CN101189336A - 使用双特异性寡核苷酸的方法及所述双特异性寡核苷酸 - Google Patents

使用双特异性寡核苷酸的方法及所述双特异性寡核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多种使用双特异性寡核苷酸的通过模板依赖性延伸反应的方法及其包含三个不同Tm部分的双特异性寡核苷酸。本发明中所证实的为该双特异性寡核苷酸的特征，其为高杂交特异性和错配容许性。

Description

使用双特异性寡核苷酸的方法及所述双特异性寡核苷酸
技术领域
本发明涉及多种使用双特异性寡核苷酸的多种方法及所述双特异性寡核苷酸。更具体而言，本发明涉及多种使用双特异性寡核苷酸的通过模板依赖性延伸反应的方法及所述双特异性寡核苷酸。
背景技术
核酸扩增是分子生物学中多种方法的关键方法，从而已提出了多种扩增方法。例如，Miller，H.I.等人(WO 89/06700)基于启动子/引物序列与目标单链DNA(″ssDNA″)杂交，然后转录该序列的多个RNA拷贝而扩增核酸序列。其它已知的核酸扩增方法包括基于转录的扩增体系(Kwoh，D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，86：1173(1989)；和GingerasT.R.等人，WO 88/10315)。
用于核酸扩增的最主要的方法已知为聚合酶链式反应(下文称为″PCR″)，其基于如下重复循环：双链DNA的变性，然后寡核苷酸引物与DNA模板退火，且通过DNA聚合酶引物延伸(Mullis等人，美国专利号4,683,195，4,683,202和4,800,159；Saiki等人，(1985)Science 230，1350-1354)。设计PCR中使用的寡核苷酸引物使其与DNA模板的互补链退火。引物通过DNA聚合酶延伸，一条引物由此产生的产物在后续反应中可以用作另一条引物的模板链。PCR扩增法导致其长度由寡核苷酸引物的5′端限制的不连续DNA片段的指数式增加。
核酸扩增，尤其是PCR扩增的成功取决于引物只与其目标(而不与非目标)序列退火的特异性，因此，使这种分子相互作用最优化很重要。引物是否可以只与其完全互补序列退火或还与具有一个或多个错配的序列退火关键取决于退火温度。通常，退火温度越高越会导致引物与其优选的配对模板之间的更特异性退火，从而依次增加只扩增目标序列的可能性。另一方面，较低的退火温度会容许模板与引物之间更多的错配。鉴于这种现象，调整退火温度可以改变模板与引物配对的特异性。例如，如果没有产物，该温度对于退火会太高。如果产生几种大小不同的产物且其中只有一条引物存在，其说明单一引物与模板的多个区域退火。在这种情况下应该提高退火温度。
对于引物退火特异性，除了退火温度，还应考虑几个“引物研究参数”，如引物长度、GC含量和PCR产物长度。满足上述全部参数的引物会导致目标DNA扩增过程中引物退火特异性的显著提高，从而解决由试验中使用的引物产生的背景和非特异性产物的问题。通常，设计较好的引物可以有助于避免非特异性退火和背景，以及在RNA-PCR中区分cDNA或基因组模板。
已开发了多种方法以提高引物退火特异性，并因此完成所需产物的扩增。例子为：递减PCR(Don等人，(1991)Touchdown PCR tocircumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic Acids Res.，19，4008)、热启动PCR(DAquila等人，(1991)Maximizing sensitivity andspecificity of PCR by pre-amplifcation heating.Nucleic Acids Res.，19，3749)、巢式PCR(Mullis和Faloona，(1987)Specific synthesis of DNA invitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.Methods Enzymol.155，335-350)和加强PCR(Ruano等人，(1989)Biphasic amplification of verydilute DNA samples via booster PCR.Nucleic Acids Res.17，540)。其它选择性方法还已经报道多种‘增强子’化合物可以提高PCR的特异性。所述增强子化合物包括提高反应的有效退火温度的化学物、DNA结合蛋白和市售试剂。然而，不存在会确保每个PCR成功的‘魔力’添加剂，在如退火温度的不同条件下试验不同的添加剂十分烦琐。虽然这些方法已有助于在一些情况中改进引物退火特异性，但是其不能从根本上解决由PCR扩增中使用的引物引起的问题，如非特异性产物和高背景。
基于PCR的技术已经被广泛使用，不仅用于目标DNA序列的扩增，而且还用于生物和医学研究领域中的科学应用或方法，如逆转录酶PCR(RT-PCR)、差异显示PCR(DD-PCR)、通过PCR的已知或未知基因的克隆、cDNA末端快速扩增(RACE)、随机引物PCR(AP-PCR)、多重PCR、SNP基因分型和基于PCR的遗传分析(McPherson和Moller，(2000)PCR.BIOS Scientific Publishers，Springer-Verlag New York BerlinHeidelberg，NY)。
如上所述，虽然已连续向各方法中引入改进的方法，但是涉及核酸扩增，特别是PCR扩增的全部这些方法和技术不能完全避免由各方法中使用的引物的非特异性所引起的限制和问题，如假阳性、较差的重复性、高背景。因此，仍需要可以产生真实的扩增结果的用于改进退火特异性的新引物和方法。
同时，DNA杂交是分子生物学中的一种基本方法，其受离子强度、碱基组成、核酸变为的片段的长度、错配的程度和变性剂的存在影响。基于DNA杂交的技术将在特定核酸序列分析中成为一种十分有用的工具，且在临床诊断、遗传学研究和法医学试验分析中明显很重要。例如，Wallace和同事们提出精细至一个碱基变化的序列差异足以能够辨认短的(例如，14-mer)低聚物，且证明了其如何可以应用在β-珠蛋白基因的定点突变的分子分析中(Wallace，B.R.，等人，(1981)The use ofsynthetic oligonucleotides as hybridization probes.Hybridization ofoligonucleotides of mixed sequence to rabbit β-globin DNA.Nucleic AcidsRes.9，879-894；以及Conner，B.J.，等人.(1983)Detection of sickle cell β-globin allele by hybridization with synthetic oligonucleotides.Proc.NatlAcad.Sci.USA 80，278-282)。
虽然寡核苷酸杂交的作用能准确地鉴定互补链，但是研究人员仍受到限制。包含寡核苷酸的杂交体的稳定性比长核苷酸的杂交体低很多。这反映于较低的解链温度。杂交体的不稳定性是在设计寡核苷酸杂交时需要考虑的最重要的因素之一。完全配对的互补与只有一个碱基错配的互补之间的稳定性差异可以十分小，在其Tms(双链解链温度)对应于小至0.5℃的差异。目的低聚物越短(在更复杂的混合物中进行互补链的鉴定)，单个碱基错配对总的双链稳定性的影响越强。然而，使用这种短的寡核苷酸的缺点在于甚至对完全互补序列其杂交较弱，，因此必须在降低严格条件下使用，从而导致杂交特异性严重降低。
已进行许多努力以提高寡核苷酸杂交的特异性。已经提出了一种化学修饰DNA的碱基以高特异性杂交的方法(Azhikina等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci，USA，90：11460-11462)以及其中在杂交后于低温下进行长时间漂洗以提高区分错配的能力的方法(Drmanac等人，(1990)DNA and Cell Biology，9：527-534)。近来，已提出了通过人为错配在DNA杂交中提高单核苷酸多态性(SNPs)的分辨率的另一种方法(Guo等人，(1997)Nature Biotechnology，15：331-5)。另外，包括美国专利号6,077,668、6,329,144、6,140,054、6,350,580、6,309,824、6,342,355和6,268,128的多个美国专利公开了用于杂交的探针及其应用。虽然已连续向各方法中引入改进的方法，但是涉及寡核苷酸杂交的全部这些方法和技术不能完全避免由寡核苷酸杂交的非特异性所引起的限制和问题。
这里仍存在人为因素，如点样和寡核苷酸在基底上的固定以及最佳杂交条件的确定的失败而影响杂交的负面数据的可能性，这种错误结果的影响更容易由高流通量的筛选法的结果引起。这种点样和杂交的固有人为因素是在基于寡核苷酸的DNA微阵列中存在的主要缺点。
此外，具有提高的速度、灵敏度和流通量的DNA序列分析技术的发展对于研究生物系统是很重要的。超过二十年以前最初开发的常规DNA测序技术(Sanger等人.(1977)Proc.Natl.Acad.ScL，74：5463-5467)对于未来的应用在流通量和成本方面受到限制。因此，已提出了几种新的技术。三种具有较大前景的方法为通过杂交测序(Brain和Smith，(1988)J.Theor.Biol.，135：303-307)；Drmanac等人，(1989)Genomics，4：114-128)；以及Southern，E.M.(1989)Patent WO/10977)、基于连接和切割的平行信号测序(Brenner等人，(2000)Proc.Natl.Acad.ScL，97：1665-1670)和焦磷酸测序(Ronaghi等人，(1996)Anal.Biochem.，242：84-89；以及(1998)Science 281：363-365)。对于全部上述技术，测序反应的成功完全取决于目标核酸的测序引物的杂交特异性。考虑到测序引物的杂交特异性，目前的方法受到进行测序反应的模板核酸长度的限制。通常，使用长度优选小于几百个碱基对的模板核酸进行测序反应，从而使测序引物的特异性杂交达到特定程度。
然而，为了更先进的研究，具有提高的速度、灵敏度和流通量的DNA测序反应不应该受到模板核酸的阻碍。鉴于此，如果测序引物与目标核酸高特异性地杂交，那么可以直接测序来自一组模板核酸的目标核酸。
整个申请中参考多个专利和出版物，且引文列于括号中。为了更充分地描述本发明和本发明所述技术领域的情况，本发明中将这些专利和出版物的内容全部引入本申请中作为参考。
发明内容
为了消除所述用作引物或探针的常规寡核苷酸以及涉及核酸杂交的多种方法的问题和缺陷，本发明人已开发了能使模板依赖性反应以更高特异性进行的双特异性寡核苷酸，且发现其对涉及寡核苷酸杂交或退火的多种方法的优异适用性。
因此，本发明的一个目的是提供一种使用双特异性寡核苷酸通过模板依赖性延伸反应来合成核酸分子的方法。
本发明的另一个目的是提供一种由DNA或核酸混合物选择性扩增目标核酸序列的方法。
本发明的又一个目的是提供一种在同一反应中使用两对或更多对引物同时扩增两个或更多个目标核苷酸序列的方法。
本发明的又一个目的是提供一种由DNA或核酸混合物测序核酸分子的方法。
本发明的又一个目的是提供一种通过模板依赖性延伸反应来检测具有遗传多样性的核酸分子的方法。
本发明的另一个目的是提供一种通过使用固定有双特异性寡核苷酸的微阵列来检测核酸样品中的目标核苷酸序列的方法。
本发明的又一个目的是提供一种用于通过模板依赖性延伸反应来合成核酸分子的双特异性寡核苷酸。
本发明的又一个目的是提供一种用于使寡核苷酸的退火特异性通过寡核苷酸的结构而被双重限定的方法。
本发明的再一个目的是提供一种用于改进寡核苷酸的退火特异性的方法。
结合附属权利要求和附图，通过下面的详细描述，本发明的其它目的和优点将变得更加显而易见。
附图说明
图1A和1B示意性地表示了本发明的双特异性(DS)寡核苷酸在模板依赖性延伸反应中的原理。图1A示出DS寡核苷酸在较高的严格条件下的高杂交特异性。图1B表示DS寡核苷酸的错配容许性。
图2示出使用本发明的DS寡核苷酸引物选择性扩增双链DNA的目标核酸的图示。
图3示出使用本发明的DS寡核苷酸引物选择性扩增mRNA的目标核酸的图示。
图4示出在寡核苷酸微阵列上使用双特异性寡核苷酸的目标核酸的选择性鉴定中的模板依赖性延伸反应的图示。
图5为示出使用常规引物对(IL-1b-5′-0和IL-1b-3′-0，泳道1；IL-19-5′-0和IL-19-3′-0，泳道3)和双特异性寡核苷酸(IL-1b-5′和IL-1b-3′，泳道2；IL-19-5′和IL-19-3′，泳道4)PCR扩增细胞因子家族基因IL-1β和IL-19的结果的琼脂糖凝胶电泳照片。M为由Forever 100-bp LadderPersonalizer(视基因公司，韩国首尔)形成的100-bp大小的标准物(marker)。
图6A为表示DEG 10基因的3′-RACE(cDNA末端快速扩增)结果的琼脂糖凝胶电泳照片，其说明双特异性寡核苷酸的PCR特异性。泳道1表示具有完全配对序列的引物，泳道2～4表示在其3′-低Tm特异性部分分别具有3、2和1个碱基错配的引物，以及泳道5～7表示在其5′-高Tm特异性部分分别具有5、3和2个碱基错配的引物。M为由Forever100-bp Ladder Personalizer生产的100-bp大小的标准物。
图6B为示出DEG 10基因的3′-RACE结果的琼脂糖凝胶电泳照片，其说明PCR中双特异性寡核苷酸的错配容许性。泳道1表示具有完全配对序列的引物，泳道2～4表示在其3′-低Tm特异性部分分别具有3、2和1个碱基错配的引物，以及泳道5～7表示在其5′-高Tm特异性部分分别具有5、3和2个碱基错配的引物。M为由Forever 100-bpLadder Personalizer生产的100-bp大小的标准物。
图7A表示用于小鼠胎盘特异性同源框家族基因Psx1和Psx2的3′-RACE的5′引物。Psx1-5′-40和Psx2-5′-40为常规引物，而Psx1-5′-41和Psx2-5′-41为根据本发明设计的引物。
图7B为示出Psx1和Psx2的3′-RACE结果的琼脂糖凝胶电泳照片。泳道1，使用双特异性寡核苷酸引物Psx1-5′-41的Psx1的3′-RACE；泳道2，使用双特异性寡核苷酸引物Psx2-5′-41的Psx2的3′-RACE；泳道3，使用常规引物Psx1-5′-40的Psx1的3′-RACE；以及泳道4，使用常规引物Psx2-5′-40的Psx2的3′-RACE。M为由Forever 100-bp LadderPersonalizer生产的100-bp大小的标准物。
图8示出使用双特异性寡核苷酸引物Psx1-5′-41(用于Psx1)和Psx2-5′-41(用于Psx2)作为测序引物由小鼠胎盘cDNA文库直接循环测序Psx1和Psx2基因的结果。
图9示出使用9对细胞因子家族基因特异性双特异性引物的多重PCR的结果。泳道1，9个细胞因子基因的多重PCR；泳道2，IL-3(200bp)的单重PCR；泳道3，IL-15(250 bp)的单重PCR；泳道4，IL-18(300bp)的单重PCR；泳道5，IL-25(350 bp)的单重PCR；泳道6，IL-2(400bp)的单重PCR；泳道7，IL-6(450 bp)的单重PCR；泳道8，IL-19(500bp)的单重PCR；泳道9，IL-1β(550 bp)的单重PCR；泳道10，IL-10(600bp)的单重PCR。M为由Forever 100-bp Ladder Personalizer生产的100-bp大小的标准物。
图10示出通过使用双特异性寡核苷酸引物PCR扩增人偏肺病毒(hMPV)的融合糖蛋白(F)基因的结果。泳道1，使用引物对hMPV5′-585和hMPV 3′-698的目标PCR；泳道2，使用引物对hMPV5′-585和hMPV3′-1007的目标PCR；泳道3，使用人β-肌动蛋白引物的目标PCR；泳道4，无模板的目标PCR；以及泳道5，无模板的目标PCR。
具体实施方式
本发明的主要目的在于(a)使用双特异性寡核苷酸的多种方法以及(b)所述双特异性寡核苷酸。本发明的双特异性寡核苷酸(下文称为“DSoligo”)使引物或探针与其目标序列以提高的特异性进行退火，从而可以显著提高核酸扩增(尤其是PCR)和杂交反应的特异性。
双特异性寡核苷酸(DS Oligo)
在本发明的一个技术方案中，提供一种用于通过模板依赖性延伸反应合成核酸分子的双特异性寡核苷酸，其由以下通式表示：
5′-Xp-Yq-Zr-3′
其中，Xp表示5′-高Tm特异性部分，该部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列；Yq表示包含至少两个通用碱基的间隔部分；Zr表示3′-低Tm特异性部分，该部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列；p、q和r表示核苷酸的数目；以及X、Y和Z为脱氧核苷酸或核苷酸；5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，且在三个部分中间隔部分具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板核酸退火的条件下形成非碱基配对的泡状结构，5′-高Tm特异性部分从而根据与模板核酸的退火特异性而与3′-低Tm特异性部分分开，因此寡核苷酸的退火特异性由5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分双重限定，从而提高了寡核苷酸的整体退火特异性。
本发明中使用的关于本发明的DS寡核苷酸(下文称为“DS oligo”)的术语“双特异性”意在描述其主要特征：其与目标序列的退火特异性受其分开的两个部分，即5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分的双重限定。通常，引物或探针的退火特异性受其整个连续序列控制。与此相反，DS oligo的退火特异性受其由间隔部分分开的两个部分(5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分)的双重限定，其中这三个部分位于一个寡核苷酸序列上。这种双重特异性使DS oligo用作呈现更高特异性的引物和探针，所以本发明是新的，对现有技术是非显而易见的。
同时，如WO 03/050303中所公开，本发明人已开发了ACP(退火控制引物)以提高退火特异性，本发明中引入其技术内容作为参考。本发明的DS oligo与ACP的显著区别在于如下：(i)DS oligo具有两个与目标序列杂交的特异性部分，而ACP具有一个特异性部分；(ii)DS oligo中的三个部分根据Tm而被明显区分开，而ACP中的部分没有；(iii)只有5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分发生退火时，DS引物才延伸以合成与模板互补的核酸分子，而ACP即使在3′-端部分发生退火时也延伸；以及(iv)因此DS oligo的退火或杂交特异性受两个分开的部分，即5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分的双重限定，而ACP的退火和杂交特异性只受3′-端部分控制。因此，可以理解，DS oligo与目标序列的退火或杂交特异性比ACP的退火和杂交特异性更高，说明DS oligo是新的，对ACP是非显而易见的。
DS oligo的主要特征为在一个寡核苷酸分子中含有三个具有明显特征的不同部分：5′-高Tm特异性部分、3′-低Tm特异性部分和间隔部分。
DS oligo适用于涉及模板依赖性延伸反应的多种方法和分析。本发明中使用的术语“模板依赖性延伸反应”指通过向其末端掺入连续核苷酸以延伸与目标序列杂交的寡核苷酸分子的反应，其中延伸的序列受互补的模板序列限定。
图1A中示出了控制DS oligo杂交(退火)特异性的原理的图示。参考图1A，将更详细地描述DS oligo。
只有DS oligo的5′-高Tm特异性部分与模板退火时，其不能用作模板依赖性延伸的引发位点，从而不发生延伸。
虽然DS oligo的5′-高Tm特异性部分与非目标序列退火，但是具有较短序列的3′-低Tm特异性部分不可能与非目标序列退火。其原因在于5′-高Tm特异性部分与3′-低Tm特异性部分在退火事件中由间隔部分分开。换句话说，3′-低Tm特异性部分以相对独立于5′-高Tm特异性部分的方式卷入退火事件，并且3′-低Tm特异性部分的退火受5′-高Tm特异性部分的退火的影响较小。与此相关，3′-低Tm特异性部分与非目标序列的退火的可能性变得更低。
在只有3′-低Tm特异性部分具有与非目标位点互补的序列时，在特定较高的严格条件下，例如5′-高Tm特异性部分退火的严格条件下也不会发生退火。根据优选的实施方式，有利于使用DS oligo在退火温度比3′-低Tm特异性部分的Tm高的严格条件下进行模板依赖性延伸反应。
5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分具有与模板基本上互补的序列时，DS oligo可以与模板退火，因此成功地进行延伸。
不希望受到理论的束缚，应该相信，间隔部分使3′-低Tm特异性部分对退火条件(例如，温度和序列互补性)更敏感。与此相关，3′-低Tm特异性部分与非目标序列之间非特异性杂交的概率在特定退火(或严格)条件下变得更低。3′-低Tm特异性部分以及5′-高Tm特异性部分与其目标序列退火时，3′-低Tm特异性部分的3′端更易产生DNA聚合酶可以延伸的位点。
本发明中使用的术语“寡核苷酸”指能够与无论是天然存在的还是合成制备的目标核苷酸序列特异性杂交的天然的或修饰的单体或连接的线性低聚物，其包括脱氧核苷酸、核苷酸等。寡核苷酸优选为在杂交中效率最大化的单链。寡核苷酸优选为寡脱氧核苷酸。本发明的寡核苷酸可以包括天然存在的dNMP(例如，dAMP、dGM、dCMP和dTMP)、核苷酸类似物或核苷酸衍生物。寡核苷酸还可以包括核苷酸。例如，本发明的寡核苷酸可以包括：如肽核酸(PNA)(M.Egholm等人，Nature，365：566-568(1993))、硫代磷酸酯DNA、二硫代磷酸酯DNA、氨基磷酸酯DNA、酰胺连接的DNA、MMI-连接的DNA、2′-O-甲基RNA、α-DNA和甲基磷酸酯DNA的具有骨架修饰的核苷酸；如2′-O-甲基RNA、2′-氟RNA、2′-氨基RNA、2′-O-烷基DNA、2′-O-烯丙基DNA、2-O-炔基DNA、己糖DNA、吡喃基(pyranosyl)RNA和失水己糖醇DNA的具有糖修饰的核苷酸；以及具有如C-5取代的嘧啶(取代基包括氟-、溴-、氯-、碘-、甲基-、乙基-、乙烯基-、甲酰基-、乙炔基-、丙炔基-、炔基-、噻唑基-、咪唑基-、吡啶基-)、含有C-7取代基(取代基包括氟-、溴-、氯-、碘-、甲基-、乙基-、乙烯基-、甲酰基-、炔基-、链烯基-、噻唑基-、咪唑基-、吡啶基-)的7-脱氮嘌呤、肌苷和二氨基嘌呤的碱基修饰的核苷酸。
本发明中使用的术语“引物”指寡核苷酸，其能够在置于其中引起与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的合成的条件下时，即在核苷酸和如DNA聚合酶的用于聚合的试剂的存在下，在合适的温度和pH下能用作合成的起始点。引物优选为在扩增中效率最大化的单链。引物优选为寡脱氧核苷酸。本发明的引物可以包含天然存在的dNMP(例如，dAMP、dGM、dCMP和dTMP)、修饰的核苷酸或非天然核苷酸。引物还可以包括核苷酸。引物必须足够长以在用于聚合的试剂的存在下启始延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于包括温度、应用和引物来源的多种因素。本发明中使用的术语“退火”或“启始”指寡脱氧核苷酸或核酸分子与模板核酸的同位，而所述同位使聚合酶将核苷酸聚合进与模板核酸或其一部分互补的核酸分子中。本发明中使用的术语“杂交”指由互补的单链核酸形成双链核酸。在此没有刻意区别“退火”与“杂交”，且其可以互换地使用。
本发明中使用的术语“探针”指包含与目标核酸序列基本互补的一个部分或多个部分的单链核酸分子。
本发明中使用的与本发明的DS oligo相关的术语“部分”指由间隔部分分开的核苷酸序列。术语“5′-高Tm特异性部分”或“3′-低Tm特异性部分”指分别在本发明的DS oligo的5′-端或3′-端的核苷酸序列，其通过间隔部分分开。与DS oligo相关的术语“5′-高Tm特异性部分”意在指在三个部分中具有最高Tm且具有与模板核酸的一个位点基本互补的杂交核苷酸序列的部分。与DS oligo相关的术语“3′-低Tm特异性部分”指具有比5′-高Tm特异性部分低而比间隔部分高的Tm且具有与模板核酸的一个位点基本互补的杂交核苷酸序列的部分。
本发明中使用的术语“Tm”指一半核酸双链分子变为单链的解链温度。与DS oligo中的部分相关的术语“高Tm”和“低Tm”意在描述相对Tm值而不是绝对Tm值。换句话说，只需要5′-高Tm特异性部分的Tm相对高于3′-低Tm特异性部分的Tm。
设计5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分，以使其具有与模板核酸的一个位点基本上互补以与其杂交的杂交核苷酸序列。本发明中使用的与DS oligo相关的术语“基本上互补”指充分地互补以在设计的退火条件或严格条件下选择性地与模板核酸序列杂交，退火的寡核苷酸从而可以通过聚合酶延伸以形成模板的互补拷贝。因此，该术语与“完全互补”或其相关的术语具有不同的含义。应该理解，达到DS oligo可以用作引物或探针的程度，DS oligo的5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板可以具有一个或多个错配。最优选地，DS oligo的5′-高Tm特异性部分和/或3′-低Tm特异性部分具有与模板的一个位点完全互补的核苷酸序列，即没有错配。
DS oligo为成功地行使作用，重要的是，5′-高Tm特异性部分的Tm比3′-低Tm特异性部分的Tm高。优选的是，5′-高Tm特异性部分的Tm在40℃～80℃、更优选40℃～75℃、仍更优选50℃～68℃、最优选50℃～65℃的范围内。优选的是，3′-低Tm特异性部分的Tm在10℃～40℃、更优选1 5℃～40℃、最优选20℃～35℃的范围内。优选地，5′-高Tm特异性部分的Tm比3′-低Tm特异性部分的Tm高至少5℃、更优选至少10℃、仍更优选至少15℃、最优选至少20℃。有利地，5′-高Tm特异性部分的Tm比3′-低Tm特异性部分的Tm高5～70℃、优选10～70℃、更优选10～60℃、仍更优选10～50℃、仍更优选10～40℃、且最优选20～40℃。
根据优选的实施方式，5′-高Tm特异性部分比3′-低Tm特异性部分长。5′-高Tm特异性部分的长度优选为15～40个核苷酸残基，更优选为15～30个核苷酸残基，且最优选为20～25个核苷酸残基。3′-低Tm特异性部分的长度优选为3～15个核苷酸残基，更优选为5～15个核苷酸残基，且最优选为6～12个核苷酸残基。
包含至少两个通用碱基的间隔部分对DS oligo的优点和特征具有部分作用。本发明中使用的术语“通用碱基”指能够与其之间具有较少差别的各天然DNA/RNA碱基形成碱基对的碱基。
已广为已知，简并引物的一些多义位点的核苷酸已被如脱氧肌苷(Ohtsuka，E等人，(1985)J.Biol.Chem.260，2605-2608；和Sakanari，J.A等人，(1989)Proc.Natl Acad.Sci 86，4863-4867)、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯(Nichols，R等人，(1994)Nature 369，492-493)和5-硝基吲哚(Loakes，D等人，(1994)Nucleic Acids Res.22，4039-4043)代替，以解决与简并引物相关的设计问题，因为这种通用碱基能够与全部四种常规碱基非特异性的配对。然而，没有任何报道：这些通用碱基在寡核苷酸分子中形成在退火(杂交)或扩增过程中产生泡状结构的部分，然后将两个相对的临近序列分开，从而由于通过两个分开的特异性(退火)部分的双特异性而导致引物或探针与目标序列的退火特异性升高。
根据优选的实施方式，间隔部分中的通用碱基选自包括脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2′-脱氧肌苷，2-氮-2′-脱氧肌苷、2′-OMe肌苷、2′-F肌苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2′-OMe 3-硝基吡咯、2′-F 3-硝基吡咯、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吲哚、5-硝基吲哚、2′-OMe 5-硝基吲哚、2′-F 5-硝基吲哚、脱氧A-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2′-F水粉蕈素、2′-F 4-硝基苯并咪唑、PNA-5-硝基吲哚(introindole)、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、吗啉代-5-硝基吲哚、吗啉代-水粉蕈素、吗啉代-肌苷、吗啉代-4-硝基苯并咪唑、吗啉代-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2′-0-甲氧基乙基肌苷、2′0-甲氧基乙基水粉蕈素、2′-0-甲氧基乙基5-硝基吲哚、2′-0-甲氧基乙基4-硝基苯并咪唑、2′-0-甲氧基乙基3-硝基吡咯及其组合的组。通用碱基或非互换型碱基类似物更优选为脱氧肌苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚，最优选为脱氧肌苷。
所述通用碱基可以以连续的方式或以与如dNMPs的其它核苷酸间隔的方式包含在间隔部分中。优选的是，间隔部分包含具有优选为脱氧肌苷的通用碱基的连续核苷酸。
关键的是，DS oligo中的间隔部分在三个部分中具有最低的Tm，以在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板核酸退火的条件下形成非碱基配对泡状结构，使得5′-高Tm特异性部分与3′-低Tm特异性部分根据与模板核酸的退火特异性而分离，从而使寡核苷酸的退火特异性受5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分的双重限定，寡核苷酸的整体退火特异性因此而显著提高。间隔部分的Tm优选在3℃～15℃、更优选4℃～15℃、最优选5℃～10℃的范围内。
根据优选的实施方式，5′-高Tm特异性部分与3′-低Tm特异性部分之间的间隔部分包含至少3个通用碱基、更优选至少4个通用碱基、最优选至少5个通用碱基。根据优选的实施方式，间隔部分包含2～10个通用碱基、更优选3～10个通用碱基、仍更优选4～8个通用碱基、最优选5～7个通用碱基。
需要具有较长序列的引物或探针时，DS oligo的优点最突出。例如，根据常规技术，具有长于35 bp的核苷酸序列的引物作为杂交序列易产生非特异性扩增子。相反，因为其包含两个根据与模板的分子间相互作用(即，退火)而彼此分开的杂交序列(即，5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分)，所以DS oligo即使具有较长序列也可以产生特异性扩增子。例如，DS oligo可以包含35～45bp的与目标序列互补的杂交序列。与此相关，应该理解，本发明可以设计更长序列的引物，而这在常规引物设计策略中是不可行。
根据优选的实施方式，5′-高Tm特异性部分的长度为15～25个核苷酸，间隔部分的长度为3～15个核苷酸，且3′-低Tm特异性部分的长度为3～15个核苷酸。
更优选地，5′-高Tm特异性部分的长度为15～25个核苷酸，间隔部分的长度为3～10个核苷酸，且3′-低Tm特异性部分的长度为5～15个核苷酸。更优选地，5′-高Tm特异性部分的长度为15～25个核苷酸，间隔部分的长度为5～7个核苷酸，且3′-低Tm特异性部分的长度为6～10个核苷酸。根据实施例中所述的示例性和说明性DS oligo，5′-高Tm特异性部分的长度为约20个核苷酸，间隔部分的长度为约5个核苷酸，且3′-低Tm特异性部分的长度为约8～10个核苷酸。
在优选的实施方式中，DS oligo由下面的通式表示：5′-Xp-(dI)q-Zr-3′(Xp和Zr的定义和特征与前述相同，dI表示脱氧肌苷，(d1)q表示包含具有通用碱基的连续核苷酸的间隔部分，且q为5～7的整数)。
有趣的是，本发明的DS oligo在容许与其目标序列的错配的严格条件下还具有错配容许性。
图1B中示出了控制DS oligo错配容许性的原理的图示。在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板退火的条件下，可以容许在5′-高Tm特异性部分中具有一个或多个、优选一至三个碱基错配。在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板退火的条件下，可以容许在3′-低Tm特异性部分中具有一个或多个、优选一至两个碱基错配。此外，在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板退火的条件下，可以容许在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分中具有一个或多个、优选一至五个碱基错配。
为使DS oligo具有错配容许性，退火条件，尤其是退火温度是重要的。在如下条件下发生退火：当5′-高Tm特异性部分和/或3′-低Tm特异性部分与目标位点具有一个或多个、但是有限制的错配碱基时，不会只有3′-低Tm特异性部分退火，而是全部部分发生退火。需要具有错配容许性的DS oligo以扩增或检测具有遗传多样性的核苷酸序列。具有错配容许性的DS oligo可以与呈现遗传多样性的目标序列退火，并成功扩增和检测目的核苷酸序列。换句话说，最初开发的用于显著提高退火和杂交特异性的DS oligo还可以用于在适当调整退火或严格条件时需要错配容许性的方法中。
在本发明的另一个技术方案中，提供一种用于使寡核苷酸的退火特异性能够通过寡核苷酸的结构而被双重限定的方法，其包括如下步骤：(a)选择目标核酸序列；(b)设计寡核苷酸序列，其包含(i)与目标核酸基本互补的杂交序列和(ii)包含至少两个通用碱基的间隔部分，使间隔部分插入杂交序列以在该寡核苷酸中形成三个部分；以及(c)限定间隔部分在寡核苷酸中的位置，以使间隔部分5′-方向的部分具有比间隔部分3′-方向的部分更高的Tm，并使间隔部分在三个部分中具有最低的Tm，从而提供一种具有三个彼此不同Tm值的区分部分的寡核苷酸，其中，(i)寡核苷酸的5′-高Tm特异性部分具有与目标核酸基本互补的杂交核苷酸序列；(ii)寡核苷酸的3′-低Tm特异性部分具有与目标核酸基本互补的杂交核苷酸序列；以及(iii)5′-高Tm特异性部分与3′-低Tm特异性部分之间的寡核苷酸的间隔部分包含至少两个通用碱基；且5′-高Tm特异性部分的Tm比3′-低Tm特异性部分的Tm高，而间隔部分在三个部分中具有最低的Tm，因此，寡核苷酸与目标核酸的退火特异性受5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分的双重限定。
本方法目的在于提供一种新方法以显著提高将与其目标序列杂交的寡核苷酸的退火特异性。本方法还可以表述为用于提高寡核苷酸的退火特异性的方法。而且，本发明表述为使用包含至少两个通用碱基的间隔部分用以提高与目标序列杂交的寡核苷酸的退火特异性的方法。
实施本发明以制备上文所述的DS oligo。因此，为避免不需要的冗长，其之间的共有描述不再重复，但是其好像被重复似的包含在所述方法的说明中。
多数用于设计引物或探针的常规方法仅使用尽可能可与其目标序列杂交的序列。而且，为了提高寡核苷酸的退火特异性，已经常规地试图调整如温度和离子浓度的扩增或杂交条件。
相反，本方法提供了一种用于通过向寡核苷酸序列本身中引入新的特征来提高退火特异性的新策略。本发明中使用的与能够使寡核苷酸的退火特异性被双重限定相关的术语“通过寡核苷酸的结构”指十分有助于提高寡核苷酸的退火特异性的寡核苷酸的结构，其通过向寡核苷酸提供新的特征以使其根据退火特异性而被双重限定。
在本方法中关键是设计包含(i)与目标核酸基本互补的杂交序列和(ii)包含至少两个通用碱基的间隔部分的寡核苷酸序列。在该步骤中，寡核苷酸的结构轮廓呈现为：在寡核苷酸中表现为5′-端部分/间隔部分/3′-端部分。5′-端部分和3′-端部分携带与目标核酸基本互补的杂交序列且其通过间隔部分分开。
本发明中最关键的步骤为确定间隔部分在寡核苷酸中的位置，以使间隔部分5′-方向的部分具有比间隔部分3′-方向的部分更高的Tm，并使间隔部分在三个部分中具有最低的Tm，从而提供一种具有三个彼此不同Tm值的区分部分的寡核苷酸。
通过本方法引入寡核苷酸的新结构特征为：(i)寡核苷酸序列中的三个区分部分(5′-高Tm特异性部分、间隔部分和3′-低Tm特异性部分)；(ii)三个部分彼此不同的Tm值；(iii)5′-高Tm特异性部分与3′-低Tm特异性部分之间包含至少两个通用碱基的间隔部分；(iv)在退火步骤中涉及与目标的分子间相互作用的两个部分，其根据退火事件通过间隔部分分开；(v)按5′-高Tm特异性部分、3′-低Tm特异性部分和间隔部分的顺序的Tm值。这种结构特征确保最终由本发明提供的寡核苷酸的退火特异性受5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分的双重限定，从而使寡核苷酸与其目标序列的退火特异性显著提高。
根据本发明的方法设计和制备的寡核苷酸比没有所述三个部分的寡核苷酸表现出更高的退火特异性。
将描述DS oligo的特征和优点如下：
(a)DS oligo的间隔部分包含在DS oligo中产生最低Tm区域的至少两个通用碱基，使其在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板核酸退火的条件下，形成非碱基配对的泡状结构。这种非碱基配对的泡状结构能使5′-高Tm特异性部分与3′-低Tm特异性部分根据与模板核酸的退火特异性而分开；
(b)5′-高Tm特异性部分的Tm比3′-低Tm特异性部分的Tm高，且间隔部分呈现最低的Tm，其使得可以确定不会只发生3′-低Tm特异性部分退火的严格条件；
(c)因此，DS oligo的整体退火特异性受5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分的双重限定；以及
(d)结果，DS oligo的整体退火特异性显著提高。
应该理解，本发明的DS oligo在如下多种方法中十分有用：(i)基于引物的核酸扩增方法，如Miller，H.I(WO 89/06700)和Davey，C等人(EP 329,822)的方法、连接酶链式反应(LCR，Wu，D.Y等人，Genomics 4：560(1989))、聚合酶连接酶链式反应(Barany，PCR Methods and Applic，1：5-16(1991))、Gap-LCR(WO 90/01069)、修复链反应(EP 439,182)、3SR(Kwoh等人，PNAS，USA，86：1173(1989))和NASBA(U.S.Pat.No.5,130,238)；(ii)基于引物延伸的技术，如循环测序法(Kretz等人，(1994)Cycle sequencing.PCR Methods Appl.3：S107-S112)和焦磷酸测序法(Ronaghi等人，(1996)Anal.Biochem.，242：84-89；和(1998)Science281：363-365)；以及(iii)基于杂交的技术，如使用核苷酸微阵列检测目标核苷酸序列。
本发明的DS oligo可以应用于多种核酸扩增、测序和基于杂交的技术。证明DS oligo作用的代表性例子如下：
I.合成核酸分子的应用
在本发明的另一个技术方案中，提供一种使用双特异性寡核苷酸通过基板依赖性延伸反应合成核酸分子的方法，其包括如下步骤：
(a)使双特异性寡核苷酸与模板核酸分子退火，其中，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm，间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板核酸退火的条件下形成非碱基配对的泡状结构，其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行退火；以及
(b)延伸所述双特异性寡核苷酸以合成与模板核酸互补的核酸分子。
因为本发明的合成方法使用本发明的DS oligo，省略其之间的共有描述，以避免本说明书的复杂性而导致不必要的重复。
使用本发明的DS oligo的本应用可以提供用于通过涉及退火和延伸步骤的模板依赖性延伸反应选择性合成与目标序列互补的核酸序列的改进方法。尤其是，通过重复其中退火和延伸步骤后接着变性步骤的模板依赖性延伸反应的方法，可以完成与目标序列互补的核酸序列的合成。
本发明的方法可以用于合成与任何模板核酸分子互补的核酸分子。该分子可以是DNA或RNA。该分子可以是双链或单链形式。在作为原材料的核酸为双链时，优选将双链变成单链或部分单链形式。已知分离链的方法包括但不限于加热、碱、甲酰胺、尿素和glycoxal处理，酶方法(例如，解旋酶作用)和结合蛋白。例如，可以通过在范围为80℃～105℃的温度下加热而完成链分离。Joseph Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)提供了用于完成所述处理的通用方法。
使用mRNA作为原材料时，在进行退火步骤之前需要反转录步骤，其具体内容参见Joseph Sambrook，等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；以及Noonan，K.F等人，Nucleic Acids Res.16：10366(1988))。使用可与mRNA的poly A尾巴杂交的寡核苷酸dT引物进行反转录。该寡核苷酸dT引物包含dTMP，只要该dT引物可以用作引物，其一个或多个可以用dNMP替换。可以用具有RNase H活性的逆转录酶进行反转录。如果使用具有RNase H活性的酶，通过仔细选择反应条件可以省去单独的RNase H消化步骤。
本发明不需要模板核酸分子具有任何特殊序列和长度。具体而言，该分子包括任何天然存在的原核、真核(例如，原生生物和寄生虫，真菌，酵母，高等植物，低等和高等动物，包括哺乳动物和人)、病毒(例如，疱疹病毒、HIV、流感病毒、EB病毒、肝炎病毒、脊髓灰质盐病毒等)或类病毒核酸。该核酸分子还可以是任何已经或者可以化学合成的核酸分子。因此，该核酸序列可以或不会在自然界发现。
用于本发明的DS oligo与模板的一个位点杂交或退火而形成双链结构。Joseph Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)以及Haymes，B.D等人，Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，D.C.(1985)中描述了适于形成这种双链结构的核酸退火的条件。DS oligo的5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分的序列不需要呈现出精确的互补性，其只需要在序列上基本互补以能够形成稳定的双链结构。因此，与完全互补的偏差是允许的，只要这种偏差不足以阻止形成双链结构的杂交。DS oligo与模板核酸的一个位点的退火是其使用聚合酶的模板依赖性聚合的先决条件。影响DSoligo与其互补核酸的碱基配对的因素(参考Joseph Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；以及Haymes，B.D等人，NucleicAcid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，华盛顿市(1985))随后影响启动效率。DS oligo的核苷酸组成会影响最佳的退火温度，因此可以影响其启动效率。
DS oligo的5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分在退火步骤中起到用作杂交部分或特异性决定位点(即，双特异性决定位点)的作用，而间隔部分不用作杂交位点且不和模板相互作用而碱基配对。
多种DNA聚合酶可以用于本方法的延伸步骤，其包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I″Klenow″片段、热稳定的DNA聚合酶和噬菌体T7DNA聚合酶。聚合酶优选为可以从多种细菌种，包括Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)、Thermus flliformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis和Pyrococcus furiosus(Pfu)中获得的热稳定的DNA聚合酶。在进行扩增反应时，优选在反应容器中提供过量的用于这种反应的成分。所指的延伸反应的成分的过量是指各成分的量使得完成所述延伸的能力基本不受所述成分的浓度的限制。需要向反应混合物中提供充足量的如Mg2+的辅因子以及dATP、dCTP、dGTP和dTTP，以达到所需的延伸程度。
本方法中的退火或杂交在DS oligo与模板核酸特异性结合的严格条件下进行。用于退火的严格条件将是序列依赖性的且根据环境参数而改变。在本方法中，一般在较高的严格条件下进行退火步骤。然而，如果将本方法应用于需要错配容许性的方法中，优选的是，尽管存在一个或多个但有限的碱基对错配，但是在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板退火的条件下进行退火步骤。这种错配容许性在具有遗传多样性的基因的扩增和检测中十分有用。严格条件可以由本领域中已知的标准来确定。
有利的是，在比3′-低Tm特异性部分的Tm高的退火温度下进行退火步骤，从而确保不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火。优选地，退火温度比3′-低Tm特异性部分的Tm高至少5℃、更优选至少10℃、仍更优选至少15℃、且最优选至少20℃。
在优选的实施方式中，退火温度在约40℃～75℃、更优选45℃～72℃、仍更优选50℃～68℃、且最优选55℃～65℃的范围内。本方法中适用的退火温度可以通过独立地考虑5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分的Tm而确定。换句话说，不通过5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分的总长度和核苷酸组成，而是通过5′-高Tm特异性部分和/或3′-低Tm特异性部分其单个的长度和核苷酸组成来确定本方法中的退火温度。通常，通过只考虑5′-高Tm特异性部分的Tm而确定的退火温度会比3′-低Tm特异性部分的Tm高，且变成最佳温度。
如果在退火步骤中需要错配容许性，优选调整退火温度以使其变得比上述的更低。
本方法可以与许多其它本领域中已知的方法结合以实现特定目的。例如，在延伸步骤后可以接着合成产物的分离(或纯化)。其可以通过凝胶电泳、柱层析、亲和层析或杂交实现。另外，本发明的合成产物可以插入用于克隆的合适载体中。此外，本发明的合成产物可以在合适的宿主表达载体中表达。
II.扩增目标核酸序列的应用
在本发明的又一个技术方案中，提供一种由DNA或核酸混合物选择性扩增目标核酸序列的方法，其包括使用一对双特异性寡核苷酸作为引物通过至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性来扩增目标核酸；其中，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与目标核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与目标核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与目标核酸退火的条件下形成非碱基配对的泡状结构；其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行扩增反应中的退火。
因为本发明的扩增方法使用本发明的DS oligo，省略其之间的共有描述，以避免本说明书的复杂性而导致不必要的重复。此外，因为本发明的方法涉及退火和延伸步骤，省略对这两个步骤的描述，以避免本说明书的复杂性而导致不必要的重复。例如，本方法与前述用于合成核酸分子的方法之间使用的DS oligo的组成和结构以及用于退火和延伸的条件是相同的。
使用本发明的DS oligo的本应用可以提供一种通过进行核酸扩增、优选PCR(聚合酶链式反应)来由核酸或核酸混合物(DNA或mRNA)选择性扩增目标核酸序列的改进方法。
图2示出了使用如上所述DS oligo来选择性扩增双链DNA的目标核酸的图示。如图2中所示，一对DS oligo与变性的ds DNA模板退火。5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分在退火步骤中起到用作杂交部分或特异性决定位点(即，双特异性决定位点)的作用，而间隔部分不用作杂交位点且不和模板相互作用而碱基配对。此时，间隔部分在DS oligo中形成泡状结构，以使两个端部，即5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分可以在空间上被分开，以双重限定DS oligo的整体特异性。后续反应的具体内容与本文前述本领域中已知的常规基于引物的核酸扩增的具有内容相似。
可以根据本领域中已知的各种基于引物的核酸扩增进行本发明，以扩增核酸序列。优选地，根据美国专利号4,683,195、4,683,202，和4,800,159中所公开的PCR法、更优选热启动PCR法进行本方法。
图3示出了使用DS oligo来选择性扩增mRNA的目标核酸的图示。在第一步骤中，使用可与mRNA的poly A尾巴杂交的oligo dT引物和逆转录酶，将从多种生物样品中获得的mRNA反转录。反转录的具体内容参考Joseph Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；以及Noonan，K.F.等人，Nucleic Acids Res.16：10366(1988))。后续反应的描述与本文前述本领域中已知的常规基于引物的核酸扩增的描述相似。
III.多重DNA扩增的应用
在本发明的另一个技术方案中，提供一种在同一反应中使用两对或更多对引物同时扩增两个或更多个目标核苷酸序列的方法，其包括使用两对或更多对双特异性寡核苷酸作为引物通过进行至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性来扩增目标核苷酸序列，其特征在于，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与目标核苷酸序列的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与目标核苷酸序列的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与目标核苷酸序列退火的条件下，形成非碱基配对的泡状结构，其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行扩增反应中的退火。
使用本发明的DS oligo的本申请还可以提供一种在同一反应中使用多对引物来扩增多个目标序列的改进方法。通常，因为需要最佳PCR反应以没有任何非特异性副产物地恰好扩增一特异性位点，所以很难确定用以平行扩增超过10个目标序列的多重PCR的条件。因为退火需要在足够高的温度下发生以在反应中发生完全地DNA-DNA配对，所以本发明的DS oligo由于其改进扩增特异性的功能而在多重DNA扩增的最优化中是理想的。本发明中使用的“多重PCR”指单一聚合酶链式反应(PCR)混合物中的多个目标DNA的同时扩增。
在本发明的特定实施方式中，所述多重方法包括：使用DS oligo的引物对进行包括至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性的扩增反应，其特征在于引物为双特异性寡核苷酸，其具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与目标核苷酸序列的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与目标核苷酸序列的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm；间隔部分在三个部分中具有最低的Tm，间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与目标核苷酸序列退火的条件下形成非碱基配对的泡状结构；其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行扩增反应中的退火。
因为使用本发明的DS oligo的本应用根据前述用于扩增核酸序列的本方法进行，所以除了使用多个目标核苷酸序列和引物对之外，省略其之间的共有描述，以避免本说明书的复杂性而导致不必要的重复。例如，本方法与前述用于扩增核酸序列的方法之间使用的DS oligo的组成和结构以及用于扩增的条件是相同的。
根据优选的实施方式，退火温度在约40℃～70℃、更优选45℃～68℃、仍更优选50℃～65℃、且最优选55℃～65℃的范围内。
在优选的实施方式中，来自各目标核苷酸序列的扩增产物其大小不同，以用于后续分析。根据优选的实施方式，多重目标核苷酸序列的扩增产物可以通过大小分开来分析。使用本领域中的多种已知方法，如通过聚丙烯酰胺凝胶板或琼脂糖凝胶板的电泳和核苷酸测序进行大小分开比较。核苷酸测序可以通过来自各制造商的自动测序仪迅速地进行。
如下面的实施例中所举例说明的，本发明的多重性可以使最终扩增的产物避免背景问题以及由本领域已知的常规多重方法引起的非特异性。
多重扩增的优点在于多种疾病或特定核苷酸序列变换(例如，单核苷酸多态性或点突变)可以在同一反应中分析。可以同时进行分析的数目没有限制，然而，其上限大概为约20个，且其可以取决于分辨率和可使用的用以分辨扩增产物的方法所需的大小差别。
本发明的方法可以应用于遗传和传染病诊断、性别鉴定、遗传连锁分析以及法医学研究。
IV.DNA测序的应用
利用DS oligo的模板依赖性延伸原理，改进的特异性使DS oligo作为液相测序的引物(尤其是循环测序)或作为固相测序(尤其是寡核苷酸芯片测序)的探针而被用于直接测序中。
在本发明另一个技术方案中，提供一种使用双特异性寡核苷酸由DNA或核酸的混合物测序目标核酸分子的方法，其包括如下步骤：
(a)使用所述双特异性寡核苷酸作为测序引物，通过进行至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性来合成与所测序的目标核酸分子互补的核酸分子，其中，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与目标核酸分子的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与目标核酸分子的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与目标核酸分子退火的条件下形成非碱基配对的泡状结构；其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行合成反应中的退火；以及
(b)测定合成的互补核酸分子的核苷酸序列。
通常，DNA测序已通过如Maxam-Gilbert测序法、Sanger测序法、焦磷酸测序法和外切核酸酶消化测序法的多种方法进行。本测序法意在改进焦磷酸测序法以及热循环测序法。
本发明可以根据Sanger双脱氧法的变形形式进行。本发明的热循环测序可以在PCR扩增的核酸模板上进行。另外，根据本发明，热循环测序将在测序之前没有PCR扩增的核酸模板上进行。
简而言之，Sanger测序法基于DNA聚合酶会将2′，3′-双脱氧核苷酸掺入核酸链中而导致链终止的原理(Sanger等人，(1977)PNAS.USA74：5463)。由Sanger开发的方法指双脱氧链终止法。在该方法中的最常规一种中，所需序列的DNA片段被克隆进如M13的单链DNA噬菌体中。这些噬菌体DNA可以用作通过DNA聚合酶I的Klenow片段的互补链的启动合成的模板。引物为与M13载体中靠近克隆插入片段的3′端的区域特异杂交的合成寡核苷酸。在四个测序反应中的每个中，启动合成在充足的四种可能的脱氧核苷酸其中一种的双脱氧类似物的存在下进行，以使生长链通过掺入这些死端式核苷酸而随机终止。调整双脱氧与脱氧形式的相对浓度，以使对应于可以通过凝胶电泳分辨的所有可能链长度的终止事件蔓延。掺入生长链的标记用于显影各电泳轨迹中的DNA图形的放射自显影图形。通过检测四泳道中条带的图形而确定克隆核酸模板中的脱氧核苷酸的序列。
作为Sanger法的变形，热循环测序法一般涉及到包含核酸测序引物、脱氧核苷三磷酸、一种多种双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)、合适的缓冲溶液、热稳定的DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和待测序的核酸模板的溶液的使用。热循环测序法的具体内容可以参考美国专利号5,432,065、5,723,298、5,756,285、5,817,797和5,831,065，其全部技术内容引入本发明中作为参考。该方法的步骤通常在与普通PCR相似的热循环条件下进行。
一旦在核酸模板上进行测序反应，分子序列的测定需要鉴定反应产物。本技术领域中已知多种检测方法。这些方法通常涉及如Ausubel，F.M等人，Current Protocols in Molecular Biology，(1993)John Wiley &Sons，Inc.，纽约，N.Y中所述的包括放射性核苷酸、荧光、红外线和化学发光标记的标记的检测。这些标记可以用引物或ddNTP、优选ddNTP来标记。最优选的标记为包括6-羧基荧光素、6-羧基-X-罗丹明、3-(ε-羧基戊基)-3′-乙基-5，5′-二甲基氧杂羰花菁、6-羧基-X-罗丹明、4，4-二氟-4-硼-3α，4α-二氮-s-二吡咯甲烷-3-丙酸衍生物和4，7-二氯罗丹明染料的荧光标记。
退火温度优选在约40℃～70℃、更优选在45℃～68℃、最优选在50℃～65℃的范围内。
如下面的实施例中所示，本方法提供目标核酸分子的高特异性测序。更具体地，使用设计具有DS oligo的独特结构的测序引物可以差异的测序小鼠胎盘特异性同源框家族基因Psx1和Psx2。这种差异性测序在测序引物的整个序列仅有3′-低Tm特异性部分中的一个碱基不同时变得突出。
令人惊讶地，本发明可以不经过纯化和分离而直接将包含在基因组DNA或一组cDNA中的目标核酸分子测序。成功直接测序基因组DNA或一组cDNA中的目标核酸分子目前还没有报道。当将本测序方法应用到直接测序包含在来自总RNA的一组cDNA中的目标核酸分子时，该方法包括如下步骤：
(a)在足以进行模板促使的酶促脱氧核糖核酸合成的条件下，使一组mRNA和与mRNA的polyA尾巴杂交的寡核苷酸dT引物接触；
(b)反转录与寡核苷酸dT引物杂交的mRNA，以制备和与寡核苷酸dT引物杂交的mRNA互补的一组第一cDNA链；
(c)使用双特异性寡核苷酸作为测序引物，通过进行至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性来合成待测序的第一cDNA链的互补核酸分子，其中，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与第一cDNA链的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与第一cDNA链的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与第一cDNA链退火的条件下，形成非碱基配对的泡状结构；其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行合成反应中的退火；以及
(d)测定合成的第一cDNA链的核苷酸序列。
V.检测具有遗传多样性的核酸分子的应用
在本发明另一技术方案中，提供一种通过双特异性寡核苷酸的模板依赖性延伸反应检测具有遗传多样性的核酸分子的方法，其包括如下步骤：
(a)使所述双特异性寡核苷酸与模板核酸分子退火，其中，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板核酸退火的条件下，形成非碱基配对的泡状结构，其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行退火，且在5′-高Tm特异性部分和/或3′-低Tm特异性部分与其目标位点具有一个或多个错配碱基时进行退火；
(b)延伸所述双特异性寡核苷酸，以合成与模板互补的核酸分子；以及
(c)检测所述双特异性寡核苷酸的模板依赖性延伸的发生。
因为使用本发明的DS oligo的本应用根据前述用于合成核酸序列的方法进行，所以省略其之间的共有描述，以避免本说明书的复杂性而导致不必要的重复。
使用本发明的DS oligo的本应用可以提供用于通过涉及退火和延伸步骤的模板依赖性延伸反应来选择性检测具有遗传多样性的核酸序列的改进方法。尤其是，可以通过重复其中退火和延伸步骤后接着变性步骤的模板依赖性延伸反应过程而完成具有遗传多样性的目标核酸的检测。
本发明是基于DS oligo的错配容许性。
多种基因组已经报道了遗传多样性。这种现象被认为是成功检测目的基因或基因组的障碍。本发明的目的在于提供一种通过使用具有错配容许性的DS oligo来克服这种常规问题的方法。具有特定序列的DS oligo可以与呈现遗传多样性的几个目标序列退火，从而成功进行所需核酸序列的扩增和检测。换句话说，最初开发的用于显著提高退火和杂交特异性的DS oligo还可以用于在适当调整退火或严格条件时需要错配容许性的方法中。
为了提供呈现错配容许性的DS oligo，其应该在通过排列所有可用的序列而产生的核酸分子的保守序列的基础上设计。本发明中使用的术语“保守区域”指基因的多种不同核苷酸序列之间明显相似的基因的核苷酸序列片段或蛋白质的氨基酸序列片段。该术语与术语“保守序列”互换使用。
在优选的实施方式中，保守区域中的最保守序列位于DS oligo的3′端部分，且最低保守序列位于间隔部分中。5′-高Tm特异性部分和/或3′-低Tm特异性部分，优选5′-高Tm特异性部分由于DS oligo的错配容许性而可以与其目标位点具有一个或多个、优选一至三个、更优选一至两个错配碱基。
为赋予DS oligo错配容许性，退火条件，尤其是退火温度很重要。在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行退火，而在5′-高Tm特异性部分和/或3′-低Tm特异性部分与其目标位点具有一个或多个错配碱基时全部部分发生退火。
退火温度优选在约40℃～70℃、更优选在45℃～68℃、最优选在50℃～65℃的范围内。
根据优选的实施方式，根据聚合酶链式反应(PCR)进行本发明。
可以通过多种常规技术进行本方法的检测步骤。例如，如果本方法以产生足以在凝胶中检测的产物的重复方式进行，那么可以通过常规凝胶电泳进行模板依赖性延伸的产物检测。如果标记那些可通过光谱测量法、光化学测量法、生物化学测量法、生物电子测量法、免疫化学测量法、电子测量法和化学测量法检测的材料，那么可以进行合适的测量法以检测模板依赖性延伸的发生。
遗传多样性在病毒基因组中最频繁发现和产生(Nathalie B等人，(2004)Journal of Clinical Microbiology，42，3532；Tersa C等人，(2002)Journal of Infectious Diseases，185，1660；Takashi E等人，(2004)Journalof Clinical Microbiology，42，126；以及Elizabeth R等人，(2001)ClinicalInfectious Diseases，32，1227)。与此相关，优选的是，待检测的具有遗传多样性的核酸分子为呈现遗传多样性的病毒的核酸。例如，将本发明应用于通过PCR检测呈现遗传多样性的人偏肺病毒时，设计具有DSoligo结构的最优选引物对示于SEQ ID NO：39(用作5′引物)和40(用作3′引物)或者SEQ ID NO：39和41(用作3′引物)中。
VI.使用固定有DS oligo的微阵列检测目标核酸序列的应用
本应用为一种通过在固定有DS oligo的微阵列上重复模板依赖性的反应来检测目标核苷酸序列的新方法。
在本发明的另一技术方案中，提供一种通过模板依赖性延伸反应来检测核酸样品中的目标核苷酸序列的方法，其包括如下步骤：
(a)延伸固定于基底上作为探针的双特异性寡核苷酸，其包括至少一个循环的杂交、模板依赖性延伸和变性，其中通过使双特异性寡核苷酸与核酸样品接触而进行杂交，其中，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与目标核苷酸序列的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与目标核苷酸序列的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与目标核苷酸序列退火的条件下，形成非碱基配对的泡状结构，其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的杂交的条件下进行杂交；以及
(b)分析模板依赖性延伸的发生。
图4中示出了通过使用固定有DS oligo的微阵列而检测核酸样品中的目标核苷酸序列的图示。
可以在通过最优化程序而常规确定的合适杂交条件下使用DSoligo进行所述方法。根据包括寡核苷酸和目标核苷酸序列的长度和GC含量的多种因素可以改变如温度、成分浓度、杂交和漂洗时间、缓冲液成分和其pH及离子强度的条件。例如，当使用相对短的寡核苷酸时，优选采用低的严格条件。用于杂交的具体条件可以参考JosephSambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；以及M.L.M.Anderson，Nucleic Acid Hybridization，Springer-Verlag New York Inc.N.Y.(1999)。
DS oligo固定于基底上。优选的基底包括合适的固体或半固体载体，如膜、滤膜、芯片、载玻片、晶片、纤维、磁性或非磁性珠、凝胶、管、板、大分子、微颗粒和毛细管。可以利用通过紫外线照射的化学结合或共价结合进行这种固化。在本发明的一个实施方式中，DSoligo结合到经修饰以包含环氧化合物或醛基的玻璃表面上或结合到涂覆多溶素的表面上。此外，DS oligo通过连接剂(例如，乙二醇低聚物和联氨)结合到基底上。可以通过如光刻法、喷墨法、机械点样法及其衍生技术的常规制造技术制造固定的DS oligo以制成阵列和用于特定应用的阵列。
根据本方法，优选将延伸步骤中使用的dNTPs标记。使用可通过光谱测量法、光化学测量法、生物化学测量法、生物电子测量法、免疫化学测量法、电子测量法或化学测量法检测的材料用以标记。例如，所述标记包括但不限于如p32和S35的放射性同位素、化学发光化合物、如荧光标记和染料的光谱标记以及磁性标记。例如，染料包括但不限于喹啉染料、三芳基甲烷染料、酞、偶氮染料和花菁染料。荧光标记包括但不限于荧光素、藻红素、罗丹明、丽丝胺Cy3和Cy5(Pharmacia)。根据本领域中的多种方法进行标记。
核酸样品中的目标核苷酸序列与固定于基底、优选为固体载体上的作为探针的DS oligo杂交，然后与目标核苷酸序列杂交的DS oligo使用dNTPs、优选为荧光标记的dNTPs和DNA聚合酶以模板依赖性的方式延伸。优选重复步骤(a)以使杂交反应进行到全部或多数DS oligo与目标核苷酸序列杂交的程度，从而使杂交结果更可再生。
根据所使用的标记的类型以本领域中已知的多种方法证明杂交的发生。例如，对于荧光标记使用显微镜，优选共聚焦荧光显微镜，用这种设备检测到的信号强度随杂交的程度成比例地增强。通常，荧光显微镜安装有扫描设备，该设备形成杂交强度的定量二维图象。用这种设备检测到的信号强度随杂交的程度以及模板依赖性延伸的程度成比例地增强。
现通过实施例更详细地描述本发明。对于本领域的技术人员，明显的是，这些实施例目的在于更具体的示例性说明，且如附属权利要求中所述的本发明的范围不限于这些实施例或受这些实施例所限制。
实施例
实施例1：使用双特异性(DS)寡核苷酸的PCR特异性
本发明开发的DS寡核苷酸用作扩增小鼠细胞因子家族基因IL-19和IL-1β的目标核苷酸序列的引物。使用DS引物扩增IL-19和IL-1β的目标核苷酸序列的方法和结果在下文中描述。
选择下面的常规引物序列并用于与DS寡核苷酸比较PCR特异性：
该实施例中使用的IL-19(500 bp)特异性常规引物为：
IL19-5′-0 5′-GTCTCATCTGCTGCCCTTAAGTCTCTAGGAGAACT-3′(SEQ ID NO：1)；和
IL19-3′-0
5′-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGCTTTACAATAAGTTAG-3′(SEQID NO：2)。
该实施例中使用的IL-1β(550 bp)特异性常规引物为：
IL1b-5′-0 5′-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCAATACCCAAAGAAG-3′(SEQ ID NO：3)；以及
IL1b-3′-0 5′-AGACCTCAGTGCAGGCTATGACCAATTCATCCC-3′(SEQ ID NO：4)。
将本发明的DS寡核苷酸应用到这些常规引物序列，以证明DS寡核苷酸是否可以克服由这些常规引物序列引起的如产生背景和非特异性产物的主要问题。
除了5′部分和3′部分之间的包含多脱氧肌苷[poly(dI)]接头的间隔部分之外，下面的DS引物包含与上述常规引物相同的序列。设计DS引物使其以如下方式包含5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分：5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，而间隔部分在三个部分中具有最低的Tm。
该实施例中使用的IL-19(500 bp)的DS引物为：
IL19-5′5′-GTCTCATCTGCTGCCCTTAAIIIIITAGGAGAACT-3′(SEQID NO：5)；以及
IL19-3′5′-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGIIIIICAATAAGTTAG-3′(SEQ ID NO：6)，其中I为脱氧肌苷。
该实施例中使用的IL-1β(550 bp)的DS引物为：
IL1b-5′5′-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCIIIIICCAAAGAAG-3′(SEQ ID NO：7)；以及
IL1b-3′5′-AGACCTCAGTGCAGGCTATGIIIIITTCATCCC-3′(SEQ IDNO：8)，其中I为脱氧肌苷。
以20μl的终体积进行目标PCR扩增，其包含2μl(50ng)从小鼠系ICR的胎盘组织分离的基因组DNA、含有15mM MgCl2的2μl 10 xPCR反应缓冲液(Roche)、2μl dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2mM)、1μl 5′DS或常规引物(10μM)、1μl 3′DS或常规引物(10μM)以及0.5μl Taq聚合酶(5单位/μl；Roche)，将包含反应混合物的管置于预加热(94℃)的热循环仪，样品在94℃变性5分钟，接着进行30个循环，每个循环为94℃下1分钟、60℃下1分钟、72℃下1分钟，然后在72℃下温育7分钟。
通过2％的琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物且通过溴化乙锭染色来检测。还可以通过放射自显影法或通过如银染(Gottschlich等人，(1997)Res.Commun.MoI.Path.Pharm.97，237-240；Kociok，N等人.(1998)MoI.Biotechnol.9，25-33)或者通过使用荧光标记的寡核苷酸(Bauer D等人，(1993)Nucleic Acids Res.21，4272-4280；Ito，T等人，(1994)FEBSLett.351，231-236.Luehrsen，K.R等人，(1997)BioTechniques 22，168-174；Smith，N.R等人，(1997)BioTechniques 23，274-279)以及使用生物素引物(Korn，B等人，(1992)Hum.MoI.Genet.1，235-242；Tagle，D.A等人，(1993)Nature 361.751-753；Rosok，O等人，(1996)BioTechniques 21，114-121)的非放射性检测方法在变性聚丙烯酰胺凝胶上来检测所得的PCR产物。
如图5中所示，各自使用引物对IL1b-5′和IL1b-3′以及IL19-5′和IL19-3′的细胞因子家族基因IL-Ib和IL-19的目标PCR扩增产生分别与IL-1β(泳道2)的预期大小550-bp和IL-19(泳道4)的预期大小500-bp对应的单一条带。该克隆的后续克隆和序列分析证实所述条带为IL-1β和IL-19片段。与此相对，不包含[poly(dI)]的常规引物对(IL19-5′-0和IL19-3′-0；IL1b-5′-0和IL1b-3′-0)产生非特异性产物(图5，泳道1和3)。这些结果显示，设计具有三个不同Tm的部分(5′-高Tm特异性部分、3′-低Tm特异性部分和间隔部分)的DS引物可以克服由常规引物序列引起的如产生背景和非特异性产物的主要问题，并显著提高PCR特异性。
实施例2：使用双特异性(DS)寡核苷酸的PCR特异性的评价
双特异性寡核苷酸的特征在于，根据杂交严格性由其独特结构引起的高杂交特异性以及错配容许性。DS寡核苷酸的高杂交特异性在5′-和3′-部分与模板退火的高严格条件下实现。同时，DS寡核苷酸的错配容许性在尽管存在一个或多个、但是有限的碱基对错配而5′-和3′-部分与模板退火的严格条件下实现。
根据本发明开发的DS寡核苷酸的双特异性通过被鉴定在小鼠胎盘表达的新基因DEGlO的3′-RACE根据杂交特异性和错配容许性来评价，(Kim，YJ等人，(2004)Annealing control primer system foridentification of differentially expressed genes on agarose gels.BioTechniques 36：424-434；XM-129567)。为进行评价，将两部分中的几个核苷酸用其它核苷酸替换以与目标模板序列错配。
该实施例中使用的5′-DEG10特异性DS引物为：
DEG10-5′-108：5′-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTCCGATG-3′(SEQ ID NO：9)；
DEG10-5′-103：5′-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTGCCATC-3′(SEQ ID NO：10)；
DEG10-5′-102：5′-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTCCCATC-3′(SEQ ID NO：11)；
DEG10-5′-101：5′-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTCCCATG-3′(SEQ ID NO：12)；
DEG10-5′-158：5′-TGTACTTATGCGTATCGTCCIIIIICTCCGATG-3′(SEQ ID NO：13)；
DEG10-5′-138：5′-TGTACTTTTGCGTTTCGTCCIIIIICTCCGATG-3′(SEQ ID NO：14)；以及
DEG10-5′-128：5′-TGTAGTTATGGGTATCCTCCIIIIICTCCGATG-3′(SEQ ED NO：15)，其中，替换的核苷酸下标并加粗，且I为脱氧肌苷。
A：在高严格性下的PCR特异性的提高
如前述(Hwang，I.T等人，(2003)Annealing control primer system forimproving specificity of PCR amplification.BioTechniqms35：1180-1184)，由小鼠品系ICR的17.5-dpc(E17.5)胎盘组织分离总RNA并用于通过逆转录酶的第一链cDNA的合成。在42℃下，使用总RNA在包括如下成分的20μl反应体积中进行反转录反应1.5小时：3μg总RNA、4μl 5x反应缓冲液(美国Promega)、5μl dNTPs(各2mM)、2μl的10μM cDNA合成引物(oligo(dT)20-连接物)、0.5μl RNase抑制剂(40单位/μl，Promega)以及1μl逆转录酶(200单位/μl，Promega)。通过加入180μl超纯H2O稀释第一链cDNA。cDNA合成引物oligo(dT)I8-ACPl为：5′-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIII(T)18-3′，其中I为脱氧肌苷。
在20μl的最终体积中进行DEGlO的3′-RACE，其包含2μl(30ng)稀释的第一链cDNA、包含15mM MgCl2(Roche)的2μl 10 x PCR反应缓冲液、2μl dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM)、1μl DEG10特异性DS引物(10μM)之一、1μl oligo(dT)15-ACP2(10μM)以及0.5μlTaq聚合酶(5单位/μl；Roche)；将包含反应混合物的管置于预加热(94℃)的热循环仪，样品在94℃变性5分钟，接着进行30个循环，每个循环为94℃下1分钟、68℃下1分钟、72℃下1分钟，然后在72℃下温育7分钟。oligo(dT)15-ACP2为：
5′-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIII(T)15-3′，其中I为脱氧肌苷。
B.DS寡核苷酸的错配容许性
除了退火温度之外，采用实施例2A中使用的用于DEG10的3′-RACE的样品DS引物、模板和PCR条件。在如下条件下进行PCR扩增：94℃下5分钟、60℃下3分钟、72℃下3分钟，如此一个循环；接着29个循环，每个循环为94℃下40秒、65℃下1分钟、72℃下40秒；以及在72℃下最后延伸7分钟。
结果，图6A通过DEG10的3′-RACE呈现了DS寡核苷酸引物的高杂交特异性。完整无损的5′-DEG10特异性DS引物(DEG10-5′-108)产生DEG10 3′-RACE的预期677-bp产物(泳道1)。与此相对，在5′部分或3′部分具有错配序列的其它引物(DEG10-5′-103、DEG10-5′-102、DEG10-5′-101、DEG10-5′-158、DEG10-5′-138以及DEG10-5′-128)不产生任何产物：3′部分具有三个碱基错配(泳道2)、两个碱基错配(泳道3)或一个碱基错配(泳道4)；5′部分具有五个碱基错配(泳道5)、三个碱基错配(泳道6)或两个碱基错配(泳道7)。
这些结果证实DS引物的双特异性在这种高的严格条件下不但可以区分在3′端的错配碱基，而且还可以区分在5′端的错配碱基。
通常，因为3′端为通过DNA聚合酶延伸的区域，所以应该与模板完全互补的引物区域为3′端，因此最重要的是确保与正确的目标序列的退火的发生。同时，5′端引物在限定与目标序列的退火特异性中的重要性相对较低，且其可以修改以包含如限制性酶切位点和启动子序列的与模板不互补的另外序列(McPherson，MJ.，Moller，S.G.(2000)PCR.BIOS Scientific Publishers，Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg，N.Y.)。与此相比，通过由于其独特结构的双特异性而可以辨认5′端以及3′端中错配碱基，证明了DS引物的突出优点。
图6B通过DEG10的3′-RACE示出了DS寡核苷酸引物的错配容许性。虽然在其5′端或3′端不含有或含有几个错配核苷酸的DS引物(DEG10-5′-108、DEG10-5′-101、DEG10-5′-128以及DEG10-5′-138)仍然产生预期677bp的DEG103′-RACE产物(泳道1、4、6和7)。与此相比，其5′端或3′端含有多个错配核苷酸的其它引物(DEG10-5′-103、DEG10-5′-102以及DEG10-5′-158)不产生任何产物(泳道2、3和5)。这些结果证实DS引物可以应用到需要错配容许性的多种核苷酸序列的扩增。
总而言之，这些结果支持以下DS引物的原理：
1)只有当5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分发生退火时，DS引物才延伸以合成与模板互补的核酸分子(泳道1)；然而
2)当只有5′-高Tm特异性部分发生退火而3′-低Tm特异性部分不发生退火时，DS引物不延伸，从而不合成与模板互补的核酸分子(泳道2～4)；以及
3)即使3′-低Tm特异性部分的序列与模板完全配对，在高严格条件下也不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火。关于退火部分，DS引物与退火控制引物(ACP)明显不同，退火控制引物(ACP)在起始PCR步骤中只通过3′端部分的退火而延伸(Hwang，I.T等人，(2003)Annealingcontrol primer system for improving specificity of PCR amplification.BioTechniques 35：1180-1184)。
实施例3：使用双特异性(DS)寡核苷酸的单碱基辨认
为证实DS寡核苷酸用于单碱基辨认的双特异性，用常规引物或DS引物扩增小鼠胎盘特异性同源框家族基因Psx1和Psx2。两个Psx的cDNA在核苷酸水平的全部序列同源性为91％(Han，YJ.，等人，(2000)Identification and characterization of Psx2，a novel member of the Psx(placenta-specific homeobox)family.Gene 241：149-155)。设计5′-引物以通过一个或两个碱基的差别来辨认Psx1和Psx2(图7A)。然而，设计3′-引物使其具有两个PsxcDNA的保守序列。Psx1和Psx2特异性常规和DS引物序列如下：
Psx1-5′-10：5′-AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTTCTAGCT-3′(SEQ ID NO：16)；
Psx2-5′-10：5′-AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTTCTGGCC-3′(SEQ ID NO：17)；
Psx1-5′-11：5′-AAGGAAGACATGCTGGTGATIIIIITTCTAGCT-3′(SEQID NO：18)；
Psx2-5′-11：5′-AAGGAAGACATGCTGGTGATIIIIITTCTGGCC-3′(SEQ ID NO：19)；
Psx1-5′-40：5′-TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAATGTGA-3′(SEQ ID NO：20)；
Psx2-5′-40：5′-TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAATCTGA-3′(SEQ ID NO：21)；
Psx1-5′-41：5′-TCTTGCACGATGGATGGGTGIIIIIGAAIGIGA-3′(SEQ ID NO：22)；
Psx2-5′-41：5′-TCTTGCACGATGGATGGGTGIIIIIGAAICIGA-3′(SEQID NO：23)；以及
Psx-3′-2：5′-TTCATCCACACCCATCCATCIIIIIAGATCCCT-3′(SEQ IDNO：24)，其中Psx1或Psx2特异性核苷酸下标并加粗。
A.第一链cDNA合成
使用实施例2中合成的小鼠胎盘第一链cDNA作为Psx cDNA的3′-RACE和目标PCR的原材料。
B.使用Psx1和Psx2特异性DS引物的Psx1和Psx2的3′-RACE
在20μl的终体积中进行Psx1和Psx2的3′-RACE，其包含2μl(30ng)稀释的第一链cDNA、包含15mM MgCl2的2μl 10 x PCR反应缓冲液(Roche)、2μl dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM)、1μl 5′-Psx1或5′-Psx2特异性DS或常规引物(10μM)之一、1μl oligo(dT)15-ACP2(10μM)以及0.5μl Taq聚合酶(5单位/μl；Roche)；将包含反应混合物的管置于预加热(94℃)的热循环仪；样品在94℃变性5分钟，接着进行30个循环，每个循环为94℃下1分钟、60～65℃下1分钟、72℃下1分钟，然后在72℃下温育7分钟。
C.使用Psx1和Psx2特异性DS引物的Psx1和Psx2的目标核酸 扩增
在20μl的终体积中进行Psx1和Psx2的目标PCR扩增，其包含2μl(30ng)稀释的第一链cDNA、包含15mM MgCl2的2μl 10 x PCR反应缓冲液(Roche)、2μl dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM)、1μl 5′-Psx1或5′-Psx2特异性DS或常规引物(10μM)之一、1μl Psx-3′-2(10μM)以及0.5μl Taq聚合酶(5单位/μl；Roche)，将包含反应混合物的管置于预加热(94℃)的热循环仪；样品在94℃变性5分钟，接着进行30个循环，每个循环为94℃下1分钟、60～65℃下1分钟、72℃下1分钟，然后在72℃下温育7分钟。
结果，图7B示出了通过5′-Psx1或5′-Psx2特异性引物产生的3′-RACE和目标PCR的产物。因为两个Psx cDNA由于靠近其3′-端的29-bp的缺失或插入而彼此不同，所以期望通过其3′-RACE扩增大小差别29-bp的产物。使用Psx1或Psx2特异性DS引物Psx1-5′-41和Psx2-5′-41的Psx cDNA的3′-RACE各自产生分别对应于预期大小311-bp(泳道1)和282-bp(泳道2)的单一条带。由3′-RACE产生的产物的后续序列分析证实5′-Psx1和5′-Psx2特异性引物分别扩增Psx1和Psx2 cDNA。与此相比，不符合DC寡核苷酸原理的常规引物(Psx1-5′-40和Psx2-5′-40)不区分两个Psx cDNA(泳道3和4)。
这些结果说明根据本发明的DS引物可以辨认单碱基错配。因此，DS寡核苷酸可以用于鉴定点突变或单核苷酸多态性分型。
实施例4：使用双特异性(DS)寡核苷酸从cDNA库直接测序目标cDNA
多数鉴定并分离新cDNA的尝试导致获得只由部分mRNA的序列表示的克隆。一旦鉴定了部分序列，通常可以通过典型的cDNA文库筛选或如RACE(cDNA末端快速扩增)的基于PCR的方法获得转录物的剩余部分，然后测序所获得的cDNA。因此，全部目前的方法是获得转录物剩余部分的序列信息的前提步骤。如果缺失序列信息直接由目标细胞产生的一组cDNA获得，那么就可以完全绕过这些耗时的前提步骤，且目标cDNA的序列可以由粗生物样品直接测定。
本发明的DS寡核苷酸用作使用胎盘第一链cDNA库直接测序小鼠胎盘特异性同源框基因PsxcDNA的引物。在此描述用于直接测序来自胎盘cDNA库的胎盘特异性基因cDNA的方法和结果。使用与实施例3中使用的相同的引物5′-Psx特异性DS。其为Psx1-5′-11、Psx2-5′-11、Psx1-5′-41和Psx2-5′-41。
A.第一链cDNA合成
使用实施例2中合成的小鼠胎盘第一链cDNA作为Psx cDNA直接测序的模板。
B.使用Psx特异性DS引物直接测序来自胎盘cDNA库的Psx cDNA
在20μl的终体积中进行循环测序反应，其包含13μl(150ng)稀释的第一链cDNA、2μl的ABI PRISM Big Dye Terminator Reaction mix(Applied Biosystems，美国)、3μl的5x测序缓冲液(Applied Biosystems)以及1.6μl的5′-Psx1-或5′-Psx2-特异性DS引物(1μM)之一，将包含反应混合物的管置于预加热(94℃)的热循环仪；样品在94℃变性5分钟，接着进行40～50个循环，每个循环为94℃下10秒钟、50～60℃下3分钟、60～65℃下4分钟。测序产物以如下步骤纯化：加入2μl的3M乙酸钠(pH4.6)和50μl新鲜的冷的100％EtOH；2)在-75℃下放置30分钟；3)在13,000g离心15～30分钟并除去上清液；4)用200μl的70％EtOH洗涤；5)在13,000g离心15～30分钟并小心地除去上清液，干燥。在恰好将测序产物加入ABI PRISM 3100基因分析仪之前，将片状沉淀物在10μl的HiDi甲酰胺中重悬。
令人吃惊地，PsxDS引物精确地测序其特异性PsxcDNA。换句话说，Psx1特异性DS引物(Psx1-5′-41)只测序Psx1 cDNA，Psx2特异性DS引物(Psx2-5′-41)只测序Psx2 cDNA(图8)。Psx2中的29-bp缺失区域用黑棒示出。与此相比，不符合DS寡核苷酸原理的常规引物(Psx1-5′-40和Psx2-5′-40)不区分两个Psx cDNA。
这些结果表明DS引物即使在循环测序以及PCR扩增中也可以辨认单碱基错配。
实施例5：使用双特异性(DS)寡核苷酸的多重PCR
为了证实DS寡核苷酸引物在多重PCR中的扩增，用DS引物扩增九个不同的细胞因子家族基因。在此描述使用DS引物的多重PCR扩增的方法和结果。设计细胞因子家族基因特异性DS引物以通过使用各细胞因子基因的最长外显子序列产生50bp的梯度。
该实施例中使用的用于IL-3(200bp)的DS引物为：
IL3-5′5′-GCTGCCAGGGGTCTTCATTCIIIIICTGGATGA-3′(SEQ IDNO：25)；以及
IL3-3′5′-GGCCATGAGGAACATTCAGAIIIIIGGTGCTCT-3′(SEQID NO：26)。
该实施例中使用的用于IL-15(250 bp)的DS引物为：
IL15-5′5′-ATGTAGCAGAATCTGGCTGCIIIIIATGTGAGG-3′(SEQ IDNO：27)；以及
IL15-3′5′-ATGTGATCCAAGTGGCTCATIIIIICCTTGTTAGG-3′(SEQID NO：28)。
该实施例中使用的用于IL-18(300 bp)的DS引物为：
IL18-5′5′-AGGAAATGGATCCACCTGAAIIIIITGATGATATA-3′(SEQID NO：29)；以及
IL18-3′5′-ATGGAAATACAGGCGAGGTCIIIIIAAGGCGCA-3′(SEQ IDNO：30)。
该实施例中使用的用于IL-25(350 bp)的DS引物为：
IL25-5′5′-AGCTCTCCAAGCTGGTGATCIIIIICAAGGCGG-3′(SEQ EDNO：31)；以及
IL25-3′5′-GAGCTGCCCTGGATGGGGTTIIIIIGTGGTCCT-3′(SEQ IDNO：32)。
该实施例中使用的用于IL-2(400bp)的DS引物为：
IL2-5′5′-CTCTGACAACACATTTGAGTGCIIIIICGATGATGAG-3′(SEQ ID NO：33)；以及
IL2-3′5′-GTGCTGTCCTAAAAATGACAGAIIIIIGAGCTTATTT-3′(SEQ ID NO：34)。
该实施例中使用的用于IL-6(450 bp)的DS引物为：
IL6-5′5′-CCAATGCTCTCCTAACAGATAAIIIIIAGTCACAGAA-3′(SEQ ID NO：35)；以及
IL6-3′5′-AGGTAAACTTATACATTCCAAGAAAIIIIITGGCTAGG-3′(SEQ ID NO：36)。
该实施例中使用的用于IL-19(500 bp)的DS引物为：
JL19-5′5′-GTCTCATCTGCTGCCCTTAAIIIIITAGGAGAACT-3′(SEQID NO：5)；以及
EL19-3′5′-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGIIIIICAATAAGTTAG-3′(SEQ ID NO：6)。
该实施例中使用的用于IL-1β(550 bp)的DS引物为：
IL1b-5′5′-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCIIIIICCAAAGAAG-3′(SEQ ID NO：7)；以及
IL1b-3′5′-AGACCTCAGTGCAGGCTATGIIIIITTCATCCC-3′(SEQ IDNO：8)。
该实施例中使用的用于IL-10(600 bp)的DS引物为：
IL10-5′5′-AAGGCCATGAATGAATTTGAIIIIITCATCAACTG-3′(SEQID NO：37)；以及
IL 10-3′5′-TGACAGTAGGGGAACCCTCTIIIIIGCTGCAGG-3′(SEQ IDNO：38)。
A.使用一对细胞因子家族基因特异性DS引物的单重PCR
在20μl的终体积中进行各细胞因子家族基因的单一目标PCR扩增，其包含2μl(50ng)的小鼠基因组DNA、2μl包含15mM MgCl2的10 x PCR反应缓冲液(Roche)、2μl的dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM)、1μl的各细胞因子家族基因特异性5′DS引物(10μM)、1μl的各细胞因子家族基因特异性3′DS引物(10μM)以及0.5μl的Taq聚合酶(5单位/μl；Roche)，将包含反应混合物的管置于预加热(94℃)的热循环仪，样品在94℃变性5分钟，接着进行30个循环，每个循环为94℃下1分钟、60～65℃下1分钟、72℃下1分钟，然后在72℃下温育7分钟。
B.使用九对细胞因子家族基因特异性DS引物的多重PCR
通过使用9对细胞因子家族基因特异性DS引物在单个管中进行多重PCR，反应混合物的终体积为50μl，其包含100ng的小鼠基因组DNA、5μl包含15mM MgCl2的10 x PCR反应缓冲液(Roche)、5μl的dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM)、1μl的各细胞因子家族基因特异性5′DS引物(0.2～5μM)、1μl的各细胞因子家族基因特异性3′DS引物(0.5～5μM)以及0.5μl的Taq聚合酶(5单位/μl；Roche)，将包含反应混合物的管置于预加热(94℃)的热循环仪，该PCR条件为：94℃下5分钟、50℃下3分钟、72℃下3分钟，如此一个循环；接着进行29个循环，每个循环为94℃下40秒钟、60℃下1分钟、72℃下40秒钟；在72℃下最后延伸5分钟的循环。
如图9中所示，多重PCR产生对应于9个不同细胞因子基因产物的预期大小200bp～600bp的多条带(图4，泳道1)。各单重PCR扩增产生分别对应于200bp的IL-3(图4，泳道2)、250bp的IL-15(图4，泳道3)、300bp的IL-18(图4，泳道4)、350bp的IL-25(图4，泳道5)、400bp的IL-2(图4，泳道6)、450bp的IL-6(图4，泳道7)、500bp的IL-19(图4，泳道8)、550bp的IL-1β(图4，泳道9)以及600bp的IL-10(图4，泳道10)。
因此，可以理解，通过本发明开发的DS引物可以成功地应用于多重PCR。DS寡核苷酸的独特结构可以克服任何常规多种PCR的共同问题，即引物干扰和二聚体形成。
实施例6：使用双特异性(DS)寡核苷酸的错配容许性检测人偏肺病毒
为证实DS寡核苷酸引物在错配容许性中的应用，使用DS引物检测临床样品中的人偏肺病毒(hMPV)。在此描述使用DS引物检测人偏肺病毒的方法和结果。该实施例不会构成本发明检测特定病毒的应用的限制。
基于通过基于排列所有可用的hMPV分离株的序列而产生的融合糖蛋白(F)基因保守区域来设计DS引物(参见表1)。为容许这些分离株的遗传多样性，基于以下标准设计引物：(a)尽管存在一个或多个、但是有限的碱基对错配，但是保守区域的长度至少为30个核苷酸(表1)；(b)保守区域中的多数错配序列优选位于DS引物中的间隔部分(例如，hMPV 5′-585、hMPV 3′-698和hMPV 3′-1007)；(c)另外，错配的核苷酸位于5′-端部分中，其可以用如脱氧肌苷的通用碱基替换(例如，hMPV3′-698和hMPV 3′-1007)；以及(d)3′-端部分中的一个或两个错配核苷酸可以用简并核苷酸或通用碱基替换(例如，hMPV 3′-1007)。
表1.基于所有可用hMPV分离株的融合糖蛋白(F)基因的保守区域的hMPV特异性DS寡核苷酸引物
Figure S2006800072179D00581
*hMPV分离株之间的遗传多样性表示为加下划线的核苷酸
该实施例中使用的hMPV F基因的特异性DS引物为：
hMPV 5′-585
5′-AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAIIIIICTAAATGTTG-3′(SEQ IDNO：39)；
hMPV 3′-698 5′-AACATCAITTTTATITGTCCTGCAIIIIITGGCATGT-3′(SEQ ID NO：40)；以及
hMPV 3′-1007
5′-TTGAITGCTCAGCIACATTGATIIIIICWGCTGTGTC-3′(SEQ IDNO：41)，
其中W可以为A或T，且I为脱氧肌苷。
根据制造商的操作说明(RNAzol LS；Tel-Test公司)使用RNAzol B法提取病毒总RNA。在42℃下，使用病毒总RNA在包括如下成分的20μl反应体积中进行反转录反应1.5小时以合成cDNA：5μl总RNA(大约100ng)、4μl 5 x反应缓冲液(美国Promega)、5μl dNTPs(各5mM)、2μl的10μM随机六脱氧核苷酸、0.5μl RNase抑制剂(40单位/μl，Promega)以及1μl莫洛尼鼠类白血病毒逆转录酶(200单位/μl，Promega)。
在20μl的终体积中进行hMPV F基因的目标PCR扩增，其包含2μl(30ng)第一链cDNA、2μl包含15mM MgCl2的10 x PCR反应缓冲液(Roche)、2μl的dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM)、1μl5′hMPV特异性DS引物(hMPV 5′-585；10μM)、1μl 3′hMPV特异性DS引物(hMPV 3′-698或hMPV 3′-1007；10μM)以及0.5μl的Taq聚合酶(5单位/μl；Roche)，将包含反应混合物的管置于预加热(94℃)的热循环仪，样品在94℃变性5分钟，接着进行30个循环，每个循环为94℃下1分钟、60～65℃下1分钟、72℃下1分钟，然后在72℃下温育7分钟。
如图10B中所示，各对hMPV特异性DS引物(hMPV 5′-585和hMPV 3′-698以及hMPV 5′-585和hMPV 3′-1007)产生分别对应于150-bp和459-bp预期大小的单一条带(泳道1和2)。后续序列分析证实其为hMPV融合糖蛋白(F)基因的部分序列。与此相比，在没有模板的阴性对照PCR中这些引物不产生产物(泳道4和5)。作为阳性对照，使用人β-肌动蛋白特异性引物对(泳道3)。
这些结果表明DS引物可以用于检测来自具有呼吸性传染病的患者的hMPV。因此，可以推出DS寡核苷酸可以在PCR扩增中用作引物或在寡核苷酸芯片中作为探针，其可以应用到在本领域中所遇到的所有可能的情况中。
实施例7：使用固定有DS Oligo的微阵列检测目标核苷酸序列
通过DNA合成仪(Expedite 8900核酸合成系统，Applied Biosystems(ABI)根据标准操作说明合成与目标核酸分子的一个区域互补的DSoligo。将合成的DS oligo固定于玻璃载玻片上形成微阵列。然后，将包含50～200ng的DNA样品、5μl的10 x PCR缓冲液(Promega)、5μl的15mM MgCl2、5μl荧光标记的dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2mM)以及0.5μl的Taq聚合酶(5单位/μl；Promega)的模板依赖性延伸反应混合物加到微阵列上，然后将微阵列置于预加热(94℃)的热循环仪。根据如下热循环进行模板依赖性延伸反应：在94℃变性5分钟，接着15～50个循环，每个循环为94℃下1分钟、50～65℃下1～3分钟、60～72℃下1～4分钟，然后在72℃下延伸5分钟。接着模板依赖性延伸反应，漂洗延伸的DS oligo并利用微阵列扫描仪通过其荧光图检测，然后分析荧光图。
实施例8：使用DS寡核苷酸的SNP(单核苷酸多态性)分型
在3′-低Tm特异性部分的中心替换一个多态性碱基(询点)，并通过DNA合成仪(Expedite 8900核酸合成系统，Applied Biosystems(ABI))根据标准操作说明合成DS oligo。将合成的DS oligo固定于玻璃载玻片上形成微阵列。然后，将包含50～200ng的DNA样品、5μl的10 xPCR缓冲液(Promega)、5μl的15mM MgCl2、5μl荧光标记的dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2mM)以及0.5μl的Taq聚合酶(5单位/μl；Promega)的模板依赖性延伸反应混合物加到微阵列上，然后将微阵列置于预加热(94℃)的热循环仪。根据如下热循环进行模板依赖性延伸反应：在94℃变性5分钟，接着15～50个循环，每个循环为94℃下1分钟、50～65℃下1～3分钟、60～72℃下1～4分钟，然后在72℃下延伸5分钟。接着模板依赖性延伸反应，漂洗延伸的DS oligo并利用微阵列扫描仪通过其荧光图检测，然后分析荧光图。
虽然已经描述了本发明的优选实施方式，应该理解，在本发明的实质内的变化和修改对于本领域的技术人员变得显而易见，本发明的范围通过附属权利要求和其等效物确定。

Claims (59)

1.一种使用双特异性寡核苷酸通过模板依赖性延伸反应合成核酸分子的方法，其包括如下步骤：
(a)使双特异性寡核苷酸与模板核酸分子退火，其中，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列；5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板核酸退火的条件下形成非碱基配对的泡状结构，其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行退火；以及
(b)延伸所述双特异性寡核苷酸以合成与模板核酸互补的核酸分子。
2.一种由DNA或核酸混合物选择性扩增目标核酸序列的方法，其包括：使用包括至少一种双特异性寡核苷酸的引物对，通过进行至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性来扩增目标核酸；其中，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与目标核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与目标核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与目标核酸退火的条件下，形成非碱基配对的泡状结构；其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行扩增反应中的退火。
3.一种在同一反应中使用两对或更多对引物同时扩增两个或更多个目标核酸序列的方法，其包括：使用其中引物对的至少一种引物为双特异性寡核苷酸的两个或更多个引物对通过进行至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性来扩增目标核苷酸序列，其特征在于，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与目标核苷酸序列的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与目标核苷酸序列的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与目标核苷酸退火的条件下形成非碱基配对的泡状结构；其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行扩增反应中的退火。
4.一种使用双特异性寡核苷酸由DNA或核酸的混合物测序目标核酸分子的方法，其包括如下步骤：
(a)使用所述双特异性寡核苷酸作为测序引物，通过进行至少两个循环的引物退火、引物延伸和变性来合成与所测序的目标核酸分子互补的核酸分子，其中，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与目标核酸分子的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与目标核酸分子的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与目标核酸分子退火的条件下形成非碱基配对的泡状结构，其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行合成反应中的退火；以及
(b)测定合成的互补核酸分子的核苷酸序列。
5.一种通过双特异性寡核苷酸的模板依赖性延伸反应检测具有遗传多样性的核酸分子的方法，其包括如下步骤：
(a)使所述双特异性寡核苷酸与模板核酸分子退火，其中，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板核酸退火的条件下形成非碱基配对的泡状结构，其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的退火的条件下进行退火，且在5′-高Tm特异性部分和/或3′-低Tm特异性部分与其目标位点具有一个或多个错配碱基时进行退火；
(b)延伸所述双特异性寡核苷酸，以合成与模板互补的核酸分子；以及
(c)检测所述双特异性寡核苷酸的模板依赖性延伸的发生。
6.一种通过双特异性寡核苷酸的模板依赖性延伸反应来检测核酸样品中的目标核苷酸序列的方法，其包括如下步骤：
(a)延伸固定于基底上作为探针的所述双特异性寡核苷酸，其包括至少一个循环的杂交、模板依赖性延伸和变性，其中通过使所述双特异性寡核苷酸与核酸样品接触而进行杂交，其中，所述双特异性寡核苷酸具有三个部分，其中5′-高Tm特异性部分具有与目标核苷酸序列的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，间隔部分包含至少两个通用碱基，且3′-低Tm特异性部分具有与目标核苷酸序列的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，间隔部分在三个部分中具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与目标核苷酸序列退火的条件下形成非碱基配对的泡状结构，其中在不会只发生3′-低Tm特异性部分的杂交的条件下进行杂交；以及
(b)分析模板依赖性延伸的发生。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述间隔部分中的通用碱基选自包括脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2′-脱氧肌苷，2-氮-2′-脱氧肌苷、2′-OMe肌苷、2′-F肌苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2′-OMe 3-硝基吡咯、2′-F 3-硝基吡咯、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吲哚、5-硝基吲哚、2′-OMe 5-硝基吲哚、2′-F 5-硝基吲哚、脱氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2′-F水粉蕈素、2′-F 4-硝基苯并咪唑、PNA-5-硝基吲哚、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、吗啉代-5-硝基吲哚、吗啉代-水粉蕈素、吗啉代-肌苷、吗啉代-4-硝基苯并咪唑、吗啉代-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2′-0-甲氧基乙基肌苷、2′0-甲氧基乙基水粉蕈素、2′-0-甲氧基乙基5-硝基吲哚、2′-0-甲氧基乙基4-硝基苯并咪唑、2′-0-甲氧基乙基3-硝基吡咯及其组合的组。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述通用碱基为脱氧肌苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述通用碱基为脱氧肌苷。
10.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述间隔部分包含具有通用碱基的连续核苷酸。
11.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述5′-高Tm特异性部分比所述3′-低Tm特异性部分长。
12.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述3′-低Tm特异性部分具有与模板核酸的一个位点完全互补以与其杂交的杂交核苷酸序列。
13.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述5′-高Tm特异性部分的长度为15～40个核苷酸。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述5′-高Tm特异性部分的长度为15～25个核苷酸。
15.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述间隔部分的长度为至少3个核苷酸。
16.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述间隔部分的长度为3～10个核苷酸。
17.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述3′-低Tm特异性部分的长度为3～15个核苷酸。
18.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述5′-高Tm特异性部分的长度为15～25个核苷酸、所述间隔部分的长度为3～10个核苷酸、且所述3′-低Tm特异性部分的长度为3～15个核苷酸。
19.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述5′-高Tm特异性部分的Tm在40℃～80℃的范围内。
20.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述3′-低Tm特异性部分的Tm在10℃～40℃的范围内。
21.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述间隔部分的Tm在3℃～15℃的范围内。
22.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，在45℃～68℃的温度范围内进行退火。
23.根据权利要求1或5所述的方法，其中，通过重复其中所述双特异性寡核苷酸退火和延伸步骤后接着变性步骤的模板依赖性延伸反应的方法完成目标核酸序列的合成。
24.根据权利要求2或3所述的方法，其中，根据聚合酶链式反应进行所述扩增。
25.根据权利要求4所述的方法，其中，所述待测序的目标核酸分子包含于基因组DNA或一组cDNA中。
26.根据权利要求5所述的方法，其中，所述具有遗传多样性的核酸分子为呈现遗传多样性的病毒的核酸。
27.一种用于通过模板依赖性延伸反应合成核酸分子的双特异性寡核苷酸，其由以下通式表示：
5′-Xp-Yq-Zr-3′
其中，Xp表示5′-高Tm特异性部分，该部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，Yq表示包含至少两个通用碱基的间隔部分，Zr表示3′-低Tm特异性部分，该部分具有与模板核酸的一个位点基本互补以与其杂交的杂交核苷酸序列，p、q和r表示核苷酸的数目；以及X、Y和Z为脱氧核苷酸或核苷酸；5′-高Tm特异性部分的Tm高于3′-低Tm特异性部分的Tm，且在三个部分中间隔部分具有最低的Tm；间隔部分在5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分与模板核酸退火的条件下形成非碱基配对的泡状结构，使5′-高Tm特异性部分从而根据与模板核酸的退火特异性而与3′-低Tm特异性部分分开，因此寡核苷酸的退火特异性由5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分双重限定，从而提高了寡核苷酸的整体退火特异性。
28.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，所述间隔部分中的通用碱基选自包括脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2′-脱氧肌苷，2-氮-2′-脱氧肌苷、2′-OMe肌苷、2′-F肌苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2′-OMe 3-硝基吡咯、2′-F 3-硝基吡咯、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吲哚、5-硝基吲哚、2′-OMe 5-硝基吲哚、2′-F 5-硝基吲哚、脱氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2′-F水粉蕈素、2′-F 4-硝基苯并咪唑、PNA-5-硝基吲哚、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、吗啉代-5-硝基吲哚、吗啉代-水粉蕈素、吗啉代-肌苷、吗啉代-4-硝基苯并咪唑、吗啉代-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2′-0-甲氧基乙基肌苷、2′0-甲氧基乙基水粉蕈素、2′-0-甲氧基乙基5-硝基吲哚、2′-0-甲氧基乙基4-硝基苯并咪唑、2′-0-甲氧基乙基3-硝基吡咯及其组合的组。
29.根据权利要求28所述的双特异性寡核苷酸，其中，所述通用碱基为脱氧肌苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚。
30.根据权利要求29所述的双特异性寡核苷酸，其中，所述通用碱基为脱氧肌苷。
31.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，所述间隔部分包含具有通用碱基的连续核苷酸。
32.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，所述5′-高Tm特异性部分比所述3′-低Tm特异性部分长。
33.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，所述3′-低Tm特异性部分具有与模板核酸的一个位点完全互补以与其杂交的杂交核苷酸序列。
34.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，p表示15～40的整数。
35.根据权利要求34所述的双特异性寡核苷酸，其中，p表示15～25的整数。
36.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，q为至少3。
37.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，q表示3～10的整数。
38.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，r表示3～15的整数。
39.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，p为15～25的整数、q为3～10的整数、且r为3～15的整数。
40.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，所述5′-高Tm特异性部分的Tm在40℃～80℃的范围内。
41.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，所述3′-低Tm特异性部分的Tm在10℃～40℃的范围内。
42.根据权利要求27所述的双特异性寡核苷酸，其中，所述间隔部分的Tm在3℃～15℃的范围内。
43.一种用于使寡核苷酸的退火特异性能够通过寡核苷酸的结构而被双重限定的方法，其包括如下步骤：
(a)选择目标核酸序列；
(b)设计寡核苷酸序列，其包含(i)与目标核酸基本互补的杂交序列和(ii)包含至少两个通用碱基的间隔部分，使间隔部分插入杂交序列以在该寡核苷酸中形成三个部分；以及
(c)限定间隔部分在寡核苷酸中的位置，以使间隔部分5′-方向的部分具有比间隔部分3′-方向的部分更高的Tm，并使间隔部分在三个部分中具有最低的Tm，从而提供一种包含三个彼此具有不同Tm值的区分部分的寡核苷酸，其中，(i)寡核苷酸的5′-高Tm特异性部分具有与目标核酸基本互补的杂交核苷酸序列；(ii)3′-低Tm特异性部分具有与目标核酸基本互补的杂交核苷酸序列；以及(iii)5′-高Tm特异性部分与3′-低Tm特异性部分之间的间隔部分包含至少两个通用碱基；且5′-高Tm特异性部分的Tm比3′-低Tm特异性部分的Tm高，而间隔部分在三个部分中具有最低的Tm，
因此，寡核苷酸与目标核酸的退火特异性受5′-高Tm特异性部分和3′-低Tm特异性部分的双重限定。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述间隔部分中的通用碱基选自包括脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2′-脱氧肌苷，2-氮-2′-脱氧肌苷、2′-OMe肌苷、2′-F肌苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2′-OMe 3-硝基吡咯、2′-F 3-硝基吡咯、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吲哚、5-硝基吲哚、2′-OMe 5-硝基吲哚、2′-F 5-硝基吲哚、脱氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2′-F水粉蕈素、2′-F 4-硝基苯并咪唑、PNA-5-硝基吲哚、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、吗啉代-5-硝基吲哚、吗啉代-水粉蕈素、吗啉代-肌苷、吗啉代-4-硝基苯并咪唑、吗啉代-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2′-0-甲氧基乙基肌苷、2′0-甲氧基乙基水粉蕈素、2′-0-甲氧基乙基5-硝基吲哚、2′-0-甲氧基乙基4-硝基苯并咪唑、2′-0-甲氧基乙基3-硝基吡咯及其组合的组。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述通用碱基为脱氧肌苷、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述通用碱基为脱氧肌苷。
47.根据权利要求43所述的方法，其中，其中，所述间隔部分包含具有通用碱基的连续核苷酸。
48.根据权利要求43所述的方法，其中，所述5′-高Tm特异性部分比所述3′-低Tm特异性部分长。
49.根据权利要求43所述的方法，其中，所述3′-低Tm特异性部分具有与模板核酸的一个位点完全互补以与其杂交的杂交核苷酸序列。
50.根据权利要求43所述的方法，其中，p表示15～40的整数。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，p表示15～25的整数。
52.根据权利要求43所述的方法，其中，q为至少3。
53.根据权利要求43所述的方法，其中，q表示3～10的整数。
54.根据权利要求43所述的方法，其中，r表示3～15的整数。
55.根据权利要求43所述的方法，其中，p为15～25的整数、q为3～10的整数、且r为3～15的整数。
56.根据权利要求43所述的方法，其中，所述5′-高Tm特异性部分的Tm在40℃～80℃的范围内。
57.根据权利要求43所述的方法，其中，所述3′-低Tm特异性部分的Tm在10℃～40℃的范围内。
58.根据权利要求43所述的方法，其中，所述间隔部分的Tm在3℃～15℃的范围内。
59.根据权利要求43所述的方法，其中，所述模板依赖性延伸反应为聚合酶链式反应。
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