CN104450961B

CN104450961B - 草鱼呼肠孤病毒i型ii型iii型rt-lamp可视化检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN104450961B
Application number: CN201410683383.7A
Authority: CN
Inventors: 潘晓艺; 沈锦玉; 郝贵杰; 袁雪梅; 藺凌云; 姚嘉赟; 徐洋; 尹文林
Original assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Current assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2034-11-25
Also published as: CN104450961A

Abstract

草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT‑LAMP可视化检测试剂盒及其检测方法，涉及靶DNA片断的检测技术领域。该试剂盒包括病毒RNA提取试剂、RT‑LAMP可视化反应试剂、1.5mL离心管和RT‑LAMP反应管，所述的RT‑LAMP可视化反应试剂中含有用于检测草鱼呼肠孤病毒I型、II型和III型的RT‑LAMP扩增用核酸引物组和可视化染料。该试剂盒检测特异性强，敏感性高，检测时间短，所需仪器简单，检测结果可以肉眼判断，具有巨大的优势和创新性。

Description

草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP可视化检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及靶DNA片断的检测技术领域，具体涉及一种利用反转录环介导等温扩增(reverse-transcription,Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)技术与可视化显色技术快速同时检测草鱼呼肠孤病毒三种基因型的试剂盒及检测方法。

背景技术

草鱼出血病病毒是中国分离的第一种鱼类病毒，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，直径70-80nm，20面体球形颗粒，含有11个片段的双链RNA，被定名为草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus，简称GCRV）。不同地区存在不同的毒株。目前已报道了10个分离株，该病毒主要引起中国淡水养殖主要品种草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率高达90%以上，给水产养殖业造成巨大损失。目前己经报道了近20个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV HZ08、GCRV JX09-01、GCRV JX09-02、GCRV GD10、GCRV104株等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。到目前为止，有报道的只有GCRV 873株、GCRV HZ08、GCRV GD10和GCRV104已完成全基因组序列分析，而其它毒株只完成了部分节段或者部分序列的测序工作。草鱼呼肠孤病毒比较复杂，不同分离株的各基因节段存在重配和抗原漂移现象，根据目前的研究，草鱼呼肠孤病毒根据基因分型，至少被分为三类：基因I型（代表株为873株），基因II型（代表株为HZ08株），基因III型（代表株为104株）。这三个基因型的草鱼呼肠孤病毒常常单独感染草鱼，也常出现混合感染的现象。

检测草鱼呼肠孤病毒的方法很多，有电镜观察法、细胞培养病毒分离法、病毒核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫检测法、RT-PCR方法和RT-LAMP方法等。电镜观察法和细胞培养病毒分离法虽然经典，但是操作繁琐、花费时间长，并且不能区分草鱼呼肠孤病毒与其它病毒的感染；免疫学方法在敏感性和特异性上较差，并且存在空窗期、交叉反应、血清型差异等问题；RT-PCR方法，具有很大优势，但需要对扩增产物进行凝胶电泳，其中用到的核酸EB染料具有致癌性，对人造成潜在安全。RT-LAMP结合可视化染料建立的方法，与其它方法相比，首先大大降低了仪器设备的要求，最低限度仅仅保温杯和温度计就可以满足扩增条件，并且简化了操作程序、降低了样品交叉污染，最后根据颜色差异和强弱，就可判断是否含有病毒及病毒载量，在操作性和时效性上具有巨大的优势。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP可视化检测试剂盒。本试剂盒包含了检测基因I型、基因II型、基因III型的草鱼呼肠孤病毒所必须的恒温扩增引物、可视化染料和其它优化的试剂组合。该试剂盒检测特异性强，敏感性高，检测时间短，所需仪器简单，检测结果可以肉眼判断，具有巨大的优势和创新性。

本发明的另一个目的在于提供一种利用草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP可视化检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法。本方法可以在80分钟内准确检测出样品中的三种基因型的草鱼呼肠孤病毒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP可视化检测试剂盒，包括可视化反应液，反应酶，密封液，DEPC水，阳性对照和阴性对照。其特征在于所述的可视化反应液中含有用于检测草鱼呼肠孤病毒I型II型III型的恒温扩增用核酸引物组和可视化染料，该引物组包含引物GCRV1-FIP、引物GCRV1-BIP、引物GCRV1-F3、引物GCRV1-B3、引物GCRV1-LF、引物GCRV1-LB、引物GCRV2-FIP、引物GCRV2-BIP、引物GCRV2-F3、引物GCRV2-B3、引物GCRV2-LF、引物GCRV2-LB、引物GCRV3-FIP、引物GCRV3-BIP、引物GCRV3-F3、引物GCRV3-B3、引物GCRV3-LF、引物GCRV3-LB；

所述的引物GCRV1-FIP序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的引物GCRV1-BIP序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的引物GCRV1-F3序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的引物GCRV1-B3序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的引物GCRV1-LF序列如SEQ ID NO：5所示；

所述的引物GCRV1-LB序列如SEQ ID NO：6所示；

所述的引物GCRV2-FIP序列如SEQ ID NO：7所示；

所述的引物GCRV2-BIP序列如SEQ ID NO：8所示；

所述的引物GCRV2-F3序列如SEQ ID NO：9所示；

所述的引物GCRV2-B3序列如SEQ ID NO：10所示；

所述的引物GCRV2-LF序列如SEQ ID NO：11所示；

所述的引物GCRV2-LB序列如SEQ ID NO：12所示；

所述的引物GCRV3-FIP序列如SEQ ID NO：13所示；

所述的引物GCRV3-BIP序列如SEQ ID NO：14所示；

所述的引物GCRV3-F3序列如SEQ ID NO：15所示；

所述的引物GCRV3-B3序列如SEQ ID NO：16所示；

所述的引物GCRV3-LF序列如SEQ ID NO：17所示；

所述的引物GCRV3-LB序列如SEQ ID NO：18所示；

所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于所述的RT-LAMP可视化反应试剂包括以下组分：

1）可视化反应液：39～41mM pH为8.6～8.9的Tris-HC1、9～11mM硫酸镁、19～21mM氯化钾、19～21mM硫酸按、0.2% Triton X-100、2.6～2.8 mM dNTP、1.2～1.6 M甜菜碱、240～300μM HNB、3.0～3.2μM引物GCRV1-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV1-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-BIP、0.3～0.5μM引物GCRV1-F3、0.3～0.5μM引物GCRV1-B3、0.3～0.5μM引物GCRV2-F3、0.3～0.5μM引物GCRV2-B3、0.3～0.5μM引物GCRV3-F3、0.3～0.5μM引物GCRV3-B3、1.4～1.6μM引物GCRV1-LF、1.4～1.6μM引物GCRV1-LB、1.4～1.6μM引物GCRV2-LF、1.4～1.6μM引物GCRV2-LB、1.4～1.6μM引物GCRV3-LF和1.4～1.6μM引物GCRV3-LB；

2）反应酶：每1.5μL含8个活性单位的Bst 聚合酶和5个活性单位的AMV反转录酶；

3）DEPC水：DEPC处理过的去离子水；

4）密封液：由矿物油或液体石蜡油组成。

所述的病毒RNA提取试剂包括变性裂解液；异丙醇，浓度100%；异丙醇，浓度55%；乙醇，浓度70%；无核酸酶的去离子水，所述的变性裂解液含有8～12 mM Tris、0.8～1.2 mMEDTA、0.6～1% NP-40、0.7～0.9% SDS、3～5mol/L异硫氰酸胍、40～44 mM 乙酸钠、0.2 mMβ-巯基乙醇，pH 4.0。

所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP可视化检测试剂盒进行RT-LAMP检测的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）RNA抽提：取草鱼内脏组织0.03～0.05g或草鱼培养细胞，采用病毒RNA提取试剂样品中的总RNA；

2）草鱼呼肠孤病毒的RT-LAMP可视化扩增：

①根据待检测RNA的数目，设置所需RT-LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；

②吸取所述的可视化反应液体积为N×12.5 μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入N×1.5μL反应酶和N×6μL去离子水，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；

③向设定的N个RT-LAMP反应管中分别加入20uL步骤②得到的混合液，得到N个RT-LAMP反应管，向上述N个RT-LAMP反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检RNA模板和阳性对照各5uL；

④在上述步骤③得到的反应管中再分别加入20uL密封液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心10秒；

⑤在金属浴或是水浴中64℃下反应80分钟后，观察反应管中液体颜色。

所述的LAMP检测试剂盒还具有阳性对照试样和阴性对照试样，所述阳性对照试样为草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RNA混合物，所述的阴性对照试样为无核酸酶的去离子水。

与现有技术相比，本发明具有如下优点:

（1）本发明根据靶基因序列设计了草鱼呼肠孤病毒检测用引物组，能特异性识别草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RNA依赖的RNA聚合酶编码基因序列上的八个独立区域，在AMV反转录酶和BstDNA聚合酶的作用下启动反转录反应和链置换反应，在靶标区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物，由于LAMP技术只有在六条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大增强了草鱼呼肠孤病毒检测的特异性；

（2）采用本发明的引物组能同时对基因I型II型III型的草鱼呼肠孤病毒进行检测，结合可视化核酸染料的使用，可以在没有任何仪器的情况下，直接用肉眼就可以根据颜色判断病毒核酸的存在与否；

（3）本发明的快速诊断试剂盒是利用逆转录环介导等温扩增技术快速检测草鱼呼肠孤病毒，不需要复杂的仪器，只需要保温杯和温度计，就能进行扩增；

（4）本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在80分钟即可完成扩增。

附图说明

图1试剂盒对草鱼呼肠孤病毒RNA可视化扩增结果；

A1：基因I型草鱼呼肠孤病毒RNA； A2：基因II型草鱼呼肠孤病毒RNA； A3：基因III型草鱼呼肠孤病毒RNA； A4：基因I型和II型草鱼呼肠孤病毒RNA混合物； A5：基因I型和III型草鱼呼肠孤病毒RNA混合物； A6：基因II型和III型草鱼呼肠孤病毒RNA混合物； A7：基因I型、II型和III型草鱼呼肠孤病毒RNA混合物； A8：阴性对照。

图2试剂盒对草鱼呼肠孤病毒RNA可视化扩增产物的电泳图；

A1：基因I型草鱼呼肠孤病毒RNA； A2：基因II型草鱼呼肠孤病毒RNA； A3：基因III型草鱼呼肠孤病毒RNA； A4：基因I型和II型草鱼呼肠孤病毒RNA混合物； A5：基因I型和III型草鱼呼肠孤病毒RNA混合物； A6：基因II型和III型草鱼呼肠孤病毒RNA混合物； A7：基因I型、II型和III型草鱼呼肠孤病毒RNA混合物； N：阴性对照。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明。

实施例1

1）用RNA提取试剂抽提RNA：

取草鱼脾脏或肝脏或肾脏组织0.03～0.05g，于冰上离心管中用研磨棒研磨，加600 μL 裂解液（含有8～12 mM Tris、0.8～1.2 mM EDTA、0.6～1% NP-40、0.7～0.9% SDS、3～5mol/L异硫氰酸胍、40～44 mM 乙酸钠、0.2 mM β-巯基乙醇，pH 4.0）后，继续研磨充分后，室温静置10分钟后，11000g离心10分钟，取上清于新离心管中，然后加入900 μL的异丙醇混匀，室温5分钟，之后11000g离心10分钟，去除上清液，沉淀中加入800 μL 百分比浓度为50%的冷异丙醇，11000g离心3分钟，去除上清液，沉淀用70％乙醇洗涤2次，室温干燥5～10min后以30μL去离子水重悬。

2）草鱼呼肠孤病毒的RT-LAMP可视化扩增：

根据待检测RNA的数目，设置所需RT-LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；吸取所述的可视化反应液（含有39～41mM pH为8.6～8.9的Tris-HC1、9～11mM硫酸镁、19～21mM氯化钾、19～21mM硫酸按、0.2% Triton X-100、2.6～2.8 mMdNTP、1.2～1.6 M甜菜碱、240～300μM HNB、3.0～3.2μM引物GCRV1-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV1-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-BIP、0.3～0.5μM引物GCRV1-F3、0.3～0.5μM引物GCRV1-B3、0.3～0.5μM引物GCRV2-F3、0.3～0.5μM引物GCRV2-B3、0.3～0.5μM引物GCRV3-F3、0.3～0.5μM引物GCRV3-B3、1.4～1.6μM引物GCRV1-LF、1.4～1.6μM引物GCRV1-LB、1.4～1.6μM引物GCRV2-LF、1.4～1.6μM引物GCRV2-LB、1.4～1.6μM引物GCRV3-LF和1.4～1.6μM引物GCRV3-LB）体积为N×12.5 μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入N×1.5μL反应酶和N×6μL去离子水，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，得到N×20 μL的预混液，再分别向设定的N个RT-LAMP反应管中加入20 uL预混液，得到N个RT-LAMP反应管，向上述N个RT-LAMP反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检RNA模板和阳性对照各5uL；然后在每个反应管中再分别加入20 uL由液体石蜡油组成的密封液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；在金属浴中64℃下恒温反应80分钟，反应结束后观察反应管中反应液颜色，紫罗兰色为阴性，淡兰色为阳性，说明样品中有草鱼呼肠孤病毒。

实施例1中RNA提取试剂的变性裂解液也可以采用含有9～11 mM Tris、0.9～1.1mM EDTA、0.7～0.9% NP-40、0.8～1% SDS、3.5～4.5mol/L异硫氰酸胍、40～44 mM 乙酸钠、0.2 mM β-巯基乙醇，pH 4.0的裂解液；或采用含6～14 mM Tris、0.6～1.4 mM EDTA、0.5～1.2% NP-40、0.6～1.2% SDS、3～6mol/L异硫氰酸胍、38～46 mM 乙酸钠、0.2 mM β-巯基乙醇，pH 4.0的裂解液。

实施例1中RT-LAMP可视化反应试剂的可视化反应液也可以采用含有40～41mM pH为8.6～8.9的Tris-HC1、9～10mM硫酸镁、20～21mM氯化钾、19～20mM硫酸按、0.2% TritonX-100、2.7～2.8mM dNTP、1.3～1.5 M甜菜碱、260～280μM HNB、3.0～3.1μM引物GCRV1-FIP、3.0～3.1μM引物GCRV1-BIP、3.0～3.1μM引物GCRV2-FIP、3.0～3.1μM引物GCRV2-BIP、3.0～3.1μM引物GCRV3-FIP、3.0～3.1μM引物GCRV3-BIP、0.3～0.4μM引物GCRV1-F3、0.3～04μM引物GCRV1-B3、0.3～0.4μM引物GCRV2-F3、0.3～0.4μM引物GCRV2-B3、0.3～0.4μM引物GCRV3-F3、0.3～0.4μM引物GCRV3-B3、1.5～1.6μM引物GCRV1-LF、1.5～1.6μM引物GCRV1-LB、1.5～1.6μM引物GCRV2-LF、1.5～1.6μM引物GCRV2-LB、1.5～1.6μM引物GCRV3-LF和1.5～1.6μM引物GCRV3-LB的反应液。

上述的引物GCRV1-FIP序列如SEQ ID NO：1所示；上述的引物GCRV1-BIP序列如SEQID NO：2所示；上述的引物GCRV1-F3序列如SEQ ID NO：3所示；

上述的引物GCRV1-B3序列如SEQ ID NO：4所示；上述的引物GCRV1-LF序列如SEQID NO：5所示；上述的引物GCRV1-LB序列如SEQ ID NO：6所示；上述的引物GCRV2-FIP序列如SEQ ID NO：7所示；上述的引物GCRV2-BIP序列如SEQ ID NO：8所示；上述的引物GCRV2-F3序列如SEQ ID NO：9所示；上述的引物GCRV2-B3序列如SEQ ID NO：10所示；上述的引物GCRV2-LF序列如SEQ ID NO：11所示；

上述的引物GCRV2-LB序列如SEQ ID NO：12所示；上述的引物GCRV3-FIP序列如SEQID NO：13所示；上述的引物GCRV3-BIP序列如SEQ ID NO：14所示；上述的引物GCRV3-F3序列如SEQ ID NO：15所示；上述的引物GCRV3-B3序列如SEQ ID NO：16所示；上述的引物GCRV3-LF序列如SEQ ID NO：17所示；上述的引物GCRV3-LB序列如SEQ ID NO：18所示。

采用上述快速诊断试剂盒和方法进行RT-LAMP可视化检测三种基因型的草鱼呼肠孤病毒RNA，试验结果如附图1和图2所示。

图1试剂盒对草鱼呼肠孤病毒RNA可视化扩增结果，如图所示，三种基因型的草鱼呼肠孤病毒单独或不同组合的RNA，在80分钟反应结束后，反应管中的反应液都为淡兰色，阴性对照为紫罗兰色。

图2试剂盒对草鱼呼肠孤病毒RNA扩增结果，三种基因型的草鱼呼肠孤病毒单独或不同组合的RNA，在80分钟反应结束后，电泳结果都有特征性扩增性条带，阴性对照无特征性扩增性条带。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省淡水水产研究所

<120> 草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP可视化检测试剂盒及其检测方法

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<170> PatentIn version 3.3

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taggagacgg attacaggta a 21

Claims

1.草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP可视化检测试剂盒，包括病毒RNA提取试剂、RT-LAMP可视化反应试剂、1.5mL离心管和RT-LAMP反应管，其特征在于所述的RT-LAMP可视化反应试剂中含有用于检测草鱼呼肠孤病毒I型、II型和III型的RT-LAMP扩增用核酸引物组和可视化染料，该可视化染料为羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue，HNB)染料，该引物组包含引物GCRV1-FIP、引物GCRV1-BIP、引物GCRV1-F3、引物GCRV1-B3、引物GCRV1-LF、引物GCRV1-LB、引物GCRV2-FIP、引物GCRV2-BIP、引物GCRV2-F3、引物GCRV2-B3、引物GCRV2-LF、引物GCRV2-LB、引物GCRV3-FIP、引物GCRV3-BIP、引物GCRV3-F3、引物GCRV3-B3、引物GCRV3-LF、引物GCRV3-LB；

所述的引物GCRV1-FIP序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的引物GCRV1-BIP序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的引物GCRV1-F3序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的引物GCRV1-B3序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的引物GCRV1-LF序列如SEQ ID NO：5所示；

所述的引物GCRV1-LB序列如SEQ ID NO：6所示；

所述的引物GCRV2-FIP序列如SEQ ID NO：7所示；

所述的引物GCRV2-BIP序列如SEQ ID NO：8所示；

所述的引物GCRV2-F3序列如SEQ ID NO：9所示；

所述的引物GCRV2-B3序列如SEQ ID NO：10所示；

所述的引物GCRV2-LF序列如SEQ ID NO：11所示；

所述的引物GCRV2-LB序列如SEQ ID NO：12所示；

所述的引物GCRV3-FIP序列如SEQ ID NO：13所示；

所述的引物GCRV3-BIP序列如SEQ ID NO：14所示；

所述的引物GCRV3-F3序列如SEQ ID NO：15所示；

所述的引物GCRV3-B3序列如SEQ ID NO：16所示；

所述的引物GCRV3-LF序列如SEQ ID NO：17所示；

所述的引物GCRV3-LB序列如SEQ ID NO：18所示；

所述的RT-LAMP可视化反应试剂包括以下组分：

1）可视化反应液：39～41mM pH为8.6～8.9的Tris-HC1、9～11mM硫酸镁、19～21mM氯化钾、19～21mM硫酸铵、0.2% Triton X-100、2.6～2.8 mM dNTP、1.2～1.6 M甜菜碱、240～300μM HNB、3.0～3.2μM引物GCRV1-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV1-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-BIP、0.3～0.5μM引物GCRV1-F3、0.3～0.5μM引物GCRV1-B3、0.3～0.5μM引物GCRV2-F3、0.3～0.5μM引物GCRV2-B3、0.3～0.5μM引物GCRV3-F3、0.3～0.5μM引物GCRV3-B3、1.4～1.6μM引物GCRV1-LF、1.4～1.6μM引物GCRV1-LB、1.4～1.6μM引物GCRV2-LF、1.4～1.6μM引物GCRV2-LB、1.4～1.6μM引物GCRV3-LF和1.4～1.6μM引物GCRV3-LB；

2）反应酶：每1.5μL含8个活性单位的Bst DNA聚合酶和5个活性单位的AMV反转录酶；

3）DEPC水：DEPC处理过的去离子水；

4）密封液：由矿物油或液体石蜡油组成。

2.如权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP可视化检测试剂盒，其特征在于所述的病毒RNA提取试剂包括变性裂解液；异丙醇，浓度100%；异丙醇，浓度55%；乙醇，浓度70%；无核酸酶的去离子水，所述的变性裂解液含有8～12 mM Tris、0.8～1.2 mMEDTA、0.6～1% NP-40、0.7～0.9% SDS、3～5mol/L异硫氰酸胍、40～44 mM 乙酸钠、0.2 mMβ-巯基乙醇，pH 4.0。

3.如权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP可视化检测试剂盒，其特征是还具有阳性对照试样和阴性对照试样，所述阳性对照试样为草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RNA混合物，所述的阴性对照试样为无核酸的去离子水。