发明内容
本发明要解决的问题是针对以上不足,提供一种水貂阿留申病毒的LAMP检测方法,克服了现有检测方法误差大、易散毒、耗时长的缺陷,采用本发明的LAMP检测方法,可以快速诊断水貂是否感染水貂阿留申病毒,具有检测成本低,检测效率高的优点。
LAMP,为loop-mediatedisothermalamplification的简称,中文名称为环介导等温扩增。
为解决以上技术问题,本发明采用的技术方案为:一种水貂阿留申病毒的LAMP检测方法,其特征在于:所述LAMP检测方法包括以下步骤:
a.DNA模板的提取;
b.LAMP反应引物的设计;
c.LAMP反应;
d.LAMP反应结果检测。
一种优化方案,所述步骤a包括:利用病毒DNA提取纯化试剂盒进行提取水貂阿留申病毒DNA,得样本DNA。
进一步地,所述步骤b包括:选择水貂阿留申病毒VP2基因作为靶基因;
根据LAMP引物设计软件网址:http://primerexplorer.jp/e/,将待扩增的DNA分为六个独立的区域,根据这六个区域分别设计LAMP反应所需的引物,所述引物包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3、环引物LB、LF,共设计五套LAMP引物扩增VP2基因。
进一步地,所述五套LAMP引物扩增VP2基因包括:
第一套为:
ADV55-F3:CCAACCAAGGTAACGCAT
ADV55-B3:TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV55-FIP:GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTTCAACAATGACTTAACTGCG
ADV55-BIP:CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV55-LF:GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGA;
第二套为:
ADV8-F3:GTTTGGTTACTTTAGAACAAGAG
ADV8-B3:TGCTCTCCAAGGAACAAAG
ADV8-FIP:TGCTTGGTAGATGCGTTACCTTTTTTATAGACAATGTAACCATAAAGACTG
ADV8-BIP:TAACTGCGTCGTTACAGGTTGCTTTTCCCAGTGTTTCTCCCAAC
ADV8-LB:ACAACATATTGCCATATACTCCAGC;
第三套为:
ADV21-F3:GATAGACAATGTAACCATAAAGACT
ADV21-B3:TTGGTTTGGTTGCTCTCC
ADV21-FIP:CGACGCAGTTAAGTCATTGTTGATTTTGTAACAGAAACCAACCAAGGTA
ADV21-BIP:TACAGGTTGCTTTAGACACTAACAATTTTAAGGAACAAAGCCCAGTG
ADV21-LB:CATATACTCCAGCTGCGCCGTT;
第四套为:
ADV37-F3:ACCATAAAGACTGTAACAGAAAC
ADV37-B3:TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV37-FIP:GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGATTTTTAACGCATCTACCAAGCA
ADV37-BIP:CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG;
第五套为:
ADV46-F3:AACCAAGGTAACGCATCT
ADV46-B3:TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV46-FIP:GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTACCAAGCAATTCAACAATGA
ADV46-BIP:CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV46-LF:AACCTGTAACGACGCAGTTAAG。
进一步地,所述步骤c包括:根据环介导等温扩增法FDR荧光检测试剂盒配制26μl反应混合物。
进一步地,所述反应混合物包括:
2×反应混合液,用量为12.5μl;
引物混合液:40pmolFIP和40pmolBIP,5pmolF3和5pmolB3,20pmolLB和20pmolLF,用量为2.6μl;
双蒸水,用量为6.9μl;
样本DNA,用量为2μl
BstDNA聚合酶,用量为1μl;
显色液,1μl;
封闭剂,一个。
进一步地,所述步骤d包括浊度法检测:采用实时浊度仪检测,每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性。
进一步地,所述步骤d包括显色法检测:基于钙黄绿素颜色改变检测,钙黄绿素是一种金属离子指示剂,根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色,阴性时为橙色,阳性时为绿色。
进一步地,所述LAMP检测方法包括步骤e:LAMP方法敏感性;
所述LAMP方法敏感性包括:以含VP2片段的质粒为检测对象,定量后将总DNA进行10倍稀释度稀释,使得最终稀拷贝数为105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、100拷贝/μl,并以双蒸水作为阴性对照。然后进行LAMP反应,分别采用浊度法和显色法来检测结果。
本发明采用以上技术方案,与现有技术相比,具有以下优点:经试验得知,特异性好、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
实施例,一种水貂阿留申病毒的LAMP检测方法,包括以下步骤:
a、DNA模板的提取
利用病毒DNA提取纯化试剂盒进行提取水貂阿留申病毒DNA,得样本DNA;
b、LAMP反应引物的设计
选择水貂阿留申病毒VP2基因作为靶基因,序列如下:AACAAGTAATGACACCTTGGTTTTTGGTAGATAGCAACGCTTGGGGTGTGTGGATGAGTCCTAAAGACTTTCAACAAATGAAAACACTATGTAGTGAAATTAGTTTGGTTACTTTAGAACAAGAGATAGACAATGTAACCATAAAGACTGTAACAGAAACCAACCAAGGTAACGCATCTACCAAGCAATTCAACAATGACTTAACTGCGTCGTTACAGGTTGCTTTAGACACTAACAACATATTGCCATATACTCCAGCTGCGCCGTTGGGAGAAACACTGGGCTTTGTTCCTTGGAGAGCAACCAAACCAACCCAATATAGGTATTATCATCCATGTTACATTTACAACAGATATCCTAACATTCAAAAAAAAGGACAGGAAGAACTTGAATGGCAAGCAATACAAGATGATTACCTTAGTGTGGATGAGCAGTACTTTAACTTTATTACTATAGAGAACAACATACCTATTAACATTCTCAGAACGGGAGATAACTTTCATTCAGGCATATATGAGTTTAAAAGTA;
根据LAMP引物设计软件网址:http://primerexplorer.jp/e/,将待扩增的DNA分为六个独立的区域,根据这六个区域分别设计LAMP反应所需的引物(包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3、环引物LB、LF),共设计五套LAMP引物扩增VP2基因;
第一套为:
ADV55-F3:CCAACCAAGGTAACGCAT
ADV55-B3:TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV55-FIP:GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTTCAACAATGACTTAACTGCG
ADV55-BIP:CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV55-LF:GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGA;
第二套为:
ADV8-F3:GTTTGGTTACTTTAGAACAAGAG
ADV8-B3:TGCTCTCCAAGGAACAAAG
ADV8-FIP:TGCTTGGTAGATGCGTTACCTTTTTTATAGACAATGTAACCATAAAGACTG
ADV8-BIP:TAACTGCGTCGTTACAGGTTGCTTTTCCCAGTGTTTCTCCCAAC
ADV8-LB:ACAACATATTGCCATATACTCCAGC;
第三套为:
ADV21-F3:GATAGACAATGTAACCATAAAGACT
ADV21-B3:TTGGTTTGGTTGCTCTCC
ADV21-FIP:CGACGCAGTTAAGTCATTGTTGATTTTGTAACAGAAACCAACCAAGGTA
ADV21-BIP:TACAGGTTGCTTTAGACACTAACAATTTTAAGGAACAAAGCCCAGTG
ADV21-LB:CATATACTCCAGCTGCGCCGTT;
第四套为:
ADV37-F3:ACCATAAAGACTGTAACAGAAAC
ADV37-B3:TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV37-FIP:GTGTCTAAAGCAACCTGTAACGATTTTTAACGCATCTACCAAGCA
ADV37-BIP:CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG;
第五套为:
ADV46-F3:AACCAAGGTAACGCATCT
ADV46-B3:TGTTGTAAATGTAACATGGATGA
ADV46-FIP:GCTGGAGTATATGGCAATATGTTGTTTTTACCAAGCAATTCAACAATGA
ADV46-BIP:CCGTTGGGAGAAACACTGGGTTTTATACCTATATTGGGTTGGTTTG
ADV46-LF:AACCTGTAACGACGCAGTTAAG;
c、LAMP反应
根据环介导等温扩增法FDR荧光检测试剂盒配制26μl反应混合物:
包括:
2×反应混合液,用量为12.5μl;
引物混合液:40pmolFIP和40pmolBIP,5pmolF3和5pmolB3,20pmolLB和20pmolLF,根据设计的引物序列,由试剂公司合成引物,用量为2.6μl;
双蒸水,用量为6.9μl;
样本DNA,用量为2μl
BstDNA聚合酶,用量为1μl;
显色液,1μl;
封闭剂,一个;
环介导等温扩增法FDR荧光检测试剂盒包括:除引物混合液、样本DNA外成分;将反应混合物置于65℃恒温反应60min,以双蒸水为阴性对照;
d、LAMP反应结果检测
浊度法检测:采用实时浊度仪检测,LAMP在反应过程中发生以下反应式:
(DNA)n-1+dNTP→(DNA)n+P2O7 4-
P2O7 4-+2Mg2+→Mg2P2O7↓
其中Mg2P2O7即焦磷酸镁,为白色沉淀。依据这个原理,日本荣研化学株式会社开发出实时浊度仪LA-320c,每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性;
显色法检测:基于钙黄绿素颜色改变检测,钙黄绿素是一种金属离子指示剂,根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色,阴性时为橙色,阳性时为绿色;
LAMP方法敏感性试验
为了验证LAMP方法的检测灵敏度,以含VP2片段的质粒为检测对象,定量后将总DNA进行10倍稀释度稀释,使得最终稀拷贝数为105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、100拷贝/μl,并以双蒸水作为阴性对照。然后进行LAMP反应,分别采用浊度法和显色法来检测结果。
材料:水貂阿留申病病毒、水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒由中国农业科学院特产研究所提供;人基因组、鼠基因组由北京蓝谱生物科技有限公司提供。
阳性质粒标准品的制备:根据水貂阿留申病毒VP2基因序列,由大连宝生物公司纯人工合成质粒,基因全长528bp。
仪器:
实时浊度仪:日本荣研LA-320c;
恒温金属浴:杭州博日CHB-100;
核酸蛋白分析仪:BeckmanDU800;
台式高速离心机:Eppendorf5417R;
PCR仪:ATC401;
凝胶成像仪:法国VILBER3026。
试剂:
环介导等温扩增法FDR荧光检测试剂盒:北京蓝谱生物科技有限公司(试剂盒组成:2×反应混合液,BstDNA聚合酶,显色液,封闭剂);
病毒DNA提取纯化试剂盒:Promega,WizardGenomicDNAPurificationKit,货号:A1120。
2xTaqPCRMastermix:TIANGEN货号:KT201
引物合成由大连宝生物工程有限公司完成。
结果与分析
最佳引物的筛选:
附图1所示,以本研究设计的五套引物对含VP2片段的质粒(质粒浓度108拷贝/ul)进行LAMP扩增,最先发生LAMP反应的引物组合为最佳引物,从图中可以看出ADV21、ADV8、ADV55、ADV46、ADV37引物组开始发生LAMP反应的时间是分别是第16min、22min、24min、29min、40min,故将ADV21引物组选为最佳引物。
最佳引物的特异性试验:
附图2所示,阴性对照以水作为模板,阳性对照用含VP2的质粒作为模板,并用人基因组、鼠基因组、细小病毒、犬瘟热病毒作为对照以检测特异性。当反应体系中存在VP2基因时,便发生LAMP扩增反应,产生大量的焦磷酸镁白色沉淀,反应液的浊度上升,在图中表现为曲线上升,从图中可以看出只有阳性对照的曲线发生了上升,其他曲线均没有变化,表明设计的引物具有良好的特异性。采用钙黄绿素染色来观察结果,与浊度法一致,如图3所示,图中:1、阴性对照;2、阳性对照;3、人基因组;4、鼠基因组;5、细小病毒;6、犬瘟热
病毒。
最佳引物的敏感性试验与PCR方法的比较:
将10倍梯度稀释的含VP2基因的质粒模板用于LAMP反应,检测结果见图4,图中:模板浓度分别为:1、105拷贝/μl;2、104拷贝/μl;3、103拷贝/μl;4、102拷贝/μl;5、101拷贝/μl;6、100拷贝/μl;7、0拷贝/μl;8、阴性对照。显色法与浊度法试验结果一致,LAMP最低检测浓度为10拷贝/μl,如图5所示。
将10倍梯度稀释的含VP2基因的质粒模板用于PCR反应,检测结果见图6,图中,模板浓度分别为:1、105拷贝/μl;2、104拷贝/μl;3、103拷贝/μl;4、102拷贝/μl;5、101拷贝/μl;6、100拷贝/μl;7、0拷贝/μl;8、阴性对照。引物为ADV21-F3,ADV21-B3。25μlPCR反应总体积的组成:2×TaqMIX12.5μl、各10pmol引物、模板1μl,补水至25ul。扩增循环条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共40个循环;最后延伸7min。取PCR产物5μl,在1%含EB琼脂糖凝胶电泳上120V电泳35min,在凝胶成像系统下照像检测。从图6可以看出,PCR最低检测浓度为100拷贝/μl。
LAMP最佳反应时间的确定:
LAMP反应时间定为能检测到质粒103拷贝/微升的时间为最佳,但是不能过分追求其敏感性以防止假阳性的出现,故结合本试验最佳引物的敏感性,将LAMP反应时间定为50分钟。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
<120>一种水貂阿留申病毒的LAMP检测方法
<140>2014101465684
<141>2014-05-09
<160>1
<210>1
<211>528
<212>DNA
<213>水貂阿留申病毒VP2基因
<400>1
AACAAGTAATGACACCTTGGTTTTTGGTAGATAGCAACGCTTGGGGTGTGTGGATGAGTC60
CTAAAGACTTTCAACAAATGAAAACACTATGTAGTGAAATTAGTTTGGTTACTTTAGAAC120
AAGAGATAGACAATGTAACCATAAAGACTGTAACAGAAACCAACCAAGGTAACGCATCTA180
CCAAGCAATTCAACAATGACTTAACTGCGTCGTTACAGGTTGCTTTAGACACTAACAACA240
TATTGCCATATACTCCAGCTGCGCCGTTGGGAGAAACACTGGGCTTTGTTCCTTGGAGAG300
CAACCAAACCAACCCAATATAGGTATTATCATCCATGTTACATTTACAACAGATATCCTA360
ACATTCAAAAAAAAGGACAGGAAGAACTTGAATGGCAAGCAATACAAGATGATTACCTTA420
GTGTGGATGAGCAGTACTTTAACTTTATTACTATAGAGAACAACATACCTATTAACATTC480
TCAGAACGGGAGATAACTTTCATTCAGGCATATATGAGTTTAAAAGTA528