无菌双蒸水14μl组成。其中荧光探针为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，荧光探针5′端标记FAM，3′端标记ROX。

C).自备试剂：20％PEG、蛋白酶K(5～10mg/ml)、酚∶氯仿(体积比1∶1)、3mol/L醋酸钠、70％乙醇、无水乙醇。

实施例2：

大鲵虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒定量公式的建立。

A).模板制备：

将含有大鲵虹彩病毒MCP基因1392个核苷酸片段连接入pGEM-T载体(请见编号为：Promega Corporation，Technical Manual，NO：042：1-30，1999年修订版)的阳性质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测定阳性重组质粒浓度为300μg/mL，A260/A280值为1.86。

并根据以下方法计算重组质粒的DNA拷贝数。

分子拷贝数(copies/μL)＝DNA质量浓度/DNA分子量，其中：DNA质量浓度＝260nm吸光度×稀释倍数×6.02×10²³；DNA分子量＝DNA碱基数×324.5。

B).标准曲线制备

将重组质粒进行10倍梯度稀释，以1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²copies/μL作为标准品模板，建立标准曲线。分别取不同稀释梯度的重组质粒2μL，依次加入10×Taq反应缓冲液2μL、2.5mmol/LdNTPs 0.4μL、50μmol/L引物GSIV FP/GSIV RP各0.4μL、25μmol/L探针GSIVprobe 0.4μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL补水至20μL将上述反应体系混匀后进行PCR扩增，反应参数：95℃10min；95℃10s，64℃45s，共40个循环每个稀释度设3个重复。据质粒拷贝数与Ct值的相关性，分析得到标准曲线(图1)。横坐标代表质粒模板拷贝数(x)，纵坐标为Ct值，拷贝数(x)与Ct的关系为：Ct＝-3.218lgX+37.766；相关系数R²＝0.99019。

实施例3：

用大鲵虹彩病毒快速定量检测的荧光定量PCR试剂盒检测大鲵虹彩病毒。

样品：对大鲵虹彩病毒接种鲤鱼上皮瘤细胞(由本实验室保藏)出现病变的细胞提取核酸。

1大鲵虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒组成与配制，

试剂组成：

a).DNA提取试剂为自己配制，20％PEG、蛋白酶K(5～10mg/ml)、酚∶氯仿(体积比1∶1)、3mol/L醋酸钠、70％乙醇、无水乙醇。

b).标准阳性模板。

c).荧光定量反应液：PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各0.4μl(50μmol/L)，荧光探针0.4μl(25μmol/L)，dNTPs 0.4μl(10mmol/L)，Taq DNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，无菌双蒸水14μl。荧光探针序列为SEQ ID NO：3，其5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光受体基团为ROX。

2用大鲵虹彩病毒快速定量检测的荧光定量PCR试剂盒检测大鲵虹彩病毒样品

A)取大鲵虹彩病毒接种鲤鱼上皮瘤细胞(由本实验室保藏)出现病变以后于-80℃至室温条件反复冻融三次，4000r离心30min，取上清转移至35mL超速离心管中，20000r离心2h，用750μl水悬浮病毒沉淀，加入等体积预冷的20％PEG 8000，反复颠倒数次，室温放置30min；室温12000r/min离心5min，弃去上清；加入100μl灭菌水，重悬病毒粒子，加入10μl蛋白酶K(5～10mg/ml)，50℃温浴1h；加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)抽提，室温12000r/min离心5min，取上清至另一离心管；加入加1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃放置20min；4℃12000r/min离心15min，弃上清；加入500μl 70％乙醇，12000r/min离心5min，弃掉上清，并挥发去乙醇，沉淀用20ul灭菌双蒸水溶解备用。

B)将阳性标准模板(试剂b)系列稀释为1×10⁸拷贝数/μl。

C)分别取荧光定量PCR反应液(试剂c)各18μl，取第A)步所得DNA和第B)步稀释的阳性标准模板各2μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变10min；94℃10s，64℃45s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为530nm。循环结束后，运用仪器自带软件，对以上3份样本进行分析，结果如下：

该样品为阳性(图2)。Ct值为：26，根据标准曲线计算出样品中病毒核酸量约为10^3.65拷贝数/μL DNA。

实施例4：

用大鲵虹彩病毒快速定量检测的荧光定量PCR试剂盒检测大鲵虹彩。

临床标本：对2010年至2011年湖北荆州、浙江温州等地3个疑似患病大鲵采集组织样品。

1大鲵虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒组成与配制，

试剂组成：

a).DNA提取试剂为自己配制，20％PEG、蛋白酶K(5～10mg/ml)、酚∶氯仿(体积比1∶1)、3mol/L醋酸钠、70％乙醇、无水乙醇。

b).标准阳性模板。

c).荧光定量反应液：PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各0.4μl(50μmol/L)，荧光探针0.4μl(25μmol/L)，dNTPs 0.4μl(10mmol/L)，Taq DNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，无菌双蒸水14μl。荧光探针序列为SEQ ID NO：3，其5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光受体基团为ROX。

2用大鲵虹彩病毒快速定量检测的荧光定量PCR试剂盒检测大鲵虹彩病毒样品。

A)取疑似患病大鲵组织作为分离病毒的样品，将组织匀浆后，于-80℃至室温条件反复冻融三次，4000r离心30min，取上清转移至35mL超速离心管中，20000r离心2h，用750μl水悬浮病毒沉淀，加入等体积预冷的20％PEG 8000，反复颠倒数次，室温放置30min；室温12000r/min离心5min，弃去上清；加入100μl灭菌水，重悬病毒粒子，加入10μl蛋白酶K(5～10mg/ml)，50℃温浴1h；加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)抽提，室温12000r/min离心5min，取上清至另一离心管；加入加1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃放置20min；4℃12000r/min离心15min，弃上清；加入500μl 70％乙醇，12000r/min离心5min，弃掉上清，并挥发去乙醇，沉淀用20ul灭菌双蒸水溶解备用。

B)将阳性标准模板(试剂b)系列稀释为1×10⁷拷贝数/μl。

C)分别取荧光定量PCR反应液(试剂c)各18μl，取第A)步所得DNA和第B)步稀释的阳性标准模板各2μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变10min；94℃10s，64℃45s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为530nm。循环结束后，运用仪器自带软件，对以上3份样本进行DNA的提取、荧光定量PCR检测，以水做阴性对照，结果如下：

一共3份样品，全为阳性，阳性率为100％(图3)。湖北荆州疑似患病大鲵的Ct值为19.50，浙江温州疑似患病大鲵的Ct值分别为22和27。根据标准曲线计算出反应体系中湖北荆州疑似患病大鲵的病毒量为10^5.68拷贝数/μL；浙江温州疑似患病大鲵的病毒量分别为10^4.90拷贝数/μL和10^3.35拷贝数/μL。

从上述实验可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需4个小时就能完成，而传统的PCR法约需7个小时左右才能完成，因此，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。

该试剂盒的操作只需1人即可完成整个定量操作过程，一次可检测32-384个(由定量检测仪的型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。

SEQUENCE LISTING

<110>  中国水产科学院长江水产研究所

<120>  大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用

<130>  大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  1

gcggttctca cacgcagtc                                                  19

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  2

acgggagtga cgcaggtgt                                                  19

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  3

agccgacgga agggtgtgtg ac                                              22

 

Claims (1)

1.一种大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由无菌双蒸水、10×Taq反应缓冲液、2.5mmol/L dNTPs、荧光定量反应液组成，其特征在于：荧光定量反应液含有引物和荧光探针，引物为正向引物和反向引物，正向引物为5′-GCGGTTCTCACACGCAGTC-3′，反向引物为5′-ACGGGAGTGACGCAGGTGT-3′，荧光探针序列为5′-AGCCGACGGAAGGGTGTGTGAC-3′，荧光探针5′端标记FAM，3′端标记ROX，5U/μL Taq DNA聚合酶，标准阳性模板pMCP是含有大鲵虹彩病毒MCP基因1392个核苷酸片段构成的pMD19-T载体，该载体在大肠杆菌E.coli DH5ａ中增殖。

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