CN113046463A - 念珠菌的引物探针组合及应用、pcr反应液、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种念珠菌的引物探针组合，用于检测四种念珠菌，包括第一引物探针组合和第二引物探针组合，核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑12所示。第一引物探针组合包括针对白念珠菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及针对光滑念珠菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针；第二引物探针组合包括针对近平滑念珠菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及针对热带念珠菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针。本发明提供的念珠菌的引物探针组合减小了不同引物之间的相互作用，提高了扩增的特异性和灵敏度。

Description

念珠菌的引物探针组合及应用、PCR反应液、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及念珠菌的引物探针组合及应用、PCR反应液、试剂盒和方法。

背景技术

念珠菌属是人体正常菌群，存在于人体的皮肤、上呼吸道、肠道等粘膜上。随着广谱抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤药物等的广泛应用，侵袭性真菌感病(invasive fungaldisease，IFD)尤其是侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)的发病率逐年提高。念珠菌是引起院内血源性感染第4位最常见病原体，而重症患者由于病情危重，需要进行多种有创监测，加上营养状态差、器官功能不全等导致免疫功能受损，成为念珠菌感染的高危人群。全世界每年侵袭性念珠菌感染人数超过250,000，造成至少50,000例患者死亡。

念珠菌常常在重症患者机体深部感染，一旦发病，对患者的预后产生巨大的影响。侵袭性念珠菌感染起病隐匿、临床表现不典型，临床诊断较为困难，尤其对于重症患者，需结合临床表现与实验室检查进行诊断。培养是IC诊断的金标准，但由于敏感性低、检测时间长，远远不能满足临床需要。目前临床上仍缺乏侵袭性念珠菌感染特异性的抗原检测方法，念珠菌的血清学检查方法应用最广泛的是1,3-β-D-葡聚糖检测(G试验)。G实验检测的是多种真菌引起的侵袭性感染。且检测结果易受干扰，如真菌G含量、输注球蛋白、多糖类抗肿瘤药、血液透析等影响，常常导致假阳性的结果。加上抗原在循环中与抗体结合后，被机体免疫快速清除，使得抗原诊断的敏感性低下，从而导致假阴性的结果。此外，研究发现侵袭性真菌感染的死亡率与抗真菌治疗时机有重大关系，48h后对病人进行抗真菌治疗的死亡率比12h内采取抗真菌治疗高25％。因此建立快速检测真菌的方法，早期获得检测结果可指导临床及时釆取适当治疗方案。

目前临床上常规的真菌感染检测方法主要有：(1)直接镜检，主要用于明确真菌感染是否存在，但不能进行菌种鉴定。(2)真菌培养，可以提高真菌检出率，但培养时间较长，且灵敏度欠佳，不利于及时诊断与治疗。(3)分子生物学技术，主要通过荧光定量PCR技术检测真菌的特异性DNA序列，是一种快速敏感的检测方法。不同的念珠菌存在相似的DNA片段，在同时对多种念珠菌进行PCR扩增时，容易造成非特异性扩增，影响了扩增产物的特异性，从而影响后续念珠菌定性或定量检测的准确率。目前国内外均有报道采用荧光定量PCR(qPCR)技术检测临床样本中的念珠菌，其灵敏度检测限为101-102CFU/mL，但临床血流感染中念珠菌的含量往往低于10CFU/mL，因此，常规qPCR检测技术仍难以满足临床对灵敏度的需求，尤其是对于感染早期或微量样本的检测仍存在局限性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺点与不足，提供一种念珠菌的引物探针组合，分别针对四种念珠菌，设计出对目的区域扩增的引物和探针，具有良好的扩增特异性和高灵敏度。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种念珠菌的引物探针组合，包括第一引物探针组合和第二引物探针组合；所述第一引物探针组合包括针对白念珠菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及针对光滑念珠菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针；第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述第二引物探针组合包括针对近平滑念珠菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及针对热带念珠菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针；第三上游引物的核苷酸序列如SEQID NO:7所示，第三下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；第四上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，第四下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

本发明提供的念珠菌的引物探针组合，分别针对四种念珠菌的高度保守区域，设计并筛选得到进行特异性扩增的引物和探针，所述念珠菌的引物探针组合在对念珠菌进行扩增时，将所述念珠菌的引物探针组合分成第一引物探针组合和第二引物探针组合，分别进行扩增，减小了不同引物之间的相互作用，提高了扩增的特异性和灵敏度。

进一步，所述第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的两端均分别设置有荧光报告基团和荧光淬灭基团，在特定激发光的作用下，可发出荧光信号，通过荧光信号检测念珠菌。

进一步，第一探针和第二探针的荧光报告基团不同，第三探针和第四探针的荧光报告基团不同。在检测荧光信号时，第一引物探针组合中的第一探针和第二探针位于同一通道中进行荧光报告基团的检测，在激发光作用下，不同的荧光报告基团发出不同的荧光信号，设置不同的荧光报告基团，通过发出不同的荧光信号，在同一通道中分辨出荧光报告基团对应的探针，从而得出对应的念珠菌种类。第二引物探针组合同理，因此需设置为第一探针和第二探针的荧光报告基团不同，第三探针和第四探针的荧光报告基团不同。

进一步，第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；第四探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。此为一种具体实施方式，设计与念珠菌基因互补的探针，便于实现念珠菌的检测。

本发明还提供上述的念珠菌的引物探针组合在PCR扩增和念珠菌检测领域的应用。本发明所述的念珠菌的引物探针组合，在PCR扩增例如数字PCR扩增、实时荧光定量PCR或普通PCR等扩增技术中均可应用，在得到扩增产物后进行念珠菌的检测。

本发明还提供一种PCR反应液，包括第一PCR反应液和第二PCR反应液；所述第一PCR反应液包括PCR预混液、上述的针对白念珠菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及上述的针对光滑念珠菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针；所述第二PCR反应液包括PCR预混液、上述的针对近平滑念珠菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及上述的针对热带念珠菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针；将所述PCR反应液用于PCR扩增时，第一PCR反应液和第二PCR反应液分别使用。所述PCR反应液应用于PCR扩增时，分别向第一PCR反应液和第二PCR反应液加入核酸模板进行扩增，减小了不同引物之间的相互作用，提高了扩增的特异性和灵敏度。

进一步，所述第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物、第二下游引物、第三上游引物、第三下游引物、第四上游引物和第四下游引物的浓度为18-22μm/L；所述第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的的浓度为9-11μm/L。引物和探针的浓度影响PCR扩增的扩增效率，设置合适的浓度，提高扩增的特异性和效率。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的PCR反应液。将待测核酸加入试剂盒中，实现念珠菌的检测。

进一步，还包括DNA提取试剂，所述DNA提取试剂用于从待测核酸中提取出DNA，将DNA作为后续扩增的模板。

本发明还提供一种定量检测四种念珠菌的方法，包括以下步骤：

S1：取上述的PCR反应液；从待测样品中提取DNA；

S2：以S1中提取的DNA为DNA模板，将DNA加入第一PCR反应液中，配置得到第一PCR特异扩增反应体系；以S1中提取的DAN为DNA模板，将DNA加入第二PCR反应液中，配置得到第二PCR特异扩增反应体系；

S3：分别对第一PCR特异扩增反应体系和第二PCR特异扩增反应体系进行数字PCR扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物；

S4：分别检测第一扩增产物和第二扩增产物的荧光信号；通过荧光信号得出念珠菌的种类和数量。

本发明提供的定量检测四种念珠菌的方法，通过检测荧光信号的强度及分类，确定荧光基团及其对应的探针，从而定量检测出念珠菌的种类及拷贝数，操作方便且准确率高；数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，能够对目标序列进行绝对定量的技术，相比qPCR技术具有更高的检测灵敏度和准确性，能够直接检测目标序列的拷贝数，计算出样本中靶标基因的含量，具有更高的灵敏度和特异性、准确性，为快速检测念珠菌类型以及做动态监测时的疗效检测提供了重要的参考依据；适用于痰液、支气管肺泡灌洗液及低浓度的血液循环游离核酸中的四种念珠菌的检测；为念珠菌的早期鉴别诊断和调整治疗方案以及预后提供参考。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1是实施例1中白念珠菌分子拷贝数与样本浓度的线性关系图；

图2是实施例1中光滑念珠菌分子拷贝数与样本浓度的线性关系图；

图3是实施例1中近平滑念珠菌分子拷贝数与样本浓度的线性关系图；

图4是热带念珠菌分子拷贝数与样本浓度的线性关系图。

具体实施方式

本发明提供念珠菌的引物探针组合；

所述念珠菌的引物探针组合包括第一引物探针组合和第二引物探针组合；

所述第一引物探针组合包括针对白念珠菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及针对光滑念珠菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针；第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述第二引物探针组合包括针对近平滑念珠菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及针对热带念珠菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针；第三上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，第三下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；第四上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，第四下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

本发明提供的念珠菌的引物探针组合，分别针对四种念珠菌的高度保守区域，设计并筛选得到进行特异性扩增的引物和探针，所述念珠菌的引物探针组合在对念珠菌进行扩增时，将所述念珠菌的引物探针组合分成第一引物探针组合和第二引物探针组合，分别进行扩增，减小了不同引物之间的相互作用，提高了扩增的特异性和灵敏度。

所述第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的两端均分别设置有荧光报告基团和荧光淬灭基团，在特定激发光的作用下，可发出荧光信号，通过荧光信号检测念珠菌。

第一探针和第二探针的荧光报告基团不同，第三探针和第四探针的荧光报告基团不同。在检测荧光信号时，第一引物探针组合中的第一探针和第二探针位于同一通道中进行荧光报告基团的检测，在激发光作用下，不同的荧光报告基团发出不同的荧光信号，设置不同的荧光报告基团，通过发出不同的荧光信号，在同一通道中分辨出荧光报告基团对应的探针，从而得出对应的念珠菌种类。第二引物探针组合同理，因此需设置为第一探针和第二探针的荧光报告基团不同，第三探针和第四探针的荧光报告基团不同。

在一个具体的实施方式中，第一探针的两端分别设置有基团VIC和BHQ1；

第二探针的两端分别设置有基团FAM和MGB；

第三探针的两端分别设置有基团FAM和BHQ1；

第四探针的两端分别设置有基团VIC和BHQ1。

第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；第二探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示；第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；第四探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:12所示。此为一种具体实施方式，设计与念珠菌基因互补的探针，便于实现念珠菌的检测。

本发明还提供上述的念珠菌的引物探针组合在PCR扩增和念珠菌检测领域的应用。本发明所述的念珠菌的引物探针组合，在PCR扩增例如数字PCR扩增、实时荧光定量PCR或普通PCR等扩增技术中均可应用，在得到扩增产物后进行念珠菌的检测。

本发明还提供一种PCR反应液，包括第一PCR反应液和第二PCR反应液；

所述第一PCR反应液包括PCR预混液、上述的针对白念珠菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及上述的针对光滑念珠菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针；

所述第二PCR反应液包括PCR预混液、上述的针对近平滑念珠菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及上述的针对热带念珠菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针；

将所述PCR反应液用于PCR扩增时，第一PCR反应液和第二PCR反应液分别使用。所述PCR反应液应用于PCR扩增时，分别向第一PCR反应液和第二PCR反应液加入核酸模板进行扩增，减小了不同引物之间的相互作用，提高了扩增的特异性和灵敏度。

所述第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物、第二下游引物、第三上游引物、第三下游引物、第四上游引物和第四下游引物的浓度为18-22μm/L；所述第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的的浓度为9-11μm/L。引物和探针的浓度影响PCR扩增的扩增效率，设置合适的浓度，提高扩增的特异性和效率。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的PCR反应液。将待测核酸加入试剂盒中，实现念珠菌的检测。所述试剂盒还包括DNA提取试剂，所述DNA提取试剂用于从待测核酸中提取出DNA，将DNA作为后续扩增的模板。

本发明还提供一种定量检测四种念珠菌的方法，包括以下步骤：

S1：取权利要求5-6任一项所述的PCR反应液；从待测样品中提取DNA；

S2：以S1中提取的DNA为DNA模板，将DNA加入第一PCR反应液中，配置得到第一PCR特异扩增反应体系；以S1提取的DNA为进行PCR扩增的DNA模板，将DNA加入第二PCR反应液中，配置得到第二PCR特异扩增反应体系；

S3：分别对第一PCR特异扩增反应体系和第二PCR特异扩增反应体系进行数字PCR扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物；

S4：分别检测第一扩增产物和第二扩增产物的荧光信号，通过荧光信号得出念珠菌的种类和数量。

具体地：

S3中，通过样本制备仪，分别将第一PCR特异扩增反应体系和第二PCR特异扩增反应体系生成微反应液滴；进行数字PCR扩增，扩增的反应程序为：50℃，2分钟1个循环；95℃，10分钟1个循环；94℃，30秒变性，60℃，60秒退火、延伸共进行40个循环；98℃，10分钟1个循环；16℃保持；设置热盖温度105℃，样本体积50μl，升降温速率1.0℃/s。

数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术，其原理为：将标准PCR反应体系生成大量微液滴，目标分子上带有荧光探针，每个微液滴包含1个或0个拷贝的目标分子作为模板，实现单分子模板PCR扩增；经过PCR扩增后，含有模板的微液滴可检测出荧光信号，记为阳性微液滴，没有模板的微液滴则没有产生荧光信号，记为阴性微液滴。最终根据泊松分布原理及阳性微液滴的比例，采用MicroDrop^TM数字PCR仪配套数据分析软件(QuantDrop数据分析软件)可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。

本发明提供的定量检测四种念珠菌的方法，通过检测荧光信号的强度及分类，确定荧光基团及其对应的探针，从而定量检测出念珠菌的种类及拷贝数，操作方便且准确率高；数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，能够对目标序列进行绝对定量的技术，相比qPCR技术具有更高的检测灵敏度和准确性，能够直接检测目标序列的拷贝数，计算出样本中靶标基因的含量，这种检测方式具有更高的灵敏度和特异性、准确性，为快速检测念珠菌类型以及做动态监测时的疗效检测提供了重要的参考依据；适用于痰液、支气管肺泡灌洗液及低浓度的血液循环游离核酸中的四种念珠菌的检测；为念珠菌的早期鉴别诊断和调整治疗方案以及预后提供参考。

实施例1

本实施例1提供一种念珠菌的引物探针组合。

从NCBI上搜索到白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌的核糖体rRNA的小亚基18s的保守的核算区域序列，利用primer软件设计引物和探针，引物包括上游引物和下游引物。根据引物设计原理，分别针对针对白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌，设计2-3对引物和探针。合成引物和探针，并采用PCR技术对引物和探针组合进行测试，发现引物会影响扩增片段的长度，且使用不同引物扩增的效率不同，从而影响后续定量检测念珠菌的灵敏度。

经过设计及测试，筛选出念珠菌的引物探针组合如表1-1所示。

表1-1定量检测四种念珠菌的引物探针组合

所述念珠菌的引物探针组合包括第一组合和第二组合；

所述第一组合包括针对白念珠菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及针对光滑念珠菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针；

所述第二组合包括针对近平滑念珠菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及针对热带念珠菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针。

本实施例1还提供一种PCR反应液，所述PCR反应液包括第一PCR反应液和第二PCR反应液；

所述第一PCR反应液包括PCR预混液、上述的针对白念珠菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及上述的针对光滑念珠菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针,成分如表1-2所示；

所述第二PCR反应液包括PCR预混液、上述的针对近平滑念珠菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及上述的针对热带念珠菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针，成分如表1-3所示。

PCR预混液为广东永诺医疗科技有限公司的MicroDrop^TM数字PCR仪配套的PCR预混液Master Mix，用于提供PCR扩增所需的成分。

表1-2第一PCR反应液组分

组分	用量
		预混液Master Mix	10ul
第一上游引物(20μm/L)	1.8μl
		第一下游引物(20μm/L)	1.8μl
第一探针(10μm/L)	0.4μl
		第二上游引物(20μm/L)	1.8μl
第二下游引物(20μm/L)	1.8μl
		第二探针(10μm/L)	0.4μl
总体积	18μl

表1-3第二PCR反应液组分

本实施例1还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的PCR反应液和DNA提取试剂，所述DNA提取试剂用于从待测样品中提取出DNA。所述DNA提取试剂为美基通用型DNA抽提试剂盒，将待测样品使用Lyticase溶壁酶处理后使用所DNA提取试剂，提取出DNA。

所述试剂盒可应用于定量检测四种念珠菌。

在所述试剂盒中还包括阳性参考品，在使用该试剂盒检测样品时，同时对阳性参考品进行检测，可将阳性参考品的检测结果作为参照，判断样品在检测中是否出现样品失效、操作失误等。

以阳性参考品为例，四种阳性参考品分别带有白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌，定量检测四种念珠菌包括以下步骤：

S1：取四种克隆质粒，四种克隆质粒分别带有四种念珠菌的DNA片段，分别进行10倍连续梯度稀释，制备成5个浓度点的阳性参考品；配置第一PCR反应液和第二PCR反应液；

S2：分别将表1-2所示的第一PCR反应液和表1-3所示的第二PCR反应液与S1中的2μlDNA混合，得到20μl第一PCR特异扩增反应体系和20μl第二PCR特异扩增反应体系；

S3：以S1中的DNA作为DNA模板，分别对第一PCR特异扩增反应体系和第二PCR特异扩增反应体系进行数字PCR扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物，具体操作如下：

分别将第一PCR特异扩增反应体系和第二PCR特异扩增反应体系加入到8道的微滴生成芯片中，然后加入50μl微滴生成油至样本制备仪(广东永诺医疗科技有限公司)中，制备得到第一PCR微反应液滴和第二PCR微反应液滴；在第一PCR微反应液滴和第二PCR微反应液滴中包括大量微反应液滴，微反应液滴包括1个或0个DNA模板，在后续的PCR仪中扩增时，若微反应液滴中存在DNA模板，则在微反应液滴中发生扩增，若微反应液滴中不存在DNA模板，则该微反应液滴中不发生扩增。

分别将制备好的第一PCR微反应液滴和第二PCR微反应液滴转移至96孔反应板上，用封板膜进行热封；

将热封好的96孔板放入PCR仪中，设置反应程序进行PCR扩增，PCR扩增反应程序为：50℃，2分钟1个循环；95℃，10分钟1个循环；94℃，30秒变性，60℃，60秒退火、延伸共进行40个循环；98℃，10分钟1个循环；16℃保持；设置热盖温度105℃，样本体积50μl，升降温速率1.0℃/s，得到第一扩增产物和第二扩增产物。

如图1-4所示，白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌5个浓度点的阳性参考品的拷贝数与样本浓度呈线性关系。

S4：分别检测第一扩增产物和第二扩增产物的荧光信号，具体步骤如下：

分别将第一扩增产物和第二扩增产物置于生物芯片分析仪中，检测荧光信号。

在一个具体实施方式中，在第一组合中，第一探针的两端分别设置有基团VIC和BHQ1，第二探针的两端分别设置有基团FAM和MGB；在第二组合中，第三探针的两端分别设置有基团FAM和BHQ1；第四探针的两端分别设置有基团VIC和BHQ1。FAM和VIC为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

若微反应液滴中存在DNA模板，则可通过微滴信号仪检测出荧光信号，该微反应液滴为阳性微液滴；若不存在DNA模板，则检测不出荧光信号，该微反应液滴为阴性微液滴。

根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，采用MicroDrop^TM数字PCR仪配套数据分析软件(QuantDrop数据分析软件)计算出拷贝数含量。

由于荧光报告基团在相应波长的激发光下发出荧光信号，根据荧光报告基团对应的激发光，可在相应的通道中检测是否存在该荧光基团，若检测出荧光报告基团发出的荧光信号，即可确定对应的探针种类，从而确定念珠菌种类，并根据荧光信号强度得出PCR扩增后的念珠菌数量。

如表1-4、表1-5、表1-6、表1-7所示为本实施例1中对四种念珠菌的阳性参考品进行检测的数据，可定量检测出念珠菌的种类并得出拷贝数含量。

表1-4白念珠菌-5个浓度点的阳性参考品ddPCR检测数据

表1-5光滑念珠菌-5个浓度点的阳性参考品ddPCR检测数据

表1-6近平滑念珠菌-5个浓度点的阳性参考品ddPCR检测数据

表1-7热带念珠菌-5个浓度点的阳性参考品ddPCR检测数据

实施例2

本实施例2提供一种定量检测四种念珠菌的检测方法，具体步骤如下：

S1：从待测样品中提取DNA作为DNA模板：6例痰液样本经Lyticase溶壁酶处理后，使用美基通用型DNA抽提试剂盒，参照试剂盒说明书提取DNA。

配置PCR反应液：PCR反应液包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，本实施例2选用实施例1中的第一PCR反应液和第二PCR反应液。

S2：分别将18μl第一PCR反应液和18μl第二PCR反应液与S1中提取的2μlDNA混合，轻轻涡旋混合均匀，得到20μl第一PCR特异扩增反应体系和20μl第二PCR特异扩增反应体系。

S3：以S1中提取的DNA作为DNA模板，分别对第一PCR特异扩增反应体系和第二PCR特异扩增反应体系进行数字PCR扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物，具体操作如下：

分别将第一PCR特异扩增反应体系和第二PCR特异扩增反应体系加入到8道的微滴生成芯片中，然后加入50μl微滴生成油至样本制备仪(广东永诺医疗科技有限公司)中，制备得到第一PCR微反应液滴和第二PCR微反应液滴；

分别将制备好的第一PCR微反应液滴和第二PCR微反应液滴转移至96孔反应板上，用封板膜进行热封；

将热封好的96孔板放入PCR仪中，设置反应程序进行PCR扩增，PCR扩增反应程序为：50℃，2分钟1个循环；95℃，10分钟1个循环；94℃，30秒变性，60℃，60秒退火、延伸共进行40个循环；98℃，10分钟1个循环；16℃保持；设置热盖温度105℃，样本体积50μl，升降温速率1.0℃/s，得到第一扩增产物和第二扩增产物。

S4：分别检测第一扩增产物和第二扩增产物的荧光信号，具体步骤如下：

分别将第一扩增产物和第二扩增产物置于生物芯片分析仪中，检测荧光信号。

根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，采用MicroDrop^TM数字PCR仪配套数据分析软件(QuantDrop数据分析软件)计算出拷贝数含量。

由于荧光报告基团在相应波长的激发光下发出荧光信号，不同的荧光信号对应不同的荧光基团，可在相应的通道中检测是否存在该荧光基团，若检测出荧光信号，即可确定对应的荧光报告基团以及对应的探针，从而确定念珠菌种类，并根据荧光信号强度得出PCR扩增后的念珠菌数量。

在本实施例2中，对第一扩增产物进行荧光信号检测，可通过检测结果得出是否包括白念珠菌和光滑念珠菌；对第二扩增产物进行荧光信号检测，可通过检测结果得出是否包括近平滑念珠菌和热带念珠菌；综合两份荧光信号检测的结果，即可得出四种念珠菌的数量。

如表2-1所示，痰液样本1中，将第一扩增产物置于反应孔E01，第二扩增产物置于反应孔G02；在E01孔中，阳性微滴数不为0，检测出FAM基团和VIC基团，则说明存在白念珠菌和光滑念珠菌；在G02孔中，阳性微滴数为0，未检测出FAM基团和VIC基团，则说明不存在近平滑念珠菌和热带念珠菌。综上可得，痰液样本1存在白念珠菌和光滑念珠菌，并可根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，得出白念珠菌和光滑念珠菌在PCR扩增中的拷贝数。

同理可得，痰液样本2不存在白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌；痰液样本3不存在白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌；痰液样本4存在近平滑念珠菌；痰液样本5不存在白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌；痰液样本6不存在白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌。可参照阳性质控的检测数据，检查样本的检测是否出现操作失误。

表2-1定量检测四种念珠菌

实施例3

本实施例3提供一种定量检测四种念珠菌的检测方法，具体步骤与实施例2相似，主要区别在于：第一PCR反应液如表3-1所示，第二PCR反应液的组分如表3-2所示：

表3-1第一PCR反应液组分

组分	用量
		预混液Master Mix	10ul
第一上游引物(18μm/L)	1.8μl
		第一下游引物(18μm/L)	1.8μl
第一探针(9μm/L)	0.4μl
		第二上游引物(18μm/L)	1.8μl
第二下游引物(18μm/L)	1.8μl
		第二探针(9μm/L)	0.4μl
总体积	18μl

表3-2第二PCR反应液组分

组分	用量
		预混液Master Mix	10ul
第三上游引物(18μm/L)	1.8μl
		第三下游引物(18μm/L)	1.8μl
第三探针(9μm/L)	0.4μl
		第四上游引物(18μm/L)	1.8μl
第四下游引物(18μm/L)	1.8μl
		第四探针(9μm/L)	0.4μl
总体积	18μl

实施例4

本实施例4提供一种定量检测四种念珠菌的检测方法，与实施例2的步骤相似，主要区别在于：第一PCR反应液如表4-1所示，第二PCR反应液的组分如表4-2所示

表4-1第一PCR反应液组分

组分	用量
		预混液Master Mix	10ul
第一上游引物(22μm/L)	1.8μl
		第一下游引物(22μm/L)	1.8μl
第一探针(11μm/L)	0.4μl
		第二上游引物(22μm/L)	1.8μl
第二下游引物(22μm/L)	1.8μl
		第二探针(11μm/L)	0.4μl
总体积	18μl

表4-2第二PCR反应液组分

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院，广州永诺医学检验所有限公司

<120> 念珠菌的引物探针组合及应用、PCR反应液、试剂盒和方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CTTGGTATTTTGCATGTTGCTCTC 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GTCAGAGGCTATAACACACAGCAG 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

TTTACCGGGCCAGCATCGGTTT 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

CCTGTTTGAGCGTCATTTCC 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

AGCACGCACAAAACACTCACTTAT 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

TAGGTTTTACCAACTCGGTGTTGAT 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

GGGTTTGGTGTTGAGCGATAC 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

GGAGTTTGTACCAATGAGTGGAAA 24

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

CTCCGCCTTTCTTTCAAGCAAACCCAG 27

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

GCGGTAGGAGAATTGCGTT 19

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

TCATTATGCCAACATCCTAGGTTTA 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

CGCAGTCCTCAGTCTAGGCTGGCAG 25

Claims (10)

1.一种念珠菌的引物探针组合，其特征在于：

包括第一引物探针组合和第二引物探针组合；

所述第一引物探针组合包括针对白念珠菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及针对光滑念珠菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针；第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述第二引物探针组合包括针对近平滑念珠菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及针对热带念珠菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针；第三上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，第三下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；第四上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，第四下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

2.根据权利要求1所述的念珠菌的引物探针组合，其特征在于：

所述第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的两端均分别设置有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的念珠菌的引物探针组合，其特征在于：

第一探针和第二探针的荧光报告基团不同，第三探针和第四探针的荧光报告基团不同。

4.根据权利要求1-3任一项所述的念珠菌的引物探针组合，其特征在于：

第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；第四探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

5.权利要求1-4任一项所述的念珠菌的引物探针组合在PCR扩增和念珠菌检测领域的应用。

6.一种PCR反应液，其特征在于：

包括第一PCR反应液和第二PCR反应液；

所述第一PCR反应液包括PCR预混液、权利要求1-4任一项所述的针对白念珠菌的第一上游引物、第一下游引物和第一探针，以及权利要求1-4任一项所述的针对光滑念珠菌的第二上游引物、第二下游引物和第二探针；

所述第二PCR反应液包括PCR预混液、权利要求1-4任一项所述的针对近平滑念珠菌的第三上游引物、第三下游引物和第三探针，以及权利要求1-4任一项所述的针对热带念珠菌的第四上游引物、第四下游引物和第四探针；

将所述PCR反应液用于PCR扩增时，第一PCR反应液和第二PCR反应液分别使用。

7.根据权利要求5所述的PCR反应液，其特征在于：

所述第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物、第二下游引物、第三上游引物、第三下游引物、第四上游引物和第四下游引物的浓度为18-22μm/L；所述第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的的浓度为9-11μm/L。

8.一种试剂盒，其特征在于：

包括权利要求6-7任一项所述的PCR反应液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：

还包括DNA提取试剂。

10.一种定量检测四种念珠菌的方法，其特征在于：

包括以下步骤：

S1：取权利要求6-7任一项所述的PCR反应液；从待测样品中提取DNA；

S2：以S1中提取的DNA为DNA模板，将DNA加入第一PCR反应液中，配置得到第一PCR特异扩增反应体系；以S1提取的DNA为进行PCR扩增的DNA模板，将DNA加入第二PCR反应液中，配置得到第二PCR特异扩增反应体系；

S3：分别对第一PCR特异扩增反应体系和第二PCR特异扩增反应体系进行数字PCR扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物；

S4：分别检测第一扩增产物和第二扩增产物的荧光信号，通过荧光信号得出念珠菌的种类和数量。

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