CN103146842A - 兔出血症病毒rt-pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于兔出血症病毒RT-PCR检测的引物。本发明还提供了含有上述引物的试剂盒，以及使用上述引物一步法RT-PCR检测兔出血症病毒的方法。本发明方法准确、可靠，灵敏度和特异性高，具有较好的临床应用价值。

Description

兔出血症病毒RT-PCR检测方法

本申请是申请日为2011年3月15日，申请号为：201110062529.2，发明名称为“兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法”的专利申请之分案申请。

技术领域

本发明涉及一种兔出血症病毒的分子检测方法，具体地说，涉及一种兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其属于生物技术领域。

背景技术

兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种高度接触烈性传染病，传播快，发病急，发病率和致死率都很高，以呼吸系统出血、肝坏死、实质脏器水肿、淤血及出血性变化为特征，是兔的一种毁灭性传染病，目前所有已测的兔的品种都表现出易感性。自然条件下，RHDV主要侵害成年兔，2月龄以下的仔兔自然感染时一般不发病。该病对养兔业造成巨大的经济损失，也严重威胁濒临灭绝的野兔品种。由此，RHDV引起了国内外学者高度重视，从形态学、生物化学和分子生物学等各个方面系统的研究该病毒。

RHDV在国际病毒分类委员会（ICTV）2000年最新的第七次报告中被列入新成立的杯状病毒科（Caliciviridae）兔病毒属（Lagovirus）。RHDV为单股正链RNA病毒，其基因组由7437个核苷酸组成，分子量为2.4×10⁶-2.6×10⁶，5’端没有帽状结构，而是共价结合与感染相关的Vpg（virion protein,genome linked）蛋白，3’末端具有一个短的PolyA尾。第1-9nt为5’非编码区，最后59nt为3’非编码区，含有两个开放阅读框架(ORF)，第10-7044nt为ORFl编码的一个含有2344个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白经蛋白水解酶加工成主要衣壳蛋白VP60以及包括RNA聚合酶和蛋白酶在内的三个非结构蛋白。根据分析，该病毒的RNA基因组结构与同科的猫嵌杯样病毒不一样，仅含有两个开放阅读框。

RHDV的免疫原性蛋白、衣壳蛋白VP60，在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原。VP60基因全长1740bp，在病毒诱导机体的免疫反应中起主要作用，其核苷酸极端保守。RHDV是一种急性、高度致死性RNA病毒，在兔体内停留时间短，没有足够的时间让病毒发生有利于进化的变异，因此几十年中RHDV仍然能保持高序列同源性。

目前，已有将分子生物学应用到RHDV诊断中的研究，其主要包括玻片凝集试验（SHA）检测RHDV、酶联免疫吸附法（ELISA）检测RHDV、RT-PCR检测RHDV等，但上述这些方法存在敏感性低、可重复性差、结果判定易受多种因素影响、处理耗时多等问题。

荧光定量PCR（fluorescence quantitative polymerase chainreaction），又称实时定量（real-time quantitative）PCR。这种技术是在PCR技术基础上发展起来的高度灵敏的核酸定量技术。它是一种在PCR体系中引入了荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使PCR扩增和终产物检测全处在封闭的条件下进行，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析方法，具有实时监测、无污染、快速、灵敏、精确、特异等特点，极大的克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题，其最主要的优势是能对待测样本起始PCR反应模板进行准确定量，扩大了PCR的应用范围，使得PCR技术更广泛的应用于临床，在监测患者病情、预后、指导用药等方面。目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

TaqMan探针技术是由美国Perkin Elmer（PE）公司研发的一种实时PCR技术，它在一条20bp左右的寡核苷酸探针的5’端标记荧光报告基团（Reporter，R），3’端标记荧光淬灭基团（Quencher，Q），其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。当这条探针保持完整时，Q和R基团由于距离很近(7-10nm)，Q基团将淬灭R基团发出的荧光信号，即报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收。PCR反应后，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针结合位置，发挥其5’-3’外切核酸酶活性，将荧光探针切断，Q基团由于距离较远而失去对报告荧光的淬灭作用，R基团的荧光信号得以释放而被检测仪所捕获。如果在PCR过程中，探针序列与模板序列不能互补，探针仍然是游离的，未杂交的探针仍然保持完整，荧光信号也就不能被检测到，从而保证了扩增的特异性。常用的荧光报告基团有FAM、JOE、HEX、Texas-Red等，淬灭基团有TAMRA、Eclipse等。

发明内容

本发明的目的在于提供用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物和TaqMan探针。

本发明的另一目的在于提供用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。

本发明的目的还在于提供兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法。

为了实现本发明的目的，本发明的用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示；本发明的用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的TaqMan探针（荧光探针VP60p），其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，

本发明所述的TaqMan探针，其5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光猝灭基团为TAMRA。

本发明根据GenBank（GenBank注册号：FJ794180）RHDV VP60衣壳蛋白基因序列设计筛选出PCR引物，并确认了各引物的特异性。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。该引物对的扩增片段长度为96bp。

本发明还提供含有如权利要求1所述的引物和TaqMan探针的兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

所述试剂盒还包括扩增缓冲液、DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂和dNTPs。

本发明还提供兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其采用一步法RT-PCR方法进行检测，包括如下步骤：

1）提取待测样品的RNA；

2）以步骤1）提取的RNA作为模板，用上述核苷酸序列如SEQ IDNo.1和2所示的引物和TaqMan探针VP60p，采用一步法RT-PCR方法进行荧光定量PCR检测，根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。

其中，步骤1）中所述样品为兔的肝组织、血液、分泌物或排泄物，所述样品还可以是用福尔马林固定或石蜡包埋的兔的肝组织。

步骤2）中的RT-PCR反应体系为：

每25μL反应液中含有：2×Quant一步法荧光定量RT-PCR试剂盒12.5μL、2.5U/μL Hotmaster DNA聚合酶1μL、4U/μL Quant反转录酶0.35μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL、10μmol/L的探针0.5μL、RNA模板1μL，不含RNA酶的水（RNase-free ddH₂O）补足至25μL。

RT-PCR反应条件为：50℃、30min，92℃、3min，92℃、10s，56℃、20s，68℃、20s，40个循环。

为了便于分析检测结果，可在RT-PCR扩增步骤中使用阳性标准品和阴性对照，所述阴性对照是以DEPC处理的水代替RNA模板；所述阳性标准品按如下步骤得到：

1）提取RHDV病毒RNA，用核苷酸序列如SEQ ID No.4和5所示的引物，进行一步法RT-PCR扩增，得到目的片段；然后将该目的片段克隆到pGEM-T Easy载体上，转入感受态细胞大肠杆菌DH5α，提取白斑阳性质粒；

2）对提取的质粒进行SacⅠ酶切，使质粒DNA线性化，然后在T7RNA聚合酶作用下体外转录RNA，作为阳性标准品。

上述PCR引物是根据GenBank（GenBank注册号：FJ794180）RHDVVP60衣壳蛋白基因序列设计筛选、经上海英骏生物技术有限公司合成得到的，使用BLAST检索，确认各引物的特异性。该引物对的扩增出的目的片段长度为240bp，位于RHDV的VP60基因内部，该序列为保守序列，240bp的片段与预期大小一致，且包含上述用核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示的引物扩增出的96bp的片段。此外，将切胶回收的目的片段与pGEM-T Easy载体连接，转入感受态细胞DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取白斑摇菌后送公司测序，经测序表明VP60重组质粒序列正确，为阳性重组质粒，可用于后续试验。

本发明中检测结果的判定标准为：对样品进行荧光定量RT-PCR检测时，出现扩增曲线，即表明样品感染了兔出血症病毒；没有扩增曲线的扩增，则说明没有感染该病毒。

本发明的优点在于：

1、采用一步法RT-PCR检测技术，在一管内连续完成反转录和定量PCR扩增，完全闭管扩增和检测，提高临床诊断依据的可靠性，减少多重操作污染的可能性，易于操作，减少加样过程中的体积损耗，保证结果的可信性，反转录得到的所有cDNA样品都用来扩增，灵敏度更高。

2、在荧光PCR仪上进行扩增和检测，无需电泳或是其他PCR后处理，有效的防范了PCR扩增产物的污染，避免假阳性结果，避免了溴化乙锭或同位素对人体及环境的危害。只需2小时即可完成PCR过程，有利于提高报告数据的速度，无人为判断，仪器自动收集和分析数据。

3、本发明的RHDV TaqMan荧光定量RT-PCR方法对VP60具有高特异性；且操作简单、快速，稳定性、重复性良好，结果一目了然；实现了实时检测，能够直观的了解整个PCR过程的动态变化。

4、本发明的荧光定量RT-PCR检测方法除能从病毒含量最高的肝组织中检测到RHDV，还能从感染RHDV致死兔的其它组织中扩增出特异性片段，可用于检测RHDV在兔体内各组织中的动态分布。该方法还可以用于检测活兔的血液、分泌物、排泄物，以及福尔马林固定或石蜡包埋样品等是否含有病RHDV；国外有报道苍蝇、跳蚤、蚊子等可能起着机械传播RHDV的作用，故该方法还可检测苍蝇、跳蚤、蚊子等媒介体内是否含有RHDV。本发明建立的检测RHDV的荧光定量RT-PCR方法为兔出血症的早期确诊和分子流行病学调查奠定基础。

附图说明

图1为本发明目的片段240bp序列PCR扩增电泳结果；其中，M：标记、1：目的产物；2：阴性对照。

图2为本发明目的片段347bp序列PCR扩增电泳结果；其中，M：标记、1：目的产物；2：阴性对照。

图3为本发明不同质粒拷贝数的荧光检测结果。

图4为本发明的荧光定量RT-PCR标准曲线。

图5为本发明的兔肝组织样品的荧光定量RT-PCR检测结果。

图6为本发明的对活兔血液样品的荧光定量RT-PCR检测结果。

图7为不同引物用量时的荧光定量RT-PCR检测结果

图8为本发明的荧光定量RT-PCR特异性检测结果。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1阳性标准品的制备

1）RHDV病毒提取RNA，用核苷酸序列如SEQ ID No.4和5所示的引物，进行一步法RT-PCR扩增，得到240bp目的片段（如图1所示）；

PCR反应体系为：

每25μL反应液中含有：10×RT-PCR缓冲液2.5μL、超纯dNTP混合物（各10mM）1μL、5×RT-PCR增强剂5μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.25μL、2.5U/μL Hotmaster DNA聚合酶1.25μL、Quant反转录酶0.25μL、10mmol/L的上下游引物各0.5μL、RNA模板1μL、RNase-freeddH₂O补至25μL；

PCR反应条件为：50℃、30min，94℃、2min，94℃、1min，51.7℃、1min，65℃、1min，扩增35个循环，65℃、10min；

2）然后将该目的片段克隆到PGEM-T Easy载体（购自Promega公司）上，转入宿主细胞大肠杆菌DH5α（购自北京全式金生物技术有限公司），阳性克隆经PCR鉴定后测序，测序结果表明为目标序列。将鉴定正确的基因片段抽提质粒DNA；

3）对提取的质粒进行SacⅠ酶切，使质粒DNA线性化，然后在T7RNA聚合酶作用下体外转录RNA；

Sac Ⅰ序列为5’-GAGCTC-3’，反应体系为：RE10×缓冲液2μL、乙酰化的BSA0.2μL、质粒DNA2.3μL、10U/μL Sac Ⅰ0.5μL、ddH₂O补加至20μL；反应条件为：37℃温度下孵育1h。

T7启动子序列为5’-TAATACGACTCACTATA-3’；反应体系为：Transcription Optimized5X Buffer（5倍优化转录缓冲液）4μL；DTT2μL、Recombinant

Ribonuclease Inhibitor（RNasin重组核糖核酸酶抑制剂）0.5μL；rATP、rGTP、rUTP和rCTP混合物4μL；线性化DNA8μL；19U/μL T7RNA聚合酶1μL；DEPC水补加至20μL；

反应条件为：37℃温度下孵育1h，然后加入RQ10.5μL，37℃温度下孵育15min；

4）经RNA Marker检测上述体外转录RNA长度为347bp（如图2所示），用紫外分光光度计测得上述体外转录RNA浓度为908.1ng/μL，计算出拷贝数；稀释其拷贝数为1.0×10¹²拷贝/μL，然后根据拷贝数将质粒10倍倍比稀释成含10⁶-10¹拷贝/μL，作为阳性标准品。

RNA纯度=A₂₆₀/A₂₈₀（1.8-2.0之间，小于1.8提示有残余蛋白质，大于2.0提示有RNA降解）。

实施例2标准曲线绘制

根据GenBank（GenBank注册号：FJ794180）RHDV VP60衣壳蛋白基因序列设计筛选出PCR引物，并确认了各引物的特异性，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和2。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。该引物对的扩增片段长度为96bp。

以实施例1得到的阳性标准品作为模板，用核苷酸序列如SEQ IDNo.1和2所示的引物和荧光探针VP60p，采用一步法RT-PCR方法进行检测。检测结果如图3所示。上述RT-PCR中反应体系为：

每25μL反应液中含有：2×Quant One Step Probe qRT-PCR MasterMix（Quant一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（探针法））12.5μL、2.5U/μLHotmaster DNA聚合酶1μL、4U/μL Quant反转录酶0.35μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL、10μmol/L的探针各0.5μL、RNA模板1μL，不含RNA酶的水补足至25L。

RT-PCR反应条件为：50℃、30min，92℃、3min，92℃、10s，56℃、20s，68℃、20s，扩增40个循环。

上述RT-PCR中反应模板浓度依次为10⁶~10¹拷贝/μL，反应的灵敏度为10¹拷贝/μL，在10⁶~10¹拷贝/μL浓度范围内有极好的线性关系。结果如图4所示。

实施例3对兔肝组织样品的检测

1、提取兔肝组织样品的RNA

取RHDV分离株（购自江苏农业科学院）100倍稀释液0.2mL，肌肉注射3月龄未免疫兔。3日后部分兔出现死亡，取10只死亡兔的肝脏组织，分别使用RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司）提取兔肝组织样品。

（1）将200mg肝组织加300μL裂解液RL，彻底研磨成匀浆，加入590μL RNase-free ddH₂O和10μL蛋白酶K，混匀后56℃处理10min。

（2）将所得液体12000rpm离心5min，取上清。

（3）上清液缓慢加入200μL无水乙醇，混匀，得到溶液和沉淀一起放入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去废液，将吸附柱放回收集管中。

（4）向吸附柱中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

（5）吸附柱中加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。

（6）吸附柱中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

（7）向吸附柱中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中，并重复此步骤一次。

（8）12000rpm离心2min，弃废液，吸附柱室温放置5min，转入新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加40μL的RNase-free ddH₂O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。

2、以上述RNA作为模板，以DEPC处理的水代替RNA模板作为阴性对照，采用一步法RT-PCR方法进行检测，反应体系及反应条件与实施例2相同，根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。结果如图5所示。

来自10只死亡兔的肝组织样品的RNA都呈现出扩增曲线，检出率为100%，说明该荧光定量RT-PCR方法可以准确检测兔出血症病毒。

实施例4对活兔血液样品的检测

1、提取兔血液样品的RNA

取RHDV分离株100倍稀释液0.2mL，肌肉注射3月龄未免疫兔。3日后部分兔出现死亡，对未死亡的12只兔采血，使用RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司）分别对12份兔血液提取血液样品。

（1）将200μL血液样品加1000μL的1×红细胞裂解液，冰上孵育20min，在孵育过程中，涡旋振荡混匀2次。

（2）将所得液体4℃2100rpm离心10min，留沉淀。

（3）向白细胞沉淀中，加入1×红细胞裂解液，重悬细胞。

（4）所得液体4℃2100rpm离心10min，留沉淀。

（5）向白细胞沉淀中，加入500μL裂解液RL，混匀。

（6）将溶液转移至过滤柱中，12000rpm离心2min，弃去过滤柱，收集滤液。

（7）向滤液中加入500μL的70%乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

（8）向吸附柱中加入350μL去蛋白液，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

（9）向吸附柱中央加入80μL的DNase I，室温放置15min。

（10）向吸附柱中央加入350μL去蛋白液，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

（11）向吸附柱中加入500μL漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，重复此步骤一次。

（12）12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（13）将吸附柱转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加40μL的RNase-free ddH₂O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。

2、以上述RNA作为模板，以DEPC处理的水代替RNA模板作为阴性对照，采用一步法RT-PCR方法进行检测，反应体系及反应条件与实施例2相同，根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。结果如图6所示。

血液样品的RNA都呈现出扩增曲线，检出率为100%，说明该荧光定量RT-PCR方法可以准确检测兔出血症病毒。

试验例1  RT-PCR中引物用量的优化

引物的浓度是影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会使反应不完全；若引物太多，则发生错配及产生非特异产物的可能性会大大增加，还会使背景荧光值增加。非特异性产物和引物二聚体也多与靶序列竞争DNA聚合酶、dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。本试验例按下述方法对引物终浓度（引物用量）进行优化。

按实施例1方法制得浓度为908.1ng/μl的体外转录RNA，计算得到4.6×10¹²copy，然后倍比稀释。

取10⁴copy的体外转录RNA为模板，用核苷酸序列如SEQ IDNo.1和2所示的引物和荧光探针VP60p，采用一步法–荧光定量RT-PCR方法进行检测。

上述RT-PCR中反应体系为：将核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示的引物（10μmol/L）按体积比1:1混合，依次向反应体系中加入0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、4μL；其余试剂及用量与实施例2中的反应体系相同，用实施例2的反应条件进行一步RT-PCR检测，结果如图7所示。

根据最大荧光信号强度和最小Ct值综合考虑，确定最佳引物用量为1.0μl，即引物的终浓度分别为0.4μmol/L。

试验例2特异性考核

分别用4种菌液作为模板，在实施例2相同的条件下进行一步法RT-PCR检测，每次扩增设阴阳性对照，鉴定探针法荧光定量方法的特异性，结果如图8所示。这4份菌液分别为兔水疱性口炎病毒细胞毒、轮状病毒细胞毒、仙台病毒、RHDV。（兔水疱性口炎病毒细胞毒、轮状病毒细胞毒、仙台病毒均购自江苏省农科院）

结果表明：RHDV有扩增，呈阳性，而兔水疱性口炎病毒细胞毒、轮状病毒细胞毒、仙台病毒没有扩增，均呈阴性，表明特异性很好，可以用于兔出血症病毒的检测。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案及试验例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于兔出血症病毒RT-PCR检测的引物，其核苷酸序列如SEQID No.4和5所示。

2.含有权利要求1所述引物的检测试剂盒。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，PCR反应体系为：

每25μL反应液中含有：10×RT-PCR缓冲液2.5μL、超纯dNTP混合物1μL，各10mM、5×RT-PCR增强剂5μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.25μL、2.5U/μL Hotmaster DNA聚合酶1.25μL、Quant反转录酶0.25μL、10mmol/L的上下游引物各0.5μL、RNA模板1μL、RNase-freeddH₂O补至25μL。

4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，PCR反应条件为：50℃、30min；94℃、2min，94℃、1min，51.7℃、1min，65℃、1min，扩增35个循环；65℃、10min。

5.权利要求1所述引物在制备用于检测兔出血症病毒阳性标准品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取RHDV病毒RNA，用核苷酸序列如SEQ ID No.4和5所示的引物，进行一步法RT-PCR扩增，得到目的片段；然后将该目的片段克隆到pGEM-T Easy载体上，转入感受态细胞大肠杆菌DH5α，提取白斑阳性质粒；

2）对提取的质粒进行Sac Ⅰ酶切，使质粒DNA线性化，然后在T7RNA聚合酶作用下体外转录RNA，得到阳性标准品。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）酶切的反应体系为：RE10×缓冲液2μL、乙酰化的BSA0.2μL、质粒DNA2.3μL、10U/μL Sac Ⅰ0.5μL、ddH₂O补加至20μL。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）酶切的反应条件为：37℃温度下孵育1h。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，体外转录RNA的反应体系为：5倍优化转录缓冲液4μL；DTT2μL、重组核糖核酸酶抑制剂0.5μL；rATP、rGTP、rUTP和rCTP混合物4μL；线性化DNA8μL；19U/μL T7RNA聚合酶1μL；DEPC水补加至20μL。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，体外转录RNA的反应条件为：37℃温度下孵育1h，然后加入RQ1 0.5μL，37℃温度下孵育15min。

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