MX2007010875A - Oligonucleiotidos de especifidad dual y procesos que hacen uso de oligonucleotidos de especificidad dual. - Google Patents

Oligonucleiotidos de especifidad dual y procesos que hacen uso de oligonucleotidos de especificidad dual.

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Abstract

La presente invencion se refiere a diversos procesos por una reaccion de extension dependiente de la plantilla, al usar un oligonucleotido de especificidad dual y un oligonucleotido de especificidad dual compuesto de tres diferentes porciones Tm para ello. Se demuestran en la presente invencion las caracteristicas del oligonucleotido de especificidad dual, las cuales son especificidad de alta hibridacion y tolerancia sin coincidencia.

Description

OLIGONUCLEÓTIDOS DE ESPECIFICIDAD DUAL Y PROCESOS QUE HACEN USO DE OLIGONUCLEÓTIDOS DE ESPECIFICIDAD DUAL.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a varios procesos que hacen uso de oligonucleótidos de especificidad dual y oligonucleótidos de especificidad dual de los mismos. Más particularmente, la presente invención se refiere a varios procesos mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla que usa oligonucleótidos de especificidad dual y oligonucleótidos de especificidad dual de los mismos.
DESCRIPCIÓN DEL ARTE RELACIONADO La amplificación de ácidos nucleicos es un proceso esencial para una variedad amplia de métodos en la biología molecular, tal que se han propuesto varios métodos de amplificación. Por ejemplo, Miller, H. I. et al. (WO 89/06700) amplificó una secuencia de ácidos nucleicos basada en la hibridación de una secuencia del promotor/cebador a un ADN de una sola hebra objetivo ("ssADN") seguido por la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos incluyen sistemas de amplificación basados en la transcripción (Kwoh, D. , et al., Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A. 86:1173(1989); y Gingeras T.R. et al., WO 88/10315). El proceso más predominante para la amplificación de ácidos nucleicos conocido como la reacción de la cadena de polimerasa (denominado de aquí en adelante como "PCR"), se basa en ciclos repetidos de desnaturalización del ADN de hebra doble, seguido por la renaturalización del cebador de los oligonucleótidos en la plantilla de ADN, y extensión del cebador mediante una polimerasa de ADN (Mullis et al. Pat.U.S. Nos. 4,683,195, 4,683,202, y 4,800,159; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354). Los cebadores de los oligonucleótidos usados en la PCR se diseñan para formar pares básicos a las hebras opuestas de la plantilla de ADN. Los cebadores se extienden mediante la polimerasa de ADN, a partir de la cual el producto de un cebador puede servir como la hebra de la plantilla para el otro cebador en reacciones subsecuentes. El proceso de amplificación de la PCR resulta en el incremento exponencial de fragmentos de ADN discretos cuya longitud está definida por los extremos 5' de los cebadores de los oligonucleótidos. El éxito en las amplificaciones de ácidos nucleicos, en particular, la amplificación de PCR, yace en la especificidad con que un cebador forma pares básicos sólo para sus secuencias objetivo (y no, las no objetivo) ; por consiguiente, es importante perfeccionar esta interacción molecular. Si un cebador puede formar pares básicos sólo a para su complemento perfecto o también para secuencias que tienen una o más diferencias dependen críticamente de la temperatura en la renaturalización. En general, una temperatura elevada en la renaturalización conducirá a una renaturalización más específica del cebador para que su plantilla coincida perfectamente, que a su vez incrementa la probabilidad de amplificar sólo la secuencia objetivo. Por otro lado, pueden tolerarse más diferencias entre la plantilla y el cebador a temperaturas más bajas durante la renaturalización. En consideración a tal fenómeno, el ajuste de la temperatura en la renaturalización puede alterar la especificidad de pares de la plantilla y el cebador. Por ejemplo, si no hay ningún producto, la temperatura puede ser demasiado alta para formar pares básicos. Si existen varios productos diferentes en tamaño dónde sólo un cebador está presente, esto indica que el único cebador se forma en pares básicos para más de una región de la plantilla. En este caso, la temperatura en la renaturalización debe incrementarse. Además de la temperatura de renaturalización, varios "parámetros de búsqueda del cebador", como la longitud del cebador, contenido de GC, y longitud del producto de la PCR, deben ser considerados para la especificidad en la renaturalización del cebador. Un cebador que satisface todos los parámetros producirá una mejora significativa de la especificidad de renaturalización del cebador durante la amplificación del ADN objetivo, mientras se resuelven los problemas de fondo y los productos no específicos que surgen de los cebadores usados en los experimentos. Es usual que los cebadores bien diseñados pueden ayudar a evitar una renaturalización no específica y respaldos, así como la distinción entre los cADNs o plantillas genómicas en la PCR-ARN. Se han desarrollado muchas metodologías para mejorar la especificidad de la renaturalización del cebador y por consiguiente, realizar la amplificación del producto deseado. Los ejemplos son PCR de toque (Don et al., (1991) Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res., 19, 4008), PCR de inicio caliente (DAquila et al., (1991) Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. Nucleic Acids Res., 19, 3749), PCR anidada (Mullis y Faloona, (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350), y PCR de refuerzo (Ruano et al., (1989) Biphasic amplification of very dilute DNA samples via booster PCR. Nucleic Acids Res. 17, 540) . También se han reportado otras metodologías alternativas en la que varios compuestos "intensificadores" pueden mejorar la especificidad de la PCR. Los compuestos intensificadores incluyen químicos que incrementan efectivamente la temperatura en la renaturalización de la reacción, proteínas que enlazan ADN, y reactivos disponibles comercialmente. Sin embargo, no existe ningún aditivo "mágico" que asegurará el éxito en cada PCR, y es muy tedioso probar los diferentes aditivos bajo condiciones diferentes tales como la temperatura en la renaturalización. Aunque estas metodologías han contribuido a la mejora de la especificidad en la renaturalización del cebador en algunos casos, estos no han accedido fundamentalmente a una solución debido a problemas que surgen a partir de los cebadores usados en la amplificación de la PCR, tal como los productos no específicos y aspectos de fondo importantes. Se han usado ampliamente no sólo las técnicas basadas en la PCR para la amplificación de una secuencia de ADN objetivo, sino también para aplicaciones científicas o métodos en los campos de la investigación biológica y médica, tal como la transcriptasa inversa de PCR (RT-PCR) , despliegue diferencial de la PCR (DD-PCR) , clonación de genes conocidos o desconocidos mediante PCR, amplificación rápida de extremos de cADN (RACE) , PCR de cebado arbitrario (AP-PCR) , PCR multiplex, clasificación del genoma SNP, y análisis genómico basado en PCR (BIOS Scientific Publishers, Springer- Verlag New York Berlin Heidelberg, NY) . Como se ha descrito anteriormente, todos estos métodos y técnicas que involucran la amplificación de los ácidos nucleicos, notablemente la amplificación de PCR, no podrían estar completamente libres de las limitaciones y problemas que son el resultado de la no especificidad de los cebadores usados en cada método, tal como los positivos falsos, reproducibilidad pobre, aspectos de fondo importantes, aunque se han introducido continuamente metodologías mejoradas para cada método. Por consiguiente, permanece la necesidad de nuevos cebadores y métodos para mejorar la especificidad en la renaturalización que puede dar lugar a verdaderos resultados en la amplificación. Entre tanto, la hibridación del ADN es un proceso fundamental en la biología molecular y es afectada por la resistencia iónica, composición de base, longitud del fragmento al que los ácidos nucleicos han estado reducidos, grado de no coincidencia, y la presencia de agentes desnaturalizantes. Las tecnologías basadas en la hibridación del ADN serían una herramienta muy útil en la determinación de la secuencia de los ácidos nucleicos específica y claramente serían valiosas en el diagnóstico clínico, investigación genética, y análisis de laboratorio forense. Por ejemplo, Wallace y colaboradores mostraron que las diferencias de la secuencia tan sutiles como un simple cambio de base son suficientes para permitir la discriminación de oligómeros cortos (por ejemplo, 14-mer) y demostró cómo esto pudiera aplicarse en el análisis molecular de la mutación de puntos en el gen de ß-globina (Wallace, B.R., et al., (1981) The use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes. Hybridization of oligonucleotides of mixed sequence to rabbit ß-globin DNA. Nucleic Acids Res. 9, 879-894; and Conner, BJ., et al. (1983). A pesar del poder de la hibridación de los oligonucleótidos para identificar correctamente una hebra complementaria, los investigadores enfrentan todavía limitaciones. Los híbridos que contienen oligonucleótidos son mucho menos estables que los híbridos de ácidos nucleicos largos. Esto se refleja en la temperatura más baja de fusión. La inestabilidad de los híbridos es uno de los factores más importantes a ser considerados cuando se diseña la hibridación de los oligonucleótidos. La diferencia de estabilidad entre un complemento perfectamente empatado y un complemento desigual en sólo una base puede ser bastante pequeña, que corresponde a tan pequeño como 0.5°C de diferencia en sus Tms (temperatura de doble fusión) . El oligómero más corto de interés (que permite la identificación de una hebra complementaria en una mezcla más compleja) , tiene un fuerte efecto en la no coincidencia de una sola base sobre su estabilidad doble total. Sin embargo, la desventaja de usar tales oligonucleótidos cortos es que hibridizan débilmente, incluso en una secuencia absolutamente complementaria, y deben usarse así bajo condiciones de severidad reducida, lo que resulta en una especificidad de hibridación seriamente disminuida. Se han hecho muchos esfuerzos para mejorar la especificidad de la hibridación en los oligonucleótidos. Se ha propuesto un método para modificar químicamente las bases del ADN para una hibridación de sensibilidad alta (Azhikina et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci, U.S.., 90: 11460-11462) y un método en el cual, el lavado después de la hibridación se realiza a temperaturas bajas durante un período largo para mejorar la capacidad de discriminar la no coincidencia (Drmanac et al., (1990) DNA and Cell Biology, 9:527-534). Recientemente, se ha introducido otro método para incrementar el poder de la resolución de polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) en la hibridación del ADN por medio de diferencias artificiales (Guo et al., (1997) Nature Biotechnology, 15:331-5). Además, muchas patentes de E.U.A. que incluyen las patentes de E.U.A. Nos. 6,077,668, 6,329,144, 6,140,054, 6,350,580, 6,309,824, 6,342,355 y 6,268,128 describen una sonda para la hibridación y sus aplicaciones. Aunque se han introducido continuamente metodologías mejoradas a cada método, todos estos métodos y técnicas que involucran la hibridación de los oligonucleótidos no podrían estar completamente libres de las limitaciones y problemas que surgen de la no especificidad de la hibridación de los oligonucleótidos.
Existe aún la posibilidad de que los factores artificiales, tales como las fallas en el manchado o teñido y la inmovilización de los oligonucleótidos en el substrato y establecimiento de las condiciones de hibridación óptimas, afectarían negativamente los datos de la hibridación; el efecto de resultados erróneos es más vulnerable a los resultados generados por el método de separación por exclusión de alto rendimiento. Tales factores artificiales inherentes al manchado e hibridación son las principales desventajas prácticas en los microarreglos de ADN basados en oligonucleótidos . Además, el desarrollo de técnicas para la determinación de la secuencia de ADN con velocidad mejorada, sensibilidad, y rendimiento es de suma importancia para el estudio de los sistemas biológicos. La técnica de formación de secuencias de ADN convencional se desarrolló originalmente hace más de dos décadas (Sanger et al. (1977) Proc. Nati. Acad. Sci, 74:5463-5467) enfrenta limitaciones en ambos, rendimiento y costo para aplicaciones futuras. Por consiguiente, se han propuesto varias técnicas recientes. Tres métodos que sostienen la gran promesa son la formación de secuencias mediante la hibridación (Brain and Smith, (1988) J. Theor. Biol., 135:303-307); Drmanac et al., (1989) Genómics, 4:114-128); y Southern, E.M. (1989) patente WO/10977), formación de secuencias de firma paralela basadas en el enlace y desdoblamiento (Brenner et al., (2000) Proc. Nati. Acad. Sci, 97:1665-1670), y pirosecuenciación (Ronaghi et al., (1996) anal. Biochem., 242:84-89; y (1998)" Science 281:363-365). Para todas las técnicas antes mencionadas, el éxito de reacciones de secuenciación depende absolutamente de la especificidad de hibridación del cebador de secuenciación a un ácido nucleico objetivo. En consideración a la especificidad de hibridación del cebador de secuenciación, los métodos actuales están sujetos a la limitación de la longitud de los ácidos nucleicos de la plantilla proporcionada para las reacciones de secuenciación. En general, las reacciones de secuenciación se efectúan usando ácidos nucleicos de plantilla preferentemente menos que unos cientos de pares base en longitud tal que la hibridación especifica del cebador de secuenciación se logra en cierta magnitud. Para estudios avanzados, sin embargo, las reacciones de secuenciación de ADN con velocidad mejorada, sensibilidad, y rendimiento no deben ser impedidas por el tamaño de los ácidos nucleicos de la plantilla. A la luz de esto, se permite la secuenciación directa de ácidos nucleicos objetivo de una población de ácidos nucleicos de la plantilla, con tal de que los cebadores de la secuenciación se hagan híbridos con los ácidos nucleicos objetivos a una especificidad alta.
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varias patentes y publicaciones, y las citas se proporcionan en paréntesis. La descripción de estas patentes y publicaciones en sus entidades están en la presente incorporadas mediante las referencias en esta solicitud para describir esta invención y el estado del arte al cual esta invención pertenece.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Para eliminar los problemas y limitaciones de tales oligonucleótidos convencionales, usados como cebadores o sondas, y varios métodos que involucran la hibridación de ácidos nucleicos, el presente inventor ha desarrollado oligonucleótidos de especificidad dual que permiten una reacción dependiente de la plantilla para proseguir con una especificidad muy superior y encontrar sus excelentes aplicaciones para una variedad amplia de procesos que involucran la hibridación de los oligonucleótidos o renaturalización. Por consiguiente, es un objeto de esta invención proporcionar un método para sintetizar una molécula de ácidos nucleicos que usa oligonucleótidos de especificidad dual mediante una reacción por extensión dependiente de la plantilla.
Es otro objeto de esta invención, proporcionar un método para amplificar selectivamente una secuencia de ácidos nucleicos objetivo de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos . Aún otro objeto de esta invención es proporcionar un método para amplificar dos o las secuencias del nucleótido objetivos que hacen uso de dos o más pares de cebadores simultáneamente en la misma reacción. Es un objetivo de esta invención, proporcionar un método para la secuenciación de una molécula de ácidos nucleicos de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos. Es aún otro objetivo de esta invención proporcionar un método para detectar una molécula de ácidos nucleicos con diversidad genética mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla. Otro objetivo de esta invención es proporcionar un método para detectar una secuencia del nucleótido objetivo en una muestra de ácidos nucleicos mediante el uso de microarreglos inmovilizados por oligonucleótidos de especificidad dual. Aún otro objetivo de esta invención es proporcionar oligonucleótídos de especificidad dual sintetizando una molécula de ácidos nucleicos mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla.
Un objetivo adicional de esta invención es proporcionar un método que permita una especificidad para la renaturalización de un oligonucleoido, para ser determinado dualmente a través de una estructura del oligonucleótido. Aún otro objetivo de esta invención es proporcionar un método para mejorar una especificidad en la renaturalización de un oligonucleótido. Otros objetivos y ventajas de la presente invención serán aparentes a partir de la descripción detallada para tomarse junto con las reivindicaciones y dibujos anexados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1A y IB representan el principio de los oligonucleótidos de especificidad dual (DS) de esta invención en una reacción de extensión dependiente de la plantilla. La FIG. 1A muestra la especificidad de hibridación alta de los oligonucleótidos DS bajo condiciones de severidad altas. La Figura IB muestra la tolerancia de no coincidencia de los oligonucleótidos DS . La FIG. 2 muestra representaciones esquemáticas para amplificar selectivamente ácidos nucleicos objetivo de ADN de hebra doble usando cebadores de oligonucleótidos DS de esta invención.
La FIG. 3 muestra representaciones esquemáticas para amplificar selectivamente ácidos nucleicos objetivo de mARN usando cebadores de oligonucleótidos DS de esta invención. LA FIG. 4 muestra representaciones esquemáticas para las reacciones de extensión dependientes de la plantilla en la determinación selectiva de ácidos nucleicos objetivo usando oligonucleótidos de especificidad dual en los microarreglos de los oligonucleótidos. LA FIG. 5 es una fotografía del gel de agarosa que muestra los resultados de la amplificación de la PCR para los genes de la familia de la citoquina, IL-lß y IL-19, usando un conjunto de cebadores convencionales (IL-lb-5'-0 e IL-lb-3'-0, línea 1; DL-19-5'-0 e IL-19-3'-0, línea 3) y los oligonucleótidos de especificidad dual (IL-lb-5' e IL-lb-3', línea 2; IL-19-5' e IL-19-3', línea 4). M es un marcador de 100 pares de bases en tamaño generado por Forever 100-bp Ladder Personalizer (Seegene, Inc. Seoul, Korea) . La FIG. 6A es una fotografía de gel de agarosa que muestra los resultados del 3 '-RACE (amplificación rápida de extremos cADN) del gen DEG 10, que demuestra la especificidad de PCR de los oligonucleótidos de especificidad dual. La línea 1 representa un cebador con la secuencia de empate perfecto, las líneas 2-4 representan cebadores con 3, 2 y 1 no coincidencia base en su porción 3' de especificidad Tm baja, respectivamente, y las líneas 5-7 representan cebadores con 5, 3 y 2 no coincidencias de bases en su porción 5' de especificidad Tm alta, respectivamente. M es un marcador de 100-bp en tamaño generado por Forever 100-bp Ladder Personalizer. LA FIG. 6B es una fotografía de gel de agarosa que muestra los resultados del 3 '-RACE del gen DEG 10, que demuestra la tolerancia de no coincidencia de los oligonucleótidos de especificidad dual en la PCR. La Línea 1 representa un cebador con una secuencia de empate perfecto, las líneas 2-4 representan a los cebadores con 3, 2 y 1 no coincidencia base en su porción 3' de especificidad baja Tm, respectivamente, y las líneas 5-7 representan los cebadores con 5, 3 y 2 no coincidencias de bases en su porción 5' de especificidad Tm alta, respectivamente. M es un marcador de 100-bp en tamaño generado por Forever 100-bp Ladder Personalizer. LA FIG. 7A representa las secuencias de los cebadores 5' para 3' -RACE de los genes Psxl y Psx2 de la familia de homeocaja de placenta específica. Los Psxl-5'-40 y Psx2-5'-40 son cebadores convencionales y Psxl-5'-41 y Psx2-5'-41 son cebadores diseñados de acuerdo con la presente invención. La FIG. 7B es una fotografía de gel de agarosa que muestra los resultados del 3 '-RACE de Psxl y Psx2. La línea 1, 3 '-RACE de Psxl que usa el cebador del oligonucleótidos de especificidad dual Psxl-5'-41,; línea 2, 3'-RACE de Psx2 que usa el cebador del oligonucleótido de especificidad dual Psx2-5*-41; línea 3, 3 '-RACE de Psxl usando el cebador convencional Psxl-5'-40; y la línea 4, 3' -RACE de Psx2 usando el cebador convencional Psx2-5' -40. M es un marcador de 100 pares de bases generado por Forever 100-bp Ladder Personalizer. La FIG. 8 muestra los resultados de la secuenciación de ciclización directa para los genes Psxl y Psx2 de la concentración de cADN de placenta de ratón usando los cebadores de oligonucleótidos de especificidad dual Psxl-5'-41 (para Psxl) y Psx2-5'-41 (para Psx2) como un cebador de secuenciación. La FIG. 9 muestra los resultados de la PCR multiplex usando 9 conjuntos de cebadores de especificidad dual del gen específico de la familia de la citoquina. Línea 1, PCR múltiple para 9 genes de la citoquina; Línea 2, PCR monoplex para BL-3 (200 bp); Línea 3, PCR monoplex para IL-15 (250 bp) ; Línea 4, PCR monoplex para IL-18 (300 bp); Línea 5, PCR monoplex para IL-25 (350 bp) ; Línea 6, PCR monoplex para IL-2 (400 bp); Línea 7, PCR monoplex para IL-6 (450 bp) ; Línea 8, PCR monoplex para IL-19 (500 bp) ; Línea 9, PCR monoplex para IL-lß (550 bp); y Línea 10, PCR monoplex para el DL-E/S (600 bp) . M es un marcador de 100-bp de tamaño generado por Forever 100-bp Ladder Personalizer.
La FIG. 10 muestra los resultados de las amplificaciones de la PCR, del gen de glicoproteina de fusión (F) del metaneumovirus humano (hMPV) mediante el uso de los cebadores de oligonucleótidos de especificidad dual. La línea 1, PCR objetivo usando el conjunto de cebadores hMPV5'-585 y hMPV 3 '-698; Línea 2, PCR objetivo usando los conjuntos del cebador hMPV5'-585 y hMPV 3'-1007; Línea 3, la PCR objetivo usando los cebadores de ß-actina humanos; Linea 4, la PCR objetivo sin la plantilla; y la Línea 5, PCR objetivo sin la plantilla.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención generalmente se refiere a: (a) una amplia variedad de procesos haciendo uso de oligonucleótidos de especificidad dual y (b) oligonucleótidos de especificidad dual de los mismos. Los oligonucleótidos de especificidad dual de esta invención (denominado de aquí en adelante como "oligo DS") permite al cebador o sonda a ser combinada en pares básicos para su secuencia objetivo con especificidad mejorada, que la especificidad de amplificación de ácidos nucleicos (en particular, PCR) y la reacción de hibridación puedan mejorarse significativamente.
Oligonucleótidos de Especificidad Dual (DS Oligo) En un aspecto de esta invención, se proporciona un oligonucleótido de especificidad dual para sintetizar una molécula de ácidos nucleicos mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla, que se representa por la siguiente fórmula general: 5*-Xp-Yq-Zr-3' en donde, Xp representa una porción de especificidad Tm elevada 5' que tiene una secuencia del nucleótido de hibridización substancialmente complementaria a un sitio en un ácido nucleico de la plantilla para hibridizarlo, Yq representa una porción de separación que comprende por lo menos dos bases universales, Zr representa una porción de especificidad Tm 3' baja, que tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en los ácidos nucleicos de la plantilla para hibridizarlos, p, q y r representan el número de nucleótidos, y X, Y, y Z son desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos; la Tm de la porción de especificidad Tm elevada 5', la porción de especificidad es superior a la porción de especificidad Tm 3 baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; las porciones de separación forman una estructura de burbuja de pares base bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm elevada 5' y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a los ácidos nucleicos de la plantilla, permitiendo que la porción de especificidad elevada Tm 5' se separe de la porción de especificidad Tm 3' baja en términos de especificidad para combinar pares básicos a los ácidos nucleicos de la plantilla, por medio del cual la especificidad en la renaturalización de los oligonucleótidos se determine dualmente mediante la porción de especificidad Tm elevada 5' y la porción de especificidad Tm 3' baja, tal que se mejore la especificidad en la renaturalización total de los oligonucleótidos. El término "especificidad dual" con respecto a los oligonucleótidos DS (denominados de aqui en adelante como "DS oligo") de esta invención usados en la presente, se acuña para describir su característica prominente, es decir, la especificidad en la renaturalización para una secuencia objetivo se determina dualmente mediante sus dos porciones separadas, es decir, la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja. En general, la especificidad en la renaturalización de cebadores o sondas está gobernada por su secuencia consecutiva total. En contraste, la especificidad en la renaturalización del oligo DS se determina dualmente por sus dos porciones (la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja) separadas por la porción de la separación, en las que estas tres porciones se localizan en una secuencia del oligonucleótido. Tal especificidad dual permite al oligo DS servir como un cebador y sonda que exhibe una especificidad mucho más alta, proporcionando la presente invención por ser nueva y no obvia en el arte previo. Entre tanto, el presente inventor ya ha desarrollado el ACP (cebador de control en la renaturalización) para mejorar la especificidad en la renaturalización como se describe en la WO 03/050303, las enseñanzas que se incorporan en la presente mediante la referencia. El oligo DS de esta invención es distintamente diferente al ACP a la luz de: (i) el oligo DS tiene dos porciones de especificidad para ser hibridizadas con una secuencia objetivo considerando que el ACP tiene una porción de especificidad; (ii) se diferencian tres porciones en el oligo DS distintamente discriminados en vista de Tm, considerando que las porciones en el ACP no son; (iii) el cebador DS se extiende para sintetizar una molécula de ácidos nucleicos complementaria a la plantilla solo cuando la renaturalización ocurre por ambas, porción de especificidad Tm elevada 5' y la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de especificidad, considerando que el ACP se extiende aún cuando la renaturalización ocurre mediante la porción del extremo 3'; y (iv) así, la renaturalización o especificidad de hibridización del oligo DS se determina dualmente mediante las dos porciones separadas, es decir, la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja, considerando que el ACP sólo se gobierna por la porción del extremo 3'. Por consiguiente, podría apreciarse que la renaturalización o especificidad de hibridación del oligo DS a su secuencia objetivo es muy superior que el ACP, debido a que el oligo DS es nuevo y no obvio sobre el ACP. La característica distintiva del oligo DS es tener tres porciones diferentes con propiedades distintas dentro de una molécula del oligonucleótido: porción de especificidad Tm 5' alta, porción de especificidad Tm 3* baja y porción de separación. El oligo DS es útil en una variedad amplia de procesos y análisis que involucran una reacción de extensión dependiente de la plantilla. El término usado en la presente "reacción de extensión dependiente de la plantilla" significa una reacción para extender una molécula de los oligonucleótidos hibridizados a una secuencia objetivo incorporando los nucleótidos sucesivos en su porción extremo en la que la secuencia extendida es determinada por una secuencia de plantilla complementaria. Una representación esquemática para los principios que gobiernan la especificidad de hibridación (renaturalización) del oligo DS se ilustra en la FIG. IA. Refiriéndose a la Fig. IA, los oligo DS se describirán con más detalle. Cuando únicamente la porción de especificidad Tm 5' alta del oligo DS se combina en pares básicos a una plantilla, no puede servir como un sitio de cebado para una extensión dependiente de la plantilla, que resulta en la no presencia de extensión. Mientras la porción de especificidad Tm 5' alta del oligo DS se combina en pares básicos a una secuencia no objetivo, la porción de especificidad Tm 3' baja, que tiene una secuencia más corta es improbable que combine pares básicos en la secuencia no objetivo. Las razones por las que la porción de especificidad Tm 5' elevada y la porción de especificidad Tm 3' baja se separan mediante la porción de separación en términos de eventos de renaturalización. En otras palabras, la porción de especificidad Tm 3' baja está involucrada en eventos de renaturalización de una manera relativamente independiente de la porción de especificidad Tm 5' alta y la renaturalización de la porción de especificidad Tm 3' baja, es menos afectada por la renaturalización de la porción de especificidad Tm 5' alta. En esta conexión, la probabilidad de combinar pares básicos en la porción de especificidad Tm 3' baja en una secuencia no objetivo se vuelve mucho más bajo. Cuando únicamente la porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia complementario a un sitio no objetivo, la renaturalización no ocurre bajo ciertas condiciones de severidad alta, por ejemplo, condiciones severas por combinar pares básicos de la porción de especificidad Tm 5' alta. De acuerdo a una modalidad preferida, es ventajoso realizar reacciones de extensión dependientes de la plantilla usando oligo DS bajo condiciones severas con una temperatura más alta que la de la porción de especificidad Tm 3' baja durante la renaturalización. Cuando ambas porciones de especificidad Tm 5' alta y porción de especificidad Tm 3' baja tienen una secuencia substancialmente complementaria a una plantilla, el oligo DS pueden combinarse en pares básicos a la plantilla y por consiguiente, ocurrir una extensión exitosa. Sin restringirse a una teoría, se cree que la porción de separación hace a la porción de especificidad Tm 3' baja más sensible a condiciones de renaturalización (por ejemplo, la temperatura y complementariedad de la secuencia) . A este respecto, la incidencia de la hibridación no específica entre la porción de especificidad Tm 3' baja, y las secuencias no objetivo se vuelven mucho más bajas bajo ciertas condiciones de renaturalización. Cuando la porción de especificidad Tm 3' baja, así como la porción de especificidad tm 5' alta se renaturalizan a su secuencia objetivo, el extremo 3' de la porción de especificidad Tm 3' baja es más probablemente que genere un sitio extendible mediante las polimerasas de ADN. El término "oligonucleótido" como se usa en la presente, se refiere a un oligómero lineal de monómeros naturales o modificados o enlaces, que incluyen desoxiribonucleótidos, ribonucleótidos y similares, capaces de hibridizar específicamente con una secuencia del nucleótido objetivo, si ocurre naturalmente o producido sintéticamente. El oligonucleótido es preferentemente de una sola hebra para una eficiencia máxima en la hibridación. Preferentemente, el oligonucleótido es un oligodesoxiribonucleótido. Los oligonucleótidos de esta invención pueden comprender dNMP que ocurren naturalmente (es decir, AMP, dGM, dCMP y dTMP) , análogos del nucleótido, o derivados del nucleótido. Los oligonucleótidos también pueden incluir ribonucleótidos. Por ejemplo, los oligonucleótidos de esta invención pueden incluir nucleótidos con modificaciones en su estructura tales como los ácidos nucleicos del péptido (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), ADN de fosforotioato, ADN de fosforoditioato, fosforamidato de ADN, ADN enlazado a una amida, ADN enlazado a MMI, ARN 2'-0-metilo, alfa-ADN y metilfosfonato de ADN, nucleótidos con modificaciones de azúcar tal como ARN 2'-0-metilo, ARN 2' -fluoro, ARN 2 '-amino, DNA 2 '-O-alquilo, ADN 2'-0-alilo, ADN 2-0-alquinilo, hexosa de ADN, ARN de piranosilo, y ADN de anhidrohexitol, y nucleótidos que tienen modificaciones base tales como pirimidinas C-5 sustituidas (substituyentes que incluyen fiuoro -, bromo -, cloro -, yodo -, metilo -, etilo -, vinilo -, formilo -, etinilo -, propinilo-, alquinilo-, tiazolilo-, imidazolilo-, piridolo-), 7-deazapurinas con substituyentes C-7 (sustituyentes que incluyen fluoro-, bromo-, cloro-, iodo -, metilo-, etilo-, vinilo-, formilo-, alquinilo-, alquenilo-tiazolilo-, imidazolilo-, piridilo-), inosina y diaminopurina . El término "cebador" como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleótido, que es capaz de actuar como un punto de iniciación de síntesis cuando se expone a condiciones en las que se induce la síntesis del producto de extensión de cebador que es complementario a una hebra de ácidos nucleicos (plantilla) , es decir, en presencia de nucleótidos y un agente para la polimerización, tal como la polimerasa de ADN, una temperatura adecuada y pH. El cebador es preferentemente de una sola hebra para una eficacia máxima durante la amplificación. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxiribonucleótido. El cebador de esta invención puede comprender dNMP que ocurre naturalmente (es decir, AMP, dGM, dCMP y dTMP) , nucleótidos modificados, o nucleótidos no natural. El cebador también puede incluir ribonucleótidos. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente para la polimerización. La longitud exacta de los cebadores dependerá de muchos factores, que incluye temperatura, aplicación y fuente del cebador. El término "renaturalización" o "cebar" como se usa en la presente, se refiere a la oposición de un oligodesoxinucleótido o ácidos nucleicos a un ácido nucleico de la plantilla, por medio del cual la aposición permite a la polimerasa polimerizar nucleótidos en una molécula de ácidos nucleicos que es complementaria a los ácidos nucleicos de la plantilla o una porción de la misma. El término usado "hibridación" usado en la presente se refiere a la formación de un ácido nucleico de hebra doble a partir de los ácidos nucleicos de una sola hebra complementarios. No hay ninguna distinción intencional entre las condiciones "renaturalización" y "hibridación", y estos términos se usarán indistintamente. El término usado en la presente "sonda" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos de hebra doble que comprende una porción o porciones que son substancialmente complementarias a una secuencia del nucleótido objetivo. El término "porción" como se usa en la presente junto con el oligo DS de esta invención se refiere a una secuencia del nucleótido separada por la porción de separación. El término "porción de especificidad Tm 5' alta" o "porción de especificidad Tm 3' baja" se refiere a una secuencia del nucleótido en el extremo 5' o extremo 3' del oligo DS de esta invención, respectivamente, que está separado por la porción de separación. El término "porción de especificidad Tm 5' alta" junto con el oligo DS se refiere a una porción con la Tm más alta entre las tres porciones, que tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en el ácidos nucleico de la plantilla. El término "porción de especificidad Tm 3' baja" con respecto al oligo DS significa una porción con una Tm más baja que la porción de especificidad Tm 5' alta, pero una Tm más alta que la porción de separación que tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en los ácidos nucleicos de la plantilla. El término "Tm" usado en la presente se refiere a la temperatura de fusión en la cual la mitad de las moléculas de un ácido nucleico dúplex se forman en una sola hebra. Los términos "Tm alta" y "Tm baja" en conjunto con las porciones en el oligo DS pretenden describir un valor Tm relativo, no obstante un valor Tm absoluto. Es decir, sólo se requiere que la Tm de la porción de especificidad 5' alta es alta en relación a la porción de especificidad Tm 3' baja. La porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se diseñan para tener una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en un ácido nucleico de la plantilla para hibridizarlo. El término "substancialmente complementario" con respecto al oligo DS se usa en la presente para dar a entender que la molécula de los oligonucleótidos es suficientemente complementaria para hibridizar selectivamente a una secuencia de ácidos nucleicos de plantilla bajo condiciones de renaturalización designadas o condiciones severas, tal que los oligonucleótidos combinados en pares básicos puedan extenderse mediante una polimerasa para formar una copia complementaria de la plantilla. Por consiguiente, este término tiene un significado diferente de "absolutamente complementarias" o términos relacionados. Se apreciará que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja del oligo DS puede tener una o más diferencias en una plantilla para una magnitud en la que el oligo DS puede servir como cebador o sonda. Más preferentemente, la porción de especificidad Tm 5' alta, y/o porción de especificidad Tm 3' baja del oligo DS tiene una secuencia del nucleótido perfectamente complementaria a un sitio en una plantilla, es decir, sin coincidencias. Para un desempeño exitoso del oligo DS, es esencial que la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta, es superior a la de la porción de especificidad Tm 3' baja. Se prefiere que la Tm, de la porción de especificidad Tm 5' alta se encuentre en los rangos de 40°C a 80°C, más preferentemente, de 40°C a 75°C, aún más preferentemente, 50°C a 68°C, y más preferentemente, 50°C a 65°C. Se prefiere que Tm, de la porción de especificidad Tm 3' baja se encuentre en los rangos de 10°C a 40°C, más preferentemente, 15°C a 40°C, más preferentemente, de 20°C a 35°C. Preferentemente, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta sea por lo menos más alta que 5°C, más preferentemente por lo menos 10°C, aún más preferentemente por lo menos 15°C, más preferentemente por lo menos 20°C que la porción de especificidad Tm 3' baja. Ventajosamente, la Tm, de la porción de especificidad Tm 5' alta, es superior a 5-70°C, preferentemente, 10-70°C, más preferentemente, 10-60°C, aún más preferentemente, 10-50°C, aún más preferentemente, 10-40°C y más preferentemente, 20-40°C que la porción de especificidad Tm 3' baja. De acuerdo a una modalidad preferida, la porción de especificidad Tm 5' alta es más larga que la porción de especificidad Tm 3' baja. La longitud de la porción de especificidad Tm 5' alta es preferentemente de 15 a 40 residuos del nucleótido, más preferentemente, de 15 a 30 residuos del nucleótido, y más preferentemente, 20 a 25 residuos del nucleótido. La longitud de la porción de especificidad Tm 3' baja es preferentemente de 3 a 15 residuos del nucleótido, más preferentemente, de 5 a 15 residuos del nucleótido, y más preferentemente, de 6 a 12 residuos del nucleótido. La porción de separación que comprende por lo menos dos bases universales es en parte responsable de las ventajas y características del oligo DS. El término "base universal" usada en la presente se refiere a uno capaz de formar pares base con cada una de las bases de ADN/ARN naturales con discriminación pequeña entre ellos. Se ha sabido ampliamente que los nucleótidos en algunas posiciones ambiguas de cebadores degenerados han sido reemplazados por la base universal tal como la desoxiinosina (Ohtsuka, E. et al., (1985) J. Biol. Chem. 260, 2605-2608; and Sakanari, J.A. et al, (1989) Proc. Nati Acad. ScL 86, 4863-4867), l-(2 '-desoxi-beta-D-ribofuranosil ) -3-nitropirrol (Nichols, R. et al., (1994) Nature 369, 492-493) y 5-nitroindol (Loakes, D. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4039- 4043) para resolver los problemas de diseño asociados con los cebadores degenerados, debido a que tales bases universales son capaces de un apareo base no específico con todas las cuatro bases convencionales. Sin embargo, no ha habido ningún reporte de que estas bases universales permitan formar una porción en una molécula de los oligonucleótidos para generar una estructura de la burbuja durante la renaturalización (hibridación) o amplificación y entonces separar dos secuencias adyacentes opuestas, que resultan en la elevación de la especificidad en la renaturalización del cebador o sonda a una secuencia objetivo mediante la especificidad dual a través de dos porciones de especificidad separadas (renaturalización) . De acuerdo con una modalidad preferida, la base universal en la porción de la separación se selecciona del grupo que consiste de desoxiinosina, inosina, 7-deaza-2'-desoxiinosina, 2-aza-2 '-desoxiinosina, 2' -OMe inosina, 2*-F inosina, desoxi 3-nitropirrol, 3-nitropirrol, 2 '-OMe 3-nitropirrol, 2'-F 3-nitropirrol, 1- (2 ' -desoxi-beta-D- ribofuranosil) -3-nitropirrol, desoxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2 '-OMe 5-nitroindol, 2'-F 5-nitroindol, desoxi A-nitrobenzimidazol, 4-nitrobenzimidazol, desoxi 4-aminobencimidazol, 4-aminobencimidazol, desoxi nebularina, 2'-F nebularina, 2'-F 4-nitrobencimidazol, PNA-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobencimidazol, PNA-3-nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobencimidazol, morfolino-3-nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4-nitrobenzimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2'-0-metoxietil inosina, 2 'O-nebularina metoxietil, 2'-0-metoxietil 5-nitroindol, 2 ' -0-metoxietil 4-nitrobencimidazol, 2'-0-metoxietil 3-nitro?irrol, y combinaciones de los mismos. Más preferentemente, la base universal o análogo base no discriminatorio es desoxiinosina, 1- (2 ' -desoxi-beta-D-ribofuranosil) -3-nitropirrol o 5-nitroindol, más preferentemente, desoxiinosina. Tales bases universales pueden estar contenidas en la porción de separación de una manera inmediata o manera interrumpida con otros nucleótidos tales como el dNMPs. Es preferible que la porción de separación comprenda nucleótidos contiguos que tienen bases universales, preferentemente, desoxiinosina .
Es crítico que la porción de separación en el oligo DS tenga la Tm más baja en las tres porciones, para que la porción de separación forme una estructura de burbuja de apareo base bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se combinen en pares básicos a los ácidos nucleicos de la plantilla, permitiendo que la porción de especificidad Tm 5' alta se separe de la porción de especificidad Tm 3' baja en términos de especificidad para combinar pares básicos a los ácidos nucleicos de la plantilla, por medio de la cual la especificidad en la renaturalización de los oligonucleótidos se determina dualmente por la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja tal que la especificidad en la renaturalización total de los oligonucleótidos es considerablemente mejor. Preferentemente, la Tm de de la porción de separación se encuentra en los rangos de 3°C a 15°C, más preferentemente, 4°C a 15°C, y más preferentemente 5°C a 10°C. De acuerdo a una modalidad preferida, la porción de separación entre la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja contiene por lo menos 3 bases universales, más preferentemente por lo menos 4 bases universales, y más preferentemente por lo menos 5 bases universales. De acuerdo a una modalidad preferida, la porción de separación contiene 2-10 bases universales, más preferentemente 3-10 bases universales, aún más preferentemente, 4-8 bases universales, y más preferentemente, 5-7 bases universales. Cuando se requiere un cebador o sonda que tienen una secuencia más larga, las ventajas del oligo DS son en sumo grado resaltadas. Por ejemplo, de acuerdo a una técnica convencional, un cebador que tiene una secuencia del nucleótido más larga que 35 bp como una secuencia de hibridación es muy susceptible de generar amplicones no específicos. En contraste, el oligo DS pueden generar amplicones específicos incluso con secuencias largas, puesto que lleva dos secuencias de hibridación {es decir, la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja) separadas entre si en términos de interacción molecular con las plantillas (es decir, renaturalización) . Por ejemplo, el oligo DS puede contener 35-45 bp de una secuencia de hibridación complementaria a una secuencia objetivo. A este respecto, podría apreciarse que la presente invención permite diseñar cebadores con las secuencias más largas consideradas por ser no factibles en las estrategias de diseño de los cebadores convencionales. De acuerdo con una modalidad preferida, la porción de especificidad Tm 5' alta es de 15 a 25 nucleótidos en longitud, la porción de separación es de 3 a 15 nucleótidos en longitud, y la porción de especificidad Tm 3' baja es de 3 a 15 nucleótidos en longitud. Más preferentemente, la porción de especificidad Tm 5' alta es de 15 a 25 nucleótidos en longitud; la porción de separación es de 3 a 10 nucleótidos en longitud; y la porción de especificidad Tm 3' baja es de 5 a 15 nucleótidos en longitud. Más preferentemente, la porción de especificidad Tm 5' alta es de 15 a 25 nucleótidos en longitud; la porción de separación es de 5 a 7 nucleótidos en longitud; y la porción de especificidad Tm 3' baja es de 6 a 10 nucleótidos en longitud. De acuerdo al oligo DS ejemplar e ilustrativo descrito en los Ejemplos, la porción de especificidad Tm 5' alta es aproximadamente de 20 nucleótidos en longitud; la porción de separación es aproximadamente de 5 nucleótidos en longitud; y la porción de especificidad Tm 3' baja es aproximadamente 8-10 nucleótidos en longitud. En la modalidad más preferida, el oligo DS se representa mediante la siguiente fórmula general: 5'-Xp- (dI)q-Zr-3' (la definición y características de Xp y Zr son iguales a las descritas previamente, di representa desoxiinosina, (dl)q representa una porción de separación que comprende nucleótidos contiguos que tienen bases universales y q es un entero entre 5-7). Interesantemente, el oligo DS presente también tiene tolerancia de no coincidencia bajo condiciones severas suficientes para tolerar no coincidencias en su secuencia objetivo. Una representación esquemática de los principios que gobiernan la tolerancia de no coincidencia del oligo DS se ilustra en la FIG. IB. Uno o más, preferentemente una a tres diferencias base en la porción de especificidad Tm 5' alta puede tolerarse bajo la condición de que tanto la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se combinen en pares básicos a la plantilla. Uno o más, preferentemente una a dos diferencias base en la porción de especificidad Tm 3' baja puede tolerarse bajo la condición de que tanto la porción de especificidad Tm 5' alta como la porción de especificidad Tm 3' baja se combinen en pares básicos a la plantilla. Además, uno o más, preferentemente una a cinco diferencias base tanto en la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja pueden tolerarse bajo la condición de que ambas, la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a la plantilla. Para imponer una tolerancia de no coincidencia en el oligo DS, en la condición de renaturalización es notablemente importante la temperatura en la renaturalización. La renaturalización se realiza bajo condiciones en las que solamente la renaturalización mediante la porción de especificidad Tm 3' baja no ocurre, mientras que renaturalización en todas las porciones ocurre cuando la porción de especificidad Tm 5* alta y/o la porción de especificidad Tm 3' baja tienen una o más, bases sin coincidencia también limitadas en su sitio objetivo. Los oligo DS que tienen tolerancia de no coincidencia se requieren para amplificar o detectar una secuencia del nucleótido con diversidad genética. Los oligos DS con tolerancia de no coincidencia pueden combinarse en pares básicos a una secuencia objetivo que muestran una diversidad genética y produce una amplificación exitosa y detección de secuencias del nucleótido de interés. En otras palabras, el oligo DS originalmente desarrollado para mejorar dramáticamente la especificidad de combinar pares básicos y la hibridación también puede usarse en los procesos que requieran tolerancia de no coincidencia cuando se renaturalizan o condiciones severas que se ajusten adecuadamente . En otro aspecto de esta invención, se proporciona un método que permite determinar una especificidad en la renaturalización de un oligonucleótido para determinarse dualmente a través de una estructura del oligonucleótido, que comprende las etapas de: (a) seleccionar una secuencia de ácidos nucleicos objetivo; (b) diseñar una secuencia de oligonucleótidos que tiene (i) una secuencia de hibridación substancialmente complementaria a los ácidos nucleicos objetivo y (ii) una porción de separación que comprende por lo menos dos bases universales, tal que la porción de separación intervenga en la secuencia de hibridación para formar tres porciones en los oligonucleótidos; y (c) determinar la posición de la porción de separación en los oligonucleótidos para permitir una porción en la dirección 5' de la porción de separación para tener una porción Tm superior a una porción en la dirección 3' de la porción de separación y permitir a la porción de separación tener la Tm más baja en las tres porciones, proporcionando así, oligonucleótidos que tienen tres porciones distintas con valores Tm diferentes entre si en los que (i) una porción de especificidad Tm 5' alta tenga una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a los ácidos nucleicos objetivo, (ii) una porción de especificidad Tm 3' baja de los oligonucleótidos tenga una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a los ácidos nucleicos objetivo; y (iii) la porción de separación de los oligonucleótidos entre la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja comprendan por lo menos de dos bases universales; y la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta sea superior a la porción de especificidad Tm 3' baja y la porción de separación tenga la la Tm más baja en las tres porciones, con lo cual la especificidad en la renaturalización de los oligonucleótidos para los ácidos nucleicos objetivo se determine dualmente por ambas, la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja. El presente método se destina a proporcionar una nueva metodología para incrementar dramáticamente la especificidad en la renaturalización de oligonucleótidos a ser hibridizados con su secuencia objetivo. El presente método también se expresa como un método para mejorar una especificidad en la renaturalización de un oligonucleótido. Por otra parte, la presente invención se expresa como un método que usa una porción de separación, que comprende por lo menos dos bases universales para mejorar la especificidad en la renaturalización de oligonucleótidos hibridizados a una secuencia objetivo. El presente método se realiza para preparar el oligo DS discutido anteriormente. Por consiguiente, en el interés de evitar la redundancia innecesaria, las descripciones comunes entre sí no están repetidas pero se incorporan en esta descripción del método como si lo estuvieran. La mayoría de los métodos convencionales para diseñar cebadores o sondas usan meramente una secuencia hibridizable en sus secuencias objetivos disponibles. Por otra parte, para incrementar la especificidad en la renaturalización de los oligonucleótidos, se ha intentado convencionalmente, ajustar las condiciones de amplificación o hibridación tales como la temperatura y concentración de iones. En contraste, el presente método proporciona una nueva estrategia para incrementar la especificidad en la renaturalización introduciendo nuevas características en las secuencias de los oligonucleótidos per se. El término "a través de una estructura de los oligonucleótidos" usada en la presente para referirse a la capacidad de la especificidad en la renaturalización de oligonucleótidos determinados dualmente significa que la estructura de los oligonucleótidos contribuye enormemente al incremento de especificidad en la renaturalización de los oligonucleótidos imponiendo en los oligonucleótidos una nueva característica para determinarse dualmente en términos de la especificidad en la renaturalización. Es crítico en el presente método diseñar una secuencia de oligonucleótidos que tienen (i) una secuencia de hibridación substancialmente complementaria a los ácidos nucleicos objetivo y (ii) una porción de separación que comprende por lo menos dos bases universales. En esta etapa, el contorno estructural de los oligonucleótidos se presenta para mostrar una porción del extremo 5' /porción de separación/porción de extremo 3' en los oligonucleótidos. Ambas porciones de extremo 5' y 3' llevan una secuencia de hibridación substancialmente complementaria a los ácidos nucleicos objetivo son intervenidas mediante la porción de separación. La etapa más crítica en la presente invención es determinar la posición de la porción de separación en los oligonucleótidos para permitir a una porción en la dirección 5' de la porción de separación para tener una Tm superior a una porción en la dirección 3' de la porción de separación y permitir a la porción de separación tener la Tm más baja en las tres porciones, proporcionando así, oligonucleótidos que tiene tres porciones distintas con valores de Tm diferentes entre si. Las nuevas características estructurales introducidas en los oligonucleótidos mediante el presente método son: (i) tres porciones distintas (porción de especificidad Tm 5' alta, porción de separación y porción de especificidad Tm 3' baja) en las secuencias de los oligonucleótidos; (ii) valores Tm diferentes de las tres porciones de una u otra; (iii) porción de separación entre la porción de especificidad Tm 3' baja que comprende por lo menos dos bases universales; (iv) dos porciones involucradas en la interacción molecular con los objetivos en la etapa de renaturalización, que se separa en términos del evento de renaturalización mediante la porción de separación; (v) valores Tm que siguen el orden de la porción de especificidad Tm 5' alta, porción de especificidad Tm 3' baja y porción de separación. Tales características estructurales aseguran finalmente la especificidad en la renaturalización de los oligonucleótidos proporcionada por la presente invención a ser determinadas dualmente por ambas, la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja, permitiendo el incremento dramático de la especificidad en la renaturalización de oligonucleótidos en su secuencia objetivo. Los oligonucleótidos diseñados y preparados de acuerdo al presente método exhiben una especificidad en la renaturalización superior a aquellos que no tienen tales tres porciones. Las características y ventajas del oligo DS se describirán como sigue: (a) la porción de separación del oligo DS comprende por lo menos dos bases universales que generan la región Tm más baja en el oligo DS, para que forme una estructura de burbuja sin apareamiento de bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a los ácidos nucleicos de la plantilla. Tal estructura de burbuja sin apareamiento de bases permite a la porción de especificidad Tm 5' alta separarse de la porción de especificidad Tm 3' baja en términos de especificidad de renaturalización a los ácidos nucleicos de la plantilla; (b) la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, y la porción de separación muestra la Tm más baja que hace posible establecer las condiciones severas solamente bajo esa renaturalización mediante la porción de especificidad Tm 3' baja no ocurre; (c) así, la especificidad en la renaturalización total del oligo DS se determina dualmente mediante la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja; y (d) consecuentemente, la especificidad en la renaturalización total del oligo DS mejora dramáticamente. Puede apreciarse que el oligo DS de la presente invención es muy útil en una variedad de (i) métodos de amplificación de ácidos nucleicos basados en el cebador tales como los métodos de Miller, H. I. (WO 89/06700) y Davey, C, et al. (EP 329,822), Reacción en cadena de la Ligasa (LCR, Wu, D.Y. et al., Genómics 4:560 (1989)), Reacción de la cadena de Polimerasa Ligasa (Barany, PCR Methods and Applic, 1:5-16(1991)), espacio-LCR (WO 90/01069), Reacción en cadena de Reparación (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, U.S.., 86:1173(1989)) y NASBA (Pat U.S. No. 5,130,238), (ii) tecnologías basadas en la extensión del cebador tales como la secuenciación en ciclo (Kretz et al., (1994) Cycle sequencing. PCR Methods Appl. 3:S107-S112) and pyrosequencing (Ronaghi et al., (1996) Anal. Biochem., 242:84-89; y (1998) Science 281:363-365), y {iii) tecnologías basadas en la hibridación como la detección de una secuencia del nucleótido objetivo que usa microarreglos de los oligonucleótidos. Los oligo DS del objetivo de la invención pueden aplicarse a una variedad de amplificación de ácidos nucleicos, secuenciación y tecnologías basadas en la hibridización. Ejemplos representativos para demostrar el efecto del oligo DS son como sigue: I. Aplicación para Sintetizar una Molécula de Ácidos Nucleicos. En otro aspecto de esta invención, se proporciona un método para sintetizar una molécula de ácidos nucleicos que usa oligonucleótidos de especificidad dual mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla, que comprende las etapas de: (a) renaturalizar los oligonucleótidos de especificidad dual a una molécula de ácidos nucleicos de plantilla, en donde los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en las que una porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en los ácidos nucleicos de la plantilla para hibridizarla, una porción de separación que comprende por lo menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido substancialmente complementaria a un sitio en los ácidos nucleicos de la plantilla para hibridizarla, la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja, en las tres porciones; la porción de separación forma una estructura de burbuja sin apareamiento de bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a los ácidos nucleicos de la plantilla, en donde la renaturalización se realiza bajo condiciones en las que la renaturalización solamente por la porción de especificidad Tm 3' baja no ocurre; y (b) extender los oligonucleótidos de especificidad dual para sintetizar una molécula de ácidos nucleicos complementaria a los ácidos nucleicos de la plantilla. Puesto que el método de la síntesis de esta invención emplea el oligo DS de esta invención, se omiten las descripciones comunes entre ellos para evitar la complejidad de esta especificación que lleva a una multiplicidad indebida. Esta aplicación al usar el oligo DS de la invención objetivo puede proporcionar un método mejorado para sintetizar selectivamente una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a una secuencia objetivo mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla involucrando la renaturalización y extendiendo las etapas. En particular, la síntesis de una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a una secuencia objetivo puede lograrse repitiendo el proceso de la reacción de extensión dependiente de la plantilla en donde la renaturalización y las etapas de extensión se continúan por la etapa de la desnaturalización. El método de la presente invención puede usarse para sintetizar una molécula de ácidos nucleicos complementaria a cualquier molécula de ácidos nucleicos de plantilla. Tal molécula puede ser ADN o ARN. La molécula puede estar ya sea en forma de hebra doble o de una sola hebra. Cuando los ácidos nucleicos como material de inicio son de hebra doble, se prefiere suministrar las dos hebras en una forma de una sola hebra o parcialmente una sola hebra. Métodos conocidos para separar las hebras incluyen, pero no se limitan a, tratamiento por calentamiento, de álcali, formamida, urea y glicoxal, métodos enziméticos (por ejemplo, acción de helicasa), y las proteínas de enlace. Por ejemplo, la separación de la hebra puede lograrse calentando a temperaturas de 80°C a 105°C. Los métodos Generales para lograr este tratamiento son proporcionados por Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) .
Cuando un mARN se emplea como material de inicio, una etapa de transcripción inversa es necesaria previo a la realización de la etapa de renaturalización, detalles que se encuentran en Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); y Noonan, K., F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)). Para la transcripción inversa, se usa un cebador dT de los oligonucleótidos hybridizable al mARN de la cola poli A. El cebador dT de oligonucleótidos comprende dTMPs, uno o más de los que pueden reemplazarse con otro dNMPs tan largos como el cebador dT puede servir como cebador. La transcripción inversa puede hacerse con la transcriptasa inversa que tiene actividad H ARNsa. Si uno usa una enzima que tiene actividad de H ARNsa, puede ser posible omitir una etapa de digestión ARNsa escogiendo cuidadosamente las condiciones de la reacción. Los presentes métodos no requieren que las moléculas de los ácidos nucleicos de plantilla tengan cualquier secuencia particular o longitud. En particular, las moléculas incluyen cualquier procariota, eucariota que ocurren naturalmente, (por ejemplo, protozoarios y parásitos, hongos, levaduras, plantas superiores, animales superiores e inferiores que incluyen mamíferos y humanos), viral (por ejemplo, virus del Herpes, HTV, virus de la influenza, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis, virus de la polio, etc.), o ácidos nucleicos viroides. La molécula de ácidos nucleicos también puede ser cualquier molécula de ácidos nucleicos que ha sido o puede sintetizarse químicamente. Así, la secuencia de ácidos nucleicos puede o no puede encontrarse en la naturaleza. El oligo DS usado para la presente invención se hibridiza o combina en pares básicos a un sitio en la plantilla tal que se forma la estructura de hebra doble. Las condiciones de los ácidos nucleicos que combinan pares básicos adecuadas para formar tales estructuras de hebra doble son descritas por Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) y Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)). Las secuencias de la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja del oligo DS no necesita exhibir una complementariedad precisa, incluso sólo necesita ser substancialmente complementaria en la secuencia para que sea capaz de formar un estructura de hebra doble estable. Así, las salidas de la complementariedad completa son permisibles, con la condición de que tales salidas no sean suficientes para prohibir completamente la hibridación, para formar una estructura de hebra doble. La renaturalización del oligo DS en un sitio en los ácidos nucleicos de la plantilla es un prerequisito previo para su polimerización dependiente de la plantilla con las polimerasas. Los factores (ver Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); and Haymes, B.D., et. al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)) que afectan el apareamiento de bases del oligo DS para sus ácidos nucleicos complementarios afectan subsecuentemente la eficacia del cebado. La composición del nucleótido del oligo DS puede afectar la temperatura en la que la renaturalización es óptima y por consiguiente, puede afectar su eficacia durante el cebado. La porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja del oligo DS durante la etapa de renaturalización juega un papel como una porción de hibridación o un sitio que determina la especificidad (es decir, especificidad dual que determina el sitio) , mientras la porción de separación no sirva como un sitio hibridación y no actúe recíprocamente con la plantilla para el apareamiento de bases. Una variedad de polimerasas de ADN pueden usarse en la etapa de extensión de los presentes métodos que incluyen fragmento "Klenow" de la polimerasa de ADN I E. coli, una polimerasa de ADN termoestable, y polimerasa de ADN del bacteriófago T7. Preferentemente, la polimerasa es una polimerasa termoestable de ADN que puede obtenerse de una variedad de especies bacterianas, que incluyen Thermus aquaticus (Taq) , Thermus thermophilus (Tth) , Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis , y Pyrococcus furiosus (Pfu) . Cuando se dirige una reacción de polimerización, es preferible proporcionar los componentes requeridos para tal reacción en exceso en el recpiente de la reacción. El exceso en la referencia a los componentes de la reacción de extensión se refiere a una cantidad de cada componente tal que la capacidad para lograr la extensión deseada no se limita substancialmente por la concentración de ese componente. Es deseable proporcionar a la mezcla de la reacción una cantidad de cofactores requeridos como Mg2+, dATP, dCTP, dGTP, y dTTP en cantidad suficiente para soportar el grado de extensión deseado. La renaturalización o la hibridación en el presente método se realiza bajo condiciones severas que permiten el enlace específico entre el oligo DS y los ácidos nucleicos de la plantilla. Tales condiciones severas para combinar pares básicos serán dependientes de la secuencia y varían dependiendo de los parámetros medioambientales. En el presente método, la etapa en la renaturalización se realiza generalmente bajo condiciones severas altas. Sin embargo, si el presente método se aplica a procesos que requieren tolerancia de no coincidencia, es preferible que la etapa en la renaturalización se lleve a cabo bajo condiciones severas en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se combinen en pares básicos a la plantilla a pesar de la presencia de uno o más, aún limitadas diferencias de pares base. Tal tolerancia de no coincidencia es muy útil en la amplificación o detección de un gen con diversidad genética. Pueden determinarse las condiciones severas prontamente de la norma conocida en el arte. Es ventajoso realizar la etapa en la renaturalización a una temperatura superior durante la renaturalización superior a la Tm de la porción de especificidad Tm 3' baja, asegurando que no ocurra la renaturalización por únicamente la porción de especificidad Tm 3' baja. Preferentemente, la temperatura en la renaturalización es por lo menos superior a 5°C, más preferentemente por lo menos Io °C, aún más preferentemente por lo menos 15°C, y más preferentemente por lo menos 20°C que la Tm de la porción de especificidad Tm 3' baja de la porción de especificidad. En una modalidad preferida, los rangos de temperaturas en la renaturalización de aproximadamente 40°C a 75°C, más preferentemente, 45°C a 72°C, aún más preferentemente, 50°C a 68°C, y más preferentemente, 55°C a 65°C. Las temperaturas de renaturalización adecuadas en el presente método pueden determinarse considerando independientemente los valores Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja. En otras palabras, las temperaturas en la renaturalización en el presente método no son determinadas por la longitud total y las composiciones del nucleótido de ambas, la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja, pero por la longitud individual y composición del nucleótido de la porción de especificidad Tm 5' alta y porción de especificidad Tm 3' baja. Normalmente, la temperatura en la renaturalización determinada, considerando sólo la porción de especificidad Tm 5' alta puede ser muy superior que la Tm de la porción de especificidad Tm 3' baja y volverse una óptima. Si se requiere la tolerancia de no coincidencia en la etapa en la renaturalización, se prefiere que la temperatura en la renaturalización se ajuste para volverse más baja que aquélla indicada anteriormente. El presente método puede combinarse con muchos otros procesos conocidos en el arte para lograr un objetivo especifico. Por ejemplo, el aislamiento (o purificación) del producto sintetizado puede seguir a la reacción de extensión. Esto puede lograrse mediante la electroforesis de gel, cromatografía en columna, cromatografía de afinidad, o hibridación. Además, el producto sintetizado de esta invención puede ser expresado en vector de expresión que alberga un hospedador adecuado.
II. Aplicación para Amplificar la Secuencia de ácidos nucleicos Objetivo Aún en otro aspecto de esta invención, se proporciona un método para amplificar selectivamente una secuencia de ácidos nucleicos objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos que comprende amplificar la secuencia de ácidos nucleicos objetivo realizando por lo menos dos ciclos de renaturalización del cebador, extensión del cebador y desnaturalización usando un par de oligonucleótidos de especificidad dual como un cebador; en donde los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en la que una porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en los ácidos nucleicos objetivo para hibridizarla, una porción de separación comprende por lo menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en los ácidos nucleicos objetivo para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación tiene forma una estructura de burbuja de apareamiento de bases condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a los ácidos nucleicos objetivo; en donde la renaturalización en la reacción de amplificación se realiza bajo las condiciones en las que no ocurre la renaturalización solamente en la porción de especificidad Tm 3' baja. Puesto que el método de amplificación de esta invención emplea el oligo DS de esta invención, se omiten las descripciones comunes para evitar la complejidad de esta especificación conduciendo a una multiplicidad indebida. Además, puesto que este método involucra la renaturalización y el proceso de extensión, se omiten las descripciones acerca de los dos procesos para evitar la complejidad de esta especificación lo que conduce a una multiplicidad indebida. Por ejemplo, la composición y estructura del oligo DS usadas y las condiciones para combinar pares básicos y extensión son comunes entre este proceso y el método para sintetizar la molécula de ácidos nucleicos discutida previamente. Esta aplicación al usar el oligo DS de la invención objetivo puede proporcionar un método mejorado para amplificar selectivamente una secuencia de ácidos nucleicos objetivo de un ácidos nucleico o una mezcla de ácidos nucleicos (ADN o mARN) realizando amplificaciones de ácidos nucleicos, preferentemente, (reacción en cadena de la polimerasa) PCR. Una representación esquemática para amplificar selectivamente un ADN de hebra doble de los ácidos nucleicos objetivo usando el oligo DS como se describió anteriormente se ilustra en las Figuras 2. Como se muestra en la FIG. 2, un par del oligo DS se combina en pares básicos a una plantilla de ADN ds desnaturalizada. La porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja durante la renaturalización juega un papel como una porción de hibridación o una especificidad que determina el sitio (es decir, el sitio que determina la especificidad dual), mientras que la porción de separación no sirve como un sitio hibridación y no actúa recíprocamente con la plantilla para el apareamiento de bases. En este momento, la porción de separación forma una estructura de burbuja en el oligo DS, para que dos porciones de extremo, es decir, la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja puedan separarse espacialmente para determinar dualmente la especificidad total del oligo DS. Los detalles de reacciones subsecuentes son similares a las amplificaciones de ácidos nucleicos basadas en el cebador convencionales conocidas en el arte descritas anteriormente. El presente método para amplificar una secuencia de ácidos nucleicos puede llevarse a cabo de acuerdo con varias amplificaciones de ácidos nucleicos basadas en el cebador conocidas en el arte. Preferentemente, los métodos se llevan a cabo de acuerdo con el proceso de la PCR descrito en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195, 4,683,202, y 4,800,159, más preferentemente, el método de inicio caliente PCR. La FIG. 3 ilustra una representación esquemática para amplificar selectivamente un ácidos nucleico objetivo del mARN que usa el oligo DS . En la primer etapa, el mARN obtenido de varias muestras biológicas se transcribe de forma inversa usando el oligo dT del cebador hibridizable a la cola poli A del mARN y la transcriptasa inversa. Se encuentran detalles de la transcripción inversa en Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); y Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)). La descripción de reacciones subsecuentes es similar a las amplificaciones convencionales de los ácidos nucleicos basadas en el cebador conocidas en el arte discutidas previamente.
III. Aplicación para la Amplificación de ADN Multiplex En un aspecto adicional de esta invención, se proporciona un método para amplificar simultáneamente dos o más secuencias del nucleótido objetivo que hacen uso de dos o más pares de cebadores en la misma reacción, que comprende amplificar las secuencias del nucleótido objetivo realizando por lo menos dos ciclos de renaturalización del cebador, extensión y desnaturalización del cebador, usando dos o más pares de oligonucleótidos de especificidad dual como un cebador, caracterizado en que los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en la que una porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la secuencia del nucleótido objetivo para hibridizarla, una porción de separación comprende por lo menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja que tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la secuencia del nucleótido objetivo para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja, en las tres porciones; la porción de separación forma una estructura de burbuja de apareamiento sin bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a la secuencia del nucleótido objetivo; en donde la renaturalización en la reacción de amplificación se realiza bajo condiciones en la que la renaturalización no ocurre solamente en la porción de especificidad Tm 3' baja. La aplicación al usar el oligo DS de la invención objetivo también puede proporcionar un método mejorado para amplificar más de una secuencia objetivo usando más de un par de cebadores en la misma reacción. En general, es sumamente difícil preparar las condiciones de la PCR multiplex para amplificar más de 10 secuencias objetivo en paralelo, debido a que una reacción PCR óptima se requiere para amplificar incluso un sitio específico sin cualquier subproducto no específico. Puesto que la renaturalización necesita tener lugar a una temperatura suficientemente alta para permitir el empate del ADN-ADN perfecto para ocurrir en la reacción, el oligo DS de la invención objetivo es ideal en la optimización de la amplificación del ADN multiplex debido a su función para mejorar la especificidad de la amplificación. La "PCR multiplex" como se usa en la presente se refiere a la amplificación simultánea de objetivos de ADN multiplex en una sola mezcla de reacción de la cadena de la polimerasa (PCR) .
En una modalidad específica de esta invención, este proceso de multiplexidad comprende realizar una reacción de amplificación que comprende por lo menos dos ciclos de renaturalización del cebador, extensión y desnaturalización del cebador, usando pares del cebador del oligo DS, caracterizados porque los cebadores son oligonucleótidos de especificidad dual que tienen tres porciones en las que una porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la secuencia del nucleótido objetivo para hibridizarla, una porción de separación comprende por lo menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja que tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la secuencia del nucleótido objetivo para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5 ' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja, en las tres porciones; la porción de separación forma una estructura de burbuja de apareo base bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a la secuencia del nucleótido objetivo; en donde la renaturalización en la reacción de amplificación se realiza bajo condiciones en las que solamente no ocurre la renaturalización en la porción de especificidad Tm 3' baja. Puesto que esta aplicación al usar el oligo DS de esta invención se lleva a cabo previamente de acuerdo con el presente método para la amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos discutida, excepto para usar más de una secuencia del nucleótido objetivo y pares del cebador, se omiten las descripciones comunes para evitar la complejidad de esta especificación que conduce a una multiplicidad indebida. Por ejemplo, la composición y estructura del oligo DS usado y las condiciones para la amplificación, son comunes entre este proceso y los presentes métodos para la amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos discutida.
De acuerdo a una modalidad preferida, los rangos de temperatura en la renaturalización se encuentran desde aproximadamente 40°C a 70°C, más preferentemente, 45°C a 68 °C, aún más preferentemente, 50°C a 65°C, y más preferentemente, 55°C a 65°C. En una modalidad preferida, los productos amplificados de cada una de las secuencias del nucleótido objetivos son diferentes en el tamaño para su análisis subsecuente. De acuerdo a una modalidad preferida, los productos de amplificación de secuencias del nucleótido objetivo multiplex pueden analizarse a través de la separación del tamaño. La comparación de la separación de tamaño se realiza usando una variedad de métodos conocida en el arte, tales como la electroforesis a través de una matriz de gel de poliacrilamida o matriz de gel de agarosa y secuenciación del nucleótido. La secuenciación del nucleótido puede llevarse a cabo rápidamente con un secuenciador automático disponible de varios fabricantes. Como se ejemplifica en el Ejemplo a continuación, la multiplexidad de esta invención permite a los productos amplificados finales estar libres de problemas de fondo así como no especificidad que se origina de los procesos multiplex convencionales conocidos en el arte. La ventaja de la amplificación multiplex es que numerosas enfermedades o alteraciones de la secuencia del nucleótido específicas (por ejemplo, polimorfismo del nucleótido simple o mutación de punto) pueden ensayarse en la misma reacción. El número de análisis que pueden correrse simultáneamente es ilimitado; sin embargo, el límite superior es probablemente de aproximadamente 20 y es probablemente dependiente de la diferencia de tamaño requerida para la resolución y los métodos que están disponibles para resolver el producto amplificado. El método de la presente invención puede aplicarse al diagnóstico de las enfermedades genéticas e infecciosas, determinación del género, análisis del enlace genético, y estudios forenses. IV. Aplicación de la Secuenciación del ADN La especificidad mejorada permite usar el oligo DS en la secuenciación directa como un cebador de la secuenciación en la fase de la solución (en particular, secuenciación por ciclo) o como una sonda de la secuenciación de la fase sólida (en particular, los oligonucleótidos cortan la secuenciación) usando el principio de extensión dependiente de la plantilla del oligo DS. En un aspecto todavía adicional de esta invención, se proporciona un método para secuenciar una molécula de ácidos nucleicos objetivo usando oligonucleótidos de especificidad dual a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos que comprende las etapas de: (a) sintetizar una molécula de ácidos nucleicos complementaria a la molécula de ácidos nucleicos objetivo para secuenciarse, realizando por lo menos dos ciclos de renaturalización en el cebador, extender y desnaturalizar el cebador, usando los oligonucleótidos de especificidad dual como un cebador de secuenciación; en donde los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la molécula de ácidos nucleicos objetivo para hibridizarla, una porción de separación comprende dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la molécula de ácidos nucleicos objetivo para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación forma una estructura de burbuja sin apareamiento de bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a la molécula de ácidos nucleicos objetivo; en donde la renaturalización en la reacción de síntesis se realiza bajo las condiciones en las que no ocurre la renaturalización solamente para la porción de especificidad Tm 3' baja. (b) determinar una secuencia del nucleótido de la molécula de ácidos nucleicos complementaria sintetizada. Generalmente, la secuenciación de ADN se ha llevado a cabo mediante varias metodologías tales como secuenciación Maxam-Gilbert, secuenciación Sanger, pirosecuenciación, y secuenciación de digestión por exonucleasa. El método de la secuenciación presente mejora la pirosecuenciación así como la secuenciación del ciclo térmico. El presente método puede realizarse de acuerdo con las variaciones del método de didesoxi Sanger. La secuenciación del ciclo térmico de la presente invención puede hacerse en plantillas de ácidos nucleicos de PCR amplificada. Además, de acuerdo con la invención, se realizará la secuenciación de ciclo térmico en una plantilla de ácidos nucleicos que no ha sido amplificada por PCR justo antes de la secuenciación. De manera breve, la secuenciación Sanger se basa en el principio de que la polimerasa de ADN incorporará 2 ',3'-didesoxinucleótidos en las cadenas de ácidos nucleicos que resultan en la terminación de la cadena (Sanger et al., (1977) PNAS. U.S.. 74:5463). El método desarrollado por Sanger se refiere al método de la terminación de la cadena didesoxi. En el más tradicional de este método, un segmento de ADN para la secuencia deseada, se clona en un fago de ADN de una sola hebra, como M13. Estos ADNs del fago pueden servir como plantillas para la síntesis cebada de la hebra complementaria por el fragmento de Klenow de la polimerasa I de ADN. El cebador es un oligonucleótido sintético para hibridizar específicamente con una región del vector MI 3 cerca del extremo 3' del inserto clonado. En cada una de las cuatro reacciones de la secuenciación, la síntesis cebada se lleva a cabo en la presencia de un análogo didesoxi suficiente de uno de los cuatro posibles desoxinucleótidos, para que las cadenas crecientes terminen aleatoriamente por la incorporación de estos nucleótidos de extremo muerto. La concentración relativa de didesoxi para las formas desoxi se ajusta para dar una propagación de los eventos de terminación que corresponden a todas las posibles longitudes de cadena que pueden resolverse mediante electroforesis de gel. Se usan etiquetas incorporadas en las cadenas en crecimiento para desarrollar una imagen de autoradiograma del patrón del ADN en cada huella de la electroforesis. La secuencia de los desoxinucleótidos en la plantilla de ácidos nucleicos clonada se determina a partir de un examen del patrón de bandas en las cuatro líneas. Como una variación del método de Sanger, el método de secuenciación de ciclo térmico involucra normalmente el uso de soluciones que contienen un cebador de secuenciación de ácidos nucleicos, trifosfatos de desoxinucleosido, uno o más trifosfatos de didesoxinucleosido (ddNTPs) , una solución de amortiguamiento adecuada, una polimerasa de ADN estable térmica (por ejemplo, la polimerasa Taq) , y la plantilla de ácidos nucleicos a ser secuenciada. Pueden encontrarse detalles de secuenciación del ciclo térmico en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,432,065, 5,723,298, 5,756,285, 5,817,797 y 5,831,065, las enseñanzas se incorporan en la presente incorporadas mediante las referencias en su totalidad. Los procesos del método generalmente se realizan bajo las condiciones del ciclo térmico similares a la PCR común. Una vez que una reacción de secuenciación se realiza en una plantilla de ácidos nucleicos, la determinación de la secuencia de la molécula requiere que los productos de la reacción se identifiquen. Un número considerable de métodos de detección se conoce en el arte. Estos métodos generalmente involucran la detección de etiquetas que incluyen etiquetas quimioluminicentes e infrarrojas, fluorescentes del radionucleótido como se describe en Ausubel, F., M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1993) John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y. Las etiquetas pueden etiquetarse con cebadores o ddNTP, preferentemente, ddNTP. La etiqueta más preferida es fluorescente, que incluye 6-carboxifluoresceina, 6-carboxi-X-rodamina, 3-(e-carboxipentil) -3 ' -etilo-5, 5 ' -dimetiloxacarbocianina, 6-carboxi-X-rodamina, derivados del ácido 4, 4-difluoro-4-bora- 3aa, aa-diaza-s-indacen-3-propiónico, y colorantes de 4,7-diclororodamina . Preferentemente, los rangos de temperaturas en la renaturalización son de aproximadamente 40°C a 70°C, más preferentemente, 45°C a 68°C, y más preferentemente, 50°C a 65°C. El presente método prueba una secuenciación específica alta de una molécula de ácidos nucleicos objetivo como se demuestra debajo en el Ejemplo. Más específicamente, los genes de la familia de la homeocaja de placenta específica de ratón, Psxl y Psx2el pueden secuenciarse diferencialmente usando su cebador de secuenciación diseñado para tener una estructura única del oligo DS. Tal secuenciación diferencial se resalta en el sentido de que las secuencias totales de los cebadores de la secuenciación son diferentes en sólo una base en la porción de especificidad Tm 3' baja. Sorprendentemente, la presente invención permite a una molécula de ácidos nucleicos objetivo contenida en un ADN genómico o una población de cADNs ser directamente secuenciadas sin purificación o aislamiento. El éxito en la secuenciación directa de una molécula de ácidos nucleicos objetivo en un ADN genómico o una población de cADNs no se han informado todavía. Cuando el método de secuenciación presente se emplea directamente a una secuencia de una molécula de ácidos nucleicos objetivo contenida en una población de cADNs de un ARN total, este método comprende las etapas de: (a) poner en contacto una población de mARNs con un cebador dT del oligonucleótido que se hibridiza a la cola poly A de los mARNs bajo condiciones suficientes para que se presenta la síntesis del ácido ácido enzimática impulsada por la plantilla; (b) transcribir inversamente los mARNs para que la hibridización del cebador dT del oligonucleótido produzca una población de una primer hebra del cADN que es complementaria a los mARNs para que hibridicen al cebador dT del oligonucloetido; (c) sintetizar una molécula de ácidos nucleicos complementaria a la primera hebra del cADN para secuenciarse, realizando por lo menos dos ciclos de la renaturalización del cebador, extender y desnaturalizar al cebador, usando los oligonucleótidos de especificidad dual como un cebador de secuenciación; en donde los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en las que una porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la primera hebra del cADN para hibridizarla, una porción de separación comprende por lo menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la primera hebra del cADN para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; las porciones de separación forman una estructura de burbuja bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a la primera hebra del cADN; en donde la renaturalización en la reacción de síntesis se realiza bajo condiciones en las que solamente no ocurre la renaturalización para la porción de especificidad Tm 3' baja. (b) determinar una secuencia del nucleótido de la primera hebra del cADN sintetizada.
V. Aplicación a la Detección de la Molécula de ácidos nucleicos con Diversidad Genética En otro aspecto de esta invención, se proporciona un método para detectar una molécula de ácidos nucleicos con la diversidad genética mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla de un oligonucleótido de especificidad dual, que comprende las etapas de: (a) renaturalizar los oligonucleótidos de especificidad dual a una plantilla de la molécula de ácidos nucleicos, en donde los oligonucleótidos de especificidad dual tiene tres porciones en los que una porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la plantilla de los ácidos nucleicos para hibridizarla, una porción de separación comprende dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la plantilla de los ácidos nucleicos para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; los separación de la porción forma una estructura de burbuja de apareo base bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a los ácidos nucleicos de la plantilla, en donde la renaturalización se realiza bajo condiciones en donde la renaturalización no ocurre solamente en la porción de especificidad Tm 3' baja y la renaturalización ocurre cuando la porción de especificidad Tm 5' alta y/o la porción de especificidad Tm 3' baja tiene una o más bases sin coincidencia en su sitio objetivo; y (b) extender los oligonucleótidos de especificidad dual para sintetizar la molécula de ácidos nucleicos complementaria a la plantilla. c) detectar la presencia de extensión dependiente de la plantilla de los oligonucleótidos de especificidad dual.
Puesto que la aplicación al usar el oligo DS de esta invención se lleva a cabo de acuerdo con los presentes métodos para sintetizar la secuencia de los ácidos nucleicos discutidos previamente, se omiten las descripciones comunes para evitar la complejidad de esta especificación lo cual conduce a una multiplicidad indebida. La aplicación al usar el oligo DS de la invención objetivo puede proporcionar un método mejorado para detectar selectivamente una secuencia de ácidos nucleicos con diversidad genética mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla involucrando las etapas de renaturalización y extensión. En particular, la detección de una secuencia de ácidos nucleicos objetivo con la diversidad genética puede lograrse repitiendo el proceso de la reacción de extensión dependiente de la plantilla en donde las etapas de renaturalización y de extensión continúen mediante la etapa de desnaturalización. La presente invención se basa en la tolerancia de no coincidencia del oligo DS . Se ha reportado la diversidad genética para varios genomas. Este fenómeno ha sido considerado un obstáculo para detectar un gen o genoma de interés sin fracasos. La presente invención se dirige a proporcionar una metodología para superar tales problemas convencionales mediante el uso del oligo DS con tolerancia de no coincidencia. Los oligo DS con una secuencia definida pueden combinarse en pares básicos en varias secuencias objetivo que muestran la diversidad genética y resultan en la amplificación exitosa y detección de secuencias del nucleótido de interés. En otras palabras, los oligo DS desarrollados originalmente para mejorar dramáticamente la especificidad de renaturalización y la hibridación también pueden usarse en procesos que requieren la tolerancia de no coincidencia donde las condiciones severas o de renaturalización son adecuadamente ajustadas. Para proporcionar el oligo DS que demuestra la tolerancia de no coincidencia, éste debe diseñarse sobre la base de una región conservada de moléculas de ácidos nucleicos generada mediante la alineación de todas las secuencias del nucleótido disponibles. El término "región conservada" como se usa en la presente se refiere a un segmento de la secuencia del nucleótido de un gen o secuencia del aminoácido, de una proteína que es significativamente similar entre varias secuencias del nucleótido distintas de un gen. Este término se usa indistintamente con el término "secuencia conservada". En una modalidad preferida, la mayoría de las secuencias conservadas dentro de la región conservada se localizan en la porción del extremo 3' del oligo DS y la secuencia conservada más baja en la porción de separación. La porción de especificidad Tm 5' alta y/o la porción de especificidad Tm 3' baja, preferentemente la porción de especificidad Tm 5' alta puede ser de uno o más, preferentemente, uno a tres, más preferentemente una o dos bases sin coincidencia a su sitio objetivo debido a la tolerancia de no coincidencia del oligo DS. Para imponer la tolerancia de no coincidencia en el oligo DS, la condición en la renaturalización, en particular, la temperatura en la renaturalización es importante. La renaturalización se realiza bajo condiciones en las que solamente no ocurre la renaturalización en la porción de especificidad Tm 3' baja, aún cuando la renaturalización mediante todas las porciones ocurre cuando la porción de especificidad Tm 5' alta y/o la porción de especificidad Tm 3' baja tienen una o más bases sin coincidencia a su sitio objetivo. Preferentemente, los rangos de temperatura en la renaturalización van desde aproximadamente 40°C a 70°C, más preferentemente, 45°C a 68°C, y más preferentemente, 50°C a 65°C. De acuerdo a una modalidad preferida, la presente invención se realiza de acuerdo con la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) . La etapa de detección del presente método puede llevarse a cabo mediante una multitud de técnicas convencionales. Por ejemplo, la detección del producto de extensión dependiente de la plantilla puede realizarse fácilmente mediante electroforesis de gel convencional si el método presente se ejecuta de una manera repetida para generar productos suficientes a ser detectados en un gel. Si los materiales etiquetados que incluyen los perceptibles por una medición espectroscópica, medición fotoquímica, medición bioquímica, medición bioelectrónica, medición inmunoquímica, medición electrónica, y medición química, una medición adecuada puede realizarse para detectar la presencia de extensión dependiente de la plantilla. La diversidad genética se encuentra más frecuentemente y se genera en el genoma viral (Nathalie B. et al., (2004) Journal of Clinical Microbiology, 42, 3532; Tersa C. et al., (2002) Journal of Infectious Diseases, 185, 1660; Takashi E. et al., (2004) Journal of Clinical Microbiology, 42, 126; y Elizabeth R. et al., (2001) Clinical Infectious Diseases, 32, 1227). A este respecto, se prefiere que la molécula de ácidos nucleicos con la diversidad genética a ser detectada, sea un ácidos nucleico de un virus que exhibe diversidad genética. Por ejemplo, cuando la presente invención se aplica para detectar los metaneumovirus humanos que exhiben diversidad genética por PCR, el conjunto de cebadores diseñado de manera más preferible por tener la estructura del oligo DS se expone en la SEQ ID NOS: 39 (para el cebador 5') y 40 (para el cebador 3') o las SEQ ID NOS: 39 y 41 (para el cebador 3').
VI. Aplicación para la Detección de la Secuencia del Nucleótido Objetivo usando Oligos DS Inmovilizados en Microarreglos Esta aplicación es un nuevo proceso para detectar la secuencia del nucleótido objetivo detector repitiendo la reacción dependiente de la plantilla en los microarreglos inmovilizados por el oligo DS. En otro aspecto de esta invención, se proporciona un método para detectar una secuencia del nucleótido objetivo en una muestra de ácidos nucleicos mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla, que comprende las etapas de: (a) extender un oligonucleótido de especificidad dual como una sonda inmovilizada en un substrato que comprende por lo menos un ciclo de una hibridación, una extensión dependiente de la plantilla y una desnaturalización, en donde la hibridación se realiza al poner en contacto los oligonucleótidos de especificidad dual a la muestra de los ácidos nucleicos, en donde los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en las que una porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la secuencia del nucleótido objetivo para hibridizarla, una porción de separación comprende por lo menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la secuencia del nucleótido objetivo para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación forma una estructura de burbuja de apareamiento sin bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a la secuencia del nucleótido objetivo, en donde la hibridación se realiza bajo condiciones en las que la hibridación no ocurre solamente en la porción de especificidad Tm 3' baja; y (b) analizar la presencia de extensión dependiente de la plantilla. Una representación esquemática para detectar una secuencia del nucleótido objetivo en una muestra de ácidos nucleicos mediante el uso de microarreglos inmovilizadas por el oligo DS se ilustra la FIG. 4. Este proceso usando los oligos DS puede llevarse a cabo bajo condiciones de hibridación rutinarias adecuadas determinadas mediante los procedimientos de optimización. Las condiciones tales como la temperatura, concentración de componentes, hibridación y tiempos de lavado, componentes de amortiguación y su pH y resistencia iónica pueden variar dependiendo de varios factores, que incluyen la longitud y contenido GC de oligonucleótidos y la secuencia del nucleótido objetivo. Por ejemplo, cuando se usan oligonucleótidos relativamente cortos, es preferible que se adopten condiciones severas bajas. Las condiciones detalladas para la hibridación pueden encontrarse en Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); and M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y. (1999). Los oligos DS se inmovilizan en un substrato. Un substrato preferible incluye un sólido adecuado o soportes semisólidos, tales como la membrana, filtro, portaobjetos, astilla, oblea, fibra, cuenta magnética o no magnética, gel, tubería, placa, macromolécula, micropartículas y tubo capilar. Tal inmovilización puede ocurrir a través del enlace químico o el enlace covalente mediante radiación ultravioleta. En una modalidad de esta invención, los oligos DS se enlazan a una superficie de vidrio modificada para contener compuestos epoxi o grupos aldehido o a una superficie revestida con polilisina. Además, los oligos DS se enlazan a un substrato a través de enlazadores (por ejemplo, el oligomer del etilen glicol y la diamina) . Los oligos DS inmovilizados pueden fabricarse para producir una serie o series para una aplicación dada mediante las tecnologías de fabricación convencionales tales como la fotolitografía, inyección de tinta, micromanchado mecánico y derivados de los mismos. De acuerdo al presente método, los dNTPs usados en la etapa de extensión se etiquetan preferentemente. Para el etiquetado, se usan materiales detectables mediante medición espectroscópica, medición fotoquímica, medición bioquímica, medición bioelectrónica, medición inmunoquímica, medición electrónica, o la medición química. Por ejemplo, las etiquetas incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos como el P32 y S35, compuestos quimioluminiscentes, marcadores espectroscópicos, tales como los marcadores de fluorescencia y tintes, y las etiquetas magnéticas. Por ejemplo, los tintes incluyen, pero no se limitan a, colorante de quinolina, colorante de triarilmetano, ftaleina, colorante azoico, y colorante de cianina. Los marcadores de fluorescencia incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, ficoeritrina, rodamina, lisamina, Cy3 y Cy5 (Pharmacia) . El etiquetado se realiza de acuerdo a varios métodos conocidos en el arte. Las secuencias del nucleótido objetivo en una muestra de ácidos nucleicos se hibridizan con los oligos DS como sondas inmovilizadas en un substrato, preferentemente, un soporte sólido, y a su vez los oligos DS hibridizados con las secuencias del nucleótido objetivos se extienden usando dNTPs, preferentemente dNTPs etiquetados con fluorescencia y una polimerasa de ADN en una forma dependiente de la plantilla. La etapa (a) se repite preferentemente para realizar las reacciones de hibridación para la magnitud en la que todos o la mayoría de los oligos DS se hibridizan con las secuencias del nucleótido objetivo, haciendo más reproducibles los resultados de análisis de hibridación. La presencia de hibridación se verifica con varios métodos conocidos en el arte que depende de los tipos de etiquetas usadas. Por ejemplo, microscopio de fluorescencia, preferentemente, el microscopio de fluorescencia confocal se usa para las etiquetas de fluorescencia, y la intensidad de la señal detectada con tales instrumentos incrementa proporcionalmente a la magnitud de hibridación. En general, los microscopios de fluorescencia están provistos con un dispositivo de escaneo o examen que construye una imagen bidimensional cuantitativa de intensidad de hibridación. La intensidad de la señal detectada con tales instrumentos se incrementa proporcionalmente a la magnitud de hibridación y después a la magnitud de una extensión dependiente de la plantilla. La presente invención se describirá ahora en mayor detalle mediante los ejemplos. Seria obvio para aquellos expertos en la técnica que estos ejemplos pretenden ser concretamente más ilustrativos y el alcance de la presente invención establecido en las reivindicaciones anexadas no sea limitado por los ejemplos.
EJEMPLO 1 : Especificidad de PCR usando los Oligonucleótidos de Especificidad Dual (DS) Los oligonucleótidos DS desarrollados mediante la presente invención se aplicaron como cebadores para amplificar las secuencias del nucleótido objetivos de los genes IL-19 e IL-I beta de la familia de la citoquina de ratón. El proceso y los resultados para la amplificación de las secuencias del nucleótido objetivos de IL-19 e IL-1 beta usando los cebadores DS se describen en la presente. Las siguientes secuencias del cebador convencionales se eligieron para comparar a los oligonucleótidos DS en vista de la especificidad de la PCR: Los cebadores convencionales IL-19-especificos usados en el Ejemplo (500 bp) son: IL19-5'-0 5'-GTCTCATCTGCTGCCCTTAAGTCTCTAGGAGAACT-3' (SEQ ID NO:l) ; y IL19-3'-0 5'-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGCTTTACAATAAGTTAG-3' (SEQ ID NO: 2) . Los cebadores convencionales IL-lbeta específicos usados en el Ejemplo (550 bp) son: ILlb-5'-0 5'-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCAATACCCAAAGAAG-3' (SEQ ID NO: 3) ; y ILlb-3'-0 5' - AGACCTCAGTGCAGGCTATGACCAATTCATCCC-3' (SEQ ID NO: 4) . Los oligonucleótidos DS de la invención objetivo se aplicaron a estas secuencias del cebador convencionales para demostrar si los oligonucleótidos DS pueden superar los principales problemas a partir de los cuales surgen estas secuencias del cebador convencionales, tales como la generación de segundo plano y los productos no específicos. Los siguientes cebadores DS comprenden secuencias idénticas a los cebadores convencionales anteriores excepto la porción de separación que tiene un enlazador de polidesoxiinosina [poli (di)] entre la porción 5' y la porción 3'. Los cebadores DS se diseñan para comprender una porción de especificidad Tm 5' alta y una porción de especificidad Tm 3' baja en una forma en la que la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, mientras la porción de separación tiene la Tm más baja entre las tres porciones. Los cebadores DS para IL-19 usados en el Ejemplo (500 bp) son: IL19-5 5'-GTCTCATCTGCTGCCCTTAAIIIIITAGGAGAACT-3* (SEQ ID NO: 5) ; y IL19-3 5'-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGIIIIICAATAAGTTAG-3' (SEQ ID NO: 6), en donde I es desoxiinosina.
Los cebadores DS para IL-lbeta usados en el Ejemplo (550 bp) son: ILlb-5 5'-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCIIIIICCAAAGAAG-3' (SEQ ID NO:7); e ILlb-3 5 ' -AGACCTCAGTGCAGGCTATGIIIIITTCATCCC-3 ' (SEQ ID NO:8), en donde I es desoxiinosina. La amplificación de PCR objetivo se condujo en el volumen final de 20 µl que contenía 2 µl (50 ng) del ADN genómico de los tejidos de la placenta de la cepa ICR de ratón ICR, 2 µl de la solución amortiguadora para la reacción 10 x PCR que contenía 15 mm MgC12 (Roche), 2 µl de dNTP (2 mm cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP) , 1 µl de DS 5' o el cebador convencional (10 µM) , 1 µl de DS 3 ' o el cebador convencional (10 µM) , y 0.5 µl de polimerasa Taq (5 unidades/µl; Roche); el tubo contenía la mezcla de la reacción que se colocó en ciclizador térmico precalentado (94°C); las muestras se desnaturalizaron durante 5 minutos a 94 °C y se sometieon a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 60°C, y 1 min a 72°C, seguido por una incubación a 7 min. a 72°C. Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 2% y se detectó mediante teñido con bromuro de etidio. Los productos de la PCR resultantes también podrían detectarse en un gel de poliacrilamida de desnaturalización mediante la autoradiografia o métodos de detección no radiactivos, tales como el teñido con plata (Gottschlich et al., (1997) Res. Commun. Mol. Path. Pharm. 91, 237- 240; Kociok, N., et al. (1998) Mol. Biotechnol. 9, 25-33), o usando oligonucleótidos etiquetados con fluorescencias (Bauer D., et al., (1993) Nucleic Acids Res. 21, 4272-4280; Ito, T. et al., (1994) FEBS Lett. 351, 231-236. Luehrsen, K.R. et al., (1997) BioTechniques 22, 168-174; Smith, N.R. et al., (1997) BioTechniques 23, 274-279), y el uso de cebadores biotinilados (Korn, B. et al., (1992) Hum. Mol. Genet. 1, 235-242; Tagle, D.A. et al., (1993) Nature 361. 751-753; Rosok, O. et al., (1996) BioTechniques 21, 114-121). Como se muestra en la FIG. 5, las amplificaciones de PCR objetivos para los genes IL-Ib e IL-19 de la familia de la citoquina que hacen uso de cada conjunto del cebador ILlb-5 e ILlb-3, e IL19-5 e IL19-3 generan una sola banda que corresponde al tamaño esperado de 550-bp IL-lbeta (línea 2) y el tamaño esperado de 500-bp para IL-19 (línea 4), respectivamente. La clonación subsecuente y el análisis de la secuencia de los clones confirmaron que las bandas son los fragmentos IL-lbeta y IL-19. En contraste, el conjunto de cebadores convencional (IL19-5'-0 e IL19-3'-0; ILlb-5'-0 e ILlb-3-O) , que no contienen los productos no específicos producidos [poli (di)], (FIG. 5, líneas 1 y 3) . Estos resultados indican que los cebadores DS diseñados para tener tres porciones Tm diferentes (porción de especificidad Tm 5' alta, porción de especificidad Tm 3' baja y porción de separación) pueden superar los principales problemas que surgen de las secuencias del cebador convencionales tales como los productos de raíz y los productos no específicos y puede reforzar la especificidad de la PCR notablemente.
EJEMPLO 2 : Evaluación de Especificidad de PCR usando Oligonucleótidos de Especificidad Dual (DS) . Los oligonucleótidos de especificidad dual se caracterizan por una especificidad de hibridación alta y tolerancia de no coincidencia que surge de su única estructura, dependiendo de la severidad de la hibridación. La especificidad de hibridación alta de los oligonucleótidoss DS se logra bajo condiciones de severidad altas en las que ambas porciones 5' y 3' se renaturalizan a la plantilla. Entretanto, la tolerancia de no coincidencia de los oligonucleótidos DS se logra bajo condiciones de severidad en la que ambas porciones 5' y 3' se renaturalizan a la plantilla, a pesar de la presencia de uno o más, incluso las diferencias limitadas del par base. La especificidad dual de los oligonucleótidos DS desarrollada según la presente invención se evaluó en términos de la especificidad de hibridación y tolerancia de no coincidencia mediante el 3' -RACE gen de un nuevo gen, DEG10 que fue identificado para ser expresado en la placenta del ratón (Kim, YJ. et al., (2004) Annealing control primer system for identification of differentially expressed genes on agarose gels. BioTechniques 36:424-434; XM 129567). Para esta evaluación, se reemplazaron unos nucleótidos en ambas porciones con otros nucleótidos para ser sin coincidencia a la secuencia de la plantilla objetivo. Los cebadores DS 5'-DEGlO-específicos usados en el Ejemplo son: DEG10-5 ' -108 : 5 ' -TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTCCGATG-3 ' (SEQ ID NO: 9) ; DEG10-5'-103: 5 ' -TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTGCCATC-3 (SEQ ID NO: 10) ; DEG10-5'-102: 5 ' -TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTCCCATC-3 ' (SEQ IDNO:ll) ; DEG10-5'-101: 5 ' -TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTCCCATG-3 ' (SEQ ID NO: 12) ; DEG10-5'-158: 5 ' -TGTACTTATGCGTATCGTCCIIIIICTCCGATG-S ' (SEQ ID NO: 13) ; DEG10-5'-138: 5 ' -TGTACTTTTGCGTTTCGTCCIIIIICTCCGATG-3 ' (SEQ ID NO: 14) ; y DEG10-5 ' -128 : 5 ' -TGTAGTTATGGGTATCCTCCIIIIICTCCGATG-3 ' (SEQ ED NO: 15), en donde los nucleótidos reemplazados están subrayados y en negritas e I es desoxiinosina.
A. Mejora en la especificidad de PCR bajo severidad alta Los ARNs totales de los tejidos de placenta 17.5-dpc (E17.5) de cepa ICR de ratón que se aislaron y usaron para la la síntesis de cADNs de la primera hebra por la transcriptasa inversa, como se describió previamente (Hwang, I.T., et al., (2003) Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplification. BioTechniqms 35:1180-1184). La reacción de la transcripción inversa se realizó usando los ARNs totales durante 1.5 hr a 42 °C en un volumen de la reacción de 20 µl compuesta de lo siguiente: 3 µg de ARN total, 4 µl de 5 x solución amortiguadora de reacción (Promega, U.S..), 5 µl de dNTPs (cada 2 mm) , 2 µl de 10 µM cADN del cebador de síntesis (oligo (dT)2 < Adaptador r) , 0.5 µl del inhibidor de ARNsa (40 unidades/µl, Promega) , y 1 µl de la transcriptasa inversa (200 unidades/µl, Promega) . Los cADNs de las primeras hebras fueron diluidos agregando 180 µl de H20 ultra purificado. La síntesis del cADN del cebador oligo (dT)I8-ACPl es: 5 ' -CTGTGAATGCTGCGACTACGATpm(T) 18-3 ' , en donde I es desoxiinosina. La 3 '-RACE de DEG10 se condujo en un volumen final de 20 µl que contenia 2 µl (30 ng) del ADN de primera hebra diluida, 2 µl de 10 x solución amortiguadora de la reacción por PCR que contenía 15 mm MgC12 (Roche), 2 µl de dNTP (2 mm cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , 1 µl de uno de los cebadores DS DEG10 específicos (10 µM) , 1 µl del oligo (dT) 15-ACP2 (10 µM) , y 0.5 µl de polimerasa Taq (5unidades/µl; Roche); el tubo que contenía la mezcla de la reacción se puso en un ciclizador térmico precalentado (94°C); las muestras se desnaturalizaron durante 5 min a 94 °C y se sometieron a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 68°C, y 1 min a 72°C, seguido por unaincubación a 7 minutos a 72°C. El oligo (dT) 15-ACP2 es: 5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIInI (T) 15-S' , en donde I es desoxiinosina . B. Tolerancia desigual de los oligonucleótidos DS Los cebadores DS de la muestra, la plantilla, y las condiciones PCR para la 3 ' -RACE de DEG10 usados en el Ejemplo 2A se emplearon excepto para la temperatura en la renaturalización. La amplificación de PCR se condujo bajo las siguientes condiciones: un ciclo de 94 °C durante 5 min, 60°C durante 3 minutos, y 72 °C durante 3 min; seguido por 29 ciclos de 94°C durante 40 seg, 65°C durante 1 min, y 72°C durante cuarenta segundos, y un ciclo de extensión final de 7 minutos a 72°C. Como resultado, la FIG. 6A muestra una especificidad de hibridación alta de cebadores de oligonucleótidos DS mediante la 3 '-RACE de DEG10. El cebador DS 5 ' -DEGlO-específico intacto (DEG10-5 ' -108) generó un producto de 677-bp de la 3'-RACE de DEG10 (línea 1) . En contraste, los otros cebadores (DEG10-5'-103, DEG10-5 ' -102, DEG10-5 ' -101, DEG10-5 ' -158, DEG10-5' -138, y DEG10-5 ' -128) con secuencias sin coincidencia en la porción 5' y la porción 3' no generaron ningún producto: la no coincidencia de tres (línea 2), dos (línea 3), o una (línea 4) base(s) en la porción 3'; la no coincidencia de cinco (línea 5) , tres (línea 6) , o dos (línea 7) base(s) en la porción 5'. Estos resultados demuestran que la especificidad dual de los cebadores DS no sólo puede diferenciar las bases sin coincidencia en el extremo 3' sino también en el extremo 5' bajo tales condiciones de severidad alta. En general, la región de cebadores que deben ser perfectamente complementaria a la plantilla es el extremo 3', debido a que este extremo es la región extendida por la polimerasa de ADN y es por consiguiente, la más importante para asegurar que ocurra la renaturalización en la secuencia objetivo correcta. Entretanto, el extremo 5' de los cebadores es menos importante para determinar la especificidad de combinar pares básicos en la secuencia objetivo y puede modificarse para llevar la secuencia adicional tal como los sitios de restricción y secuencias del promotor que no son complementarias a la plantilla (McPherson, MJ. , Moller, S.G. (2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlín Heidelberg, N.Y.). En contraste con éstos, la ventaja excepcional de los cebadores DS se demuestra por la especificidad dual debido a su única estructura, permitiendo la discriminación de bases sin coincidencia en el extremo 5' asi como en el extremo 3'.
La FIG. 6B muestra un ejemplo de la tolerancia de no coincidencia de cebadores de los oligonucleótidos DS mediante 3 '-RACE de DEG10. Aunque los cebadores DS (DEG10-5 ' -108 , DEG10-5'-101, DEG10 - 5'-128, y DEG10-5 ' -138) no tienen o tienen unos pocos nucleótidos de no coincidencia en sus porciones de extremo 5' o 3', aún generaron un producto de 677 bp esperado 3 ' -RACE de DEG10 (líneas 1, 4, 6 y 7). En contraste, los otros cebadores (DEG10-5 ' -103, DEG10-5 ' -102, y DEG10-5 ' -158 ) con los nucleótidos más sin coincidencia en sus porciones 5' o 3' no generaron ningún producto (líneas 2, 3 y 5) . Estos resultados indican que los cebadores DS también pueden aplicarse a las amplificaciones de diversas secuencias del nucleótido que requieren de una tolerancia de no coincidencia . En resumen, estos resultados apoyan los siguientes principios de los cebadores DS: 1) sólo cuando renaturalización ocurre en ambas, porción de especificidad Tm 5' alta y porción de especificidad Tm 3' baja, el cebador DS se extiende para sintetizar una molécula de ácidos nucleicos complementaria a la plantilla (linea 1) ; sin embargo, 2) cuando la renaturalización sólo ocurre en la porción de especificidad Tm 5' alta y no en la porción de especificidad Tm 3' baja, el cebador DS no se extiende para sintetizar una molécula de ácidos nucleicos complementaria a la plantilla (líneas 2-4); y 3) aunque la secuencia de la porción de especificidad Tm 3' baja tiene un empate perfecto a la plantilla, la renaturalización solamente por la porción de especificidad Tm 3' baja no ocurre bajo las condiciones severas altas (líneas 5-7). Con respecto a la porción en la renaturalización, el cebador DS es contrariamente distinto al cebador de control de renaturalización (ACP) que se extiende sólo mediante la renaturalización de la porción de extremo 3' en un etapa de la PCR inicial (Hwang, I.T., et al., (2003) Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplification. BioTechniques 35:1180-1184).
EJEMPLO 3: Discriminación de una sola base usando Oligonucleótidos de Especificidad Dual (DS) . Para demostrar la especificidad dual de los oligonucleótidos DS para la discriminación de una sola base, los genes Psxl y Psx2 de los cADNs de la familia homeocaja de placenta especifica de ratón se amplificaron con cebadores convencionales o cebadores DS. La identidad de la secuencia total entre los dos de Psx cADNs fue del 91% en el nivel del nucleótido (Han, YJ., et al., (2000) Identification and characterization of Psx2, a novel member of the Psx (placenta-specific homeobox) family. Gene 241:149-155). Los cebadores 5' se diseñaron para distinguir Psxl y Psx2 por una o dos bases de discriminación (FIG. 7A) . Sin embargo, el cebador 3' fue diseñado para tener una secuencia conservada para ambos Psx cADNs. El Psxl y P.sx2 específicos convencionales y las secuencias del cebador DS son: Psxl-5'-10: 5'-AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTTCTAGCT-3' (SEQ ID NO: 16) ; Psx2-5'-10: 5 ' -AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTTCTGGCC-3 ' (SEQ ID NO: 17) ; Psxl-5'-l 1: 5 ' -AAGGAAGACATGCTGGTGATnInTTCTAGCT-3 ' (SEQ ID NO: 18) ; Psx2-5'-ll: S'-AAGGAAGACATGCTGGTGATHIIITTCTGGCC-3' (SEQ TD NO: 19) ; Psxl-5'-40: 5'-TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAATGTGA-3' (SEQ JD NO: 20) ; Psx2-5'-40: 5 ' -TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAATCTGA-3 ' (SEQ JD NO: 21) ; Psxl-5'-41: 5 ' -TCTTGCACGATGGATGGGTGnInGAAIGIGA-3 ' (SEQ JD NO: 22) ; Psx2-5'-41: 5 ' -TCTTGCACGATGGATGGGTGnInGAAICIGA-3 ' (SEQ JD NO: 23); y Ps?-3'-2: 5 ' -TTCATCCACACCCATCCATCnInAGATCCCT-3 ' (SEQ ID NO:24), en donde los nucleótidos Psxl o Psx2-específieos son subrayados y están en negritas.
A. Síntesis del cADN de la primera hebra.
El cADN de la primera hebra de la placenta de ratón sintetizada en el Ejemplo 2 se usó como un material de inicio para la 3 '-RACE y una PCR objetivo del cADN de Psx. B. 3 '-RACE de Psxl y Psxl usando Psxl- y Psx2 del cebador DS específico. La 3 '-RACE de Psxl y Psx2 se condujo en un volumen final de 20 µl que contenía 2 µl (30 ng) del cADN de la primera hebra diluida, 2 µl de 10 x solución amortiguadora de reacción por PCR que contenía 15 mm MgC12 (Roche), 2 µl de dNTP (2 mm cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1 µl de uno de 5' Psxl o 5'-Psx2 DS específico o cebadores convencionales (10 µM) , 1 µl de oligo (dT) Í5-ACP2 (10 µM) , y 0.5 µl de polimerasa Taq (5 unidades/µl; Roche) ; el tubo que contenía la mezcla de la reacción se colocó en un ciclizador térmico precalentado (94°C); las muestras se desnaturalizaron durante 5 min a 94 °C y se sometieron a 30 ciclos de 1 min a 94 |C, 1 min a 60-65 |C, y 1 min a 12 ° C, seguido por una incubación a 7 minutos a 72°C. C. Amplificación de ácidos nucleicos objetivo de Psxl y Psx2 usando de Psxl y Psx2 de cebadores DS específicos. La amplificación de la PCR objetivo de Psxl y Psx2 se condujo en un volumen final de 20 µl que contenía 2 µl (30 ng) del cADN de la primera hebra diluida, 2 µl de 10 x solución amortiguadora de la reacción PCR que contenía 15 mm MgC12 (Roche) , 2 µl de dNTP (2 mm cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1 µl de uno de 5' Psxl o 5'-Psx2 DS específico o los cebadores convencionales (10 µM) , 1 µl de Psx-3'-2 (10 µM) , y 0.5 µl de polimerasa Taq (5 unidades/µl; Roche); el tubo que contenía la mezcla de la reacción se puso en un ciclizador térmico precalentado (94°C); las muestras se desnaturalizaron durante 5 min a 94 °C y se sometieron a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 60-65°C, y 1 min a 72°C, seguido por una incubación de 7 minutos a 72°C. Como resultado, la FIG. 7B muestra los productos de la 3 ' -RACE y la PCR objetivo generados por los cebadores 5' Psxl o Psx2 específicos. Puesto que los dos cADNs de Psx difieren entre si por la supresión de 29-bp o inserción hacia su extremo 3', los productos diferentes en tamaño por 29-bp se espera que sean amplificado por su 3 '-RACE. La 3 ' -RACE del cADN Psxl usando los cebadores DS Psxl o Psx2 específicos, Psxl-5'-41 y Psx2-5'-41 cada uno generó una sola banda que corresponde al tamaño 311-bp esperado (línea 1) y 282-bp (línea 2), respectivamente. El análisis de la secuencia subsecuente de los productos generados por 3 ' -RACE confirmaron que los cebadores 5 '-Psxl y Psx2 específicos amplificaron los cADNs de Psxl y de Psx2, respectivamente. En el contraste, los cebadores convencionales (Psxl-5'-40 y Psx2-5'-40), que no cumplen con los principios de los oligonucleótidos DC, no distinguen dos cADNs de Psx (líneas 3 y 4) . Estos resultados indican que los cebadores DS de acuerdo con la presente invención pueden discriminar una no coincidencia de una sola base. Por consiguiente, los oligonucleótidos DS pueden aplicarse para identificar mutaciones de punto o genotipos de polimorfismo de un solo nucleótido.
EJEMPLO 4 : Secuenciación Directa de un cADN Objetivo del Acumulado de cADN usando Oligonucleótidos (DS) de Especificidad Dual . La mayoría de los esfuerzos para identificar y aislar un nuevo cADN da como resultado, la adquisición de clones que representan sólo una parte de la secuencia del mARN. Una vez que la secuencia parcial se ha identificado, el resto del transcrito puede obtenerse a menudo a través de cualquier separación por exclusión de la colección de cADN típica o métodos basados en la PCR como la RACE (amplificación rápida de extremos del cADN) , seguido por la secuenciación del cADN obtenido. Así, todos los métodos actuales son un etapa del requisito previo para obtener la información de la secuencia del resto de la transcripción. Si la información de la secuencia perdida se obtiene directamente de una población de cADNs generada de una célula objetivo, estas etapas de prerrequisito consumibles en el tiempo pueden ser completamente desviadas y la secuencia del cADN objetivo puede determinarse directamente de una muestra biológica cruda. Los oligonucleótidos DS de la invención objetivo se aplicaron como cebadores directamente al gen Psx de los cADNs de homeocaja de placenta específicos usando el acumulado del cADN de la primera hebra. Se describe en la presente el proceso y los resultados para la secuenciación directa de los cADNs del gen de placenta específico del acumulado de cADN de placenta. Se usaron los mismos cebadores DS S'-Psx específicos usados en el Ejemplo. Estos son Psxl-5'-ll, Psx2-5'-ll, Psxl-5'-41, y Psx2-5'-41. A. Síntesis del cADN de la primera hebra. El cADN de la primera hebra de la placenta de ratón sintetizado en el Ejemplo 2 se usó como una plantilla para la secuenciación directa de los cADNs Psx. B. Secuenciación directa del cADN Psx del acumulado de cADN de Placenta usando el cebador DS de Especificidad Psx. La reacción de secuenciación en ciclo se condujo en un volumen final de 20 µl que contenia 13 µl (150 ng) de cADN de la primera hebra diluida, 2 µl de la mezcla de reacción de Terminación por Colorante Grande ABI PRISM (Biosystems Biosystems, USA) , 3 µl de 5 x solución amortiguadora de la reacción de secuencia (Applied Biosystems), y 1.6 µl de uno de los cebadores DS 5 '-Psxl- o 5 ' -Psx2-específicos (1 µM) ; el tubo que contenía la mezcla de la reacción se colocó en un ciclizador térmico precalentado (94°C); las muestras se desnaturalizaron durante 5 min a 94 °C y se sometieron a 40-50 ciclos de 10 segundos a 94°C, 3 min a 50-60°C, y 4 min a 60-65°C. Los productos de la secuenciación se purificaron como lo siguiente: 1) se agregaron 2 µl de 3 M de acetato de sodio (pH 4.6) y 50 µl de 100% EtOH fresco, 2) se mantuvo a -75°C durante 30 min, 3) se centrifugó durante 15-30 min a 13,000 g y el sobrenadante se removió, 4) se lavó con 200 µl de 70% EtOH, 5) se centrífugo durante 15-30 minutos a 13,000 g y se removió el sobrenadante cuidadosamente, y se secó. El peletizado se volvió a suspender en 10 µl de Formamida HiDi justo antes de correrse el producto de secuenciación en el Analizador Genético ABI PRISM 3100. Sorprendentemente, los cebadores Psx DS secuenciaron precisamente sus cADNs Psx específicos. En otras palabras, el cebador DS Psxl específico (Psxl-5'-41) secuenció solo el cADN de Psxl y el cebador Psxl-específico (Psx2-5'-41) secuenció solo el cADN de Psx2 (FIG. 8) . La región de 29-bp de supresión en Psx2 se muestra por una barra negra. En contraste, los cebadores convencionales (Psxl-5'-40 y Psx2-5' -40), que no cumplen con los principios de los oligonucleótidos DS, no distinguieron dos cADNs Psx. Estos resultados indican que los cebadores DS pueden discriminar la no coincidencia de una sola base incluso en la secuenciación del ciclo, así como en la amplificación de la PCR.
EJEMPLO 5: PCR Multiplex usando Oligonucleótidos de Especificidad Dual (DS) Para demostrar la aplicación de cebadores de oligonucleótidos DS en la PCR multiplex, nueve genes diferentes de la familia de la citoquina se amplificaron con los cebadores DS. Se describe en la presente el proceso y los resultados para la amplificación de la PCR multiplex usando los cebadores DS. Los cebadores DS específicos del gen de la familia de la citoquina se diseñaron para generar una escalera de 50 bp usando la secuencia del exon más larga de cada gen de la citoquina. Los cebadores DS para IL-3 usados en el Ejemplo (200 bp) son: IL3-5' 5'-GCTGCCAGGGGTCTTCATTCIIIIICTGGATGA-3' (SEQ ID NO: 25); y IL3-3' 5'-GGCCATGAGGAACATTCAGAIIIIIGGTGCTCT-3' (SEQ ID NO:26) . Los cebadores DS para IL-15 usados en el Ejemplo (250 bp) son: IL15-5' 5'-ATGTAGCAGAATCTGGCTGCIIIIIATGTGAGG-3' (SEQ ID NO: 27); y IL5-3' 5'-ATGTGATCCAAGTGGCTCATIIIIICCTTGTTAGG-3' (SEQ ID NO:28) . Los cebadores DS para IL-18 usados en el Ejemplo (300 bp) son: IL18-5' 5'-AGGAAATGGATCCACCTGAAIIIIITGATGATATA-3' (SEQ ID NO:29) ; y IL18-3' 5'-ATGGAAATACAGGCGAGGTCIIIIIAAGGCGCA-3' (el SEQ JD NO: 30) . Los cebadores DS para IL-25 usados en el Ejemplo (350 bp) son: IL25-5' 5'-AGCTCTCCAAGCTGGTGATCIIIIICAAGGCGG-3' (SEQ ED NO: 31); y IL25-3' 5'-GAGCTGCCCTGGATGGGGTTIIIIIGTGGTCCT-3' (SEQ ID NO:32). Los cebadores DS para IL-2 usados en el Ejemplo (400 bp) son: IL2-5' 5 ' -CTCTGACAACACATTTGAGTGCIIIIICGATGATGAG-3 ' (SEQ ID NO: 33) ; e IL2-3' 5'-GTGCTGTCCTAAAAATGACAGAIIIIIGAGCTTATTT-3' (SEQ ID NO:34) . Los cebadores DS para IL-6 usados en en el Ejemplo (450 bp) son: IL6-5' 5'-CCAATGCTCTCCTAACAGATAAIIIIIAGTCACAGAA-3' (SEQ ID NO: 35) ; y IL6-3' 5'-AGGTAAACTTATACATTCCAAGAAAIIIIITGGCTAGG-3' (SEQ ID NO:36) . Los cebadpres DS para IL-19 usados en el Ejemplo (500 bp) son: IL19-5' 5'-GTCTCATCTGCTGCCCTTAAIIIIITAGGAGAACT-3' (SEQ ID NO:5) ; y IL19-3' 5'-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGIIIIICAATAAGTTAG-3' (SEQ ID N0:6) . Los cebadores DS para IL-lbeta usados en el Ejemplo (550 bp) son: ILlb-5' 5'-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCIIIIICCAAAGAAG-3' (SEQ ID NO: 7 ) ; y ILlb-3' 5'-AGACCTCAGTGCAGGCTATGIIIIITTCATCCC-3' (SEQ ID NO: 8) . Los cebadores DS para IL-10 usados en el Ejemplo (600 bp) son: IL10-5' 5'-AAGGCCATGAATGAATTTGAIIIIITCATCAACTG-3' (SEQ ID NO: 37) ; y IL10-3' 5'-TGACAGTAGGGGAACCCTCTIIIIIGCTGCAGG-3' (SEQ ID NO:38) .
A. PCR Monoplex usando un conjunto de cebadores DS de gen específico de la familia de la citoquina. La única amplificación de PCR objetivo para cada gen de la familia de la citoquina se condujo en un volumen final de 20 µl que contenía 2 µl (50 ng) del ADN genómico de ratón, 2 µl de 10 x solución amortiguadora de la reacción de PCR que contenía 15 mM MgCl2 (Roche), 2 µl de dNTP (2 mm cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 µl de cada cebador DS 5' específico de la familia de la citoquina (10 µM) , 1 µl de cada cebador DS 3' específico de la familia de la citoquina (10 µM) , y 0.5 µl de polimerasa Taq (5unidades/µl; Roche) ; el tubo que contenía la mezcla de la reacción se colocó en un ciclizador térmico precalentado (94°C); las muestras se desnaturalizaron durante 5 min a 94 °C y se sometieron a 30 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 60-65°C, y 1 min a 72°C, seguido por una incubación durante 7 minutos a 72 °C. B. PCR multiplex usando 9 conjuntos de cebadores DS de genes específicos de la familia de la citoquina. La amplificación de PCR multiplex se condujo en un solo tubo usando 9 conjuntos de cebadores DS del gen específico de la familia de la citoquina; la mezcla de la reacción fue de un volumen final de 50 µl que contenía 100 ng de ADN genómico de ratón, 5 µl de 10 x solución amortiguadora de la reacción por PCR que contenía 15 mM MgCl2 (Roche), 5 µl de dNTP (2 mm cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1 µl de cada cebador DS 5' del gen específico de la familia de la citoquina (0.2-5 µM) , 1 µl de cada c cebador DS 3' del gen específico de la familia de la citoquina (0.5-5 µM) , y 0.5 µl de polimerasa Taq (5 unidades/µl; Roche) ; el tubo que contenía la mezcla de la reacción se colocó en un ciclizador térmico precalentado (94°C); las condiciones de la PCR fueron de un ciclo de 94°C durante 5 min, 50°C durante 3 min, y 72 °C durante 3 min; seguido por 29 ciclos de 94 °C durante 40 seg, 60°C durante 1 min, y 72°C durante 40 seg, y un ciclo de extensión final de 5 minutos a 72°C.
Como se muestra en la FIG. 9, la amplificación de PCR multiplex genera bandas múltiples que corresponden a los tamaños esperados de 200 bp a 600 bp para 9 productos de gen de citoquina diferentes (FIG. 4, línea 1) . Cada amplificación de PCR monoplex generó una sola banda que corresponde al tamaño esperado de 200 bp IL-3 (FIG. 4, línea 2), 250 bp para IL-15 (FIG. 4, línea 3), 300 bp para IL-18 (FIG. 4, línea 4), 350 bp para IL-25 (FIG. 4, línea 5), 400 bp para IL-2 (FIG. 4, línea 6), 450 bp para IL-6 (FIG. 4, línea 7), 500 bp para IL-19 (FIG. 4, línea 8), 550 bp para IL-lbeta (FIG. 4, línea 9), y 600 bp para IL-10 (FIG. 4, línea 10), respectivamente.
Por consiguiente, podría apreciarse que los cebadores DS desarrollados en la presente invención pueden aplicarse con éxito a la PCR multiplex. La única estructura de oligonucleótidos DS permite superar el problema común de cualquier PCR multiplex convencional, a saber, la interferencia del cebador y la formación más oscura.
EJEMPLO 6 : Detección de Metaneumovirus Humano usando la Tolerancia de No coincidencia en Oligonucleótidos (DS) de Especificidad Dual . Para demostrar la aplicación de cebadores de oligonucleótidos DS en la tolerancia de no coincidencia, los cebadores DS se aplicaron para detectar el metaneumovirus humano (hMPV) en las muestras clínicas. El proceso y los resultados para la detección del metaneumovirus humano usando los cebadores DS se describen en la presente. Este Ejemplo no debe traducirse como una limitante de las aplicaciones de la invención para la detección del virus específico. Los cebadores DS se diseñaron en base a la región conservada del gen de la glicoproteína de fusión (F) generado por la alineación de secuencias de todos los aislados hMPV disponibles (ver Tabla 1) . Para tolerar la diversidad genética de estos aislados, los cebadores se diseñaron en base a los siguientes criterios: (a) las regiones conservadas deben tener por lo menos 30 nucleótidos en longitud a pesar de la presencia de uno o más, aún limitadas diferencias en el par base (Tabla 1); (b) la mayoría de las secuencias sin coincidencia dentro de las regiones conservadas se localizan preferentemente en la porción de separación en el cebador DS (por ejemplo, hMPV 5 '-585, hMPV 3 '-698, y hMPV 3' -1007); (c) por otra parte, los nucleótidos sin coincidencia se localizan en la porción del extremo 5', algunos de los cuales podría reemplazarse con las bases universales tales como las desoxiinosinas (por ejemplo, hMPV 3' -698 y hMPV 3'-1007); y (d) uno o dos nucleótido (s) sin coincidencia en la porción del extremo 3' puede reemplazarse con el nucleótido (s) degenerado o base(s) universales (por ejemplo, hMPV 3'-1007).
TABLA 1. Cebadores de Oligonucleótidos hMPV Específicos Basados en la Región Conservada del Gen de Glicoproteína de Fusión (F) de todos los Aislados disponibles hMPV.
No. de Cebador Secuencia aislados AGCTTC-AGTCAATTaVAa.GAAGßTTCCTAAATGTTG- 1 AGCTTC?GTOVATTCa-AC?GAAGATCTCTAAATGTTG- 3 AGCTTCAGTCAATTCAAOVGAAGAITCCTAAATGTTG- 4 Secuencias de virus < AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGATTOCTAAATGTTG- 1 AGCTTCAGTaVATTCAACAGAAGArECCTAAATGTTG- 9 •AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGGTTTCTAAATGTTG- 14 Cebador 5' (585) : 5' -AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAIIIIICTAAATGTTG-3' Secuencias de virus Cebador 3' (698) : •••TTGACTGCTCAGC^CATTGATTCCTCCTGCTGTGTC 2 •••TTGATOGCTCIAGC^CATTGATCCCTCCTGCTGTGTC 7 •••TTGAOTGCTCAGCAACATTGATCCCTGCAGCTGTGTC------ 8 Secuencias de virus < •••TTGATTGCTC-AG8ACATTsATCCCJPGCTGCTGTGTC 1 •••TTGATOGW(»GCAAC?TTGATCCCTCCTCCTGTGTC 1 •"TTGAOTGCXa\GCAAC-ATTAATTCCTGCTGCTGTGTC 9 •••TTGAOTGCTOMK^CATTAATWXCGCTGCTGTGTC 2 Cebador 3' (1007 ) : 5' -TTGAITGCTCAGCIACATTGATIIIIICWGCTGTGTC-3' * La diversidad genética entre los aislados hMPV se muestra como los nucleótidos subrayados. Los cebadores DS específicos para el gen F hMPV usado en el Ejemplo son: hMPV 5 '-585 5 ' -AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAIIIIICTAAATGTTG 3' (SEQ ID NO:39) ; hMPV 3' -698 5' - AACATCAITTTTATITGTCCTGCAIIIIITGGCATGT-3' (SEQ ID NO:40) ; y hMPV 3 '-1007 5 ' -TTGAITGCTCAGCIACATTGATIIIIICWGCTGTGTC-3 ' (SEQ ID NO:41) , en donde W puede ser A o T, e I es desoxiinosina. El ARN total viral se extrajo usando el método B ARNzol de acuerdo con el protocolo del fabricante (RNAzol LS; Tel-Test, Inc.). La reacción de transcripción inversa fue realizada para sintetizar cADN usando el ARN viral durante 1.5 hr a 42 °C en un volumen de la reacción de 20 µl compuesto de lo siguiente: 5 µl de ARN total (aproximadamente 100 ng) , 4 µl de 5 x solución amortiguadora de reacción (Invitrogen, U.S..), 5 µl de dNTPs (cada 5 mm) , 2 µl de 10 µM de hexadesoxinucleótidos aleatorios, 0.5 µl del inhibidor de ARNsa (40 unidades/µl, Promega), y 1 µl de la transcriptasa inversa del virus de la Leucemia de murino Moloney (200 unidades/µl, Promega) . La amplificación de PCR objetivo del gen F hMPV se condujo en un volumen final de 20 µl que contenía 2 µl (30 ng) del primer cADN de la hebra, 2 µl de 10 x solución amortiguadora de la reacción por PCR que contenía 15 mm MgC12 (Roche), 2 µl de dNTP (2 mm cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1 µl del cebador DS 5' hMPV específico (hMPV 5' -585; 10 µM) , 1 µl del cebador DS 3' hMPV-específico (hMPV 3 '-698 o hMPV 3'-1007; 10 µM) , y 0.5 µl de polimerasa Taq (5 unidades/µl; Roche) ; el tubo que contenía la mezcla de la reacción se colocó en un puso en un ciclizador térmico precalentado (94°C); las muestras se desnaturalizaron durante 5 min a 94°C y se sometieron a 30 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 60-65 °C, y 1 min a 72 °C, seguido por una incubación durante 7 minutos a 72°C. Como se mostró en la FIG. 10B, cada par de cebadores DS hMPV-específicos (hMPV 5 '-585 y hMPV 3 '-698, y hMPV 5 '-585 y hMPV 3' -1007) generan una sola banda que corresponde a los tamaños esperados de 150-bp y 459-bp, respectivamente (las líneas 1 y 2) . El análisis de secuencia subsecuente de los productos confirmó que estas son las secuencias parciales del gen (F) de la glicoproteína de fusión hMPV. En contraste, estos cebadores no generan ningún producto en una PCR de control negativo sin la plantilla, (líneas 4 y 5) . Como un control positivo, se usó el conjunto del cebador beta-actina específica de humano (línea 3) . Estos resultados indican que los cebadores DS pueden aplicarse para detectar hMPVs de un paciente con infecciones respiratorias. Así, podría comprenderse que los oligonucleótidos DS pueden adaptarse, como los cebadores en la amplificación de PCR o sondas en el corte de los oligonucleótidos, a todas las situaciones potenciales encontradas en el campo.
EJEMPLO 7 : Detección de la Secuencia del Nucleótido Objetivo usando Microarreglos Oligo-in ovilizados DS Los oligos DS complementarios a una región de una molécula de ácidos nucleicos objetivo se sintetizan por medio de un sintetizador de ADN (Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems (ABI) ) de acuerdo con un protocolo normal. Los oligos DS sintetizados se inmovilizan en un portaobjetos de vidrio para una microordenación. Entonces, una mezcla de reacción de extención dependiente de la plantilla que contenía 50-200 ng de la muestra de ADN, 5 µl de 10 x solución amortiguadora de la reacción por PCR (Promega), 5 µl de 15 mM MgCl2, 5 µl de dNTP etiquetado por fluorescencia (2 mm cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y 0.5 µl de polimerasa Taq (5 unidades/µl; Promega) se agrega a la microordenación después de que las microarreglos se colocan en un ciclizador térmico precalentado (94°C). La reacción de extensión dependiente de la plantilla se conduce de acuerdo al siguiente ciclo térmico: desnaturalización durante 5 min a 94°C, y 15-50 ciclos de 1 min a 94°C, 1-3 min a 50-65°C y 1-4 min a 60-72°C, seguido por una extensión de 5 minutos a 72CC. Siguiendo la reacción de extensión dependiente de la plantilla, los oligos DS extendidos se lavan y se detectan mediante sus imágenes fluorescentes a través de un escáner de microarreglos, seguido por el análisis de las imágenes.
EJEMPLO 8 : Formación de Genotipos SNP (Polimorfismo de un Solo Nucleótido) usando Oligonucleótidos DS. Los oligos DS se sintetizan por medio de un sintetizador de ADN (Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems (ABI)) de acuerdo con el protocolo estándar al colocar una base polimórfica (sitio de la interrogación) en el centro de la porción de especificidad Tm 3' baja. Los oligonucleótidos sintetizados se inmovilizan en un portaobjetos de vidrio para microarreglos. Entonces, una mezcla de reacción de extensión dependiente de la plantilla que contenía 50-200 ng de muestra de ADN, 5 µl de 10 x solución amortiguadora de la reacción PCR (Promega), 5 µl de 15 mm MgC12, 5 µl de dNTP etiquetado por fluorescencia (2 mm cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y 0.5 µl de polimerasa Taq (5 unidades/µl; Promega) se agrega a las microarreglos después de que las microarreglos se colocan en un ciclizador térmico precalentado (94°C) . La reacción de extensión dependiente de la plantilla se conduce de acuerdo al siguiente ciclo térmico: desnaturalización durante 5 min a 94 °C, y 15-50 ciclos de 1 min a 94°C, 1-3 min a 50-65°C y 1-4 min a 60-72 °C, seguido por una extensión de 5 minutos a 72 °C. Siguiendo la reacción de extensión dependiente de la plantilla, los oligos DS extendidos se lavan y se detectan mediante sus imágenes fluorescentes a través de un escáner de microarreglos, seguido por el análisis de las imágenes. Habiendo descrito una modalidad preferida de la presente invención, se entenderá que las variantes y modificaciones que caen dentro del espíritu de la invención pueden ser aparentes para los experimentados en este arte, y el alcance de esta invención será determinado por las reivindicaciones anexadas y sus equivalentes.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para sintetizar una molécula de ácidos nucleicos usando un oligonucleótido de especificidad dual mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) renaturalizar los oligonucleótidos de especificidad dual a una molécula de ácidos nucleicos de la plantilla, en donde los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en la que una porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación, substancialmente complementaria a un sitio en los ácidos nucleicos de la plantilla para hibridizarla, una porción de separación comprende por lo menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en los ácidos nucleicos de la plantilla para hibridizarla; la Tm, de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación forma una estructura de burbuja sin apareamiento de bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a los ácidos nucleicos de la plantilla, en donde la renaturalización se realiza bajo condiciones en las que la renaturalización no ocurre únicamente por la porción de especificidad Tm 3' baja; y (b) extender los oligonucleótidos de especificidad dual para sintetizar la molécula del ácido nucleico complementaria al ácido nucleico de la plantilla. 2. Un método para amplificar selectivamente una secuencia de ácidos nucleicos objetivo de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos, que comprende amplificar la secuencia de ácidos nucleicos objetivo realizando por lo menos dos ciclos de renaturalización del cebador, extender y desnaturalizar el cebador, usando un conjunto de cebadores que comprende por lo menos un oligonucleótido de especificidad dual; caracterizado porque los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en el ácido nucleico objetivo para hibridizarla, una porción de separación comprende al menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia de nucleótidos hibridizable sustancialmente complementaria a un sitio en los ácidos nucleicos objetivo para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación forma una estructura de burbuja sin apareamiento de bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a los ácidos nucleicos objetivo; en donde la renaturalización en la reacción de amplificación se realiza bajo condiciones en las que la renaturalización solamente no ocurre por la porción de especificidad Tm 3' baja. 3. Un método para amplificar simultáneamente dos o más secuencias de nucleótidos objetivos haciendo uso de dos o más pares de cebadores en la misma reacción, que comprende amplificar las secuencias del nucleótido objetivo realizando por lo menos dos ciclos de renaturalización del cebador, extensión y desnaturalización del cebador, usando dos o más pares del cebador, en donde al menos un cebador del par del cebador es un oligonucleótido de especificidad dual, caracterizado porque los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en la que una porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la secuencia del nucleótido objetivo para hibridizarla, una porción de separación comprende por lo menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la secuencia del nucleótido objetivo para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación forma una estructura de burbuja sin apareamiento de bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a la secuencia del nucleótido objetivo; en donde la renaturalización en la reacción de amplificación se realiza bajo condiciones en la que la renaturalización no ocurre solamente por la porción de especificidad Tm 3' baja. 4. Un método para secuenciar una molécula de ácidos nucleicos usando un oligonucleótido de especificidad dual a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) sintetizar una molécula de ácidos nucleicos complementaria a la molécula de ácidos nucleicos objetivo para secuenciarse, realizando por lo menos dos ciclos de renaturalización en el cebador, extender y desnaturalizar el cebador, usando los oligonucleótidos de especificidad dual como un cebador de secuenciación; en donde los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la molécula de ácidos nucleicos objetivo para hibridizarla, una porción de separación comprende por lo menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la molécula de ácidos nucleicos objetivo para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación forma una estructura de burbuja sin apareamiento de bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a la molécula de ácidos nucleicos objetivo; en donde la renaturalización en la reacción de síntesis se realiza bajo las condiciones en las que no ocurre la renaturalización solamente por la porción de especificidad Tm 3' baja. (b) determinar una secuencia del nucleótido de la molécula de ácidos nucleicos complementaria sintetizada. 5. Un método para detectar una molécula de ácidos nucleicos con diversidad genética mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla, de un oligonucleótido de especificidad dual, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) renaturalizar los oligonucleótidos de especificidad dual a una plantilla de la molécula de ácidos nucleicos, en donde los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en las que una porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la plantilla de los ácidos nucleicos para hibridizarla, una porción de separación comprende por lo menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la plantilla de los ácidos nucleicos para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación forma una estructura de burbuja sin apareamiento de bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja, se renaturalizan a los ácidos nucleicos de la plantilla, en donde la renaturalización se realiza bajo condiciones en donde la renaturalización no ocurre solamente por la porción de especificidad Tm 3' baja y la renaturalización ocurre cuando la porción de especificidad Tm 5' alta y/o la porción de especificidad Tm 3' baja tiene una o más bases sin coincidencia en su sitio objetivo; y (b) extender los oligonucleótidos de especificidad dual para sintetizar la molécula de ácidos nucleicos complementaria a la plantilla. c) detectar la presencia de extensión dependiente de la plantilla de los oligonucleótidos de especificidad dual. 6. Un método para detectar una secuencia del nucleótido objetivo en una muestra de ácidos nucleicos mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla de un oligonucleótido de especificidad dual, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) extender un oligonucleótido de especificidad dual como una sonda inmovilizada en un substrato que comprende por lo menos un ciclo de una hibridación, una extensión dependiente de la plantilla y una desnaturalización, en donde la hibridación se realiza al poner en contacto los oligonucleótidos de especificidad dual a la muestra de los ácidos nucleicos, en donde los oligonucleótidos de especificidad dual tienen tres porciones en las que una porción de especificidad Tm 5' alta tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la secuencia del nucleótido objetivo para hibridizarla, una porción de separación comprende por lo menos dos bases universales y una porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en la secuencia del nucleótido objetivo para hibridizarla, la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación forma una estructura de burbuja sin apareamiento de bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a la secuencia del nucleótido objetivo, en donde la hibridación se realiza bajo condiciones en las que la hibridación no ocurre solamente en la porción de especificidad Tm 3' baja; y (b) analizar la presencia de extensión dependiente de la plantilla. 7. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la base universal en la porción de separación se selecciona del grupo que consiste de desoxiinosina, inosina, 7-deaza-2 ' -desoxiinosina, 2-aza-2 ' -desoxiinosina, 2 '-OMe inosina, 2'-F inosina, desoxi 3-nitropirrol, 3-nitropirrol, 2 ' -OMe 3-nitropirrol, 2'-F 3-nitropirrol, 1- (2 ' -desoxi-beta-D-ribofuranosil) -3-nitropirrol, desoxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2 ' -OMe 5-nitroindol, 2'-F 5-nitroindol, desoxi 4-nitrobenzimidazol, 4-nitrobenzimidazol, desoxi 4-aminobencimidazol, 4-aminobencimidazol, desoxi nebularina, 2'-F nebularina, 2'-F 4-nitrobencimidazol, PNA-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobencimidazol, PNA-3-nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobenzimidazol, morfolino-3- nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4-nitrobencimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2'-0-metoxietil inosina, 2 'O-nebularina de metoxietil, 2'-0-metoxietil 5-nitroindol, 2 ' -O-metoxietil 4-nitrobencimidazol, 2' -O-metoxietil 3-nitropirrol, y combinaciones de los mismos. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la base universal es desoxiinosina, 1- (2 '-desoxi-beta-D-ribofuranosil) -3-nitropirrol o 5-nitroindol. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la base universal es desoxiinosina. 10. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la porción de separación comprende nucleótidos contiguos que tienen bases universales. 11. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la porción de especificidad Tm 5' alta es más larga que la porción de especificidad Tm 3' baja. 12. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la porción de especificidad Tm 3' baja tiene la secuencia del nucleótido de hibridación perfectamente complementaria al sitio en el ácido nucleico de la plantilla para hibridizarla. 13. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la porción de especificidad Tm 5' alta es de 15 a 40 nucleótidos en longitud. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la porción de especificidad Tm 5' alta es de 15 a 25 nucleótidos en longitud. 15. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la porción de separación es de al menos 3 nucleótidos en longitud. 16. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la porción de separación es de 3 a 10 nucleótidos en longitud. 17. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la porción de especificidad Tm 3' baja es de 3 a 15 nucleótidos en longitud. 18. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la porción de especificidad Tm 5' alta es de 15 a 25 nucleótidos en longitud, la porción de separación es de 3 a 10 nucleótidos en longitud, y la porción de especificidad Tm 3' baja es de 3 a 15 nucleótidos en longitud. 19. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta se encuentra en los rangos de 40°C a 80°C de especificidad. 20. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la Tm, de la porción de especificidad Tm 3' baja se encuantra en los rangos de 10°C a 40° °C de especificidad. 21. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la Tm de la porción de separación se encuentra en los rangos de 3°C a 15°C. 22. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la renaturalización se realiza a una temperatura en el rango de 45°C a 68°C. 23. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 5, caracterizado porque la síntesis de una secuencia de ácidos nucleicos objetivo se logra repitiendo el proceso de la reacción de extensión dependiente de la plantilla en donde la renaturalización de los oligonucleótidos de especificidad dual y las etapas de extensión se continúan por la etapa de la desnaturalización. 24. El método de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque la amplificación se realiza de acuerdo con la reacción en cadena de la polimerasa. 25. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la molécula de ácidos nucleicos objetivo a ser secuenciada está contenida en un ADN genómico o una población de cADNs. 26. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de ácidos nucleicos con diversidad genética es un ácido nucleico de un virus que exhibe diversidad genética. 27. Un oligonucleótido de especificidad dual para sintetizar una molécula de ácidos nucleicos mediante una reacción de extensión dependiente de la plantilla, que se representa por la siguiente fórmula general: O —Xp— q—¿r—O en donde, Xp representa una porción de especificidad Tm 5' alta que tiene una secuencia del nucleótido de hibridización substancialmente complementaria a un sitio en un ácido nucleico de la plantilla para hibridizarlo, Yq representa una porción de separación que comprende por lo menos dos bases universales, Zr representa una porción de especificidad Tm 3' baja, que tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria a un sitio en los ácidos nucleicos de la plantilla para hibridizarlos, p, q y r representan el número de nucleótidos, y X, Y, y Z son desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos; la Tm de la porción de especificidad Tm elevada 5', es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja, la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; las porciones de separación forman una estructura de burbuja sin apareamiento de bases bajo condiciones en las que la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja se renaturalizan a los ácidos nucleicos de la plantilla, permitiendo que la porción de especificidad elevada Tm 5' se separe de la porción de especificidad Tm 3' baja en términos de especificidad para combinar pares básicos a los ácidos nucleicos de la plantilla, por medio del cual la especificidad en la renaturalización de los oligonucleótidos se determine dualmente mediante la porción de especificidad Tm elevada 5' y la porción de especificidad Tm 3' baja, tal que se mejore la especificidad en la renaturalización total de los oligonucleótidos. 28.. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la base universal en la porción de separación se selecciona del grupo que consiste de desoxiinosina, inosina, 7-deaza-2'-desoxiinosina, 2-aza-2 '-desoxiinosina, 2 ' -OMe inosina, 2'-F inosina, desoxi 3-nitropirrol, 3-nitropirrol, 2 ' -OMe 3-nitropirrol, 2'-F 3-nitropirrol, 1- (2 * -desoxi-beta-D-ribofuranosil) -3-nitropirrol, desoxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2 ' -OMe 5-nitroindol, 2 ' -F 5-nitroindol, desoxi 4-nitrobenzimidazol, 4-nitrobenzimidazol, desoxi 4- aminobencimidazol, 4-aminobencimidazol, desoxi nebularina, 2'-F nebularina, 2'-F 4-nitrobencimidazol, PNA-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobencimidazol, PNA-3-nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, mnorfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobencimidazol, morfolino-3-nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4-nitrobenzimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2'-0-metoxietil inosina, 2 'O-nebularina metoxietil, 2'-0-metoxietil 5-nitroindol, 2 ' -O-metoxietil 4-nitrobencimidazol, 2 ' -O-metoxietil 3-nitropirrol, y combinaciones de los mismos. 29. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la base universal es desoxiinosina, 1- (2 ' -desoxi-beta-D-ribofuranosil) -3-nitropirrol o 5-nitroindol. 30. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la base universal es desoxiinosina. 31. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la porción de separación comprende nucleótidos contiguos que tienen bases universales. 32. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la porción de especificidad Tm 5' alta es más larga que la porción de especificidad Tm 3' baja. 33. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la porción de especificidad Tm 3' baja tiene una secuencia del nucleótido de hibridación perfectamente complementaria al sitio en los ácidos nucleicos de la plantilla para hibridizarla. 34. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque p representa un entero de 15 a 40. 35. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque p representa un entero de 15 a 25. 36. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque q es por lo menos 3. 37. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la q representa un entero de 3 a 10. 38. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque r representa un entero de 3 a 15. 39. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la p es entero de 15 a 25, q es un entero de 3 a 10, y r es un entero de 3 a 15. 40. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la porción de especificidad Tm 5' alta se encuentra en los rangos de 40°C a 80°C. 41. El oligonucleótido de especificidad dual, de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la Tm de la porción de especificidad Tm 3' baja se encuantra en los rangos de 10°C a 40°C. 42. El oligonucleótido de especificidad dual de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la Tm de los rangos de porción de separación se encuentran de 3°C a 15°C. 43. Un método por permitir determinar una especificidad de la renaturalización de un oligonucleótido a ser determinado dualmente a través de una estructura del oligonucleótido, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) seleccionar una secuencia de ácidos nucleicos objetivo; (b) diseñar una secuencia de un oligonucleótido que tiene (i) una secuencia de hibridación substancialmente complementaria al ácido nucleico objetivo y (ii) una porción de separación que comprende por lo menos dos bases universales, tal porción de separación interviene en la secuencia de hibridación para formar tres porciones en el oligonucleótido; y (c) determinar la posición de la porción de separación en el oligonucleótido para permitir a una porción en la dirección 5' de la porción de separación, tener una Tm superior, a la porción en la dirección de 3' de la porción de separación y permitir a la porción de separación tener el Tm más bajo en las tres porciones, proporcionando así, un oligonucleótido que tiene tres porciones distintas entre si con valores de Tm diferentes de uno u otro en los que (i) una porción de especificidad Tm 5' alta del oligonucleótido tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria al ácido nucleico objetivo, (ii) una porción de especificidad Tm 3' baja del oligonucleótido tiene una secuencia del nucleótido de hibridación substancialmente complementaria al ácido nucleico objetivo; y (iii) la porción de separación del oligonucleótido entre la porción de especificidad Tm 5' alta y la porción de especificidad Tm 3' baja comprende dos bases universales por lo menos; y la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta es superior a la porción de especificidad Tm 3' baja y la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones, por lo cual la especificidad de la renaturalización del oligonucleótido para los ácido nucleicos objetivo se determina dualmente por ambas, porción de especificidad Tm 5' alta y porción de especificidad Tm 3' baja. 44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la base universal en la porción de separación se selecciona del grupo que consiste de desoxiinosina, inosina, desoxiinosina, inosina, 7-deaza-2'-desoxiinosina, 2-aza-2 ' -desoxiinosina, 2 ' -OMe inosina, 2 ' -F inosina, desoxi 3-nitropirrol, 3-nitropirrol, 2 ' -OMe 3-nitropirrol, 2'-F 3-nitropirrol, 1- (2 ' -desoxi-beta-D-ribofuranosil) -3-nitropirrol, desoxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2 '-OMe 5-nitroindol, 2'-F 5-nitroindol, desoxi 4-nitrobenzimidazol, 4-nitrobenzimidazol, desoxi 4-aminobencimidazol, 4-aminobencimidazol, desoxi nebularina, 2'-F nebularina, 2 ' -F 4-nitrobencimidazol, PNA-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobencimidazol, PNA-3-nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobencimidazol, morfolino-3-nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4-nitrobenzimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2'-0-metoxietil inosina, 2 'O-nebularina metoxietil, 2'-0-metoxietil 5-nitroindol, 2 ' -O-metoxietil 4-nitrobencimidazol, 2 ' -O-metoxietil 3-nitropirrol, y combinaciones de los mismos. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la base universal es desoxiinosina, 1- (2 ' -desoxi-beta-D-ribofuranosil) -3-nitropirrol o 5-nitroindol. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la base universal es desoxiinosina. 47. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la porción de separación comprende nucleótidos contiguos que tienen bases universales. 48. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la porción de especificidad Tm 5' alta es más larga que la porción de especificidad Tm 3' baja. 49. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la porción de especificidad Tm 3' baja tiene la secuencia del nucleótido de hibridación perfectamente complementaria al sitio en el ácido nucleico de la plantilla para hibridizarla. 50. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque p representa un entero de 15 a 40. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque p es un entero de 15 a 25. 52. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque q es por lo menos 3. 53. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque q representa un entero de 3 a 10. 54. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque r representa un entero de 3 a 15. 55. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque p es un entero de 15 a 25, q es un entero de 3 a 10, y r es un entero de 3 a 15. 56. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la Tm de la porción de especificidad Tm 5' alta se encuentra en el rango de especificidad de 40°C a 80°C. 57. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la Tm, de la porción de especificidad Tm 3' baja se encuentra en el rango de 10°C a 40°C. 58. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la Tm, de la porción de separación se encuentra en los rangos de 3°C a 15°C. 59. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la reacción de extensión dependiente de la plantilla es una reacción en la cadena de la polimerasa.
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