CN104263857B - 一种快速检测水貂肠炎病毒的纳米pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

一种快速检测水貂肠炎病毒的纳米pcr试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测水貂肠炎病毒的纳米PCR试剂盒及其应用，所述的试剂盒包括：2×Nano PCR缓冲液，DNA聚合酶，引物混合物，无核酸ddH2O以及阳性质粒，所述的引物为上游引物5‑ACAAGCGGCAAGCAATCCTC‑3以及下游引物：5‑CTGCCTCTATTTCGGACCAT‑3。本发明的试剂盒提高了检测的灵敏度和缩短了反应时间，具有良好的特异性，检测灵敏度与使用重组质粒pEASY‑T1‑MEV‑NS1结果相似，灵敏度是传统PCR的100倍。

Description

一种快速检测水貂肠炎病毒的纳米PCR试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和养殖技术领域，具体的涉及一种快速检测水貂肠炎病毒的纳米PCR试剂盒及其应用。
背景技术
水貂肠炎病毒(MEV)引起的水貂病毒性肠炎发病率和死亡率高，给养貂业带来了巨大的经济损失。然而本病没有特异的治疗方法，只能采用疫苗免疫来预防，所以对水貂病毒性肠炎的诊断显得尤为重要。目前对MEV的诊断主要是HA-HI(血凝实验-血凝抑制实验)和传统PCR方法，HA操作繁琐，耗时费力，而且需要准备猪的红血细胞；而PCR是近些年发展起来的分子生物学诊断方法，但是传统PCR灵敏度不高，因此如何提供一种高灵敏度和检测时间短的快速检测水貂肠炎病毒的试剂盒是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测水貂肠炎病毒的纳米PCR试剂盒及其应用，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种快速检测水貂肠炎病毒的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括：2×Nano PCR缓冲液，DNA聚合酶，引物混合物，无核酸ddH2O以及阳性质粒，所述的引物为上游引物5-ACAAGCGGCAAGCAATCCTC-3以及下游引物：5-CTGCCTCTATTTCGGACCAT-3。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的Nano PCR缓冲液包含dNTPs和Mg2+。
本发明另一方面还涉及上述纳米PCR试剂盒在制备检测水貂肠炎病毒试剂中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的检测水貂肠炎病毒包括如下步骤：从水貂粪便中提取DNA作为检测模板，取1.0μL DNA，再加入6.0μL of2×nano PCR缓冲液,0.6μL上下游引物(10μmol/L),0.2μL of Taq DNA酶(5U/μL)补水ddH2O至12μL。同时设置本试剂盒所带的质粒作为阳性对照。在PCR仪上进行如下条件的反应:94℃,3分钟，然后94℃变性30s,54.9℃退火30s，72℃延伸15s,进行31个循环后，最终72℃后延伸10分钟。
本发明的试剂盒提高了检测的灵敏度和缩短了反应时间，具有良好的特异性，检测灵敏度与使用重组质粒pEASY-T1-MEV-NS1结果相似，灵敏度是传统PCR的100倍。
附图说明
图1：是本发明实施例提供的nanoPCR退火温度、引物浓度和质粒浓度的优化示意图；
M:DNA分子质量标准；(a)1-12:退火温度分别为48℃,48.6℃,49.4℃,50.6℃,52.2℃,53.7℃,54.9℃,56.3℃,57.8℃,58.8℃,59.5℃,和60℃。(b)1-10:引物量分别为0.1μL,0.2μL,0.3μL,0.4μL,0.5μL,0.6μL,0.7μL,0.8μL,0.9μL,和1.0μL。(c)1-10:质粒DNA量分别为0.1μL,0.2μL,0.4μL,0.6μL,0.8μL,1.0μL,1.2μL,1.4μL,1.6μL,和1.8μL；
图2：是本发明实施例提供的nanoPCR和传统PCR敏感性实验示意图；
(a)nanoPCR敏感性实验结果；(b)传统PCR敏感性实验M:DNA分子质量标准；1–9:重组质粒的量分别为8.75×108,8.75×107,8.75×106,8.75×105,8.75×104,8.75×103,8.75×102,8.75×101和8.75×100拷贝/微升；10:阴性对照；
图3是本发明实施例提供的nanoPCR特异性实验示意图；
M:DNA分子质量标准；1:水貂肠炎病毒DNA；2:犬瘟热病毒cDNA,3:水貂阿留申病毒DNA,4:健康水貂粪便DNA。
具体实施方式
若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
本试剂盒组成包括：2×Nano PCR缓冲液，DNA聚合酶，引物混合物，无核酸ddH2O以及阳性质粒。
1.引物设计：使用Primer Premier5.0软件，依据MEVNS1序列(GenBank登录号为FJ592174)设计出扩增NS1部分基因序列的引物，设计了3对不同引物，分别对引物的特异性进行鉴定，用ImageJ1.46r软件对不同引物扩增条带的灰度进行分析得出第一对引物为最佳引物，其序列为5’到3’顺序：
上游：ACAAGCGGCAAGCAATCCTC；
下游：CTGCCTCTATTTCGGACCAT；
扩增长度为194bp；
本发明所使用的纳米PCR缓冲液是购买商品化的试剂盒为NanoPCR试剂盒，产品目录号是NPK20；
2.nanoPCR退火温度的优化：
采用梯度PCR仪，依次设定退火温度分别为48℃,48.6℃,49.4℃,50.6℃,52.2℃,53.7℃,54.9℃,56.3℃,57.8℃,58.8℃,59.5℃和60℃,采用20微升反应体系，经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图1a图，用ImageJ1.46r软件对图1a各个退火温度下的条带的灰度进行分析，结果显示54.9℃时条带最亮，图片见图1a图
3.nanoPCR引物浓度的优化：
在确定最佳退货温度54.9℃的条件下，采用12μL反应体系，分别加入0.1μL,0.2μL,0.3μL,0.4μL,0.5μL,0.6μL,0.7μL,0.8μL,0.9μL,和1.0μL的10μM的引物，在加入6.0μLof2×nanobuffer,1.0μLDNA模板，0.2μL Taq酶，以及上述引物，在用ddH2O补足12μL体系。反应程序如下：94℃,3然后31个循环94℃for30s,54.9℃for30s and72℃for15s,最终72℃延伸10min.最终确定0.6μL为最佳引物量。图片见图1b。
4.nanoPCR模板(质粒)浓度的优化：
在确定最佳退货温度54.9℃，最佳引物浓度为0.6μL的条件下，采用12μL反应体系，分别加入0.1μL,0.2μL,0.4μL,0.6μL,0.8μL,1.0μL,1.2μL,1.4μL,1.6μL,和1.8μL重组质粒pEASY-T1-MEV-NS1，在加入6.0μL of2×nanobuffer,各0.6μL的上下游引物，0.2μLTaq酶，在用ddH2O补足12μL体系。反应程序如下：94℃,3然后31个循环94℃for30s,54.9℃for30s and72℃for15s,最终72℃延伸10min.
最终确定1.0μL为最模板浓度。图片见图1c图
5.nanoPCR和传统PCR敏感性实验(以重组质粒pEASY-T1-MEV-NS1为模板)
采用上述12μL体系，分别对nanoPCR和传统PCR的敏感性进行实验，对pEASY-T1-MEV-NS1质粒依次进行10倍稀释如下8.75×108,8.75×107,8.75×106,8.75×105,8.75×104,8.75×103,8.75×102,8.75×101,和8.75×100拷贝/μL，依次加入到nanoPCR和传统PCR的反应体系中。结果显示传统PCR检测限为8.75×103个拷贝/微升，而nanoPCR检测限为8.75×101个拷贝/微升。nanoPCR与传统PCR相比灵敏度可提高100倍。见图2。
6.nanoPCR特异性实验
用nanoPCR对感染水貂的常见病毒MEV，CDV(犬瘟热病毒)和AMDV(水貂阿留申病毒)进行检测，结果发现本nanoPCR只能检测出MEV，而对AMDV、正常水貂粪便以及CDV的cDNA的检测均呈现阴性，图3为纳米PCR特异性实验结果。
以上步骤为本试剂盒建立的程序，该nanoPCR与传统PCR不同之处在于在PCR反应体系内加入了纳米颗粒，从而提高了检测的灵敏度和缩短了反应时间，此为nanoPCR的特点所在。另外申请人也应用已知MEV疫苗毒(用TCID50作为衡量标准)作为模板检测了nanoPCR与传统PCR的灵敏度，与使用重组质粒pEASY-T1-MEV-NS1结果相似，nanoPCR的灵敏度是传统PCR的100倍。
从水貂粪便中提取DNA作为检测模板，取1.0μL DNA，再加入6.0μL of2×nano PCR缓冲液,0.6μL上下游引物(10μmol/L),0.2μL of Taq DNA酶(5U/μL)补水ddH2O至12μL。同时设置本试剂盒所带的质粒作为阳性对照。在PCR仪上进行如下条件的反应:94℃,3分钟，然后94℃变性30s,54.9℃退火30s，72℃延伸15s,进行31个循环后，最终72℃后延伸10分钟。申请人通过上述方法对临床的246份样本进行了检测，发现nanoPCR的阳性率比传统PCR的阳性率高(数据见下表1)。
表1
以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种快速检测水貂肠炎病毒的纳米PCR试剂盒，其特征在于，该快速检测水貂肠炎病毒的纳米PCR试剂盒包括：2×Nano PCR缓冲液，DNA聚合酶，引物混合物，无核酸ddH20以及阳性质粒；
引物混合物为上游引物：5-ACAAGCGGCAAGCAATCCTC-3；
以及下游引物：5-CTGCCTCTATTTCGGACCAT-3；
在PCR仪上进行如下条件的反应：94℃，3分钟，然后94℃变性30s，54.9℃退火30s，72℃延伸15s，进行31个循环后，最终72℃后延伸10分钟。
2.根据权利要求1所述的快速检测水貂肠炎病毒的纳米PCR试剂盒，其特征在于，NanoPCR缓冲液包含dNTPs和Mg2+。
3.权利要求1所述的快速检测水貂肠炎病毒的纳米PCR试剂盒在制备检测水貂肠炎病毒试剂中的应用。
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