CN107075576B - 哑铃结构寡核苷酸、包含其的核酸扩增用引物及利用该引物的核酸扩增方法 - Google Patents

哑铃结构寡核苷酸、包含其的核酸扩增用引物及利用该引物的核酸扩增方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及哑铃结构寡核苷酸(dumbbell structure oligonucleotide,DSO)、包含其的核酸扩增用引物及利用该引物的核酸扩增方法，更具体而言，涉及一种在进行聚合酶链反应中，能够在每个第一周期的与模板结合之前排除非特异性扩增产物的利用了哑铃结构寡核苷酸的多重基因扩增及单核苷酸多态性分析方法。本发明在聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)时，利用哑铃结构寡核苷酸(dumbbell structure oligonucleotide,DSO)，在常温下抑制非目的扩增产物，因而通过减少非特异扩增产物，能够高效提高敏感度和特异度，改进基因扩增方法，所述哑铃结构寡核苷酸通过附加任意碱基序列和3`‑末端模板依赖型特异碱基序列以及使该两种碱基序列连接的普适碱基对而生成，并且将所述哑铃结构寡核苷酸的5'‑末端寡核苷酸和3`‑末端寡核苷酸设计成在每个第一周期的与模板结合之前互补结合。

Description

哑铃结构寡核苷酸、包含其的核酸扩增用引物及利用该引物 的核酸扩增方法
技术领域
本发明涉及哑铃结构寡核苷酸(dumbbell structure oligonucleotide,DSO)、包含其的核酸扩增用引物及利用该引物的核酸扩增方法，更具体而言，涉及一种在进行聚合酶链反应中，能够在每个第一周期的与模板结合之前排除非特异性扩增产物的利用了哑铃结构寡核苷酸的多重基因扩增及单核苷酸多态性分析方法。
背景技术
现在，研究人员为了获得基因试样而最普遍使用的方法是利用了DNA聚合酶的聚合酶链反应方法。聚合酶链反应中所利用的寡核苷酸被设计成结合于模板DNA相反一侧链。所述方法任意调节、设计能够与模板DNA结合的寡核苷酸的长度和碱基序列，从而具有能够只使靶基因的所需部位准确地扩增的优点，相反，由于一次反应只能使一个目的基因扩增，在要扩增的目的基因数量较多的情况下，存在需要重复执行同一作业的缺点。
为了解决这种问题，正在致力于开发将两种以上的模板基因和与各个模板基因相应的引物混合成为一体而进行聚合链反应的诸多方法，而且，为了改善引物的结合特异性并据此能够实现产物的扩增而开发了许多方法。诸如降落PCR(Don et al.,1991)、热启动PCR(DAquila et al.,1991)、巢式PCR(Mullis and Faloona,1987)及加强PCR(Ruano etal.,1989)。作为此外的其它接近方式，利用各种增强剂化合物，改善PCR的特异性，在这些增强剂化合物中，包括有有效提高结合反应温度的化学物质、DNA结合蛋白、可商业利用的反应物质等。但是，在所有PCR方法中，无法导出并获得成功的结果物，在多种结合温度条件下测试这些添加物是需要投入大量时间和精力的工作。虽然所述接近方式在改善引物退火特异性方面发挥某种程度的贡献，但所述这些方法却无法成为对于由用于PCR扩增的引物所导致的诸如非异物性产物及高背景问题的根本解决方案。另外，一次能够成功扩增的基因数量仅为3至4个，未改善各基因间的竞争或干扰效应、非特异性产物的扩增等缺点，实质上无法使用。
于是，为了进行多重聚合酶链反应及等位基因特异PCR，必须使目的模板基因的条件最优化，为此需要承受大量时间和精力及样品的消耗，由于如此最优化的条件并不适用于其它基因，为了克服这种问题，开发了接头聚合酶链反应(Linker PCR)或通过连接介导的聚合酶链反应(Ligation Mediated PCR)(参照：Journal of Clinical Microbiology,43(11)：5622-5627,2005)等方法。但是，接头聚合酶链反应由于将在第一管中反应的产物一部分转移到第二管并进行反应的实验特性，存在可能发生严重的交叉污染问题，连接介导聚合酶链反应由于利用了多种酶的复杂实验方法给研究人员带来困难，因而只在一部分情况下利用这种实验方法。
因此，要求开发一种廉价且能够简单地实现基因扩增的技术。为了迎合这种要求而开发的技术就是通过只是简单操作引物，防止在到达PCR反应适合温度之前发生扩增的方法。作为这种方法的示例，有大韩民国专利授权号649165所公开的发明。在该技术中，在初始引物中附加插入有调节子(regulator)部位。该调节子部位为多聚脱氧肌苷连接(polydeoxyinosine linker)，构成该调节子部位的肌苷(inosine)是具有比作为构成通常引物的普通核苷酸的G、A、T、C更低Tm值的普适碱基(universal base)，因而在特定温度下，该多聚脱氧肌苷连接形成“泡沫状结构(bubble like structure)”，阻止引物非特异性结合于模板，发挥抑制PCR非特异扩增的作用。该技术与前述的现有技术相比，在其实现方面虽然略微价廉，但在实际PCR中，存在需要使第一周期的结合阶段的温度(PCR反应适合温度)与第二周期中的结合阶段的温度互不相同的不便。这是为了从第二PCR周期开始，使附加导入于引物的序列也能够参与启动。当然，并非必须要求这一“不同温度的应用”，但是为了高效的PCR而需要应用不同的温度。另外，在所述技术中还存在如下限制：需要在5'-末端部位附加预选随机核苷酸序列，并且其不应与模板的任何位置互补。这导致附加的不便，进而当无法获知模板的所有基因序列时，导致无法确信能否成功地应用所述技术。因此，需要开发一种能够比现有技术更低廉、更易实现的新方法。这种非特异扩增的抑制技术在所有PCR中当然很重要，特别是在应用于实施基因检查、疾病检查等的诊断(diagnosis)领域的PCR中更加重要。
<在先技术文献>(专利文献1)KR10-0649165B
发明内容
技术问题
因此，本发明的目的在于解决这种现有技术的问题和自过去要求的技术问题。
本发明的目的在于提供一种PCR用引物和利用其的PCR方法，其通过抑制常温下非目的PCR扩增，因而能够实现热启动PCR，另外，PCR扩增时，与自初始模板起的扩增相比，使自PCR产物起的扩增处于优势，结果，能够抑制PCR中的非特异扩增。
因此，本发明人为了开发仅凭一次聚合酶链反应就能够使多个基因扩增的方法，经过专心致力于研究的结果，确认了在制作要扩增的基因碱基序列的引物时，当利用由哑铃结构寡核苷酸(dumbbell structure oligonucleotide,DSO)构成的引物时，通过一次聚合酶链反应，就能够使互不相同的大量基因迅速、准确地同时扩增，从而完成了本发明，上述哑铃结构寡核苷酸在5`-末端附加了能够与3～5bp的3`-末端互补结合的任意碱基序列和用于连接该两个部位的3～5bp普适碱基对以形成哑铃结构(dumbbell structure)。
最终，本发明的主要目的是提供一种方法，该方法利用附加了3～5bp普适碱基对的引物，仅凭一次聚合酶链反应就能够使可以存在于所有样品中的基因扩增，该普适碱基对用于连接在5`-末端附加插入的3～5bp的与3`-末端互补的任意碱基序列和模板特异性碱基序列。
技术方案
为了解决所述课题，本发明提供以如下通式表示的哑铃结构寡核苷酸，
通式：5'-Ap-Bq-Cr-3'
其中，所述A代表包含具有与所述3'-末端的连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的5'-低Tm特异性部位，所述B代表包含具有普适碱基的核苷酸的切割部位，所述C代表包含具有与模板核酸的特定连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的3'-高Tm特异性部位，所述p、q及r代表核苷酸数目。
优选所述p包含3～5个核苷酸。
优选所述q包含3～5个核苷酸。
优选所述r包含18～30个核苷酸。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm低于所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述切割部位的Tm低于所述5'-低Tm特异性部位的Tm及所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm为10～30℃。
优选所述切割部位的Tm为3～10℃。
优选所述3'-高Tm特异性部位的Tm为50～65℃。
优选所述普适碱基选自由脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2'-脱氧肌苷、2-氮杂-2'-脱氧肌苷、2'-OMe肌苷、2'-F肌苷及它们的组合所构成的组中。
优选所述哑铃结构寡核苷酸选自由序列号1至序列号35所构成的组中。
另外，本发明提供包含以如下通式表示的哑铃结构寡核苷酸的核酸扩增用引物，
通式：5'-Ap-Bq-Cr-3'
其中，所述A代表包含具有与所述3'-末端的连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的5'-低Tm特异性部位，所述B代表包含具有普适碱基的核苷酸的切割部位，所述C代表包含具有与模板核酸的特定连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的3'-高Tm特异性部位，所述p、q及r代表核苷酸数目。
优选所述p包含3～5个核苷酸。
优选所述q包含3～5个核苷酸。
优选所述r包含18～30个核苷酸。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm低于所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述切割部位的Tm低于所述5'-低Tm特异性部位的Tm及所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm为10～30℃。
优选所述切割部位的Tm为3～10℃。
优选所述3'-高Tm特异性部位的Tm为50～65℃。
优选所述普适碱基选自由脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2'-脱氧肌苷、2-氮杂-2'-脱氧肌苷、2'-OMe肌苷、2'-F肌苷及它们的组合所构成的组中。
优选所述哑铃结构寡核苷酸选自由序列号1至序列号35所构成的组中。
另外，本发明提供一种核酸扩增方法，由包含模板、引物及聚合酶的混合物进行聚合酶链反应而使核酸扩增，其特征在于，利用核酸扩增用引物，该核酸扩增用引物包含以如下通式表示的哑铃结构寡核苷酸，
通式：5'-Ap-Bq-Cr-3'
其中，所述A代表包含具有与所述3'-末端的连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的5'-低Tm特异性部位，所述B代表包含具有普适碱基的核苷酸的切割部位，所述C代表包含具有与模板核酸的特定连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的3'-高Tm特异性部位，所述p、q及r代表核苷酸数目。
优选所述p包含3～5个核苷酸。
优选所述q包含3～5个核苷酸。
优选所述r包含18～30个核苷酸。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm低于所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述切割部位的Tm低于所述5'-低Tm特异性部位的Tm及所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm为10～30℃。
优选所述切割部位的Tm为3～10℃。
优选所述3'-高Tm特异性部位的Tm为50～65℃。
优选所述普适碱基选自由脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2'-脱氧肌苷、2-氮杂-2'-脱氧肌苷、2'-OMe肌苷、2'-F肌苷及它们的组合所构成的组中。
优选所述哑铃结构寡核苷酸使用选自由序列号1至序列号35所构成的组中的核酸扩增用引物。
优选所述核酸扩增方法为利用了二种以上模板的多重聚合酶链反应。
发明效果
本发明在聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)时，利用哑铃结构寡核苷酸(dumbbell structure oligonucleotide,DSO)，在常温下抑制非目的扩增产物，因而从结果上通过减少非特异扩增产物来高效率地提高敏感度和特异度，改进基因扩增方法，所述哑铃结构寡核苷酸通过附加任意碱基序列和3`-末端模板依赖型特异碱基序列以及使两碱基序列连接的普适碱基对而生成，并且将所述哑铃结构寡核苷酸的5'-末端寡核苷酸和3`-末端寡核苷酸设计成在每个第一周期的与模板结合之前互补结合。如果利用本发明的基因扩增方法，则仅凭一次聚合酶链反应就能够使多个基因扩增，而且可以更容易地检测分析单核苷酸多态性，能够有助于基因相关领域研究开发的进步。
附图说明
图1是示出用于多重基因同时扩增方法的引物的结构性特征的图。
图2是示出自PCR期间的第三周期起，与基于初始模板的扩增相比，以PCR产物为模板的扩增占据优势的模式图。
图3示出在靶依赖性延伸反应中本发明的哑铃结构寡核苷酸的原理。(a)显示了在高严格条件下由于哑铃结构寡核苷酸的高杂交特异性而无法发生扩增的环境，(b)显示了哑铃结构寡核苷酸成功发生延伸反应。
图4是利用基因扩增方法来扩增的性传播疾病病原菌的电泳照片。
图5是示出利用了哑铃结构寡核苷酸和等位基因特异性聚合酶链反应的MTHFR基因C677T的SNP解读结果的图。
图6是示出利用了哑铃结构寡核苷酸和等位基因特异性聚合酶链反应的BRAF基因V600E的SNPs解读结果的图。
图7是示出利用了哑铃结构寡核苷酸和等位基因特异性聚合酶链反应的APC基因的SNPs解读结果的图。
具体实施方式
下面详细说明本发明。
本发明人在为了开发仅通过一次聚合酶链反应就能够使多个基因扩增的方法，在进行各种研究的过程中，着眼于如果用作模板的各个基因和能够与之互补结合的引物可以分别特异性地结合，则可以通过一次聚合酶链反应而使多个基因扩增，以期提高引物对模板基因的特异选择性。
因此，作为本发明的优选具体例，提供一种使用哑铃结构寡核苷酸，利用模板依赖性延伸反应来制造核酸分子的方法。
作为本发明的另一优选具体例，提供一种在一个DNA或核酸混合物中，使靶核酸序列选择性扩增的方法。
作为本发明的又一优选具体例，提供一种在同一反应中利用两个以上的引物对而同时使两个以上的靶核苷酸序列扩增的方法。
作为本发明的又一优选具体例，提供一种利用模板依赖性延伸反应检测具有遗传多样性的核酸分子的方法。
作为本发明的又一优选具体例，提供一种通过模板依赖性延伸反应来制造核酸分子的哑铃结构寡核苷酸。
作为本发明又一优选具体例，提供一种用于改善寡核苷酸的退火特异性的方法。
通过下述发明的详细说明、权利要求书及附图，如上所述的本发明的多样具体例将更加明确。
本发明涉及一种哑铃结构寡核苷酸及利用其的各种方法。本发明的哑铃结构寡核苷酸由于经改善的特异性，使引物或探针退火到靶核酸上，能够极大改善核酸扩增(特别是PCR)的特异性。
因此，本发明提供以如下通式表示的哑铃结构寡核苷酸：
通式：5'-Ap-Bq-Cr-3'
其中，所述A代表包含具有与所述3'-末端的连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的5'-低Tm特异性部位，所述B代表包含具有普适碱基的核苷酸的切割部位，所述C代表包含具有与模板核酸的特定连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的3'-高Tm特异性部位，所述p、q及r代表核苷酸数目。
优选所述p包含3～5个核苷酸。
优选所述q包含3～5个核苷酸。
优选所述r包含18～30个核苷酸。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm低于所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述切割部位的Tm低于所述5'-低Tm特异性部位的Tm及所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm为10～30℃。
优选所述切割部位的Tm为3～10℃。
优选所述3'-高Tm特异性部位的Tm为50～65℃。
优选所述普适碱基选自由脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2'-脱氧肌苷、2-氮杂-2'-脱氧肌苷、2'-OMe肌苷、2'-F肌苷及它们的组合所构成的组中。
优选所述哑铃结构寡核苷酸选自由序列号1至序列号35所构成的组中。
另外，本发明提供核酸扩增用引物，该核酸扩增用引物包含以如下通式表示的哑铃结构寡核苷酸：
通式：5'-Ap-Bq-Cr-3'
其中，所述A代表包含具有与所述3'-末端的连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的5'-低Tm特异性部位，所述B代表包含具有普适碱基的核苷酸的切割部位，所述C代表包含具有与模板核酸的特定连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的3'-高Tm特异性部位，所述p、q及r代表核苷酸数目。
优选所述p包含3～5个核苷酸。
优选所述q包含3～5个核苷酸。
优选所述r包含18～30个核苷酸。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm低于所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述切割部位的Tm低于所述5'-低Tm特异性部位的Tm及所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm为10～30℃。
优选所述切割部位的Tm为3～10℃。
优选所述3'-高Tm特异性部位的Tm为50～65℃。
优选所述普适碱基选自由脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2'-脱氧肌苷、2-氮杂-2'-脱氧肌苷、2'-OMe肌苷、2'-F肌苷及它们的组合所构成的组中。
优选所述哑铃结构寡核苷酸选自由序列号1至序列号35所构成的组中。
另外，本发明提供核酸扩增方法，由包含模板、引物及聚合酶的混合物进行聚合酶链反应而使核酸扩增，其特征在于，利用核酸扩增用引物，该核酸扩增用引物包含以如下通式表示的哑铃结构寡核苷酸，
通式：5'-Ap-Bq-Cr-3'
其中，所述A代表包含具有与所述3'-末端的连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的5'-低Tm特异性部位，所述B代表包含具有普适碱基的核苷酸的切割部位，所述C代表包含具有与模板核酸的特定连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的3'-高Tm特异性部位，所述p、q及r代表核苷酸数目。
优选所述p包含3～5个核苷酸。
优选所述q包含3～5个核苷酸。
优选所述r包含18～30个核苷酸。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm低于所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述切割部位的Tm低于所述5'-低Tm特异性部位的Tm及所述3'-高Tm特异性部位的Tm。
优选所述5'-低Tm特异性部位的Tm为10～30℃。
优选所述切割部位的Tm为3～10℃。
优选所述3'-高Tm特异性部位的Tm为50～65℃。
优选所述普适碱基选自由脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2'-脱氧肌苷、2-氮杂-2'-脱氧肌苷、2'-OMe肌苷、2'-F肌苷及它们的组合所构成的组中。
优选所述哑铃结构寡核苷酸使用选自由序列号1至序列号35所构成的组中的核酸扩增用引物。
优选所述核酸扩增方法为利用了二种以上的模板的多重聚合酶链反应。
根据本发明的一种方式，本发明提供以如下通式表示并且通过模板依赖性延伸反应来合成核酸分子的哑铃结构寡核苷酸。
通式：5`-Ap-Bq-Cr-3`
所述A是能够与从所述通式的3`-末端连续的一部分序列实质性互补结合的碱基序列，B代表包含普适碱基对的切割部位，C代表针对杂交的模板核酸的一个位置而实质性互补的碱基序列，p、q及r为核苷酸的数目，A、B及C为脱氧核苷酸或核糖核苷酸，所述切割部位在A、B及C的3个部位中具有最低Tm；可知所述切割部位在所述A和B结合于所述模板核酸的条件下，形成非碱基对发卡结构，在对所述模板核酸的结合特异性方面，使得所述A从B分离，所述寡核苷酸的结合特异性由A及B两者决定，能够提高引物对模板基因的特异选择性。
本发明的哑铃结构寡核苷酸在多个领域中非常有用，该领域包括Miller,H.I.在WO 89/06700中提及的方法及Davey,C.等在EP 329,822中提及的方法、诸如连接酶链反应(LCR,Wu,D.Y.et al.,Genomics 4：560(1989))、聚合酶连接酶链反应(Barany,PCRMethods and Applic.,1：5-16(1991))、Gap-LCR(WO 90/01069)、修复链反应(EP 439,182)、3SR(Kwoh et al.,PNAS,USA,86：1173(1989))及NASBA(U.S.Pat.No.5,130,238)等的引物相关核酸扩增方法，诸如循环测序(Kretz et al.,(1994)Cycle sequencing.PCRMethods Appl.3：S107-S112)及焦磷酸测序(Ronaghi et al.,(1996)Anal.Biochem.,242：84-89；及(1998)Science 281：363-365)等的引物延伸相关技术，以及诸如使用寡核苷酸微阵列的靶核苷酸序列检测的杂交相关技术。
图1是示出用于多重基因同时扩增方法的引物的结构性特征的图。如图1所示，在制作要扩增的基因的引物时，制作了由哑铃结构寡核苷酸构成的引物，在进入每个第一周期时，没有与模板碱基序列互补结合，因而抑制了非特异性结合，而在聚合酶链反应中与模板基因杂交时，为了能够在中央形成凸起部(bulge)而以3bp～5bp普适碱基对进行替代，将5'-末端部分的3～5bp碱基序列替代为能够与3`-末端部位互补结合的碱基序列，3`末端部位的碱基序列能够与要扩增的基因互补结合。确认了如果利用如此制作的引物进行PCR扩增，则即使退火温度变化，模板基因也能正常扩增，相反，在退火温度变化的条件下，如果利用现有的引物进行PCR扩增，则随着退火温度的提高而扩增率下降，模板基因没有正常扩增(参照：图2)。因此确认如果利用本发明的DSO引物进行PCR扩增，则提高引物对模板基因的特异选择性，即使在将多个模板基因和与之相应的各个引物混合而进行一次聚合酶链反应的情况下，各个模板基因也可以正常扩增，将通过如此使用DSO引物而凭借一次聚合酶链反应就能够使多个模板基因扩增的方法命名为“DIGPlexTM”。
结果，本发明的多重基因同时扩增方法包括如下步骤：(i)从2至30个靶基因分别选择要扩增的部位的步骤；(ii)确定能够与所述被选择的各个部位的3'-末端碱基序列互补结合的5`-末端任意碱基序列，制作附加有位于所述确定的碱基序列中央部的3～5bp普适碱基对的正义引物的步骤；(iii)确定能够与所述被选择的各个部位的3'-末端碱基序列互补结合的碱基序列，制作附加有位于所述确定的碱基序列中央部的3～5bp普适碱基对的反义引物的步骤；(iv)将所述2至30个靶基因和分别与所述靶基因相应的所述制作的2至30个正义引物及反义引物全部混合，利用所述混合物，进行一次聚合酶链反应的步骤；及(v)确认利用所述聚合酶链反应来获得的扩增产物的步骤。此时，没有特别限制聚合酶链反应时温度及时间条件。另外，没有特别限制对于获得的扩增产物的确认。
如果利用本发明的多重基因同时扩增方法，则仅凭一次聚合酶链反应就可以使多个基因扩增，可以容易地实现单核苷酸多态性分析，能够有助于基因相关领域研究开发的进步。
下面，通过确认是否存在感染性疾病病原菌的实施例和分析引起心血管疾病的MTHFR基因、作为甲状腺乳头状癌病因的BRAF基因及大肠癌相关APC基因的单核苷酸多态性，更详细地说明本发明。这些实施例只用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不限定于这些实施例，这是本领域的技术人员不言而喻的。
[实施例]
实施例1：性传播性疾病特异基因的扩增
在从获取自20名性传播性疾病可疑患者的样本中提取DNA，对于获取的DNA，混合2μl的10X聚合酶链反应缓冲溶液(750mM Tris-HCl(pH 9.0)、20mM MgCl2、500mM KCl、200mM(NH4)2SO4)、2μl的2.5mM dNTP混合物(2.5mM dATP,2.5mM dGTP,2.5mM dTTP,2.5mM dCTP)、2.0unit的Taq聚合酶(Biotools,Spain)及1μl的具有序列号1至26、36及37的碱基序列的DS引物(0.5μM)，加入三蒸水，滴定至20μl后，进行聚合酶链反应(94℃下10分钟，94℃下30秒，65℃下60秒，72℃下60秒，35个周期)，获得了扩增产物。此时，使用的各个DSO引物的碱基序列如下表1所示。作为参考，在本说明书附带的序列目录上的序列号1至序列号37中记载的碱基序列中，文字“N”如下表1和表2所示，意味着“肌苷(Inosine),I”。
表1
Figure GDA0002616617970000131
1)疾病类型
TP:Treponema pallidum(梅毒螺旋体)
MG:Mycoplasma Genitalium(生殖器支原体)
NG:Neisseria gonorrhoeae(淋病奈瑟氏菌)
MH:Mycoplasma hominis(人型支原体)
UU:Ureaplasma urealyticum(解脲支原体)
GV:Gardenerella vaginalis(阴道加德纳菌)
CT:Chlamydia trachomatis(沙眼衣原体)
HSV2:Herpes Simplex Virus(单纯疱疹病毒)
2CA:Candida albicans(白色念珠菌)
HSV1:Herpes Simplex Virus(单纯疱疹病毒)
1UP:Ureaplasma parvum(微小脲原体)
IC:GAPDH
接着，在2.0％琼脂糖凝胶中，对进行了聚合酶链反应的反应产物进行电泳(参照图4)。图4是通过聚合酶链反应而扩增的12种性传播疾病病原菌电泳照片，图4的1号示出扩增被CA感染的临床样本的图像，2号示出扩增被UP、GV感染的临床样本的图像，3号示出扩增被GV感染的临床样本的图像，4号示出扩增被CT感染的临床样本的图像，5号示出扩增被GV感染的临床样本的图像，6号示出扩增被UP、CA感染的临床样本的图像，7号示出扩增被MH、UP、GV感染的临床样本的图像，8号示出扩增阴性样本的图像，9号示出扩增被GV、CT感染的临床样本的图像，10号示出扩增被UP、HSV2、CA感染的临床样本的图像，11号示出扩增被CA感染的临床样本的图像，12号和13号示出扩增阴性样本的图像，14号示出扩增被GV、CT感染的临床样本的图像，15号示出扩增被CT、TV感染的临床样本的图像，16号、17号、18号及19号示出扩增阴性样本的图像，20号示出扩增被UP、GV感染的临床样本的图像，21号示出扩增阴性样本的图像，22号示出扩增被UP感染的临床样本的图像，23号示出扩增被UP、GV、CA感染的临床样本的图像，24号示出扩增阴性样本的图像，25号示出扩增被MH、GV感染的临床样本的图像，26号示出扩增被UP感染的临床样本的图像，27号示出扩增被MH、GV感染的临床样本的图像，28号示出扩增被UP、CA感染的临床样本的图像，29号示出扩增被MH、UU、GV感染的临床样本的图像，30号示出扩增被CA感染的临床样本的图像，31号示出扩增阴性样本的图像，32号示出扩增阴性对照组的图像。如以上结果所示，可以确认当使用利用了本发明DSO引物的多重基因同时扩增方法时，能够通过一次聚合酶链反应来使多个基因扩增。
实施例2：利用DSO引物的MTHFR基因、BRAF基因及APC基因的单核苷酸多态性分析
为了使从商业途径取得的人类MTHFR、BRAF、APC基因(wild type,hetero type,homo type)扩增，将人类基因组DNA(Invitrogen Inc.,USA)用作模板，利用具有如下碱基序列的正常引物进行扩增后，通过实施利用了限制酶处理的结果确认方法以及利用本发明的DSO引物的聚合酶链反应，确认了扩增产物。
表2
Figure GDA0002616617970000151
将采集自人类血液中的2μl(50ng/μl)的基因组DNA、2μl的10X聚合酶链反应缓冲溶液(750mM Tris-HCl(pH 9.0)、20mM MgCl2、500mM KCl、200mM(NH4)2SO4)、2μl的2.5mMdNTP混合物(2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dTTP、2.5mM dCTP)、1.5unit的Taq聚合酶(Biotools,Spain)及1μl的所述各个DSO引物的混合物(0.5μM)混合，加入三蒸水，滴定至20μl后，进行聚合酶链反应。此时，聚合酶链反应的条件为94℃下10分钟，94℃下30秒，退火60秒，72℃下60秒，在这种条件下进行35个周期，在退火温度分别为60℃、55℃及62℃的不同温度下进行，然后结束反应，将扩增的切片在2％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳(参照图5、6、7)。
图5用于确认与心血管疾病有密切关联性的MTHFR基因有无突变，显示出以通过现有分析方法聚合酶链反应-限制酶性段长度多态性法来确认其类型的16名临床样本为对象，进行等位基因特异PCR分析的结果。在图像中，M是确认扩增产物大小的大小标记。临床样本1、3、5、7、8、9、11、12及13为高半胱氨酸浓度高的临床样本，在本分析中确认了兼具wild(野生型)和mutant(突变型)，临床样本2、4、10、14及15为心血管疾病患者，在本分析中确认了只具有mutant(突变型)，临床样本6和16为正常人，在本分析中确认了只具有wild(野生型)。
图6用于确认与甲状腺癌有密切关联的BRAF基因有无突变，显示出以通过现有分析方法聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法来确认其类型的16名临床样本为对象，进行等位基因特异PCR分析的结果。在图像中，M是确认扩增产物大小的大小标记。临床样本1、5、6、7、10、12及16为正常人，在本分析中确认了只具有wild(野生型)，临床样本3、8、11、13及15出现甲状腺功能异常，为患者临床样本，在本分析中确认了兼具wild(野生型)和mutant(突变型)，临床样本2、4、9及14为甲状腺癌患者，在本分析中确认了只具有mutant(突变型)。
图7用于确认与家族性息肉病(大肠癌)有密切关联的APC基因有无突变，显示出以通过现有分析方法聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法来确认其类型的16名临床样本为对象，进行等位基因特异PCR分析的结果。在图像中，M是确认扩增产物大小的大小标记。临床样本1、2、3、4、8、9、10、11、12、14及16为正常人，在本分析中确认了只具有wild(野生型)，经大肠内视镜结果，确认临床样本6、7、13及15有息肉，在本分析中确认了兼具wild(野生型)和mutant(突变型)，临床样本5为原位癌0期患者，在本分析中确认了只具有mutant(突变型)。
Sequence Listing
<110> 精确诊断有限公司(DIOGENE CO., LTD.)
<120> 哑铃结构寡核苷酸、包含其的核酸扩增用引物及利用其的核酸扩增方法
<130> PA17012153WNP
<160> 37
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> ompA 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 1 cgaggnnnnn gactacccaa accttcaacg acacctcg 38
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> ompA 3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 2 cgcatnnnnn caagccaaga ccgcaagtga ataatgcg 38
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> porA 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 3 ccaaannnnn ttacagactg gcggcggttt cgttttgg 38
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> porA 3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 4 caagcnnnnn gtcgactgca cacccgaaca gcttg 35
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> btub1 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 5 cagctnnnnn cctcgatgtc atccgtaagg aagctg
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> btub1 3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 6 gtcagnnnnn gagcttacga aggtcggagt tgagctgac 39
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> gyrA 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 7 catctnnnnn tgccaatcct aagataaatt ccaaaccaga agagatg 47
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> gyrA 3'-引物 <220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 8 gaccannnnn cctagctcct tataagcttg aactgctggt c 41
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> gap 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 9 gatatnnnnn cgcccgtcaa actatgggag ctggtaatat c 41
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> gap 3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 10 gctttnnnnn ctgagtttcc tcattcggag atcaacggat taaagc 46
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> gap 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 11 catgtnnnnn ggatgaacgc tggctgtgtg cctaatacat g 41
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> gap 3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 12 gactgnnnnn catcgctttc tgacaaggta ccgtcagtc 39
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 16s 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 13 cactcnnnnn ggagtttttg tgcacgctcg gttgagtg
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 16s 3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 14 cgtgannnnn caacggtctg ggcagattca cg 32
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> phr1 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 15 cgcaannnnn catcgaatct ttgaacgcac attgcg 36
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> phr1 3'-引物 <220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 16 gcggtnnnnn gatatacgtg gtggacgtta ccgc 34
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> glyC 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 17 ccaggnnnnn gtcaacgacc atattcacgc ctgg 34
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> glyC 3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 18 gagatnnnnn cagacggagc cgttggtgat aagatctc 38
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> glyC 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 19 cttgannnnn gatgtttgct tggtcgttcc tggtcctcaa g 41
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> glyC 3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 20 catgannnnn ccgtcgggac tgaacgtctc atg 33
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> gap 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 21 gcaagnnnnn gtccatttca acaagcacgc aaacttgc
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> gap 3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 22 cacctnnnnn tggagcatta atttggctat catctttttg aataggtg 48
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> p47 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 23 gtatgnnnnn gtgcgtactc ggagcttgca gagaagacat ac 42
<210> 24
<211> 48
<212> DNA
<213> p47 3'-引物 <220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 24 cgaggnnnnn gggctgcaat tctttgttct tcgagttttc gtgcctcg 48
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> p27 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 25 gatggnnnnn ggtcgcatta tagccaaagt taccgctacc atc 43
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> p27 3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 26 ctgaannnnn tcaaatccgt cagcaaattg aagattcaac ttcag 45
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> MTHFR 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 27 atcttnnnnn tgctgttgga aggtgcaaga t 31
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> MTHFR野生型3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 28 ccgatnnnnn gcgtgatgat gaaatcgg 28
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> MTHFR突变型3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 29 tcgatnnnnn gcgtgatgat gaaatcga
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> BRAF 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 30 caatgnnnnn gaatatctgg gcctacattg 30
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> BRAF野生型3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 31 tgaaannnnn cactccatcg agatttca 28
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> BRAF突变型3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 32 agaaannnnn cactccatcg agatttct 28
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> APC 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 33 gaggtnnnnn ccacacagaa ctaacctc 28
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> APC野生型3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 34 agtttnnnnn ttatgagaaa agcaaact 28
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> APC突变型3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 35 ggtttnnnnn ttatgagaaa agcaaacc 28
<210> 36
<211> 44
<212> DNA
<213> GAPDG 5'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 36 ggacannnnn cacaagtatc actaagctcg ctttcttgct gtcc 44
<210> 37
<211> 38
<212> DNA
<213> GAPDH 3'-引物
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(10)
<223> “n”指肌苷。
<400> 37 ccaaannnnn ttacagactg gcggcggttt cgttttgg

Claims (10)

1.一种以如下通式表示的哑铃结构寡核苷酸，
通式：5′-Ap-Bq-Cr-3′
其中，所述A代表包含具有与所述3′-末端的连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的5′-低Tm特异性部位，所述B代表包含具有普适碱基的核苷酸的切割部位，所述C代表包含具有与模板核酸的特定连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的3′-高Tm特异性部位，所述5′-低Tm特异性部位的Tm低于所述3′-高Tm特异性部位的Tm，所述切割部位的Tm低于所述5′-低Tm特异性部位的Tm及所述3′-高Tm特异性部位的Tm，所述5′-低Tm特异性部位的Tm为10～30℃，所述切割部位的Tm为3～10℃，所述3′-高Tm特异性部位的Tm为50～65℃，所述p、q及r代表核苷酸数目，
其中，所述p为3～5，所述q为3～5，所述r为18～30。
2.根据权利要求1所述的哑铃结构寡核苷酸，其特征在于，
所述普适碱基选自由脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2′-脱氧肌苷、2-氮杂-2′-脱氧肌苷、2′-OMe肌苷、2′-F肌苷及它们的组合所构成的组中。
3.根据权利要求1所述的哑铃结构寡核苷酸，其特征在于，
所述哑铃结构寡核苷酸选自由序列号1至序列号35所构成的组中。
4.一种包含以如下通式表示的哑铃结构寡核苷酸的核酸扩增用引物，
通式：5′-Ap-Bq-Cr-3′
其中，所述A代表包含具有与所述3′-末端的连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的5′-低Tm特异性部位，所述B代表包含具有普适碱基的核苷酸的切割部位，所述C代表包含具有与模板核酸的特定连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的3′-高Tm特异性部位，所述5′-低Tm特异性部位的Tm低于所述3′-高Tm特异性部位的Tm，所述切割部位的Tm低于所述5′-低Tm特异性部位的Tm及所述3′-高Tm特异性部位的Tm，所述5′-低Tm特异性部位的Tm为10～30℃，所述切割部位的Tm为3～10℃，所述3′-高Tm特异性部位的Tm为50～65℃，所述p、q及r代表核苷酸数目，
其中，所述p为3～5，所述q为3～5，所述r为18～30。
5.根据权利要求4所述的核酸扩增用引物，其特征在于，
所述普适碱基选自由脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2′-脱氧肌苷、2-氮杂-2′-脱氧肌苷、2′-OMe肌苷、2′-F肌苷及它们的组合所构成的组中。
6.根据权利要求4所述的核酸扩增用引物，其特征在于，
所述哑铃结构寡核苷酸选自由序列号1至序列号35构成的组中。
7.一种核酸扩增方法，由包含模板、引物及聚合酶的混合物进行聚合酶链反应而使核酸扩增，其特征在于，利用包含以如下通式表示的哑铃结构寡核苷酸的核酸扩增用引物，
通式：5′-Ap-Bq-Cr-3′
其中，所述A代表包含具有与所述3′-末端的连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的5′-低Tm特异性部位，所述B代表包含具有普适碱基的核苷酸的切割部位，所述C代表包含具有与模板核酸的特定连续碱基序列互补的碱基序列的核苷酸的3′-高Tm特异性部位，所述5′-低Tm特异性部位的Tm低于所述3′-高Tm特异性部位的Tm，所述切割部位的Tm低于所述5′-低Tm特异性部位的Tm及所述3′-高Tm特异性部位的Tm，所述5′-低Tm特异性部位的Tm为10～30℃，所述切割部位的Tm为3～10℃，所述3′-高Tm特异性部位的Tm为50～65℃，所述p、q及r代表核苷酸数目，
其中，所述p为3～5，所述q为3～5，所述r为18～30。
8.根据权利要求7所述的核酸扩增方法，其特征在于，
所述普适碱基选自由脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2′-脱氧肌苷、2-氮杂-2′-脱氧肌苷、2′-OMe肌苷、2′-F肌苷及它们的组合所构成的组中。
9.根据权利要求7所述的核酸扩增方法，其特征在于，
所述哑铃结构寡核苷酸使用选自由序列号1至序列号35所构成的组中的核酸扩增用引物。
10.根据权利要求7所述的核酸扩增方法，其特征在于，
所述核酸扩增方法为利用了二种以上模板的多重聚合酶链反应。
CN201580046667.8A 2015-02-25 2015-02-25 哑铃结构寡核苷酸、包含其的核酸扩增用引物及利用该引物的核酸扩增方法 Active CN107075576B (zh)

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