CN106702027A

CN106702027A - 一种rhdv重组聚合酶等温扩增检测方法

Info

Publication number: CN106702027A
Application number: CN201710029253.5A
Authority: CN
Inventors: 黄兵; 马秀丽; 于可响; 姜亦飞; 刘存霞; 张连芝; 庞玉倩; 李玉峰; 宋敏训
Original assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-01-16
Filing date: 2017-01-16
Publication date: 2017-05-24

Abstract

本发明公开了一种检测兔出血症病毒(RHDV)的特异性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列为：上游引物F：如SEQ.ID.NO.1所示；下游引物R：如SEQ.ID.NO.2所示。一种兔出血症病毒(RHDV)重组聚合酶等温扩增检测方法：提取肝脏组织的RNA，利用上述特异性引物进行重组酶聚合酶等温扩增，并检测扩增产物，若能扩增出317bp的条带，则判断为RHDV阳性，反之则为阴性。本发明的方法，最低检出病毒量为0.1LD₅₀，灵敏度与传统RT‑PCR一致，具有简便、快速、敏感性高、特异性好等优势，完全能够满足快速检测RHDV的需要，适用于临床生产和实验室的快速诊断。

Description

一种RHDV重组聚合酶等温扩增检测方法

技术领域

本发明涉及一种生物检测技术，具体涉及一种检测兔出血症病毒(RHDV)的特异性引物和重组聚合酶等温扩增检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

兔出血症是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一种高度接触性、急性、致死性传染病，常呈暴发性流行，对家兔饲养行业造成毁灭性的损失。RHDV的基因组为一条单股正链的RNA分子，由约7437个核苷酸组成，基因组含有2个开放阅读框架，衣壳蛋白VP60是主要的结构蛋白。RHDV的常用检测方法有血凝试验(HA)、反向间接血凝(IHA)、免疫扩散法、荧光抗体法、酶联免疫吸附法(ELISA)、电镜观察法、RT-PCR法等。HA、IHA、免疫扩散法等方便快捷，但敏感性较低,不适宜于微量病毒的检测。ELISA、荧光抗体法较为成熟，但不及RT-PCR方法敏感。常规RT-PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，需要特殊的基因扩增仪器。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。英国公司TwistDx Inc以此为基础开发的核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。RPA反应的最适温度在37℃～42℃，无需变性，在常温下即可进行，这无疑能大大加快基因扩增的速度。此外，由于不需要特殊的温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种检测兔出血症病毒(RHDV)的特异性引物，以及重组聚合酶等温扩增检测方法，该方法具有简便、快速、敏感性高、特异性好等优势，完全能够满足快速检测RHDV的需要。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测兔出血症病毒(RHDV)的特异性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列为：

上游引物F：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’；如SEQ.ID.NO.1所示；

下游引物R：5’–CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT-3’；如SEQ.ID.NO.2所示。

所述引物所对应的特异性扩增片段位于RHDV参照基因(Genbank DQ205345)的第5301-5617位点之间，大小为317bp，其核苷酸序列为：

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACA gAACAACCCATTCACAgCCg-3’，如SEQ.ID.NO.4所示。

一种兔出血症病毒(RHDV)重组聚合酶等温扩增检测方法，为：提取肝脏组织的RNA，利用上述特异性引物进行重组酶聚合酶等温扩增，并检测扩增产物，若能扩增出317bp的条带，则判断为RHDV阳性，反之则为阴性。

优选的，所述提取肝脏组织的RNA的具体方法如下：

将肝脏组织用PBS以1∶10(w/v)研磨成悬液,装入高压灭菌处理过的1.5mL EP管中，于-80℃反复冻融3次，冻融后以9000×g离心10min，取上清液300μL于2mL离心管中，加入900μL TRIZOL试剂，剧烈颠倒6～10次，室温静置10min；加入200μL氯仿，上下颠倒60～100次，室温静置5min；4℃10000×g离心10min；取上清移入1.5mL离心管中，加等体积的异丙醇，轻轻摇匀，-20℃放置30min，4℃10000×g离心10min，倒掉上清；加入1mL 75％乙醇溶液，4℃10000×g离心5min，去掉上清，在超净工作台中干燥5min，用适量0.1％DEPC水溶液溶解RNA，-20℃冻存。

优选的，进行重组酶聚合酶等温扩增时，按照TwistAmp DNA Amplification Kits试剂盒操作说明进行，反应体系为：上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL，RT Buffer 29.5μL，Template 10μL，ddH2O 5.6μL；漩涡混匀，离心；加入2.5μL 280mM MgAc，混匀。

优选的，进行重组酶聚合酶等温扩增时，扩增参数为：40℃15min后取出，冷却至室温；混匀后，离心，40℃35min。

优选的，所述检测扩增产物的方法为电泳：取5μL PCR产物加入2℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察。

本发明的检测RHDV的特异性引物，是根据RHDV的VP60基因序列设计的引物，并基于该特异性引物的性质，本发明进一步优化建立了适宜于快速准确进行RHDV检测的等温扩增基因方法，最低检出病毒量为0.1LD₅₀，灵敏度与传统RT-PCR一致。该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。

附图说明

图1：兔出血症病毒重组酶聚合酶扩增引物的优化；其中，M-标准DNA分子量2000；1-EQ.ID.NO.1/SEQ.ID.NO.3；2-EQ.ID.NO.1/SEQ.ID.NO.2。

图2：兔出血症病毒重组酶聚合酶等温检测特异性结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-兔出血症病毒；2-巴氏杆菌；3-波氏杆菌；4-大肠杆菌；5-葡萄球菌；6-魏氏梭菌；7-兔肝脏。

图3：兔出血症病毒重组酶聚合酶等温检测灵敏度结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-10³LD₅₀；2-10²LD₅₀；3-10LD₅₀；4-1LD₅₀；5-0.1LD₅₀；6-0.01LD₅₀。

图4：兔出血症病毒RT-PCR检测灵敏度结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-10³LD₅₀；2-10²LD₅₀；3-10LD₅₀；4-1LD₅₀；5-0.1LD₅₀；6-0.01LD₅₀。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例一

1、引物设计

常规RT-PCR所用引物长度一般18-25个，而RP引物的长度一般为30-35个核苷酸，引物过短会严重影响重组酶的活性，依据重组酶聚合酶的扩增特性。通过对已有的大量RHDV基因序列进行比对，参照RHDV基因序列(Genbank DQ205345)设计了3条保守引物，如下：

SEQ.ID.NO.1：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’(34nt)；

SEQ.ID.NO.2:5’-CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT-3’(位于33nt)；

SEQ.ID.NO.3:5’-AACTgCATgCCACCAgCCCAgCCAgCgTACAT-3’(32nt)。

其中，SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的扩增片段长度为317bp(第5301-5617位)。

SEQ.ID.NO.1SEQ.ID.NO.3的扩增片段长度为360bp(第5301-5660位)。

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCgTgCTgAgCCAgATgTACgCTggCTgggCTggTggCATgCAgTT-3’，如SEQ.ID.NO.5所示。

2、核酸提取

将肝脏组织用PBS以1∶10(w/v)研磨成悬液,装入高压灭菌处理过的1.5mL EP管中，于-80℃反复冻融3次，冻融后以9000×g离心10min，取上清液300μL于2mL离心管中，加入900μL TRIZOL试剂，剧烈颠倒6～10次，室温静置10min；加入200μL氯仿，上下颠倒60～100次，室温静置5min；4℃10000×g离心10min；取上清移入1.5mL离心管中，加等体积的异丙醇，轻轻摇匀，-20℃放置30min，4℃10000×g离心10min，倒掉上清；加入1mL 75％乙醇溶液，4℃10000×离心5min，去掉上清，在超净工作台中干燥5min，用适量0.1％DEPC水溶液溶解RNA，-20℃冻存。

3、重组酶聚合酶等温扩增

按照Twistamp DNA AmplifiCATion KiTs试剂盒操作说明进行,PCR反应体系：上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL,Rehydration Buffer 29.5μL,模板RNA 10μL,ddH2O 5.6μL。漩涡混匀，离心。加入2.5μL 280mM MgAC,混匀。放入PCR仪，40℃15min后取出，冷却至室温，混匀后，离心，放入PCR仪，40℃35min。

常规RT-PCR按照HiscripIIOne Step RT-PCR Kit说明书进行，50μl反应体系如下：2×onestep RT-PCR Mix 25μl，上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL,模板RNA 10μL，ddH2O 12.6μl。扩增参数如下：50℃30min，95℃5min。然后95℃20s，50℃20s，72℃30s，黄35个遁环；最后72℃延伸10min。

反应结束后于2％琼脂糖凝胶电泳,120V，30min，观察结果。

本实施例所用RT-PCR反应体系是通过常规商品化试剂盒进行组装，DNA MArkerDL-2000、TRIZOL,DEPC,均购自TAKARA公司(大连)；HisCripIIOne STep RT-PCR KiT购自VAzyme公司；TwisTAmp DNA AmplifiCATion KiTs购自TwisTDX公司。

4、结果

电泳结果表明，仅SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2这对引物扩增到了约317bp特异片段，而SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.3这对引物含有多个条带，结果如图1所示。因此，应用SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2这对引物建立了重组酶聚合酶等温核酸检测方法。

7、特异性验证

分别用兔出血症病毒、兔巴氏杆菌、兔波氏杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、魏氏梭菌、健康兔肝脏样品提取DNA或RNA作为模板进行RT-PCR，通过凝胶电泳检测。实验结果如图2所示，只有兔出血症病毒为阳性，其他的均为阴性，说明检测体系特异性良好。

8、灵敏度验证

选择标准RHDV毒株肝脏样品以10倍系列稀释，用上述建立的重组酶聚合酶等温扩增方法进行检测。与传统的RT-PCR方法的均为0.1LD₅₀，结果如图3和图4所示。

9、临床样品检测

收集家兔鼻腔拭子，加入0.8mL PBS(0.01mol/L pH7.2)，充分震荡，取上清提取核酸，用上述建立的方法进行检测，同时与传统的RT-PCR方法进行比较。结果两种方法的符合率为100％。

SEQUENCE LISTING

<110> 申请人名称

<120> 一种RHDV重组聚合酶等温扩增检测方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgttatggag ggcaaaaccc gcacagcgcc gcaa 34

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggctgtgaa tgggttgttc tgtggagagt gtt 33

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aactgcatgc caccagccca gccagcgtac at 32

<210> 4

<211> 317

<212> DNA

<213> 兔出血症病毒

<400> 4

tgttatggag ggcaaaaccc gcacagcgcc gcaaggcgaa gcagcaggca ctgctaccac 60

agcatcagtt cccggaacca cgaccgacgg catggatcct ggcgtggtgg ccgcaactag 120

tgtggtcact gcagaaaatt catccgcatc ggttgcaacg gcggggattg gcggcccacc 180

ccaacaggtg gaccaacaag aaacatggag gactaacttt tactacaatg atgttttcac 240

ttggtccgtc gcggatgcgc ccggcagcat tctctacact gtccaacact ctccacagaa 300

caacccattc acagccg 317

<210> 5

<211> 360

<212> DNA

<213> 兔出血症病毒

<400> 5

tgttatggag ggcaaaaccc gcacagcgcc gcaaggcgaa gcagcaggca ctgctaccac 60

agcatcagtt cccggaacca cgaccgacgg catggatcct ggcgtggtgg ccgcaactag 120

tgtggtcact gcagaaaatt catccgcatc ggttgcaacg gcggggattg gcggcccacc 180

ccaacaggtg gaccaacaag aaacatggag gactaacttt tactacaatg atgttttcac 240

ttggtccgtc gcggatgcgc ccggcagcat tctctacact gtccaacact ctccacagaa 300

caacccattc acagccgtgc tgagccagat gtacgctggc tgggctggtg gcatgcagtt 360

Claims

1.一种检测兔出血症病毒的特异性引物，其特征在于：包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列为：

2.根据权利要求1所述的检测兔出血症病毒的特异性引物，其特征在于：所述引物所对应的特异性扩增片段位于RHDV参照基因的第5301-5617位点之间，大小为317bp，其核苷酸序列为：

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAAC CCATTCACAgCCg-3’，如SEQ.ID.NO.4所示。

3.权利要求1或2所述的检测兔出血症病毒的特异性引物在检测兔出血症病毒中的应用。

4.一种兔出血症病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，其特征在于：提取肝脏组织的RNA，利用权利要求1所述的特异性引物进行重组酶聚合酶等温扩增，并检测扩增产物，若能扩增出317bp的条带，则判断为RHDV阳性，反之则为阴性。

5.根据权利要求4所述的兔出血症病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，其特征在于：所述提取肝脏组织的RNA的具体方法如下：

将肝脏组织用PBS以1∶10研磨成悬液,装入EP管中，于-80℃反复冻融3次，冻融后以9000×g离心10min，取上清液300μL于离心管中，加入900μL TRIZOL试剂，剧烈颠倒6～10次，室温静置10min；加入200μL氯仿，上下颠倒60～100次，室温静置5min；4℃10000×g离心10min；取上清移入离心管中，加等体积的异丙醇，轻轻摇匀，-20℃放置30min，4℃10000×g离心10min，倒掉上清；加入1mL 75％乙醇溶液，4℃10000×g离心5min，去掉上清，干燥5min，用0.1％DEPC水溶液溶解RNA，-20℃冻存。

6.根据权利要求4所述的兔出血症病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，其特征在于：进行重组酶聚合酶等温扩增时，按照TwistAmp DNA Amplification Kits试剂盒操作说明进行，反应体系为：20μmol/μL的上、下游引物各1.2μL，RT Buffer 29.5μL，Template 10μL，ddH2O 5.6μL；漩涡混匀，离心；加入2.5μL 280mM MgAc，混匀。

7.根据权利要求4所述的兔出血症病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，其特征在于：进行重组酶聚合酶等温扩增时，扩增参数为：40℃15min后取出，冷却至室温；混匀后，离心，40℃35min。