CN110484641A - 一种高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，包括如下步骤：步骤一、准备待鉴定菌株包括光滑念珠菌、尼瓦利亚念珠菌、布加拉念珠菌和对照菌株的DNA模板；步骤二、设计上下游引物；步骤三、利用高分辨率溶解曲线技术HRM，获取各菌株高分辨溶解曲线图，具体为利用Real‑time PCR技术，通过实时检测DNA熔解过程中荧光信号值的变化获取各菌株高分辨溶解曲线图；步骤四、利用分析软件分析鉴定待鉴定菌株的具体类型；步骤五、测定步骤三中结果为阳性菌株的核苷酸序列；步骤六、验证鉴定方法的灵敏度。本发明提供高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，可明确鉴定光滑念珠菌复合体中的不同物种，方法操作简单，准确高效。
Description
技术领域
本发明涉及菌种鉴定领域，特别涉及一种高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法。
背景技术
光滑念珠菌复合体是一种重要的临床致病真菌，可引起侵袭性真菌感染等致死性疾病。光滑念珠菌复合体包括三种人类致病念珠菌：光滑念珠菌(Candida glabrata)、尼瓦利亚念珠菌(Candida nivariensis)和布加拉念珠菌(Candida bracarensis)。光滑念珠菌是临床上一种常见的病原真菌，在北美洲和欧洲的分离率仅低于白念珠菌，位居第二，是我国第四种最常见的念珠菌；而后两种属于罕见念珠菌，在酵母菌中的占比<0.5％。据报道，后两种罕见菌对唑类的敏感性低于光滑念珠菌，因此菌种准确鉴定对临床诊断和治疗十分重要。
光滑念珠菌复合体中三种菌的生化反应特征相似，临床传统表型鉴定方法(包括Vitek 2Compact和API ID32C)无法将两种罕见菌鉴定至菌种水平或将其错误鉴定为光滑念珠菌。MALDI-TOF MS是一种新兴技术在临床微生物菌种鉴定中发挥重要作用，能够正确鉴定临床常见酵母菌种，但其鉴定能力依赖于数据库：当数据库中缺乏少见和新发菌种谱图时，常常无法鉴定或错误鉴定。临床应用广泛的质谱系统Vitek MS v2.0和BrukerBiotyper v3.1均无法将两种罕见菌正确鉴定至种水平。使用聚合酶链式反应(PCR)对菌种核糖体DNA转录间区进行扩增及核酸序列测定是物种鉴定的“金标准”，但操作复杂、耗时较长。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于非诊断和治疗目的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，可明确鉴定光滑念珠菌复合体中的不同物种，方法操作简单，准确高效。
一种高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，包括如下步骤：
步骤一、准备待鉴定菌株包括光滑念珠菌、尼瓦利亚念珠菌、布加拉念珠菌和对照菌株的DNA模板；
步骤二、设计上下游引物；
步骤三、利用高分辨率溶解曲线技术HRM，获取各菌株高分辨溶解曲线图，具体为利用Real-time PCR技术，通过实时检测DNA熔解过程中荧光信号值的变化获取各菌株高分辨溶解曲线图；
步骤四、利用分析软件分析鉴定待鉴定菌株的具体类型；
步骤五、测定步骤三中结果为阳性菌株的核苷酸序列；
步骤六、验证鉴定方法的灵敏度。
高分辨溶解曲线技术HRM的基本原理：双链核苷酸(double strand DNA，dsDNA)的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsDNA解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA上，因此利用实时PCR技术，通过实时检测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将PCR产物中存在的差异直观地展示出来。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。
在上述任一方案中优选的是，对照菌种为Candida albicans-白念珠菌，Candidatropicalis-热带念珠菌，Candida parapsilosis-近平滑念珠菌，Candida metapsilosis-似平滑念珠菌，Candida orthopsilosis-拟平滑念珠菌，Candida krusei-克柔念珠菌，Candida haemulonii-希木龙念珠菌，Candida duobushaemulonii-伪希木龙念珠菌，Candida haemulonii var.vulnera-希木龙念珠菌vulnera变种，Candidapseudohaemulonii-假希木龙念珠菌，Candida auris-耳念珠菌，Trichosporon asahii-阿萨希毛孢子菌，Aspergillus sydowii-聚多曲霉，Aspergillus flavus-黄曲霉，Alternaria alternate-链格孢菌，Cladosporium sphaerospermum-球孢枝孢，Curvularialunata-月状弯孢菌，Fusarium solani-茄病镰刀菌，Hortaea werneckii-威尼克外瓶霉，Kodamaea ohmeri-奥默柯达菌，Talaromyces funiculosus-绳状篮状菌，Trichophytonrubrum-红色毛癣菌中的全部菌株。
在上述任一方案中优选的是，步骤二中
上游引物为5'-TCAACAATGGATCTCTTGGT-3'，
下游引物为5'-CCAACAATTTCAAGCTAACT-3'。
在上述任一方案中优选的是，上下游引物使用Primer3引物设计软件进行设计，产物长度为210bp。
在上述任一方案中优选的是，步骤三中Real-time PCR反应体系包括包括2×Taqman qPCR Mix(Takara)15μL、上，下游引物各0.9μL、Rox Reference DyeⅡ(100×)0.3μL、Evagreen，20×in Water 1.5μL、DNA模板2μL，用灭菌纯水补足体系至30μL。
在上述任一方案中优选的是，步骤三中Real-time PCR反应条件为预变性：95℃10min；95℃15s，58℃30s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。
在上述任一方案中优选的是，步骤三中高分辨溶解曲线技术HRM程序为：95℃10s，60℃1min，(0.025℃/s升温至)95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，连续检测荧光强度。
在上述任一方案中优选的是，步骤四中利用high-resolution melting analysis软件进行结果分析。
在上述任一方案中优选的是，步骤五中鉴定出的阳性结果菌株Candidaglabrata-光滑念珠菌，使用Sanger测序法测得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在上述任一方案中优选的是，步骤五中鉴定出的阳性结果菌株Candidabracarensis-布加拉念珠菌，使用Sanger测序法测得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在上述任一方案中优选的是，步骤五中鉴定出的阳性结果菌株Candidanivariensis-尼瓦利亚念珠菌，使用Sanger测序法测得核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在上述任一方案中优选的是，步骤六中以10倍稀释光滑念珠菌、布加拉念珠菌、尼瓦利亚念珠菌DNA模板，验证鉴定方法的灵敏度，其最低检测限为60-100个拷贝。
本发明提的供高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，可明确鉴定光滑念珠菌复合体中的不同物种，方法操作简单，准确高效。
附图说明
图1为按照本发明实施例1的PCR扩增ΔRn与cycle关系图；
图2为按照本发明的图1所示实施例1的HRM测定的荧光值与温度曲线图；
图3为按照本发明的图1所示实施例1的HRM测定的校正荧光值与温度曲线图；
图4为按照本发明的图1所示实施例1的灵敏度验证结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实验菌种：Candida glabrata(C.glabrata)-光滑念珠菌，Candida nivariensis(C.nivariensis)-尼瓦利亚念珠菌，Candida bracarensis(C.bracarensis)-布加拉念珠菌；
对照菌种：Candida albicans-白念珠菌，Candida tropicalis-热带念珠菌，Candida parapsilosis-近平滑念珠菌，Candida metapsilosis-似平滑念珠菌，Candidaorthopsilosis-拟平滑念珠菌，Candida krusei-克柔念珠菌，Candida haemulonii-希木龙念珠菌，Candida duobushaemulonii-伪希木龙念珠菌，Candida haemuloniivar.vulnera-希木龙念珠菌vulnera变种，Candida pseudohaemulonii-假希木龙念珠菌，Candida auris-耳念珠菌，Trichosporon asahii-阿萨希毛孢子菌，Aspergillussydowii-聚多曲霉，Aspergillus flavus-黄曲霉，Alternaria alternate-链格孢菌，Cladosporiumsphaerospermum-球孢枝孢，Curvularia lunata-月状弯孢菌，Fusarium solani-茄病镰刀菌，Hortaea werneckii-威尼克外瓶霉，Kodamaea ohmeri-奥默柯达菌，Talaromycesfuniculosus-绳状篮状菌，Trichophyton rubrum-红色毛癣菌。
实验菌株和对照菌株均来自中国医院侵袭性真菌病监测网(CHIF-NET)。使用商品化试剂盒(本例中使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen公司，货号51306)，相关操作遵从说明书执行)对菌株总DNA进行提取。
引物设计：上下游引物使用Primer3引物设计软件进行设计，产物长度210bp
上游引物为5'-TCAACAATGGATCTCTTGGT-3'，
下游引物为5'-CCAACAATTTCAAGCTAACT-3'。
实时PCR(Real-time PCR)反应体系与条件:
Real-time PCR反应体系：反应体系包括包括2×Taqman qPCR Mix(Takara)15μL、上，下游引物各0.9μL、Rox Reference DyeⅡ(100×)0.3μL、Evagreen，20×in Water 1.5μL、DNA模板2μL，用灭菌纯水补足体系至30μL。
Real-time PCR反应条件为：预变性：95℃10min；95℃15s，58℃30s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。HRM程序为：95℃10s，60℃1min，(0.025℃/s升温至)95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，连续检测荧光强度。
使用ABI QuantStudio 6flex荧光定量PCR仪测定，high-resolution meltinganalysis软件进行结果分析，如图1-图3所示。
图1为PCR扩增ΔRn与cycle关系图，结果表明所设计引物对实验菌株与阴性对照菌株进行PCR扩增，结果为设计的引物仅能扩增实验菌株，阴性对照菌均不能扩增，具体通过CT值即每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数可以进行判断，在36以后可认为未扩增。
将荧光定量PCR鉴定出的阳性结果菌株测定其DNA序列。测定结果如下：
鉴定出的阳性结果菌株Candida glabrata-光滑念珠菌核苷酸，使用Sanger测序法测得序列如SEQ ID NO:1所示。
鉴定出的阳性结果菌株Candida bracarensis-布加拉念珠菌，使用Sanger测序法测得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
鉴定出的阳性结果菌株Candida nivariensis-尼瓦利亚念珠菌，使用Sanger测序法测得核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
high-resolution melting analysis软件进行HRM分析结果如图2所示，实验菌株出现熔解峰，且均为单峰型(不同菌株有不同的熔解曲线，阴性对照菌株未出现熔解曲线)。
熔解曲线是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度(Tm)，不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线，熔解温度上有一特征峰(Tm，DNA双链解链50％的温度)，用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开。
图3结果表明Candida bracarensis在82.55-85.20℃的温度范围内，荧光信号迅速降低，Tm值为84.15℃；Candida glabrata在82.83-85.86℃的温度范围内，荧光信号迅速降低，Tm值为84.38℃；Candida nivariensis在83.08-86.10℃的温度范围内，荧光信号迅速降低，Tm值为84.73℃。
由图1-图3的结果表明：三种实验菌株通过建立的高分辨率曲线法可以将其进行区分。
灵敏度验证
用Qubit测定原始质粒的浓度，采用公式：拷贝数/微升＝(6.02×1023)×(ng/μl×10-9)/(DNA长度×660)，将其单位转换为拷贝数/微升。用超纯水对模板进行10倍梯度稀释，使其终拷贝数依次为6×105、6×104、6×103、6×102、6×10，按照上述体系及反应条件下进行灵敏度验证，其最低检测限为60-100个拷贝。结果如图4所示。
实施例2
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实验菌种：Candida glabrata(C.glabrata)-光滑念珠菌，Candida nivariensis(C.nivariensis)-尼瓦利亚念珠菌，Candida bracarensis(C.bracarensis)-布加拉念珠菌；
对照菌种：选取实施例1中的部分菌种作为对照菌株：Candida albicans-白念珠菌，Candida tropicalis-热带念珠菌，Candida parapsilosis-近平滑念珠菌，Candidametapsilosis-似平滑念珠菌，Candida orthopsilosis-拟平滑念珠菌，Candida krusei-克柔念珠菌，Candida haemulonii-希木龙念珠菌，Candida duobushaemulonii-伪希木龙念珠菌，Candida haemulonii var.vulnera-希木龙念珠菌vulnera变种，Candidapseudohaemulonii-假希木龙念珠菌，Candida auris-耳念珠菌。
实验菌株和对照菌株均来自中国医院侵袭性真菌病监测网(CHIF-NET)。使用商品化试剂盒对菌株总DNA进行提取。
引物设计：上下游引物使用Primer3引物设计软件进行设计，产物长度210bp
上游引物为5'-TCAACAATGGATCTCTTGGT-3'，
下游引物为5'-CCAACAATTTCAAGCTAACT-3'。
实时PCR(Real-time PCR)反应体系与条件:
Real-time PCR反应体系：反应体系包括包括2×Taqman qPCR Mix(Takara)15μL、上，下游引物各0.9μL、Rox Reference DyeⅡ(100×)0.3μL、Evagreen，20×in Water 1.5μL、DNA模板2μL，用灭菌纯水补足体系至30μL。
Real-time PCR反应条件为：预变性：95℃10min；95℃15s，58℃30s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。HRM程序为：95℃10s，60℃1min，(0.025℃/s升温至)95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，连续检测荧光强度。
使用ABI QuantStudio 6 flex荧光定量PCR仪测定，high-resolution meltinganalysis软件进行结果分析。
灵敏度验证
以10倍稀释光滑念珠菌、布加拉念珠菌、尼瓦利亚念珠菌DNA模板中的一种对上述实验方法进行灵敏度验证。
实施例3
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实验菌种：Candida glabrata(C.glabrata)-光滑念珠菌，Candida nivariensis(C.nivariensis)-尼瓦利亚念珠菌，Candida bracarensis(C.bracarensis)-布加拉念珠菌；
对照菌种：选取实施例1中的部分菌种作为对照菌株：Trichosporon asahii-阿萨希毛孢子菌，Aspergillus sydowii-聚多曲霉，Aspergillus flavus-黄曲霉，Alternariaalternate-链格孢菌，Cladosporium sphaerospermum-球孢枝孢，Curvularia lunata-月状弯孢菌，Fusarium solani-茄病镰刀菌，Hortaea werneckii-威尼克外瓶霉，Kodamaeaohmeri-奥默柯达菌，Talaromyces funiculosus-绳状篮状菌，Trichophyton rubrum-红色毛癣菌。
其余步骤同实施例1。
本领域技术人员不难理解，本发明的一种高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法包括上述发明说明书的发明内容和具体实施方式部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> 一种高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法
<130> 2019
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 886
<212> DNA
<213> Candida glabrata-光滑念珠菌
<400> 1
gggcttcgat ttattgattt gtctgagctc ggagagagac atctctgggg aggaccagtg 60
tagacactca ggaggctcct aaaatatttt ctctgctgtg aatgctattt ctcctgcctg 120
cgcttaagtg cgcggttggt gggtgttctg cagtgggggg agggagctga caaagacctg 180
ggagtgtgcg tggatctctc tattccaaag gaggtgtttt atcacacgac tcgacacttt 240
ctaattacta cacacagtgg agtttacttt actactattc ttttgttcgt tgggggaaag 300
ctctctttcg ggggggagtt ctcccagtgg atgcaaacac aaacaaatat tttttatttt 360
aactaattca gtcaacacaa gatttctttt agtagaaaac aacttcaaaa ctttcaacaa 420
tggatctctt ggttctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgatacg taatgtgaat 480
tgcagaattc cgtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccctctg gtattccggg 540
gggcatgcct gtttgagcgt catttccttc tcaaacacgt tgtgtttggt agtgagtgat 600
actctcgttt ttgagttaac ttgaaattgt aggccatatc agtatgtggg acacgagcgc 660
aagcttctct attaatctgc tgctcgtttg cgcgagcggc gggggttaat actgtattag 720
gttttaccaa ctcggtgttg atctagggag ggataagtga gtgttttgtg cgtgctgggc 780
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atcattaaac cggaagaaag atctttaaag aaaattaaat tgattt 886
<210> 2
<211> 777
<212> DNA
<213> Candida bracarensis-布加拉念珠菌
<400> 2
dagtctggga gtgttatggg ggtggtactg tgagagatgt gtctctggaa caatgaggat 60
ggaggagtct gagcctgcgc ttaagtgcgc ggcctgggtt ttgtctgtgc gaggtgttct 120
actttcaagg agcatgtttt cgagcgtacc gttttccaca acactacaca cagtggagta 180
atctattgtt ctttctattt ttctttgggg gacgcaagtt tcccgggaga agcaaacaca 240
aacaattatt tttatatcta aaatttgtca gaacttaatt tctcttttga gaaaataact 300
tcaaaacttt caacaatgga tctcttggtt ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc 360
gatacgtaat gtgaattgca gaattccgtg aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc 420
cctctggtat tccagggggc atgcctgttt gagcgtcatt tccttctcaa acacctgtgt 480
ttggtagtga gtgatactct gttgagttag cttgaaattg ttggccattt agtggggaca 540
tttggagtct tgctttgcgg gtcttatttt tcattgggag tttcgcaatg ggaatatcgt 600
attaggtttt accaacttcg gtattttttt gttgcgggat gttaattcct ttggatagag 660
atctgtgtat ggtgaatcca aacttgtcag cacggcaaac agaaaccttt aagtttgacc 720
tcaaatcagg taggattacc cgctgaactt aagcatatca aaagcgggaa gagaaaa 777
<210> 3
<211> 735
<212> DNA
<213> Candida nivariensis-尼瓦利亚念珠菌
<400> 3
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gcctgcgctt aagtgcgcgg cggaggcggt gcttttctgg agctagctaa ttcaaagggg 120
cgagtttgta tctttcaact ttacacacag tggagtaatc ttactttatt gttcttattt 180
tctttgggac tgctcttttt gggcgtcccg ggagaagcaa acacaaacaa ttattttata 240
ttctactttg tcaaaaccaa attctctgtt gagaaataac ttcaaaactt tcaacaatgg 300
atctcttggt tctcgcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgatacgtaa tgtgaattgc 360
agaattccgt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg ccctctggta ttccgggggg 420
catgcctgtt tgagcgtcat ttccttctca aacgtctcgt ttggtggtga gtgatactct 480
gctggagtta gcttgaaatt gttggccatt ttatgcggac gtgcatggtg ggctgttttt 540
ttcattggaa gttttgcaat gagaaagtcg tattaggttt taccaacttc gacggtctct 600
gttgcagggc attttaaatt ctggtggaag ggctctactg tgaagtcatg ctggcaaaca 660
ggaaccttta agtttgacct caaatcaggt aggattaccc gctgaactta agcatatcaa 720
aaagccggaa aaaaa 735
Claims (10)
1.一种高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，包括如下步骤：
步骤一、准备待鉴定菌株包括光滑念珠菌、尼瓦利亚念珠菌、布加拉念珠菌和对照菌株的DNA模板；
步骤二、设计上下游引物；
步骤三、利用高分辨率溶解曲线技术HRM，获取各菌株高分辨溶解曲线图，具体为利用Real-time PCR技术，通过实时检测DNA熔解过程中荧光信号值的变化获取各菌株高分辨溶解曲线图；
步骤四、利用分析软件分析鉴定待鉴定菌株的具体类型；
步骤五、测定步骤三中结果为阳性菌株的核苷酸序列；
步骤六、验证鉴定方法的灵敏度。
2.如权利要求1所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤一中对照菌株为Candida albicans-白念珠菌，Candida tropicalis-热带念珠菌，Candidaparapsilosis-近平滑念珠菌，Candida metapsilosis-似平滑念珠菌，Candidaorthopsilosis-拟平滑念珠菌，Candida krusei-克柔念珠菌，Candida haemulonii-希木龙念珠菌，Candida duobushaemulonii-伪希木龙念珠菌，Candida haemuloniivar.vulnera-希木龙念珠菌vulnera变种，Candida pseudohaemulonii-假希木龙念珠菌，Candida auris-耳念珠菌，Trichosporon asahii-阿萨希毛孢子菌，Aspergillussydowii-聚多曲霉，Aspergillus flavus-黄曲霉，Alternaria alternate-链格孢菌，Cladosporium sphaerospermum-球孢枝孢，Curvularia lunata-月状弯孢菌，Fusariumsolani-茄病镰刀菌，Hortaea werneckii-威尼克外瓶霉，Kodamaea ohmeri-奥默柯达菌，Talaromyces funiculosus-绳状篮状菌，Trichophyton rubrum-红色毛癣菌中的全部菌种。
3.如权利要求2所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤二中
上游引物为5'-TCAACAATGGATCTCTTGGT-3'，
下游引物为5'-CCAACAATTTCAAGCTAACT-3'。
4.如权利要求3所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤二中上下游引物使用Primer3引物设计软件进行设计，产物长度为210bp。
5.如权利要求4所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤三中Real-time PCR反应体系包括2×Taqman qPCR Mix(Takara)15μL、上，下游引物各0.9μL、Rox Reference Dye Ⅱ(100×)0.3μL、Evagreen，20×in Water 1.5μL、DNA模板2μL，用灭菌纯水补足体系至30μL。
6.如权利要求5所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤三中Real-time PCR反应条件为预变性：95℃10min；95℃15s，58℃30s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。
7.如权利要求6所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤三中高分辨溶解曲线技术HRM程序为：95℃10s，60℃1min，(0.025℃/s升温至)95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，连续检测荧光强度。
8.如权利要求7所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤四中利用high-resolution melting analysis软件进行结果分析。
9.如权利要求8所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤五中鉴定出的阳性结果菌株Candida glabrata-光滑念珠菌，使用Sanger测序法测得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
10.如权利要求9所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤五中鉴定出的阳性结果菌株Candida bracarensis-布加拉念珠菌，使用Sanger测序法测得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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