CN108796131B

CN108796131B - 可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光rt-lamp检测组、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN108796131B
Application number: CN201810700142.7A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 范晴; 谢志勤; 谢丽基; 黄娇玲; 熊文婕; 张艳芳; 曾婷婷; 王盛; 罗思思
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-10-20
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN108796131A

Abstract

本发明公开了一种可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT‑LAMP检测组、试剂盒及其应用，该二重荧光RT‑LAMP检测组包括2组特异性引物和探针，其中第一组特异性引物和探针包括FMDV‑F3，FMDV‑B3，FMDV‑FIP(F1c‑F2)，FMDV‑BIP(B1c‑B2)，和FMDV‑探针，第二组特异性引物和探针包括BTV‑F3，BTV‑B3，BTV‑FIP(F1c‑F2)，BTV‑BIP(B1c‑B2)和BTV‑探针，所述2组特异性引物和探针依次如序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示，该二重荧光RT‑LAMP检测组能够在同一反应管里鉴别诊断口蹄疫病毒和蓝舌病病毒，具有特异性好、敏感性高、污染小、方便快捷等优点，并且检测结果可直接用肉眼观察，根据反应产物颜色判断结果，可应用于条件简陋的基层检疫。

Description

可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明是关于牛病毒检测技术领域，特别是关于一种可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测组、试剂盒及其应用。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease，FMDV)引起的偶蹄类动物共患的急性高度接触性传染病，具有传播广、发病急、危害大等流行病学特点，主要感染牛、猪、羊和骆驼等个20科的70多种家养和野生哺乳动物。蓝舌病是由蓝舌病病毒(Bluetonguevirus,BTV)引起的反刍动物非接触性传染病，可通过库蠓等昆虫染感宿主，主要感染绵羊、牛及野生反刍动物。两种病毒感染动物均表现为体温升高，精神沉郁，口腔黏膜、乳头和蹄部出现水泡溃烂，症状相似，难以区分。被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，在中国被列为一类动物疫病。FMDV一旦暴发，只能通过屠宰和集体焚毁的方式进行处理，BTV一般呈隐性感染，但在我国多个省份广泛存在，时时危害着畜牧业的健康发展。

LAMP是2000年Notomi等人开发出的一种新型核酸扩增方法，恒温扩增，操作简便，反应快速，成本低，已广泛应用在疾病诊断和基因筛选中。但LAMP由于其结果判定方法的局限(浊度，颜色，加染料)，多重LAMP方法一直未有较大进展。虽然目前国内外多位学者已建立了多重LAMP检测方法，但这些方法都有一定的不足：只能检测样品是否带病，但不能确定具体是哪一种病原引起的结果。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测组、试剂盒及其应用，其能够在同一反应管里鉴别诊断口蹄疫病毒和蓝舌病病毒，敏感性高、污染小，可以用肉眼直接观察反应产物颜色判断结果。

为实现上述目的，本发明提供了一种可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测组，其选用口蹄疫病毒的3D基因和蓝舌病病毒的NS3基因作为靶区域，设计2组特异性引物和探针，其中第一组特异性引物和探针包括FMDV-F3，FMDV-B3，FMDV-FIP(F1c-F2)，FMDV-BIP(B1c-B2)，以及FMDV-探针，第二组特异性引物和探针包括BTV-F3，BTV-B3，BTV-FIP(F1c-F2)，BTV-BIP(B1c-B2)，以及BTV-探针，所述2组特异性引物和探针依次如序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示，即，FMDV-F3、FMDV-B3、FMDV-FIP(F1c-F2)、FMDV-BIP(B1c-B2)、FMDV-探针、BTV-F3、BTV-B3、BTV-FIP(F1c-F2)、BTV-BIP(B1c-B2)、BTV-探针依次如序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示。

在一优选的实施方式中，特异性引物FMDV-FIP(F1c-F2)，FMDV-BIP(B1c-B2)，BTV-FIP(F1c-F2)和BTV-BIP(B1c-B2)为内引物，特异性引物FMDV-F3，FMDV-B3，BTV-F3和BTV-B3为外引物。

在一优选的实施方式中，所述FMDV-探针和BTV-探针均设计在F1c和B1c基因序列之间。

在一优选的实施方式中，所述FMDV-探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，该FAM荧光基团在520nm波长下呈黄绿色；所述BTV-探针的5’端标记CY 5.5荧光基团，3’端标记BHQ2淬灭基团，该CY 5.5荧光基团在694nm波长下呈大红色。

本发明还提供了一种可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒，包括以下反应体系：RNA模板，2×缓冲液，MgSO₄，(NH4)₂SO₄，吐温20，甜菜碱，dNTPs，酶溶液，以及权利要求2所述的两组特异性引物和探针。

在一优选的实施方式中，上述可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒包括以下25μL的反应体系：2μL RNA模板，2×缓冲液12.5μL，100mMKCl，80mM MgSO₄，100mM(NH4)₂SO₄，1％吐温20，8M甜菜碱，14mM dNTPs，酶溶液1μL，内引物各40pmol，外引物各5pmol，探针各0.1μM，加双蒸水补足至25μL。

在一优选的实施方式中，所述2×缓冲液的成分为Tris–HCl，该Tris–HCl的浓度为200mM，pH值为8.8。

在一优选的实施方式中，所述酶溶液含15U的Bst DNA聚合酶和20U的AMV逆转录酶。

本发明还提供了一种上述可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒的非疾病诊断和治疗目的的使用方法，将反应体系中的各个组分混合均匀，置恒温仪或水浴锅，于65-68℃进行RT-LAMP反应90分钟。

本发明还提供了一种上述可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测组或上述可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒在鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒中的应用。

本文所提及的FMDV-FIP等同于FMDV-FIP(F1c-F2)，本文所提及的FMDV-BIP等同于FMDV-BIP(B1c-B2)，本文所提及的BTV-FIP等同于BTV-FIP(F1c-F2)，本文所提及的BTV-BIP等同于BTV-BIP(B1c-B2)。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明涉及的RT-LAMP检测组采取的是一种新的技术路线：在FIP与BIP之间添加Taqman探针，反应前荧光基团与淬灭基因紧密相邻，此时探针中的荧光基团不发光，LAMP反应中，探针分子杂交到靶序列上，引物延伸，使探针断裂，荧光基团与淬灭基团分开，荧光基团发光。LAMP扩增效率极高，扩增产物的数量比real-time PCR多，断裂的探针数量多，因此能在反应管内凭肉眼可直接读取反应结果，不需要电泳，且荧光基团所显示颜色的不同能准确鉴别两种病毒。该二重荧光RT-LAMP检测组的优点：1继承了LAMP的优点：简便、快速、灵敏、成本低。2特异性高：探针的杂交比引物扩增更特异，能有效抑制假阳性结果。通常当延长LAMP反应时间，由于引物间相互缠绕，反应会出现非特异性扩增。在研究中，发明人尝试延长反应时间至120分钟，在实时浊度仪上能监测到非特异性扩增的浊度曲线，但反应结束后，在多色荧光成像分析系统下，非特异性扩增的反应管内探针不断裂，因此不能发光，由此可见该二重荧光RT-LAMP方法特异性较好。3减少污染，反应后直接凭肉眼读取反应结果，不需要电泳或开盖添加染料，大大降低LAMP的污染。4结果准确：本研究使用了两种荧光基团，FAM和CY5.5，这两种荧光基团的激发光和吸收光均不同，因此可呈现不同的颜色，FAM吸收波为520nm，呈黄绿色，CY5.5吸收波为694nm，呈大红色不同的荧光基团，仅能在特定的通道下观察到，即在520通道下只能观察到FAM，无法观察到CY5.5。比仅凭沉淀物观察，电泳等方式更准确，是第一次实现了真正意义上的多重LAMP鉴别检测。

(2)本发明用FMDV和BTV病毒体外转录RNA对二重荧光RT-LAMP检测方法的特异性、敏感性等方面进行评估，用临床样品和模拟混合感染样品验证方法的临床检测效果。结果显示，两种病毒体外转录RNA最低检测限为200拷贝/反应；特异性好，与其它病毒无交叉反应；干扰性小，可同时检测到两个模板浓度不同的样品；该方法方便快捷，全程仅需一台水浴锅90分钟完成反应，且不需要电泳，肉眼直接观察反应产物判断结果；与OIE推荐荧光定量RT-PCR方法检测符合率100％。结果表明本研究建立的FMDV和BTV多重荧光RT-LAMP具有良好的特异性，敏感性和重复性，可用于条件简陋的基层检疫。

附图说明

图1是根据本发明一实施方式的二重荧光RT-LAMP反应原理图。

图2是根据本发明一实施方式的二重荧光RT-LAMP特异性试验结果；其中，1:FMDVA型，2:FMDV O型，3:FMDV Asia 1型，4:BTV 1型，5:BTV16型，6:BTV 4型，7:FMDV O型和BTV1型，8:FMDV Asia 1型和BTV 16型，9-16分别为:PPRV，VSV，EHDV，MB，RPV，BVDV，IBRV，GTPV。图A为520nm波长通道下电泳图，图B为670nm波长通道下电泳图，图C为520nm波长和670nm波长双通道下电泳图，该670nm波长通道可观察到694nm附近的波长。

图3是根据本发明一实施方式的二重荧光RT-LAMP敏感性试验结果；其中，1～7:10⁶～10⁰拷贝/μl(FMDV和BTV RNA混合模板标准品)，8：阴性对照。图A为520nm波长通道下电泳图；图B为670nm波长通道图；图C为520nm波长和670nm波长双通道下电泳图。

图4是根据本发明一实施方式的二重荧光RT-LAMP检测方法干扰性试验结果；其中，1:样品1(10⁷FMDV+10²BTV)，样品2(10⁸FMDV+10⁴BTV)，样品3(10⁵FMDV+10³BTV)样品4(10²FMDV+10⁷BTV)，样品5(10⁴FMDV+10⁸BTV)，样品6(10³FMDV+10⁵BTV)，样品7(10³FMDV+10⁸BTV)。图A为520nm波长通道下电泳图；图B为670nm波长通道下电泳图；图C为520nm波长和670nm波长双通道下电泳图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。

实施例1

1.材料和方法

1.1试剂和设备

LAMP RNA扩增试剂盒，Loopamp LA-320C实时浊度仪购自日本荣研公司；RNA/DNA抽提试剂盒，质粒小量提取试剂盒购自全式金公司；premixTaq PCR试剂盒购自大连宝生物公司；pGM-T载体购自天根公司；T7体外转录试剂盒购自Ferments公司；NanoDrop 2000核酸测定仪购自美国ThermoFisher Scientific公司；多色荧光成像分析系统购自美国BIO-RAD公司。

1.2毒株

口蹄疫O型、A型、AsiaⅠ型灭活疫苗购自兰州兽医研究所，口蹄疫O型、A型、AsiaⅠ型灭活病毒，蓝舌病灭活病毒(4型，8型，9型，15型，17型，18型)，小反刍兽疫灭活病毒(PPRV)，水泡性口炎(VSV)灭活病毒(NJ型，IND型)，鹿流行性出血热(EHDV)灭活病毒由云南出入境提供，蓝舌病广西分离株(1型，16型)，3株牛支原体(MB)由广西兽医研究所分离获得，牛瘟病毒(RPV)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)，山羊痘病毒(GTPV)购自中国兽医药品监察所。

1.3引物和探针的设计

下载Genebank上已登录的FMDV 3D基因和BTV NS3基因序列，用MEGA 5.0进行比对分析，利用primer premier 5.0和Primer explore V4设计2套LAMP特异性引物和探针。每套特异性引物和探针包括：2条外引物(F3和B3)，2条内引物(FIP(FIP＝F1c+F2)(即FIP(F1c-F2))和BIP(BIP＝B1c+B2))，1条探针Probe。探针设计在F1c和B1c之间，两条探针的分别标记不同的荧光基团：FMDV-Probe(即，FMDV-探针)5’端标记FAM荧光，3’端标记BHQ1淬灭基团，在520nm波长下呈黄绿色；BTV-Probe(即，BTV-探针)5’端标记CY 5.5荧光，3’端标记BHQ2淬灭基团，在694nm波长下呈大红色。引物序列见表1，反应原理见图1。引物由大连宝生物公司合成,HPLC级纯化。

表1引物序列

1.4标准品的制备

使用T7体外转录试剂盒对2种病毒进行体外转录，获得靶基因的RNA模板。NanoDrop 2000核酸测定仪测定体外转录RNA的浓度，根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数，-70℃保存备用。拷贝数(copies/μL)＝质粒浓度(g/μL)×10^-9×6.02×10²³/660×3100(质粒总长度)。将计算好拷贝数的体外反转录RNA分别进行10倍梯度稀释，浓度为1×10⁸～1拷贝/μL，再将同浓度的2种病毒体外反转录RNA等体积混合，制备成标准品。

分别用反转录PCR扩增FMDV外引物(FMDV-B3，FMDV-F3)片断278bp和BTV外引物(BTV-F3,BTV-B3)片断370bp，用琼脂糖凝胶回收纯化连入pGM-T载体，筛选阳性重组菌，用质粒试剂盒提取阳性重组菌的质粒。参照T7体外转录试剂盒说明书将2种病毒进行体外转录，获得靶基因的RNA模板，用D₂₆₀测定RNA浓度，根据阿弗加德罗常数换为拷贝数：拷贝数(copies·μL^-1)＝质粒浓度(g·μL^-1)×10^-9×6.02×10²³/660×3000，将两种体外转录RNA等量混合，梯度稀释制备标准品，-70℃保存备用。

1.5核酸提取

参照全式RNA/DNA共提试剂盒说明书进行核酸抽提，取250μL病毒培养物和临床样品洗脱液抽提病毒RNA/DNA，最后加30μL TE洗脱缓冲液对RNA/DNA进行收集，-80℃保存备用。

1.6二重荧光RT-LAMP检测

采用日本荣研公司LAMP RNA扩增试剂盒进行二重荧光RT-LAMP反应，二重反应体系如下：2μL RNA模板，2×buffer 12.5μL(成分为200mM Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，80mM MgSO₄，100mM(NH4)₂SO4，1％Tween 20，8M betaine，和14mM dNTPs(SIGMA，东京，日本)，酶溶液1μL(含Bst DNA聚合酶15U，AMV逆转录酶20U)，内引物各40pmol(FMDV-FIP，FMDV-BIP，BTV-FIP和BTV-BIP)，外引物各5pmol(FMDV-F3，FMDV-B3，BTV-B3和BTV-F3)，探针各0.1μM(FMDV-Probe和BTV-Probe)，加双蒸水补足25μL。各组份混合均匀，置恒温仪或水浴锅，65℃(65-68℃范围内均可反应)反应90分钟。

1.7二重荧光RT-LAMP反应结果判定

二重荧光RT-LAMP反应体系中加入了探针，可在特定的荧光通道下显示不同颜色。口蹄疫阳性扩增产物在520nm波长通道下显示黄绿色，蓝舌病在670nm波长通道下显示大红色，且两荧光通道相互独立无干扰，即在520nm波长通道下不能观到BTV的扩增条带，在670nm波长通道下不能观察FMDV的扩增条带，结果独立准确。

1.8临床样品检测效果的评价

106份临床样品采集自广西各牛场：抗凝血84份，水泡液拭子5份，组织样品17份(包括淋巴结6份，脾脏6份，水泡皮5份)。抗凝血离心收集血细胞，抽提样品RNA；水泡拭子用双蒸馏水洗脱，离心收集上清，抽提样品RNA；组织样品加PBS研磨，离心收集上清，抽提样品RNA。用已建立好的二重荧光RT-LAMP对抽提好的RNA进行检测，同时用OIE推荐的FMDV荧光RT-PCR和BTV荧光RT-PCR进行检测,并测序所有阳性样品荧光RT-PCR产物，评估二重荧光RT-LAMP的临床检测效果。

2.结果

2.1二重荧光RT-LAMP检测方法特异性评价

用小反刍兽疫灭活病毒(PPRV)，水泡性口炎病毒(VSV)，鹿流行性出血热病毒(EHDV)、牛支原体(MB)，牛瘟病毒(RPV)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)，山羊痘病毒(GTPV)所提取的核酸对二重RT-LAMP方法进行评价，结果表明二重体系仅对FMDV和BTV病毒有特异性扩增，对其它病毒均无交叉反应，结果见图2，可见该方法具有良好特异性。

2.2二重荧光RT-LAMP检测方法灵敏性评价

体外转录获得口蹄疫病毒和蓝舌病病毒RNA，浓度分别为1×10⁸～1拷贝/μL，再将同浓度的两种体外反转录RNA等体积混合，制备成标准品。利用该二重RT-LAMP方法对FMDV和BTV RNA混合模板标准品进行检测，评估该方法的灵敏性。结果表明二重荧光RT-LAMP灵敏度可达200个混合模板拷贝/反应，结果见图3，可见该方法灵敏性高。

2.3二重荧光RT-LAMP检测方法干扰性评价

将FMDV和BTV标准品按不同浓度进行组合，制备不同浓度模拟混合感染样品，用二重荧光RT-LAMP检测，评价高浓度模板是否会抑制低浓度模板的扩增效率。模拟混合感染样品：样品1(10⁷FMDV+10²BTV)，样品2(10⁸FMDV+10⁴BTV)，样品3(10⁵FMDV+10³BTV)样品4(10²FMDV+10⁷BTV)，样品5(10⁴FMDV+10⁸BTV)，样品6(10³FMDV+10⁵BTV)，样品7(10³FMDV+10⁸BTV)。结果表明，当一个模板浓度高而另一个模板浓度较低时，二重荧光RT-LAMP仍然可同时检测到两个模板(见图4)，不影响彼此扩增效率，干扰性小。

2.4临床样品验证

用建立的二重荧光RT-LAMP检测方法对106份临床样品进行检测，其中FMDV阳性样品3份，阳性率2.8％，BTV阳性样品22份，阳性率为20.8％；未检测到FMDV和BTV混合感染样品，混合感染率为0％；与OIE推荐荧光定量RT-PCR方法检测符合率100％。所有阳性样品荧光RT-PCR产物测序结果显示，所有样品均为对应病毒，无假阳性结果。结果表明二重荧光RT-LAMP临床检测效果好。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测组、试剂盒及其应用

<130> P180999DD1F

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测组、试剂盒及)

<400> 1

gcccgatgga gaaagtacgt 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO.2)

<400> 2

cacctcctca aacatgatgt tca 23

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO.3)

<400> 3

gtccgttgtt tgagtgcatt tgctttacac taggatgatg attggca 47

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO.4)

<400> 4

ctgatgttga ttggcaaaga tttgggttag catcaaaggc cgaat 45

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO.5)

<400> 5

aattggctcg gcggtcggtt g 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO.6)

<400> 6

agtctggttc gtgtggatga tac 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO.7)

<400> 7

taaacgccac gctcatatca ct 22

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO.8)

<400> 8

tgcgtagcac cagtagtgtt tgagcccttg aaatattgga taaagc 46

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO.9)

<400> 9

ccaaagttaa agagtgattt gggtggtcat gtgtatgata gctctctttt 50

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO.10)

<400> 10

ctgcattcgc atcgtacgca gaagc 25

Claims

1.一种可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测组，其特征在于，包括两组特异性引物和探针，其中第一组特异性引物和探针包括FMDV-F3，FMDV-B3，FMDV-FIP，FMDV-BIP，以及FMDV-探针，第二组特异性引物和探针包括BTV-F3，BTV-B3，BTV-FIP，BTV-BIP，以及BTV-探针，所述2组特异性引物和探针依次如序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.10所示；

特异性引物FMDV-FIP，FMDV-BIP，BTV-FIP和BTV-BIP为内引物，特异性引物FMDV-F3，FMDV-B3，BTV-F3和BTV-B3为外引物；

所述FMDV-探针和BTV-探针均设计在F1c和B1c基因序列之间;

所述FMDV-探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，该FAM荧光基团在520 nm波长下呈黄绿色；所述BTV-探针的5’端标记CY 5.5荧光基团，3’端标记BHQ2淬灭基团，该CY 5.5荧光基团在694 nm波长下呈大红色。

2. 一种可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下反应体系：RNA模板，2×缓冲液，MgSO₄，(NH4)₂SO₄，吐温 20，甜菜碱，dNTPs，酶溶液，以及权利要求1中所述的两组特异性引物和探针。

3. 如权利要求2所述的可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下25μL的反应体系：2µL RNA模板，2×缓冲液12.5 µL，100mMKCl，80mM MgSO₄，100mM (NH4)₂SO₄，1%吐温20，8M甜菜碱，14mM dNTPs，酶溶液 1µL，内引物各40pmol，外引物各5pmol，探针各0.1 µM，加双蒸水补足至25µL。

4.如权利要求2或3所述的可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述2×缓冲液的成分为Tris–HCl，该Tris–HCl的浓度为200mM，pH值为8.8。

5. 如权利要求2或3所述的可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述酶溶液含15U 的Bst DNA 聚合酶和 20U 的AMV逆转录酶。

6.如权利要求2或3所述的可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒的非疾病诊断和非治疗目的的使用方法，其特征在于，将反应体系中的各个组分混合均匀，置恒温仪或水浴锅，于65-68°C进行RT-LAMP反应90分钟。