CN107034314A

CN107034314A - 鉴别mev野毒株与mevb毒株的lamp引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN107034314A
Application number: CN201710447272.XA
Authority: CN
Inventors: 王建科; 林鹏; 程悦宁; 程世鹏; 孙亚茹; 易立; 仝明薇; 张淼
Original assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Current assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2017-06-14
Publication date: 2017-08-11

Abstract

本发明涉及一种鉴别鉴别MEV野毒株与MEVB毒株的LAMP引物组、试剂盒及方法。所述LAMP引物组包括F3和B3组成外引物对和FIP和BIP组成的内引物对。所述试剂盒包括所述LAMP引物组、反应混合液以及DNA聚合酶。该LAMP引物组及试剂盒不仅可用于MEV野毒株的特异性检测，还可以用于MEVB毒株与MEV野毒株的鉴别。

Description

鉴别MEV野毒株与MEVB毒株的LAMP引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及病原体临床检测技术领域，具体而言，涉及一种鉴别MEV野毒株与MEVB毒株的LAMP引物组、试剂盒及方法。

背景技术

水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)属于细小病毒科，细小病毒属的成员。MEV是一种单股DNA病毒，病毒基因组包含大约5,000bp的核苷酸，病毒基因组包含两个开放阅读框，分别编码非结构蛋白NS1和NS2以及衣壳蛋白VP1和VP2。病毒粒子呈二十立面体对称，直径只有20纳米。

细小病毒科成员MEV感染水貂后能引起水貂急性的病毒性肠炎。本病最早报道于1947年的加拿大，发现感染水貂死亡率高达80％。1952年，有学者首次分离鉴定了病原证实为病毒，随后制备了组织灭活疫苗用于本病的预防。之后，本病报道于世界各地，在水貂养殖的不同国家均具有本病的发生。随着毛皮动物养殖业的发展，水貂病毒性肠炎已经成为危害水貂养殖业的三大疫病之一，给世界养貂业带来了巨大的经济损失。MEV能感染所有品种的水貂引起出血性肠炎，尤其是新出生的水貂和幼年水貂，具有较高的发病率和死亡率。

MEV诊断方法的建立对于本病的防治具有重要的意义，目前，多种实验室方法已经用于水貂病毒性肠炎的诊断(Chen and Cui,2009；Rivera and Sundquist,1984；Shen etal.,1986；Uttenthal et al.,1990；Veijalainen et al.,1986；Wang et al.,2011,2012；Zhang et al.,2007)。但是现有的方法存在各自的弊端，电子显微镜技术和病毒分离具有较高的特异性和敏感性，但是这些技术或耗时或昂贵，前者不能在一般的实验室操作。乳胶凝集试验虽然快速但是特异性较低。血凝试验缺乏稳定性而且需要血凝抑制试验符合实验结果，而且随时需要准备新鲜的猪红血球，并且本方法对于无血凝特性的MEV毒株是无效的(Rivera and Sundquist,1984)。虽然ELISA和PCR技术具有较高的特异性和敏感性，已经广泛的应用于MEV的诊断上，但是这些技术需要专业的设备和专门的操作人员。

更为重要的是，现有技术中缺乏一种方便快捷的区分MEV的野毒株和疫苗株的方法。由于临床MEV野毒经典株、变异株的同时存在，加上疫苗的大量使用，给临床监测和诊断带来很大的困难。建立MEV野毒株、疫苗株的鉴别检测方法是检测和诊断该病的重要前提。

有鉴于此，特提出本发明。

参考文件：

Chen,C.M.and Cui,S.J.,2009.Detection of porcine parvovirus by loop-mediated isothermal amplification.Journal of virological methods 155,122-5.

Rivera,E.and Sundquist,B.,1984.A non-haemagglutinating isolate ofmink enteritis virus.Vet Microbiol 9,345-53.

Shen,D.T.,Ward,A.C.and Gorham,J.R.,1986.Detection of mink enteritisvirus in mink feces,using enzyme-linked immunosorbent assay,hemagglutination,and electron microscopy.Am J Vet Res 47,2025-30.

Uttenthal,A.,Larsen,S.,Lund,E.,Bloom,M.E.,Storgard,T.andAlexandersen,S.,1990.Analysis of experimental mink enteritis virus infectionin mink:in situ hybridization,serology,and histopathology.J Virol 64,2768-79.

Veijalainen,P.M.,Neuvonen,E.,Niskanen,A.and Juokslahti,T.,1986.Latexagglutination test for detecting feline panleukopenia virus,canineparvovirus,and parvoviruses of fur animals.Journal of clinical microbiology23,556-9.

Wang,J.K.,Cheng,S.P.,Yi,L.,Yang,S.,Luo,B.,Xu,H.L.,Yan,X.J.and Wu,H.,2011.Establishment of double antibody sandwich ELISA for detection of minkenteritis virus.Chinese Veterinary Science 41,183-187.

Wang,J.K.,Cheng,S.P.,Yang,S.,Yi,L.,Xu,H.L.,Cheng,Y.N.,Shi,X.C.,Wu,H.and Yan,X.J.,2012.Establishment of PCR-RFLP for differentiation of minkenteritis virus vaccine strain and wild strain.Chinese Veterinary Science 42,264-267.

Zhang,H.L.,Yan,X.J.,Chai,X.L.,Wu,W.,Yi,L.,Luo,G.L.,Tian,H.Y.,Shao,X.Q.and Wang,F.X.,2007.Establishment and application of PCR for detection ofmink enteritis virus.Special Wild Economic Animal and Plant Research 29,1-3.

发明内容

本发明的目的在于提供种一种用于检测MEV野毒株的LAMP引物组和试剂盒，该引物组和试剂盒能特异性地对MEV野毒株进行检测，但不对疫苗株MEVB进行扩增。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种检测MEV野毒株的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括F3和B3组成外引物对和FIP和BIP组成的内引物对；

所述F3、B3、FIP以及BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～4所示。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothemal amplification,LAMP)是近年来发展出来的一种核酸扩增技术。通过设计识别目的片段6个序列的4个特异引物，整个反应可以在恒温条件下1h左右完成，由于采用4个引物，与传统的核酸扩增技术相比，它具有敏感、特异的特点。反应不需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器，对操作人员的熟练度和专业水平要求不高，因此该方法特别适合基层或者实验条件较差的试验室进行病原微生物的快速检测。

引物的特异性是LAMP检测方法成败的关键。引物的设计及筛选有其独特的设计原则及规律。LAMP反应中内引物FIP/BIP和外引物F3/B3的特异性决定了反应的特异性。本发明提供的LAMP引物具有非常高的特异性，可针对SNP位点进行检测，所设计的LAMP-SNP引物只能将MEV野毒株进行扩增，而MEVB毒株和非MEV毒株没有扩增。

本发明还涉及一种用于检测MEV野毒株的LAMP试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的LAMP引物组、反应混合液以及DNA聚合酶。

本发明提供的检测试剂盒具有用样少、特异性强、敏感性高、快速准确等特点，为检测MEV野毒株提供了简捷、有效的早期快速诊断途径。

优选的，如上所述的用于鉴别MEV野毒株的LAMP试剂盒，所述反应混合液包括dNTP、MgSO₄以及甜菜碱中的一种或多种。

优选的，如上所述的用于鉴别MEV野毒株的LAMP试剂盒，所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活性单位为6～10U/μL，更优选为8U/μL。

Bst DNA聚合酶来源于Bacillus stearothermophilus。它有5'→3'的聚合酶活性和双链特异的5'→3'外切酶活性，但没有3'→5'外切酶活性。具有热稳定性、链置换活性及聚合酶活性，在体外DNA等温扩增反应中起重要作用。

优选的，如上所述的用于鉴别MEV野毒株的LAMP试剂盒，所述试剂盒中还含有指示剂；所述指示剂选自SYBR Green I、EvaGreen、PicoGreen、Peko Green、碘化丙啶、钙黄绿素或羟基萘酚蓝中的一种。

因为产物是双链DNA，也可以通过颜色变化直接观察，即在反应产物中加入SYBRGreen I、EvaGreen、PicoGreen、Peko Green、碘化丙啶(PI)等双链DNA荧光显色试剂或者黄连素(berberine)，在荧光灯下观察颜色变化，如Sybr-Green、EvaGreen、PicoGreen、PekoGreen、阳性为绿色荧光，阴性无绿色荧光。而PI阳性为红色荧光，阴性无红色荧光。黄连素在荧光下阳性为黄色荧光，而阴性无黄色荧光；

或者在反应体系中加入20～30mM钙黄绿素(Calcein)和0.3～0.7mM MnCl₂，在反应过程中和反应后观察颜色或荧光变化，可见光下阴性为橙色，阳性为绿色，在荧光灯下阴性无绿色荧光，阳性为绿色荧光。钙黄绿素和MnCl₂也可在反应结束后加入产物中观察颜色或荧光变化。

所述试剂盒也可以不使用指示剂，由于最终产物是由不同长度DNA分子组成的混合物，故用2％-3％琼脂糖凝胶电泳，可以看到类似梯状条带，也可以判断阳性扩增。

优选的，如上所述的用于鉴别MEV野毒株的LAMP试剂盒，所述试剂盒还包括MEV野毒株DNA的阳性对照。

如上所述的引物组或如上所述的试剂盒在鉴别MEV野毒株与MEVB毒株中的应用；

由于该引物组和试剂盒能特异性地对MEV野毒株进行检测，但不对疫苗株MEVB进行扩增，因此可用于临床和科研中MEV野毒株与MEVB毒株的鉴别；

优选的，所述MEV野毒株包括：MEV SD 07/09、MEV ZJ1，MEV-LN10、MEV-SDNH、MEV-L、MEV-Abashiri、MEV-LHV、MEV-SD12/01、MEV-Jlin/2010。

本发明还涉及一种鉴别MEV野毒株与MEVB毒株的方法，包括：

提取含有MEV野毒株或MEVB毒株的待检测样本的DNA，添加如上所述的试剂盒中的试剂组成反应体系进行恒温反应；若反应过程中或反应后观察到反应液中指示剂出现颜色变化或荧光强度变化，或电泳检测到反应产物出现弥散状梯状条带，则所述待检样本中含有MEV野毒株，反之所述待检样本中仅含有MEVB毒株。

优选的，如上所述的检测方法，所述反应体系中，F3、B3、FIP以及BIP的浓度比为(3～5):(3～5):(23～27):(23～27)；

更优选的，所述反应体系中，F3、B3、FIP以及BIP的浓度比为4:4:25:25；

优选的，如上所述的检测方法，所述恒温反应的条件为：

63℃～68℃恒温反应50min～80min；

更优选的，所述恒温反应的条件为：

65℃恒温反应60min；

更优选的，在所述恒温反应之后还包括：

80℃灭活10min。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、本发明提供的LAMP引物组能够特异性地用于MEV野毒株的检测，且基于该特点，可将所述LAMP引物组及包含所述引物组的试剂盒用于MEV野毒株与MEVB疫苗毒株的鉴别。

2)、本发明检测对象是水貂肠炎病毒DNA，水貂肠炎病毒DNA具有保守、稳定的特点，加上我们设计了针对该保守序列的6个位点的4条引物，扩增产物也是具有特异和稳定的特点；从而不依赖于病毒基因组的序列测定，只需要学会简单的DNA操作即可掌握。

3)、本发明采用Bst DNA聚合酶代替常规PCR的DNA聚合酶，该酶耐高温，有链置换功能和DNA 5’→3’聚合活性，在60℃～65℃等温条件下对靶DNA实现特异扩增；由于不需要高温变性、低温退火和延伸的循环，省去了常规PCR变温所需要的时间，从而实现快速高效的DNA扩增。

4)、本发明所使用的仪器都是常规仪器，离心机和恒温水浴锅或者其他恒温设备，不需要昂贵的PCR仪设备，成本大大降低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为使用本发明提供的LAMP-SNP技术检测鉴别MEV毒株(MEV SD、MEV ZJ1，MEV-LN10和MEVB)和非MEV毒株(CDV3毒株，AMDV-G毒株和CAV-2C毒株)的DNA(或cDNA)的电泳检测结果；1泳道为MEVB，2～4为MEV SD、MEV ZJ1，MEV-LN10；5～7为CDV3毒株，AMDV-G毒株和CAV-2C毒株；

图2为用不同稀释度的pT-MEV-NS1作为模板，分别按照已经建立LAMP-SNP反应条件和PCR条件进行扩增的电泳检测结果；图2A:LAMP-SNP；图2B:PCR；1～8泳道的pT-MEV-NS1质粒的稀释倍数分别为10-¹～10^-8；

图3为对阳性临床样品进行LAMP-SNP技术检测时的部分检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例

实验方法：

根据文献报道引物诊断样品中阳性MEV【Wang,J.,Cheng,S.,Yi,L.,Cheng,Y.,Yang,S.,Xu,H.,Li,Z.,Shi,X.,Wu,H.,and Yan,X.(2013).Detection of mink enteritisvirus by loop-mediated isothermal amplification(LAMP).Journal of virologicalmethods 187,401-405.】。参考GenBank上的所有MEV NS1基因序列，进行比对发现MEVB毒株第1846位为A，而其他MEV毒株为G。因此利用该位点差异在LAMP在线设计引物软件(http://primerexplorer.jp/e/)设计一组引物，鉴别MEVB毒株与MEV野毒株。

引物序列为：

F3：TAGAGACACAAGCGGCAA；

B3：CCTCTATTTCGGACCACG；

FIP(F1c+F2)：CTGGAGTACTCCACGGTTCCTCCTCAGAGTCAAGACCA；

BIP(B1c+B2)：GATACGCCTATTGCAGAAACTTTGCACGTCTTTGTGAGT。

收集吉林省104份临床粪便样品，利用DNA提取试剂盒提取DNA，根据文献中的引物检测MEV阳性样品。再分别用PCR技术和LAMP-SNP技术分别检测阳性MEV临床样品。

病毒DNA提取：

含有MEV SD毒株的无菌采取粪拭子样品浸泡于含有400μl的Tris-EDTA溶液的1.5ml离心管里，存于-20℃备用。MEVB同步接毒F81细胞96h出现细胞病变后收毒作为阳性对照。按照试剂盒的说明书应用DNA提取试剂盒分别提取粪便样品、MEVB毒株感染细胞及阴性对照细胞的总DNA。提取的DNA作为LAMP和PCR实验的模板。

根据GenBank上的MEV SD毒株NS1基因设计一对引物，应用Primer Preimer5.0软件设计一对特异性引物。引物序列如下：

MEV NS1F：CGCGGATCCATGTCTGGCAACCAGTATA

MEV NS1R：CGGCTGCAGTTAATCCAAGTCGTCTCGAA

以MEV NS1F、MEV NS1R为引物，以MEV SD毒株的DNA为模板进行PCR扩增，反应条件为95℃5min，94℃30s，55℃60s，72℃120s，35个循环，72℃后延伸10min。纯化后的NS1片段与pMD-18T载体连接，获得阳性pT-MEV-NS1。

根据文献中的引物检测MEV阳性样品。再利用LAMP-SNP技术鉴别诊断MEVB疫苗毒和野毒株，反应体系：F3、B3各0.4μL(10pM)，FIP、BIP各2.5μL(10pM)，dNTP 3.5μL(10mM)，10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5μL，Bst DNA聚合酶0.5μL(8U)，MgSO₄ 4μL(100mM)，甜菜碱6μL(20μM)，样品DNA 2μL。反应条件为：在金属浴65℃反应60min，80℃灭活10min。2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察结果。

检测LAMP-SNP技术的特异性和敏感性。本实验室已经分离的MEV SD毒株、MEV ZJ1毒株，MEV-LN10毒株和MEVB毒株；非MEV毒株CDV3毒株，AMDV-D毒株和CAV-2C毒株，对以上毒株进行LAMP-SNP技术检测。对阳性的pT-MEV-NS1质粒十倍稀释(2×10⁶-2×10^-2copies/mL)检测LAMP-SNP技术最低检测量，并与PCR进行对比。

实验结果：

提取MEV毒株(MEV SD、MEV ZJ1，MEV-LN10和MEVB)和非MEV毒株(CDV3毒株，AMDV-G毒株和CAV-2C毒株)的DNA(或cDNA)，应用LAMP-SNP技术检测阳性样品。其电泳检测结果见图1。所设计的LAMP-SNP引物只能将MEV野毒株进行扩增，而MEVB毒株和非MEV毒株没有扩增。表明本试验设计的LAMP-SNP引物具有良好的特异性。用不同稀释度的pT-MEV-NS1作为模板，分别按照已经建立LAMP-SNP反应条件和PCR条件进行扩增，经2％琼脂糖凝胶电泳，扩增的结果见图2。由图可见LAMP-SNP最低检测量为10¹copies/mL，而PCR技术的最低检测量为10²copies/mL。

从吉林省部分地区收集104份临床粪便样品并提取DNA，采用LAMP技术检测出43份阳性临床样品。对43份阳性临床样品分别用PCR和LAMP-SNP技术进行检测，部分检测结果见图3，符合率为100％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120> 鉴别MEV野毒株与MEVB毒株的LAMP引物组、试剂盒及方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagagacaca agcggcaa 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctctatttc ggaccacg 18

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctggagtact ccacggttcc tcctcagagt caagacca 38

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatacgccta ttgcagaaac tttgcacgtc tttgtgagt 39

Claims

1.检测MEV野毒株的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括F3和B3组成外引物对和FIP和BIP组成的内引物对；

所述F3、B3、FIP以及BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～4所示。

2.一种用于检测MEV野毒株的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的LAMP引物组、反应混合液以及DNA聚合酶。

3.根据权利要求2所述的用于鉴别MEV野毒株的LAMP试剂盒，其特征在于，所述反应混合液包括dNTP、MgSO₄以及甜菜碱中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的用于鉴别MEV野毒株的LAMP试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活性单位为6～10U/μL。

5.根据权利要求2所述的用于鉴别MEV野毒株的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有指示剂；所述指示剂选自SYBR Green I、EvaGreen、PicoGreen、Peko Green、碘化丙啶、钙黄绿素或羟基萘酚蓝中的一种。

6.根据权利要求2所述的用于鉴别MEV野毒株的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括MEV野毒株DNA的阳性对照。

7.权利要求1所述的引物组或权利要求2～6任一项所述的试剂盒在鉴别MEV野毒株与MEVB毒株中的应用；

8.一种鉴别MEV野毒株与MEVB毒株的方法，其特征在于，包括：

提取含有MEV野毒株或MEVB毒株的待检测样本的DNA，添加权利要求2～5任一项所述的试剂盒中的试剂组成反应体系进行恒温反应；若反应过程中或反应后观察到反应液中指示剂出现颜色变化或荧光强度变化，或电泳检测到反应产物出现弥散状梯状条带，则所述待检样本中含有MEV野毒株，反之所述待检样本中仅含有MEVB毒株。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述反应体系中，F3、B3、FIP以及BIP的浓度比为(3～5):(3～5):(23～27):(23～27)。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述恒温反应的条件为：

63℃～68℃恒温反应50min～80min。