CN109811080A

CN109811080A - 一种念珠菌分种检测的dpo引物对、检测方法、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109811080A
Application number: CN201910263009.4A
Authority: CN
Inventors: 王志贤; 阎香言; 盛长忠; 周泽奇; 粟艳
Original assignee: Danner (tianjin) Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Danner (tianjin) Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2019-05-28

Abstract

本发明提供了一种念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用，所述DPO引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明的DPO引物对可以特异性扩增念珠菌属，不与其他常见致病菌属如曲霉菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌发生交叉，此外，本发明DPO引物对的设计使得不同念珠菌种的产物具有不同退火温度，通过产物的熔解曲线分析，即可判定是白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌或光滑念珠菌中的哪种，仅用一对引物即可实现多重检测，较现有技术更为简便经济。

Description

一种念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用，尤其涉及一种念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用，具体涉及一种白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术

念珠菌是真菌中最为常见的条件致病菌之一，主要包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌，所述念珠菌占临床医学样本中的80％以上。念珠菌常寄生于人的皮肤、口腔、阴道和肠粘膜等位置，当机体免疫机能下降时，容易引起念珠菌病。由于培养法区分不同念珠菌种的时间周期较长，不利于快速治疗，临床常用广谱抗真菌药物进行念珠菌感染的治疗。不同念珠菌种对抗生素的耐药性不同，若不区分菌种而采用统一的治疗方案容易对机体产生不同的影响。现有技术中常使用聚合酶链式反应(PCR)进行分种检测。

CN109055502A公开了一种基于真菌游离DNA(cell free DNA,cfDNA)的侵袭性真菌感染快速多重PCR鉴定诊断检测方法，可鉴定由临床常见和高发的白色念珠菌(Candidaalbicans)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)，克柔念珠菌(Candida krusei)，光滑念珠菌(Candida glabrata)及烟曲霉(Aspergillus fumigtus)造成的侵袭性感染。该发明根据各真菌属、种的特征基因组区段设计扩增引物，依据所述扩增片段设计可区分菌种的检测荧光探针，对待测样品进行实时荧光PCR(real time PCR)，综合了巢式PCR的高灵敏性和多重荧光杂交探针PCR的高特异性和多靶标性的优势鉴定真菌菌种。虽然该方法实现一步单管反应鉴定多种病原菌，但该反应体系中存在多条引物和探针，不仅经济成本高，反应体系的稳定性也显著降低。

CN101509037A公开了一种检测四种/四种以上侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒及其应用方法，在试剂盒内设有含有特异性引物和至少四种念珠菌相对应的荧光探针的荧光定量PCR反应液、至少四种念珠菌的阳性质控品和阴性质控品，根据荧光定量PCR检测仪检测的Ct值进行判断。通过引物高特异扩增和荧光探针的高特异杂交双重控制，假阳性低。但该方法需要一对通用引物和针对不同菌种的特异性探针，探针数量多，反应体系稳定性较差，同时成本高昂。

CN108034745A公开了一种检测四种念珠菌的引物探针组合，属于微生物检测技术领域，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团的序列。该发明提供的一对引物一条探针特异性地同时检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌四种念珠菌。但该发明无法区分阳性样本对应的具体菌种，即无法对念珠菌进行分种。

因此，提供一种特异性好、高效快速、成本低、灵敏度高、能区分不同念珠菌种的方法，具有重要意义，为精准用药、流行性疾病研究奠定基础。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用，有效区分白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌，本发明的DPO引物对特异性好、灵敏度高，反应结束后利用熔解曲线判断待测样本所含念珠菌的菌种信息，高效简便，为精准用药和流行性疾病研究奠定基础。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种念珠菌分种检测的DPO引物对，所述DPO引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

DPO上游引物序列(SEQ ID NO.1)：

5’-ACAAGGTTTCCGTAGGTGIIIIIGCGGAAGGAT-3’；

DPO下游引物序列(SEQ ID NO.2)：

5’-TCATATTACGTATCGCIIIIIICTGCGTTCTTC-3’.

DPO(Dual priming oligonucleotide)引物是一种双启动寡核苷酸引物，包括两个独立的特异性引物区域，这两段独立的特异性区域通过寡聚次黄嘌呤(Inosine,I)进行连接，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，使5’和3’区域形成两个独立功能的双特异性引物结构。

本发明提供一种基于熔解曲线分析的侵袭性念珠菌DPO引物检测方法，用ClustaX比对NCBI上大量核酸序列，比对菌种范围包括：白色念珠菌LC016565.1、HE860439.1、HE860438.1、LC201976.1、HG916992.1等430条序列；近平滑念珠菌AB109223.1、LT596112.1、LN864561.1、FM172980.1、LC390002.1等800条序列；热带念珠菌KX664485.1、LT837798.1、JN542555.1、HM222942.1、FJ515173.1等350条序列；克柔念珠菌KU987874.1、KP674518.1、KX912139.1、FJ515204.1、EF568018.1等177条序列；光滑念珠菌HE993756.1、KU936094.1、KP780450.1、KM603625.1、LC011411.1、HG970737.1等291条序列。通过比对2048条序列，可以最大程度获得念珠菌种内高保守区，得到不同临床分离株的高保守区和可变区，进而指导引物设计位置，提高对不同菌种的不同分离株的敏感性；另一方面，通过不同菌种间的序列比对，可以明确不同菌种间的高突变区和高保守区，提高DPO引物对不同念珠菌菌种的特异性。

为保证引物设计的通用性，需要在保守序列区设计引物，以使得设计的引物序列在面对绝大多数临床样本中的念珠菌种可以高效准确的扩增。但在设计引物的保守区出现的个别突变位点，设计的普通引物很难避免将该突变位点引入到引物中，会导致该引物在对存在该突变位点的临床分离株无法扩增(或者扩增效率大大下降)的情况出现，而通过多重序列分析，找出突变位点并利用DPO引物跨过该位点时，能够大大改善这种情况，提高引物体系的扩增效率和整套检测体系的敏感性。

具体的引物设计包括如下步骤：

(1)多重序列比对确定目标序列的高保守区

18s rRNA-ITS1-5.8s rRNA-28s rRNA序列比对，发现在念珠菌的18s rRNA-ITS1-5.8s rRNA-28s rRNA(NC_032096.1:1891236-1893022)300-435bp区段出现了半保守区，436bp后为高保守区，序列比对的结果示意图见图1；

(2)设计DPO引物

利用18s rRNA-ITS1-5.8s rRNA-28s rRNA区域，18s、5.8s、28s rRNA突变少，而ITS1和ITS2区域种间突变较多的特点。在18s、5.8s、28s rRNA区域上跨ITS去设计引物，使得引物位于突变少的18s、5.8s、28s rRNA区，以保证不同念珠菌的正常扩增及效率，而不同念珠菌种间的ITS区域的突变和差异使得相同DPO引物对扩增得到的不同产物具有不同的退火温度Tm值，因此可以通过熔解曲线分析得以分析和确定，DPO引物设计示意图见图2，其中DPO引物中脱氧次黄嘌呤跨过目标序列的可变位点如图3所示。图3中红框内为本发明DPO引物的设计区域，序列上方有*的表示保守，所以该段序列中有一个可变序列。

本发明中，使用一对DPO引物对实现五种念珠菌种分种检测的原理如下：

实时荧光PCR反应体系中，加入过量荧光染料，PCR变性过程中单链的DNA与游离的染料相互独立，荧光信号弱；引物退火过程中，DPO引物特异性结合到目标序列上，DNA双链部分形成，染料特异性地结合到DNA双链中，荧光信号增强；PCR延伸过程中，随着DNA双链的形成，结合的染料越来越多，荧光信号不断增强；PCR延伸阶段结束后，DNA双链结合的荧光染料达到最大值，荧光信号进入平台期；最后通过较大温度跨度的变温阶段，检测扩增产物的熔解曲线，根据阳性对照品测出的标准值进行比对，即可获知待测样本中的是哪种念珠菌。

根据DPO引物区分不同菌种虽然理论简单，但此原理操作存在很大的难度，需要大量的序列比对确定目标序列的保守区段，在保证引物设计的基本原则基础上选择引物设计的具体位置，同时充分利用DPO引物的脱氧次黄嘌呤区段的特点，达到整个体系对特定菌种的特异性和敏感性，在实际操作中，往往会出现因选取序列的过分保守导致对特定菌种的敏感性下降或者引物选取序列的保守性不够而导致特异性下降。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的DPO引物对在制备念珠菌分种检测的产品中的应用。

第三方面，本发明提供一种念珠菌分种检测的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的DPO引物对。

优选地，所述阴性质控为含有拟南芥DNA片段的质粒，所述拟南芥DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：

CATGATTCAGCCAACATAACCCGACCCGTACAATTCTATTACGCGTCTCCGGCGACTGACTATACTTGCCGTTCGGAGTTAGGGTTTTACTCCGAGAGAAAATTGAGTCAGCGATGAATCCGTTGACAAGGTGAAGAAGACGCAGAGCATTAACGCGAAAGAATTAGATCTAGGGATTTACGACGAAGCATCTTGGCACGCCAAGTACAAAGATTCAGCCTACGTTTACGTCGGAGAATTACCTTACGATCTCACGGAGGGTGACCTCCTCGCCGTTTTCTCACAATATGGTGAAGTTGTTGATTTGAATCTTGTTCGAGATAAAGGAACTGGGAGATCAAAAAGATTTGCGTTTGTTGCTTATGAAGATCAGAGAAGTACTAATCTTGCTGTTGGATAATAAAAGTGGAGCATTGTGGTAAATACTTAAAGAGAGAAGAGGAAGATGAAGAGACGAAGCAGAAGAAGAGAGAAGCTCCGTGGTGTTTGCAGAGCTTTTCAGAGAAAGGAGTGTACTCGTGGAGATTCTTGCAAATTTTCTCACGATGAAAATAGAGCTGCCAATACCGGGTGGGGTCACGAAGATCGTAGAAGTTCCAAGTGAGAGATCAAGTAAGTAAATACCATAATGATGTAGAGGATAAATAGGGATTGTTCATATTGATATCCAAGTGGTAATGCTCTACATTGAAGAATGGTTTCTAAGTTGTAGCTAGAATCTAATGGAAAATGTGATTTATTGACCATTAGCTTACACACCGGTGTTTTGCTCTGTATATGTCGATCTTATTTTCAGTGTTCACCTTTAC.

优选地，所述阳性质控分别为含有白色念珠菌DNA片段的质粒、含有热带念珠菌DNA片段的质粒、含有近平滑念珠菌DNA片段的质粒、含有克柔念珠菌DNA片段的质粒和含有光滑念珠菌DNA片段的质粒。

本发明中，阴性质控和阳性质控均采用本领域常用的质粒pMD19，需要说明的是，任何满足阴性质控和阳性质控质粒构建的载体均可用于替换pMD19，此处无需特殊限定。

优选地，所述白色念珠菌DNA片段、热带念珠菌DNA片段、近平滑念珠菌DNA片段、克柔念珠菌DNA片段和光滑念珠菌DNA片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

白色念珠菌DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：

ATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTTGGCGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGGCCCGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGACCCGGGTCTGTGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGCATGCTGCTCTCTCGGGGGCGGCCGCTGCGGTTTACCGGGCCAGCATCGGTTTGGAGCGGCAGGATAATGGCGGAGGAATGTGGCACGGCTTCTGCTGTGTGTTATAGCCTCTGACGATACTGCCAGCCTAGACCGAGGACTGCGGTTTTTACCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGC.

热带念珠菌DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体如下：

AAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGATCCAGGCCTATGTAAAGTTCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGTATGTTACTTCTTCGGGGGTGGCCTCTACAGTTTATCGGGCCAGCATCAGTTTGGGCGGTAGGAGAATTGCGTTGGAATGTGGCACGGCTTCGGTTGTGTGTTATAGCCTTCGTCGATACTGCCAGCCTAGACTGAGGACTGCGGTTTATACCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGCCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACGTCTATGCGAGTGTTTGGGTGTAAAACCCGTACGCGTAATGAAAGTGAACGTAGGTGGGGGCCCGTATGGGTGCACCATCGACCGATCCTGATGTCTTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCATAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGTAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCGAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGACCC.

近平滑念珠菌DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体如下：

GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACTTTCAGTGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGTCCCAGACCTATGTAAAGTTCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGTATGTTACTCTCTCGGGGGTGGCCTCTACAGTTTACCGGGCCAGCATCAGTTTGAGCGGTAGGATAAGTGCAAAGAAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTATAGTCTTTGTCGATACTGCCAGCTTAGACTGAGGACTGCGGCTTCGGCCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGCCCGTCTTGAAACACGGACC.

克柔念珠菌DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体如下：

TTTCATGCGCTTGATTTTTCAAGCCAACCATCGAAAGGGAATCCGGTTAAAATTCCGGAACTTGGATATGGATTCTTCACGGCAACGTAACTGAATGTGGAGACGTCGGCGTGAGCCCTGGGAGGAGTTATCTTTTCTTCTTAACAGCTTATCACCCTGGAATTGGTTTATCCGGAGATGGGGTCTTATGGCTGGAAGAGCGCGGTAATTTTGCCGCGTCCGGTGCGCTCACGACGGTCCTTGAAAATCCACAGGAAGGAATAGTTTTCATGCCAAGTCGTACTCATAACCGCAGCAGGTCTCCAAGGTTAACAGCCTCTAGTTGATAGAATAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACTTCGGGATAAGGATTGGCTCTAAGGATCGGGTGGTTTGGGCCTTGCGTAGAAGTGGTGGTGACTGGCGGCGGGCTGCTTTCGGGCGGACTGCTGTTGGACGTCGCTATAGACACACTTGGTAGGCATTTATGTCGTCCGGATCACGCTTAACGATCAACTTAGAACTGGTACGGACAAGGGGAATCTGACTGTCTAATTAAAACATAGCATTGTGATGGTCAGAAAGTGATGTTGACACAATGTGATTTCTGCCCAGTGCT.

光滑念珠菌DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体如下：

GCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTTGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGTACCACTTTGGGACTGTACTTTGCCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATGGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGTGTGTCAGTTCTTTGTAAAGGGTGCTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACAGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCTTGCCTCTCGTGGGGGGACTCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCGGTTTTGGCGGCCGGAAAAAACCTAGGGAATGTGGCTCTGCCTCGGTGTAGAGTTATAGCCCTGGGGAATACGGCCAGCCGGGACCGAGGACTGCGATTTGTATCTAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACGTCTATGCGAGTGTTTGGGTGTTAAACCCGTACGCGTAATGAAAGTGAACGTAGGTTGGGCCCCTGGGGGGTGCACAATCGACCGATCCTGATGTCTTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCATAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGTAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCGAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCTGCCGAAGTT.

优选地，所述辅助试剂包括Taq酶、dNTP、MgCl₂、DMSO、缓冲液和SYBR Green I染料。

优选地，所述缓冲液包括Tris-HCl和KCl。

优选地，所述Tris-HCl在缓冲液中的浓度为15-20mM，例如可以是15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。

优选地，所述KCl在缓冲液中的浓度为100-200mM，例如可以是100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。

第四方面，本发明提供一种念珠菌分种检测的方法，包括使用第一方面所述的DPO引物对、第三方面所述试剂盒的步骤。

优选地，所述方法包括如下步骤：

(1)分别以待测样本的DNA、阴性质控的质粒和阳性质控的五种质粒为模板，加入权利要求1所述DPO引物对、Taq酶、dNTP、MgCl₂、DMSO和SYBR Green I染料，进行实时荧光PCR反应；

(2)通过产物的扩增曲线和熔解曲线分析判断样品中是否存在念珠菌并确定念珠菌菌种。

优选地，步骤(1)所述Taq酶的终浓度为0.5-5U，例如可以是0.5U、0.8U、1U、1.2U、1.5U、1.8U、2U、2.5U、3U、3.5U、4U、4.5U或5U。

优选地，步骤(1)所述dNTP的终浓度为0.1-5M，例如可以是0.1M、0.3M、0.5M、0.8M、1M、1.2M、1.5M、1.8M、2M、2.5M、2.8M、3M、3.5M、4M、4.5M、4.8M或5M。

优选地，步骤(1)所述DPO引物对的终浓度为50-500nM，例如可以是50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、120nM、150nM、180nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM。

优选地，步骤(1)所述MgCl₂的终浓度为0.8-10nM，例如可以是0.8nM、1nM、1.2nM、1.5nM、1.8nM、2nM、2.5nM、3nM、3.5nM、4nM、4.5nM、5nM、5.5nM、6nM、6.5nM、7nM、7.5nM、8nM、8.5nM、9nM、9.5nM或10nM。

优选地，步骤(1)所述模板的终浓度为0.1pg-10ng，例如可以是0.1pg、0.5pg、1pg、2pg、3pg、4pg、5pg、10pg、20pg、30pg、40pg、50pg、60pg、70pg、80pg、90pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、2ng、3ng、4ng、5ng、6ng、7ng、8ng、9ng或10ng，优选为0.5ng-2ng。；

优选地，步骤(1)所述DMSO的质量百分比为1-15％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。

优选地，步骤(1)所述SYBR Green I染料的终浓度为0.5-2×。

本发明中，染料的添加量为0.5-2×，本领域技术人员应当知晓并掌握根据染料的浓缩倍数调整到体系所需的工作浓度，例如荧光染料一般为Sigma的SYBR Green I dye10000×，为DMSO溶解的10000倍浓缩液，使用时需要稀释到工作浓度。如终浓度为1×，需要将储存的浓缩液稀释1000倍，取2.5μL加入到体系中(25μL体系)。

优选地，步骤(1)所述实时荧光PCR反应包括如下步骤：

(1’)90-98℃预变性，8-12min，1个循环；

(2’)90-98℃10s，55-60℃35-45s，40-50个循环；

(3’)65-97℃升温，1个循环。

优选地，步骤(1’)之前还包括预热的过程：50℃，2min，1个循环。

本发明中，通过预热激活反应体系中的酶系统，提高反应效率。

优选地，步骤(1)所述实时荧光PCR反应具体包括如下步骤：

(1”)50℃预热2min，1个循环；

(2”)95℃预变性10min，1个循环；

(3”)95℃变性10s，58℃延伸40s，延伸时采集荧光信号，45个循环；

(4”)95℃5s，65℃1min；升温到97℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃。

本发明中，PCR反应循环结束后，通过对PCR反应产物进行熔解曲线分析进行念珠菌分种判定，从65℃到97℃，每升温0.5℃持续2s后采集反应管中反应液的荧光信号。PCR反应循环结束后，通过上述(4”)步骤进行熔解曲线分析，绘制熔解曲线，熔解曲线荧光值剧烈下降时的温度为产物的Tm值，用改Tm值比对已有的“Tm值-菌种对照表”即可以进行念珠菌分种判定。

本发明中，通过特定引物设计原则设计出的DPO引物对，配合本发明所述PCR反应体系以及反应条件，可以显著提高念珠菌种的分种检测特异性，不与其他常见菌种如大肠杆菌、曲霉菌或金黄色葡萄球菌进行交叉，同时检测的灵敏度高。现有技术中，为实现不同菌种的分种需要配合多种探针，不仅增加经济成本，同时增加检测体系中的复杂程度，体系的稳定性下降，且多种探针需要多个荧光通道进行分析，而本发明仅通过一对DPO引物对即可实现在同一荧光通道中对五种常见念珠菌种的分种鉴定，方法简便高效。

优选地，步骤(2)所述判断的标准为：

(a)若检测通道的Ct值不大于35，则为阳性结果，若检测通道的Ct值大于35，则为阴性结果；

(b)对阳性结果进一步分析，通过熔解曲线分析，比对产物与四种阳性质控的对应退火温度Tm值，Tm值相同的即判定待测样本含有对应阳性质控的念珠菌种。

第五方面，本发明提供一种如第二方面所述的试剂盒用于念珠菌分种检测的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的DPO引物对可以特异性扩增念珠菌属，不与其他常见致病菌属如念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌发生交叉，此外，本发明DPO引物对的设计使得不同念珠菌种的产物具有不同退火温度，通过产物的熔解曲线分析，即可判定是白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌或光滑念珠菌中的哪种；

(2)本发明中，熔解曲线分析法可以在实时荧光PCR扩增反应后直接进行，无需开管操作，也可以在普通PCR扩增后转移到实时荧光PCR仪进行分析，且熔解曲线分析属于非消耗性检测，在分析结束后，样本保持PCR后的状态，可以多次重复分析；

(3)本发明中，熔解曲线法能够在同一荧光通道中同时分析和检测多种念珠菌种，根据扩增产物的Tm值变化，可以在同一荧光通道中区分多种念珠菌种的特异靶序列；

(4)本发明的DPO引物设计特异性高，退火温度范围50-65℃，整个体系的反应温度容易调整。

附图说明

图1为不同念珠菌种的18s rRNA-ITS1-5.8s rRNA-ITS2-28s rRNA序列多重比对结果示意图；

图2为DPO引物设计示意图，其中pf是DPO上游引物，pr是DPO下游引物；

图3为念珠菌属目标序列中的保守区中的可变位点，每列序列上方有*代表比对结果一致，位点保守，无*表示比对结果不一致，位点存在突变；

图4为分别以含有白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌DNA片段的质粒为模板，检测产物的熔解曲线；

图5为实施例2中待测样本的扩增曲线；

图6为实施例2中待测样本的熔解曲线；

图7为实施例4中不同浓度质粒标准品以及空白对照的扩增曲线，其中曲线1-7分别对应的质粒拷贝数为10⁶copies、10⁵copies、10⁴copies、10³copies、102copies、10¹copies和10⁰copies，8为无靶序列的空白对照；

图8为实施例4中不同浓度质粒标准品以及空白对照的熔解曲线；

图9为实施例5中不同浓度的阳性标准质粒以及阴性对照的扩增曲线；

图10为实施例5中Ct值与靶序列浓度的线性关系图；

图11为对比例1中本发明DPO引物与普通引物分别扩增同一浓度样本的扩增曲线，其中曲线1为本发明DPO引物体系，曲线2为普通引物体系；

图12为对比例1中本发明DPO引物与普通引物分别扩增同一浓度样本的熔解曲线，其中曲线1为本发明DPO引物体系，曲线2为普通引物体系。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

材料与仪器

Roche LightCycler 480II荧光定量PCR检测仪；

大龙恒温振荡金属浴HM100-Pro；

大龙高速冷冻离心机D3204R；

Eppendorf移液器；

罗氏核酸提取试剂盒Roche High Pure PCR Template Preparation Kit；

pMD19-T Vector宝生物公司。

以下实施例中采用的材料不限于上述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，本领域技术人员应当掌握使用常规材料及仪器的相关知识。

实施例1试剂盒的组装

DPO引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示：

DPO上游引物序列(SEQ ID NO.1)：5’-ACAAGGTTTCCGTAGGTGIIIIIGCGGAAGGAT-3’；

DPO下游引物序列(SEQ ID NO.2)：5’-TCATATTACGTATCGCIIIIIICTGCGTTCTTC-3’.

阴性质控品：所述阴性质控为含有拟南芥DNA片段的质粒，所述拟南芥DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体序列如下：

阳性质控品：含有白色念珠菌DNA片段的质粒、含有热带念珠菌DNA片段的质粒、含有近平滑念珠菌DNA片段的质粒、含有克柔念珠菌DNA片段的质粒和含有光滑念珠菌DNA片段的质粒。

辅助试剂：Taq酶、dNTP、MgCl₂、DMSO和SYBR Green I染料。

将装有上述组分的离心管及说明书等装入试剂盒中。

实施例2念珠菌分种检测

采用实施例1中的试剂盒进行念珠菌分种检测，包括如下步骤：

(1)样本DNA提取：

(2)配制体系，具体体系组成见表1：

表1

组分	剂量
		TaqPolymerase	2U
dNTP	2M
		Primers	200nM
MgCl<sub>2</sub>	3mM
		Tris-HCl	15mM
KCl	100mM
		Template	1μL
DMSO	5％
		SYBR Green I Dye	1×
Total	25μL

(3)将步骤(2)体系放入实时荧光PCR仪，进行PCR扩增反应，具体条件如下所示：

(1”)50℃预热2min，1个循环；

(2”)95℃预变性10min，1个循环；

步骤(4”)的检测荧光通道为SYBR Green I，运行PCR反应程序，保存文件；

(4)结果判定：

1)试剂盒有效性的判定：

阴性质控组有效：阴性质控组在SYBR Green I通道下无典型扩增曲线或无Ct值，否则可能存在试剂污染，请排除污染源后重测；

阳性质控组有效：阳性质控组在SYBR Green I通道下均有典型扩增曲线，确认无误后通过调节阈值将阳性质控的Ct值调节至20，并以此作为待测样本的阈值；

2)检测样本的有效性判定：

若Ct值在，表明加入的DNA量正常；

3)念珠菌分种判定：

PCR循环扩增产物后，不同念珠菌种DNA序列的熔解温度不同，通过阳性质控的五种质粒进行仪器校准，本发明采用罗氏480进行检测，得到白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌对应的产物退火温度表(表2)，需要说明的是，任何满足实时荧光PCR的仪器均可，在此无需做具体限定，校准目的在于消除不同仪器带来的具体退火温度差异。

表2不同念珠菌种的退火温度Tm值对照表

菌种	Tm值	CG含量	产物长度
				白色念珠菌Candida albicans	84.6	49.10％	204bp
热带念珠菌Candida tropicalis	81.1	41.60％	194bp
				近平滑念珠菌Candida parapsilosis	82.2	47.60％	177bp
光滑念珠菌Candida glabrata	83.8	46.60％	285bp
				克柔念珠菌Pichia kudriavzevii	87.8	56.00％	214bp

由表2可知，不同念珠菌种的产物Tm值差异较大，均在1℃以上，便于区分，特异性好，灵敏度高，不限于PCR仪器的具体测量值可能稍有偏差，但念珠菌种间的Tm值是相对稳定的，通过对阳性质控的检测，可以得到适用于任何机器的Tm值对照表，阳性质控对应的熔解曲线图见图4。待测样本的扩增曲线见图5，熔解曲线见图6，比对待测样本产物的Tm值即可得知样本为哪种念珠菌。

由图5-6可知，待测样本的Tm值为84.61，为白色念珠菌感染。

需要说明的是，在本发明试剂盒各组分添加量范围内均可以实现对曲霉菌的分种检测，即，0.1-5M的dNTP、50-500nM的DPO引物对、0.8-10nM的MgCl₂、0.1pg-10ng的模板、1-15％的DMSO以及0.5-2×的SYBR Green I染料，本实施例2仅列举其中的最优添加量配比。

实施例3特异性检测分析

分别提取新生隐球菌、格特隐球菌、构巢曲霉、杂色曲霉、酿酒酵母、马尔尼菲青霉、白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的DNA，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测，结果见表4。

表4特异性检测结果

由表4可知，本发明试剂盒的特异性好，能有效区分念珠菌属和非念珠菌属，非念珠菌属无Ct值表明其不能进行有效扩增，此外，对于最接近白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的其他念珠菌种如葡萄牙念珠菌和季也蒙念珠菌，虽然能进行有效扩增，但产物退火温度差异1℃以上，可以有效区分不同念珠菌种。

实施例4灵敏度分析检测

通过熔解曲线法检测不同浓度五种念珠菌靶序列的质粒标准品的灵敏度，利用人工合成的白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的靶序列质粒标准品(上海生工合成)，稀释成10⁶copies、10⁵copies、10⁴copies、10³copies、10²copies、10¹copies、10⁰copies。将其作为模板，使用实施例1中的试剂盒和实施例2中的方法，利用罗氏480II荧光定量PCR仪器进行检测，并进行熔解曲线分析。以白色念珠菌为例，不同浓度的扩增曲线图见图7，熔解曲线见图8。

由图7的扩增曲线可知，在10⁶copies-10²copies质粒标准品存在的情况下，本发明都能给出较好的信号，在10¹copies-10⁰copies质粒标准品存在的情况下，无法检测出荧光信号，在靶序列不存在的情况下，本发明无法检测出荧光信号。图8的熔解曲线表明，在10⁶copies-10²copies质粒标准品存在的情况下，能够形成独特且一致的熔点，形成图中的单峰；在10¹copies-10⁰copies质粒标准品存在的情况下，无法形成独特一致的单峰，在靶序列不存在的情况下，无单峰。因此，采用本发明进行熔解曲线法检测念珠菌靶序列的质粒标准品的灵敏度可达10²copies。

实施例5定量分析

定量检测五种念珠菌：白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌。将本试剂盒可检测的五种念珠菌每种浓度为1ng/μl等量均匀混合，进行10倍连续梯度稀释制备成7个浓度点的标准曲线，每个浓度进行3个复孔，使用拟南芥的基因片段做为阴性对照，扩增曲线见图9，建立起Ct值与浓度之间的线性关系见图10。由图10可知，标准曲线在PCR反应的线性扩增区域形成线性方程y＝3.3795x+7.7414，R²＝0.9999,试剂盒扩增效率是97.7％，其线性范围是：1ng/μl～0.000001ng/μl。在测量样本时，上述标准曲线、阴性对照以及未知浓度的样本DNA进行荧光PCR反应，使用罗氏LightCycler 480II、ABI7500、StepOne Plus等荧光定量PCR仪时，其内置分析软件可以根据标准曲线和样本的Ct值，计算出样本中的靶基因的核酸浓度，进行定量分析。

对比例1

采用普通引物进行念珠菌种的检测鉴定，所述普通引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.9-10所示，同时采用本发明的DPO引物与配套试剂盒进行检测对比，扩增曲线见图11和熔解曲线见图12，其中1为本发明的DPO引物体系，2为普通引物体系。

普通上游引物SEQ ID NO.9：5’-GCCTGTTTGAGCGTCGTTTC-3’；

普通下游引物SEQ ID NO.10：5’-CGCCTTACCACTACCGTCTT-3.

由图11可知，针对同一浓度的目标序列DNA，本发明DPO引物对及配套试剂盒检测体系的配合可以显著提高扩增效率，明显高于普通引物的扩增效率；由图12可知，本发明的DPO引物对及配套试剂盒检测体系可以显著提高检测的特异性，而普通引物对扩增产物呈现非特性性扩增峰。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 丹娜（天津）生物科技有限公司

<120> 一种念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用

<130> 2019

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

acaaggtttc cgtaggtgnn nnngcggaag gat 33

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(22)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

tcatattacg tatcgcnnnn nnctgcgttc ttc 33

<210> 3

<211> 809

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

catgattcag ccaacataac ccgacccgta caattctatt acgcgtctcc ggcgactgac 60

tatacttgcc gttcggagtt agggttttac tccgagagaa aattgagtca gcgatgaatc 120

cgttgacaag gtgaagaaga cgcagagcat taacgcgaaa gaattagatc tagggattta 180

cgacgaagca tcttggcacg ccaagtacaa agattcagcc tacgtttacg tcggagaatt 240

accttacgat ctcacggagg gtgacctcct cgccgttttc tcacaatatg gtgaagttgt 300

tgatttgaat cttgttcgag ataaaggaac tgggagatca aaaagatttg cgtttgttgc 360

ttatgaagat cagagaagta ctaatcttgc tgttggataa taaaagtgga gcattgtggt 420

aaatacttaa agagagaaga ggaagatgaa gagacgaagc agaagaagag agaagctccg 480

tggtgtttgc agagcttttc agagaaagga gtgtactcgt ggagattctt gcaaattttc 540

tcacgatgaa aatagagctg ccaataccgg gtggggtcac gaagatcgta gaagttccaa 600

gtgagagatc aagtaagtaa ataccataat gatgtagagg ataaataggg attgttcata 660

ttgatatcca agtggtaatg ctctacattg aagaatggtt tctaagttgt agctagaatc 720

taatggaaaa tgtgatttat tgaccattag cttacacacc ggtgttttgc tctgtatatg 780

tcgatcttat tttcagtgtt cacctttac 809

<210> 4

<211> 593

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

atatcaataa gcggaggaaa agaaaccaac agggattgcc tcagtagcgg cgagtgaagc 60

ggcaaaagct caaatttgaa atctggcgtc tttggcgtcc gagttgtaat ttgaagaagg 120

tatctttggg cccggctctt gtctatgttc cttggaacag gacgtcacag agggtgagaa 180

tcccgtgcga tgagatgacc cgggtctgtg taaagttcct tcgacgagtc gagttgtttg 240

ggaatgcagc tctaagtggg tggtaaattc catctaaagc taaatattgg cgagagaccg 300

atagcgaaca agtacagtga tggaaagatg aaaagaactt tgaaaagaga gtgaaaaagt 360

acgtgaaatt gttgaaaggg aagggcttga gatcagactt ggtattttgc atgctgctct 420

ctcgggggcg gccgctgcgg tttaccgggc cagcatcggt ttggagcggc aggataatgg 480

cggaggaatg tggcacggct tctgctgtgt gttatagcct ctgacgatac tgccagccta 540

gaccgaggac tgcggttttt acctaggatg ttggcataat gatcttaagt cgc 593

<210> 5

<211> 865

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

aaaagaaacc aacagggatt gccttagtag cggcgagtga agcggcaaaa gctcaaattt 60

gaaatctggc tctttcagag tccgagttgt aatttgaaga aggtatcttt gggtctggct 120

cttgtctatg tttcttggaa cagaacgtca cagagggtga gaatcccgtg cgatgagatg 180

atccaggcct atgtaaagtt ccttcgaaga gtcgagttgt ttgggaatgc agctctaagt 240

gggtggtaaa ttccatctaa agctaaatat tggcgagaga ccgatagcga acaagtacag 300

tgatggaaag atgaaaagaa ctttgaaaag agagtgaaaa agtacgtgaa attgttgaaa 360

gggaagggct tgagatcaga cttggtattt tgtatgttac ttcttcgggg gtggcctcta 420

cagtttatcg ggccagcatc agtttgggcg gtaggagaat tgcgttggaa tgtggcacgg 480

cttcggttgt gtgttatagc cttcgtcgat actgccagcc tagactgagg actgcggttt 540

atacctagga tgttggcata atgatcttaa gtcgcccgtc ttgaaacacg gaccaaggag 600

tctaacgtct atgcgagtgt ttgggtgtaa aacccgtacg cgtaatgaaa gtgaacgtag 660

gtgggggccc gtatgggtgc accatcgacc gatcctgatg tcttcggatg gatttgagta 720

agagcatagc tgttgggacc cgaaagatgg tgaactatgc ctgaataggg tgaagccaga 780

ggaaactctg gtggaggctc gtagcggttc tgacgtgcaa atcgatcgtc gaatttgggt 840

ataggggcga aagactaatc gaccc 865

<210> 6

<211> 613

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

gcatatcaat aagcggagga aaagaaacca acagggattg ccttagtagc ggcgagtgaa 60

gcggcaaaag ctcaaatttg aaatctggca ctttcagtgt ccgagttgta atttgaagaa 120

ggtatctttg ggtctggctc ttgtctatgt ttcttggaac agaacgtcac agagggtgag 180

aatcccgtgc gatgagatgt cccagaccta tgtaaagttc cttcgaagag tcgagttgtt 240

tgggaatgca gctctaagtg ggtggtaaat tccatctaaa gctaaatatt ggcgagagac 300

cgatagcgaa caagtacagt gatggaaaga tgaaaagaac tttgaaaaga gagtgaaaaa 360

gtacgtgaaa ttgttgaaag ggaagggctt gagatcagac ttggtatttt gtatgttact 420

ctctcggggg tggcctctac agtttaccgg gccagcatca gtttgagcgg taggataagt 480

gcaaagaaat gtggcactgc ttcggtagtg tgttatagtc tttgtcgata ctgccagctt 540

agactgagga ctgcggcttc ggcctaggat gttggcataa tgatcttaag tcgcccgtct 600

tgaaacacgg acc 613

<210> 7

<211> 631

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

tttcatgcgc ttgatttttc aagccaacca tcgaaaggga atccggttaa aattccggaa 60

cttggatatg gattcttcac ggcaacgtaa ctgaatgtgg agacgtcggc gtgagccctg 120

ggaggagtta tcttttcttc ttaacagctt atcaccctgg aattggttta tccggagatg 180

gggtcttatg gctggaagag cgcggtaatt ttgccgcgtc cggtgcgctc acgacggtcc 240

ttgaaaatcc acaggaagga atagttttca tgccaagtcg tactcataac cgcagcaggt 300

ctccaaggtt aacagcctct agttgataga ataatgtaga taagggaagt cggcaaaata 360

gatccgtaac ttcgggataa ggattggctc taaggatcgg gtggtttggg ccttgcgtag 420

aagtggtggt gactggcggc gggctgcttt cgggcggact gctgttggac gtcgctatag 480

acacacttgg taggcattta tgtcgtccgg atcacgctta acgatcaact tagaactggt 540

acggacaagg ggaatctgac tgtctaatta aaacatagca ttgtgatggt cagaaagtga 600

tgttgacaca atgtgatttc tgcccagtgc t 631

<210> 8

<211> 872

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 8

gccttagtaa cggcgagtga agcggcaaaa gctcaaattt gaaatctggt acctttggtg 60

cccgagttgt aatttggaga gtaccacttt gggactgtac tttgcctatg ttccttggaa 120

caggacgtca tggagggtga gaatcccgtg tggcgaggtg tgtcagttct ttgtaaaggg 180

tgctcgaaga gtcgagttgt ttgggaatgc agctctaagt gggtggtaaa ttccatctaa 240

agctaaatac aggcgagaga ccgatagcga acaagtacag tgatggaaag atgaaaagaa 300

ctttgaaaag agagtgaaaa agtacgtgaa attgttgaaa gggaagggca tttgatcaga 360

catggtgttt tgcgccttgc ctctcgtggg gggactctcg cagctcactg ggccagcatc 420

ggttttggcg gccggaaaaa acctagggaa tgtggctctg cctcggtgta gagttatagc 480

cctggggaat acggccagcc gggaccgagg actgcgattt gtatctagga tgctggcata 540

atggttatat gccgcccgtc ttgaaacacg gaccaaggag tctaacgtct atgcgagtgt 600

ttgggtgtta aacccgtacg cgtaatgaaa gtgaacgtag gttgggcccc tggggggtgc 660

acaatcgacc gatcctgatg tcttcggatg gatttgagta agagcatagc tgttgggacc 720

cgaaagatgg tgaactatgc ctgaataggg tgaagccaga ggaaactctg gtggaggctc 780

gtagcggttc tgacgtgcaa atcgatcgtc gaatttgggt ataggggcga aagactaatc 840

gaaccatcta gtagctggtt cctgccgaag tt 872

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 9

gcctgtttga gcgtcgtttc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 10

cgccttacca ctaccgtctt 20

Claims

1.一种念珠菌分种检测的DPO引物对，其特征在于，所述DPO引物对的核苷酸序列如SEQID NO.1-2所示。

2.一种如权利要求1所述的DPO引物对在制备念珠菌分种检测的产品中的应用。

3.一种念珠菌分种检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的DPO引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂；

优选地，所述阴性质控为含有拟南芥DNA片段的质粒，所述拟南芥DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述阳性质控分别为含有白色念珠菌DNA片段的质粒、含有热带念珠菌DNA片段的质粒、含有近平滑念珠菌DNA片段的质粒、含有克柔念珠菌DNA片段的质粒和含有光滑念珠菌DNA片段的质粒；

优选地，所述白色念珠菌DNA片段、热带念珠菌DNA片段、近平滑念珠菌DNA片段、克柔念珠菌DNA片段和光滑念珠菌DNA片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

优选地，所述辅助试剂包括Taq酶、dNTP、MgCl₂、DMSO和SYBR Green I染料。

5.一种念珠菌分种检测的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的DPO引物对、权利要求3或4所述试剂盒的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述Taq酶的终浓度为0.5-5U；

优选地，步骤(1)所述dNTP的终浓度为0.1-5M；

优选地，步骤(1)所述DPO引物对的终浓度为50-500nM；

优选地，步骤(1)所述MgCl₂的终浓度为0.8-10nM；

优选地，步骤(1)所述模板的终浓度为0.1pg-10ng，优选为0.5-2ng；

优选地，步骤(1)所述DMSO的质量百分比为1-15％；

优选地，步骤(1)所述SYBR Green I染料的终浓度为0.5-2×。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述实时荧光PCR反应包括如下步骤：

(1’)90-98℃预变性，8-12min，1个循环；

(2’)90-98℃10s，55-60℃35-45s，40-50个循环；

(3’)65-97℃升温，1个循环。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1’)之前还包括预热的过程：50℃，2min，1个循环；

优选地，步骤(1)所述实时荧光PCR反应具体包括如下步骤：

(1”)50℃预热2min，1个循环；

(2”)95℃预变性10min，1个循环；

(4”)95℃5s，65℃1min；升温到97℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃；

优选地，步骤(2)所述判断的标准为：

(b)对阳性结果进一步分析，通过熔解曲线分析，比对产物与五种阳性质控的对应退火温度Tm值，Tm值相同的即判定待测样本含有对应阳性质控的念珠菌种。

10.一种如权利要求3或4所述的试剂盒用于念珠菌分种检测的用途。