CN107254527B - 一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒及方法，其中，罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒包括螺原体DNA提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有用于检测罗氏沼虾螺原体扩增用核酸引物组，该引物组包含引物MrSpi‑P1、引物MrSpi‑B1、引物MrSpi‑P2、引物MrSpi‑B2、引物MrSpi‑P3和引物MrSpi‑B1；本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的快速扩增反应体系，不但使得罗氏沼虾螺原体定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒可用于现场检测，具有很高的科研和经济价值。
Description
技术领域
本发明属于靶基因片断的快速检测领域，具体地说，涉及一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒及方法。
背景技术
罗氏沼虾螺原体(Macrobrachium rosenbergii Spiroplasma，MrSpi)是一种可引起罗氏沼虾幼体和成虾致死性疾病的病原微生物。其通过鳃、肠道和表皮进入罗氏沼虾体内，在血细胞中寄生和增殖，进而感染结缔组织，引起罗氏沼虾幼体活力和抗病力降低，引起罗氏沼虾成虾肌肉损伤和鳃水肿，进而引起罗氏沼虾幼体和成虾死亡。罗氏沼虾螺原体是我国新近发现并在罗氏沼虾苗种中流行的新病原，该病原广泛存在于水产养殖环境中，已在多种虾类中被发现。根据流行病学调查，罗氏沼虾螺原体在罗氏沼虾育苗和养殖期间具有很高的感染风险。
专利一种检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒(申请号：200710025337.8，申请日：2007-07-24，公开号：CN 101105494A，公开日：2008-01-16)是一种利用免疫学原理进行设计的检测试剂盒，存在检测步骤封锁且灵敏度低的缺陷；专利虾蟹螺原体病原的原位杂交检测探针及试剂盒(申请号：201210443870.7，申请日：2012.11.08，公开号：CN103805680A，公开日：2014.05.21)是一种利用核酸杂交原理进行设计的检测试剂盒，存在对操作人员要求高、步骤繁琐、检测失败率高等缺点。
因此，研制一种操作简便、临床实用、检测灵敏度和特异性高的罗氏沼虾螺原体检测试剂盒，具有重要应用经济价值和市场前景。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒及方法，本发明的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明罗氏沼虾螺原体快速检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于检测罗氏沼虾螺原体扩增用核酸引物组，该引物组包含引物MrSpi-P1、引物MrSpi-B1、引物MrSpi-P2、引物MrSpi-B2、引物MrSpi-P3和引物MrSpi-B3；
所述的引物MrSpi-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述的引物MrSpi-B1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述的引物MrSpi-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的引物MrSpi-B2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述的引物MrSpi-P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述的引物MrSpi-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明还公开了一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒，包括螺原体DNA提取试剂和反应试剂，所述的反应试剂中含有上述的用于检测罗氏沼虾螺原体扩增用核酸引物组。
进一步地，所述螺原体DNA提取试剂的成分为60mM Tris、800mM NaCl、20mM EDTA、1％体积百分比NP-40的pH 8.0的裂解液。
进一步地，所述反应试剂包括以下组分：
a)预反应液：20mM pH为8.8的Tris-HC1、8mM硫酸镁、15mM氯化钾、10mM硫酸按、0.l2％Tween-20、1.4mM dNTP、0.5M甜菜碱、0.2μM引物MrSpi-P1、0.2μM引物MrSpi-B1、1.6μM引物MrSpi-P2、1.6μM引物MrSpi-B2、0.8μM引物MrSpi-P3和0.8μM引物MrSpi-B3；
所述的引物MrSpi-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述的引物MrSpi-B1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述的引物MrSpi-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的引物MrSpi-B2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述的引物MrSpi-P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述的引物MrSpi-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
b)反应酶：每微升含8个活性单位的Bst 2.0DNA聚合酶；
c)反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；
d)反应显色液：含有10％SYBR Green I的荧光染料。
本发明还公开了一种利用上述的罗氏沼虾螺原体的快速检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：
1)DNA抽提：取罗氏沼虾幼体或苗或肠道或肝胰脏组织30-80mg于2mL离心管中，采用上述的螺原体DNA提取试剂进行DNA提取；
2)对罗氏沼虾螺原体基因进行扩增；
3)对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测。
进一步地，步骤1)中的DNA抽提具体为：取罗氏沼虾幼体或苗或肠道或肝胰脏组织30-80mg于1.5mL离心管中，并向离心管加入上述的螺原体DNA提取试剂200μL，于冰上用研磨棒研磨，研磨均匀后，95℃以上加热10分钟左右，10000rpm离心10分钟后，上清即为待检DNA模板，-80℃保存备用。
进一步地，步骤2)中对罗氏沼虾螺原体基因进行扩增具体为：
2.1)根据待检测样品的数目，设置所需反应管数N，N＝样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；
2.2)吸取预反应液的体积为N×22μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμL反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；
2.3)向设定的N个反应管中分别加入23uL步骤2.2)得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各2uL；
2.4)在上述步骤2.3)得到的反应管中再分别加入30uL反应封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；
2.5)在65℃下恒温反应50分钟。
进一步地，所述的阳性对照为含有罗氏沼虾螺原体基因的质粒，所述的阴性对照为无核酸去离子水。
进一步地，步骤3)中显色检测具体为：取出经步骤2.2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入l uL反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，绿色判断为阳性，浅黄色为阴性，观察结束后将反应管装入密封袋，丢弃至特定区域。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明根据筛选的螺原体细胞分裂蛋白基因作为靶基因，进行特异检测用引物组设计，设计了针对六个结合区的4条引物，只有六个结合区都能完全结合，整个反应才能顺利进行，这增强了反应的高度特异性；此外还设计了两条环引物，可以将扩增反应速度增加至少一倍以上，同时也增加了反应的灵敏度，仅需12个基因拷贝30分钟就可以观察到反应体系的颜色变化；
2)本发明的快速诊断试剂盒在恒温条件下反应，并通过肉眼可见的颜色变化来判断结果，这使得试剂盒的使用软硬件条件简单，可以避免其它生化试剂对人体的危害；
3)本发明的快速诊断试剂盒还可通过肉眼观察复印产生的副产物——焦磷酸镁沉淀来判断结果，避免了反应产物开盖对环境的污染；
4)本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的可以通过肉眼判断结果的等温扩增反应体系，不但使得罗氏沼虾螺原体定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测罗氏沼虾螺原体的第一个可视化检测试剂盒，填补了罗氏沼虾螺原体无快速检测方法的缺口，具有很高的科研和经济价值。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明引物特异性测试图；其中，1：罗氏沼虾螺原体；2：罗氏沼虾双顺反子病毒；3：罗氏沼虾野田村病毒；4：罗氏沼虾纽缔病毒；5：对虾白斑综合征病毒；6：产气肠杆菌；7：嗜水气单胞菌；8：健康罗氏沼虾DNA阴性对照；9：罗氏沼虾螺原体基因阳性质粒对照；
图2是本发明灵敏性检测图；其中，1.1.2×105copies；2.1.2×104copies；3.1.2×103copies；4.1.2×102copies；5.1.2×10copies；6.1.2copies；7.健康罗氏沼虾DNA阴性对照。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明的思路为：本发明采用链置换酶和等温扩增技术，通过检测罗氏沼虾螺原体特定基因，来检测罗氏沼虾螺原体，这是目前国内外首次建立的快速罗氏沼虾螺原体检测试剂盒。该方法的建立为罗氏沼虾螺原体病的监测和预防奠定基础。
实施例1罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒
罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒包括螺原体DNA提取试剂和反应试剂，该试剂盒仅需常规离心机和水浴锅就可以完成核酸提取和检测，并且整个检测过程仅需2小时以内，检测产物封闭观察，不会污染环境，此外，检测结果可以通过肉眼观察颜色变化，就可以判断结果，实用强。
其中，螺原体DNA提取试剂为成分为60mM Tris、800mM NaCl、20mM EDTA、1％体积百分比NP-40的pH 8.0的裂解液。
反应试剂包括以下组分：
a)预反应液：20mM pH为8.8的Tris-HC1、8mM硫酸镁、15mM氯化钾、10mM硫酸按、0.12％Tween-20、1.4mM dNTP、0.5M甜菜碱、0.2μM引物MrSpi-P1、0.2μM引物MrSpi-B1、1.6μM引物MrSpi-P2、1.6μM引物MrSpi-B2、0.8μM引物MrSpi-P3和0.8μM引物MrSpi-B3；
其中，引物MrSpi-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
引物MrSpi-B1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
引物MrSpi-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
引物MrSpi-B2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
引物MrSpi-P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
引物MrSpi-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
b)反应酶：每微升含8个活性单位的Bst 2.0DNA聚合酶；
c)反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；
d)反应显色液：含有10％SYBR Green I的荧光染料。
实施例2利用实施例1所述的罗氏沼虾螺原体快速检测试剂盒进行检测的方法
(1)DNA抽提：
取罗氏沼虾幼体或苗或肠道或肝胰脏组织30-80mg于1.5mL离心管中，并向离心管加入上述螺原体DNA提取试剂200μL，于冰上用研磨棒研磨，研磨均匀后，95℃以上加热10分钟左右，10000rpm离心10分钟后，上清即为待检DNA模板，-80℃保存备用。
(2)罗氏沼虾螺原体基因的快速扩增：
根据待检测样品的数目，设置所需快速反应管数N，N＝样品数+2，其中l管为阳性对照(含有罗氏沼虾螺原体基因的质粒)，l管为阴性对照(无核酸去离子水)；吸取预反应液的体积为N×22μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμL反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，向设定的N个反应管中分别加入23uL混合液，并向N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各2uL；然后在每个反应管中再分别加入30uL封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；在65℃下恒温反应50分钟。
(3)显色检测：
取出经步骤(2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入l uL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，若显示绿色，说明样品中含有罗氏沼虾螺原体核酸，显示为浅黄色则无罗氏沼虾螺原体核酸。
上述预反应液含有：20mM pH为8.8的Tris-HC1、8mM硫酸镁、15mM氯化钾、10mM硫酸按、0.l2％Tween-20、1.4mM dNTP、0.5M甜菜碱、0.2μM引物MrSpi-P1、0.2μM引物MrSpi-B1、1.6μM引物MrSpi-P2、1.6μM引物MrSpi-B2、0.8μM引物MrSpi-P3和0.8μM引物MrSpi-B3，其中所述的引物MrSpi-P1序列如SEQ ID NO：1所示；所述的引物MrSpi-B1序列如SEQ ID NO：2所示；所述的引物MrSpi-P2序列如SEQ ID NO：3所示；所述的引物MrSpi-B2序列如SEQ ID NO：4所示；所述的引物MrSpi-P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述的引物MrSpi-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
实施例3罗氏沼虾螺原体快速检测试剂盒特异性检测
(1)DNA抽提：
取罗氏沼虾螺原体阳性组织样本30-80mg于1.5mL离心管中，并向各个离心管加入DNA提取试剂裂解液200μL，于冰上用研磨棒研磨，研磨均匀后，95℃以上加热10分钟左右，10000rpm离心10分钟后，上清即为待检DNA模板，-80℃保存备用。
(2)罗氏沼虾螺原体基因的快速扩增：
设置9个快速反应管数；吸取预反应液的体积为9×22μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入9μL反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，向设定的9个反应管中分别加入23uL混合液，并向9个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、罗氏沼虾螺原体DNA模板、罗氏沼虾双顺反子病毒核酸、罗氏沼虾野田村病毒核酸、罗氏沼虾纽缔病毒核酸、对虾白斑综合征病毒核酸、产气肠杆菌核酸、嗜水气单胞菌核酸和阳性对照各2uL；然后在每个反应管中再分别加入30uL封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；在65℃下恒温反应50分钟。
(3)显色检测：
取出经步骤(2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入l uL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，若显示绿色，说明样品中含有罗氏沼虾螺原体核酸，显示为浅黄色则无罗氏沼虾螺原体核酸，结果见图1，仅罗氏沼虾螺原体和罗氏沼虾螺原体基因模板扩增后显色为阳性绿色，其它病毒或细菌显色都为阴性浅黄色，表明对其它病毒无交叉扩增性。
实施例4罗氏沼虾螺原体快速检测试剂盒灵敏度检测
(1)DNA模板设置：
取已被定量的罗氏沼虾螺原体DNA样品进行梯度稀释，设置螺原体核酸拷贝数浓度分别为：1.2×105copies/μL；1.2×104copies/μL；1.2×103copies/μL；1.2×102copies/μL；1.2×10copies/μL；1.2copies/μL；-80℃保存备用。
(2)罗氏沼虾螺原体基因的快速扩增：
设置7个快速反应管数，其中l管为阴性对照(无核酸去离子水)；吸取预反应液的体积为7×22μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入7μL反应酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，向设定的7个反应管中分别加入23uL混合液，并向7个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照和待检6个稀释度的螺原体DNA模板各2uL；然后在每个反应管中再分别加入30uL封闭液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；在65℃下恒温反应50分钟。
(3)显色检测：
取出经步骤(2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入l uL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，若显示绿色，说明样品中含有罗氏沼虾螺原体核酸，显示为浅黄色则无罗氏沼虾螺原体核酸，结果见图2，经Real-time PCR定量后的罗氏沼虾螺原体DNA系列稀释的扩增显色图，当反应体系中加入12个螺原体基因拷贝的DNA，扩增显色结果就为阳性。
本发明利用等温扩增技术快速检测罗氏沼虾螺原体的检测试剂盒，在已试验的4种不同的病毒、2种细菌和1种螺原体进行了检测，检测结果仅罗氏沼虾螺原体和罗氏沼虾螺原体对应基因为阳性，其它均为阴性，说明该检测方法特异性高。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒及方法
<130> 2017
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<211> 44
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<213> 人工序列
<400> 3
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggttcgcaa acgaccaagt tatttacatg ttctcttcac gcatta 46
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcatcgctaa ctggttcatc at 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
catgagaatg ctaatcgtcg c 21
Claims (2)
1.一种罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒，其特征在于，包括螺原体DNA提取试剂和反应试剂，所述反应试剂包括以下组分：
a）预反应液：20mM pH为8.8的Tris-HC1、8mM硫酸镁、15mM氯化钾、10mM硫酸铵 、0.l2%Tween-20、1.4 mM dNTP、0.5 M甜菜碱、0.2μM引物MrSpi-P1、0.2μM引物MrSpi-B1、1.6μM引物MrSpi-P2、1.6μM引物MrSpi-B2、0.8μM引物MrSpi-P3和0.8μM引物MrSpi-B3；
所述的引物MrSpi-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述的引物MrSpi-B1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述的引物MrSpi-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的引物MrSpi-B2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述的引物MrSpi-P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述的引物MrSpi-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
b）反应酶：每微升含8个活性单位的Bst 2.0 DNA聚合酶；
c）反应封闭液：由矿物油或液体石蜡油组成；
d）反应显色液：含有10 % SYBR Green I的荧光染料。
2.根据权利要求1所述的罗氏沼虾螺原体可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述螺原体DNA提取试剂的成分为60mM Tris、800mM NaCl、20mM EDTA、1%体积百分比 NP-40的pH8.0的裂解液。
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| CN107254527A (zh) | 2017-10-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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Application publication date: 20171017 Assignee: Yangzhou Fuyuan aquatic products Co.,Ltd. Assignor: ZHEJIANG INSTITUTE OF FRESH WATER FISHERIES Contract record no.: X2021330000048 Denomination of invention: A visual rapid detection kit and method for Spiroplasma rosenbergii Granted publication date: 20210326 License type: Common License Record date: 20210609 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20171017 Assignee: Zhejiang Zhengda livestock and poultry aquatic products Co.,Ltd. Assignor: ZHEJIANG INSTITUTE OF FRESH WATER FISHERIES Contract record no.: X2021330000053 Denomination of invention: A visual rapid detection kit and method for Spiroplasma rosenbergii Granted publication date: 20210326 License type: Common License Record date: 20210628 |
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