JP6940412B2 - Pcr方法 - Google Patents
Pcr方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6940412B2 JP6940412B2 JP2017548462A JP2017548462A JP6940412B2 JP 6940412 B2 JP6940412 B2 JP 6940412B2 JP 2017548462 A JP2017548462 A JP 2017548462A JP 2017548462 A JP2017548462 A JP 2017548462A JP 6940412 B2 JP6940412 B2 JP 6940412B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- target
- versatile
- oligonucleotide probe
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/161—Modifications characterised by incorporating target specific and non-target specific sites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/186—Modifications characterised by incorporating a non-extendable or blocking moiety
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/101—Homogeneous assay format, e.g. one pot reaction
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
標的配列;
汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、標的配列の3’末端のうちの1つの配列またはそれに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ;
その3’末端に、オリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行すること
を含む方法を提供する。
汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、標的配列の3’末端のうちの1つの配列の逆相補体または標的配列の3’末端のうちの1つに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ;
その3’末端に、オリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応を実行すること
を含む方法を提供する。
標的特異的プライマー;
RNA標的配列
を提供すること、および
逆転写を実行すること
を含む方法を提供し、標的特異的プライマーは本明細書で上に記載される方法によって調製される。
本発明は、たとえば、以下の項目を提供する。
(項目1)
標的配列のアンプリコン構築物を生成するための方法であって、
標的配列;
汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列またはそれに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ;
その3’末端に、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行すること
を含む方法。
(項目2)
前記標的配列がDNA、cDNAまたはRNA配列である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記標的配列がcDNA標的配列を含み、前記cDNA標的配列が前記cDNA標的配列に対応するRNA配列に対して逆転写酵素PCR(RT−PCR)を実行することによってin situで形成される、項目1または2のいずれかに一項に記載の方法。
(項目4)
複数の異なる標的配列に対して多重PCRが実行される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖DNA配列である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的配列が、前記標的配列の3’末端のうちの1つまたはそれに隣接する配列と同一である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端に位置する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記オリゴヌクレオチドプローブが1つまたは複数の追加の配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記1つまたは複数の追加の配列が前記汎用性配列の5’および前記標的特異的配列の3’に配置される、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記1つまたは複数の追加の配列が機能性配列である、項目9または10のいずれかに一項に記載の方法。
(項目12)
前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端が、ポリメラーゼ伸長をブロックすることが可能なブロック基を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドトリホスフェート(ddNTP)またはスペーサーC3である、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記オリゴヌクレオチドプローブが20から50個のヌクレオチドを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記汎用性プライマーが一本鎖DNA配列である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記汎用性プライマーの3’末端が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列に相補的である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記汎用性プライマーがその5’末端またはその5’末端部分に1つまたは複数の機能性配列および/または基を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記1つまたは複数の基が、蛍光性標識および結合性基から選択される、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記汎用性プライマーが50から100個のヌクレオチドを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブの対が提供され、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の3’末端の配列のうちの1つの配列または前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含み、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の他の3’末端の配列または前記標的配列の他の3’末端に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブが異なる汎用性配列を含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
第1および第2の汎用性プライマーの対が提供され、前記第1の汎用性プライマーは、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含み、前記第2の汎用性プライマーは、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む、項目22または23のいずれかに一項に記載の方法。
(項目25)
前記第1および第2の汎用性プライマーが異なる機能性配列および/または基を含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
複数の異なる標的配列を多重PCRによって増幅するために、複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ対および汎用性プライマーまたはプライマー対が提供される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記オリゴヌクレオチドプローブが前記汎用性プライマーの濃度と比較してより低い濃度で提供される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が10:1を超える、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が12:1から275:1である、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が16:1から256:1である、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記標的配列の前記アンプリコン構築物がさらに配列決定される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
標的配列からアンプリコン構築物を生成するのに使用するための標的特異的プライマーを調製するための方法であって、
汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、前記標的配列の3’末端のうちの1つにおける配列の逆相補体または前記標的配列の3’末端うちの1つに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ;
その3’末端に、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応を実行すること
を含む方法。
(項目33)
前記オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖DNA配列である、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的配列が、前記標的配列の3’末端の配列またはそれに隣接する配列と同一である、項目32または33のいずれかに一項に記載の方法。
(項目35)
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である、項目32〜34のいずれかに一項に記載の方法。
(項目36)
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端に位置する、項目32〜35のいずれかに一項に記載の方法。
(項目37)
前記オリゴヌクレオチドプローブが1つまたは複数の追加の配列を含む、項目32〜36のいずれかに一項に記載の方法。
(項目38)
前記1つまたは複数の追加の配列が前記汎用性配列の5’および前記標的特異的配列の3’に配置される、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記1つまたは複数の追加の配列が機能性配列である、項目37または38のいずれかに一項に記載の方法。
(項目40)
前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端が、ポリメラーゼ伸長をブロックすること
が可能なブロック基を含む、項目32〜40のいずれかに一項に記載の方法。
(項目42)
前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドトリホスフェート(ddNTP)またはスペーサーC3である、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記オリゴヌクレオチドプローブが20から50個のヌクレオチドを含む、項目32〜42のいずれかに一項に記載の方法。
(項目44)
前記汎用性プライマーが一本鎖DNA配列である、項目32〜43のいずれかに一項に記載の方法。
(項目45)
前記汎用性プライマーの3’末端が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列に相補的である、項目32〜44のいずれかに一項に記載の方法。
(項目46)
前記汎用性プライマーがその5’末端またはその5’末端部分に1つまたは複数の機能性配列および/または基を含む、項目32〜45のいずれかに一項に記載の方法。
(項目47)
前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記1つまたは複数の機能性基が、蛍光性標識および結合性基から選択される、項目46に記載の方法。
(項目49)
前記汎用性プライマーが50から100個のヌクレオチドを含む、項目32〜48のいずれかに一項に記載の方法。
(項目50)
第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブの対が提供され、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列または前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含み、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の他の3’末端の配列または前記標的配列の他の3’末端に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含む、項目32〜49のいずれかに一項に記載の方法。
(項目51)
前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブが異なる汎用性配列を含む、項目50に記載の方法。
(項目52)
第1および第2の汎用性プライマーの対が提供され、前記第1の汎用性プライマーは、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含み、前記第2の汎用性プライマーは、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む、項目50または51のいずれかに一項に記載の方法。
(項目53)
前記第1および第2の汎用性プライマーが異なる機能性配列および/または基を含む、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記オリゴヌクレオチドプローブが前記汎用性プライマーの濃度と比較してより低い濃度で提供される、項目32〜53のいずれかに一項に記載の方法。
(項目55)
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が10:1を超える、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が12:1から275:1である、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が16:1から256:1である、項目56に記載の方法。
(項目58)
PCRによってDNA、cDNAまたはRNA標的配列を増幅するために前記標的特異的プライマーが使用される、項目32〜57のいずれかに一項に記載の方法。
(項目59)
RNA標的配列からcDNAアンプリコン構築物を生成するための方法であって、
標的特異的プライマー;
RNA標的配列
を提供すること、および
逆転写を実行すること
を含み、前記標的特異的プライマーは項目32〜58のいずれかに一項に記載の方法によって調製される方法。
(項目60)
前記標的特異的プライマーがin situで調製される、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記cDNAアンプリコン構築物がPCRによってさらに増幅される、項目59または60のいずれかに一項に記載の方法。
(項目62)
標的特異的プライマーを調製するのに使用するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、標的配列の3’末端のうち1つの配列の逆相補体または前記標的配列の3’末端のうちの1つに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目63)
一本鎖DNA配列である、項目62に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目64)
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的配列が、前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列またはそれに隣接する配列と同一である、項目62または63のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目65)
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である、項目62〜64のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目66)
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端に位置する、項目62〜65のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目67)
1つまたは複数の追加の配列を含む、項目62〜66のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目68)
前記1つまたは複数の追加の配列が前記汎用性配列の5’および前記標的特異的配列の3’に配置される、項目67に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目69)
前記1つまたは複数の追加の配列が機能性配列である、項目67または68のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目70)
前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、項目69に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目71)
前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端が、ポリメラーゼ伸長をブロックすることが可能なブロック基を含む、項目62〜70のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目72)
前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドトリホスフェート(ddNTP)またはスペーサーC3である、項目71に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(項目73)
20から50個のヌクレオチドを含む、項目62〜72のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
本発明の方法は、Illumina MiSeq(登録商標)装置での配列決定のためにDNA標的配列のタグ付きのアンプリコン構築物を生成するために実行された。このアッセイのための標的配列は、ヒトMUTYH遺伝子(refSeq NM_001128425)のエクソン7の一部である。このアッセイは、MUTYH関連のポリポーシス(MAP)を引き起こすことが知られている特異的突然変異(MUTYH:c.536A>G、p.Tyr179Cys)を分析するために使用される。
ステップ1:98℃で30秒間
ステップ2:以下を40サイクル:
98℃で10秒間
60℃で20秒間
72℃で20秒間
ステップ3:72℃で5分間
図2は、反応シーケンスの第1の反応を例示する。簡潔に示すために、第1および第2の汎用性プライマー28および30の機能性配列36および38は、文字「N」で置き換えた。
図4a〜4dは、本発明の方法により異なるDNA標的配列から得られたDNA断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
W:NRAS遺伝子のエクソン2(refseq NM_002524.4)
X:NRAS遺伝子のエクソン3(refseq NM_002524.4)
T:KRAS遺伝子のエクソン3(refseq NM_004985.3)
U:KRAS遺伝子のエクソン2(refseq NM_004985.3)
各標的配列に対して様々な濃度比で、本発明の方法を数回繰り返した。各回、汎用性プライマーの濃度は一定にしておいたが、オリゴヌクレオチドプローブの濃度は減少させた。
ステップ1:98℃で30秒間
ステップ2:以下を40サイクル:
98℃で10秒間
60℃で20秒間
72℃で20秒間
ステップ3:72℃で5分間
各標的配列の反応の各々から生成したアンプリコン構築物は、Agilent Bioanalyzer DNA 1000キットを使用して展開した。標的配列が本発明の方法によって首尾よく増幅されたかどうか立証するために、塩基対でのアンプリコンの予想される長さを、DNAの視認可能なバンドに対して外挿した。オリゴヌクレオチドプローブの濃度が2fmol/μlから117amol/μlの範囲内であり、汎用性プライマーの濃度が30fmol/μlであった場合に、必要とされるアンプリコン構築物のより高い濃度が得られることが判明した。これは、16:1から256:1の汎用性プライマー対オリゴヌクレオチドプローブの最適な濃度比に等しい。汎用性プライマー対オリゴヌクレオチドプローブの最適な濃度比が使用された反応の結果を、図4a〜4dに示す。
図5〜6は、本発明の方法により異なるDNA標的配列から得られたDNA断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
ステップ1:98℃で30秒間
ステップ2:以下を40サイクル:
98℃で10秒間
60℃で20秒間
72℃で20秒間
ステップ3:72℃で5分間
上記のように、生成されたアンプリコン構築物は、Agilent Bioanalyzer DNA1000キットを使用して展開し、塩基対でのそれらの予想サイズを既知のサイズのDNAの視認可能なバンドに対して外挿した。アンプリコン構築物の各々のおよそのゲノム位置および塩基対での予想サイズは、以下の通りであった:
図7は、本発明の方法により異なるDNA標的配列から得られたDNA断片のゲル電気泳動の結果を示す。
C−NB:JAK2遺伝子のエクソン14(refseq NM_004972.3)
N−NB:MUTYH遺伝子のエクソン7(refseq NM_001128428)
W−NB:NRAS遺伝子のエクソン2(refseq NM_002524.4)
X−NB:NRAS遺伝子のエクソン3(refseq NM_002524.4)
再び、第1および第2の汎用性プライマーの単一の対を、4対の第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることが可能なように設計した。本発明の方法は、実施例2から得られた最適な濃度比(汎用性プライマーの濃度:30fmol/μlおよびオリゴヌクレオチドプローブの濃度:1fmol/μl)を使用して、全4つの標的配列に対して実行した。
ステップ1:98℃で30秒間
ステップ2:以下を40サイクル:
98℃で10秒間
60℃で20秒間
72℃で20秒間
ステップ3:72℃で5分間
上記のように、生成されたアンプリコン構築物は、Agilent Bioanalyzer DNA1000キットを使用して展開し、塩基対でのそれらの予想サイズを既知のサイズのDNAの視認可能なバンドに対して外挿した。アンプリコン構築物の各々の塩基対での予想サイズは、以下の通りであった:
Claims (61)
- 標的配列を含むオリゴヌクレオチドのアンプリコン構築物を生成するための方法であって、
標的配列を含むオリゴヌクレオチド;
汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列またはそれに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ;
その3’末端に、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
前記標的配列を含むオリゴヌクレオチド、第1の標的特異的プライマーおよび第2の標的特異的プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行して、前記アンプリコン構築物を生じさせることであって、前記第1の標的特異的プライマーが、ポリメラーゼ使用した伸長反応を介して前記オリゴヌクレオチドプローブおよび前記汎用性プライマーを使用してin situで調製される、こと
を含む方法。 - 前記標的配列を含むオリゴヌクレオチドがDNA、cDNAまたはRNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記標的配列を含むオリゴヌクレオチドが、前記標的配列を含むcDNAを含み、前記標的配列を含むcDNAが前記標的配列を含むcDNAに対応するRNAに対して逆転写酵素PCR(RT−PCR)を実行することによってin situで形成される、請求項1または2のいずれかに一項に記載の方法。
- 複数の異なる標的配列を含むオリゴヌクレオチドに対して多重PCRが実行される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖DNAである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的配列が、前記標的配列の3’末端のうちの1つまたはそれに隣接する配列と同一である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端に位置する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが1つまたは複数の追加の配列を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の追加の配列が前記汎用性配列の5’および前記標的特異的配列の3’に配置される、請求項9に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の追加の配列が機能性配列である、請求項9または10のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端が、ポリメラーゼ伸長をブロックすることが可能なブロック基を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドトリホスフェート(ddNTP)またはスペーサーC3である、請求項13に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが20から50個のヌクレオチドを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーが一本鎖DNAである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの3’末端が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列に相補的である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーがその5’末端またはその5’末端部分に1つまたは複数の機能性配列および/または基を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の基が、蛍光性標識および結合性基から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーが50から100個のヌクレオチドを含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブの対が提供され、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の3’末端の配列のうちの1つの配列または前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含み、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の他の3’末端の配列または前記標的配列の他の3’末端に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブが異なる汎用性配列を含む、請求項22に記載の方法。
- 第1および第2の汎用性プライマーの対が提供され、前記第1の汎用性プライマーは、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含み、前記第2の汎用性プライマーは、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む、請求項22または23のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の汎用性プライマーが異なる機能性配列および/または基を含む、請求項24に記載の方法。
- 複数の異なる標的配列を多重PCRによって増幅するために、複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ対および汎用性プライマーまたはプライマー対が提供される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが前記汎用性プライマーの濃度と比較してより低い濃度で提供される、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が10:1を超える、請求項27に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が12:1から275:1である、請求項28に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が16:1から256:1である、請求項29に記載の方法。
- 前記標的配列の前記アンプリコン構築物がさらに配列決定される、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 標的配列からアンプリコン構築物を生成するのに使用するための標的特異的プライマーを調製するための方法であって、
汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、前記標的配列の3’末端のうちの1つにおける配列の逆相補体または前記標的配列の3’末端のうちの1つに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ;
その3’末端に、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼを使用して伸長反応を実行すること
を含む方法。 - 前記オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖DNAである、請求項32に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的配列が、前記標的配列の3’末端の配列またはそれに隣接する配列と同一である、請求項32または33のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である、請求項32〜34のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端に位置する、請求項32〜35のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが1つまたは複数の追加の配列を含む、請求項32〜36のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の追加の配列が前記汎用性配列の5’および前記標的特異的配列の3’に配置される、請求項37に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の追加の配列が機能性配列である、請求項37または38のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項39に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端が、ポリメラーゼ伸長をブロックすることが可能なブロック基を含む、請求項32〜40のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドトリホスフェート(ddNTP)またはスペーサーC3である、請求項41に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが20から50個のヌクレオチドを含む、請求項32〜42のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーが一本鎖DNAである、請求項32〜43のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの3’末端が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列に相補的である、請求項32〜44のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーがその5’末端またはその5’末端部分に1つまたは複数の機能性配列および/または基を含む、請求項32〜45のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項46に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の機能性基が、蛍光性標識および結合性基から選択される、請求項46に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーが50から100個のヌクレオチドを含む、請求項32〜48のいずれかに一項に記載の方法。
- 第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブの対が提供され、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列または前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含み、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の他の3’末端の配列または前記標的配列の他の3’末端に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含む、請求項32〜49のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブが異なる汎用性配列を含む、請求項50に記載の方法。
- 第1および第2の汎用性プライマーの対が提供され、前記第1の汎用性プライマーは、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含み、前記第2の汎用性プライマーは、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む、請求項50または51のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の汎用性プライマーが異なる機能性配列および/または基を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが前記汎用性プライマーの濃度と比較してより低い濃度で提供される、請求項32〜53のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が10:1を超える、請求項54に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が12:1から275:1である、請求項55に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が16:1から256:1である、請求項56に記載の方法。
- PCRによって前記標的配列を含むDNA、cDNAまたはRNAを増幅するために前記標的特異的プライマーが使用される、請求項32〜57のいずれかに一項に記載の方法。
- 標的配列を含むRNAからcDNAアンプリコン構築物を生成するための方法であって、
標的特異的プライマー;
標的配列を含むRNA
を提供すること、および
逆転写を実行すること
を含み、前記標的特異的プライマーは請求項32〜58のいずれかに一項に記載の方法によって調製される方法。 - 前記標的特異的プライマーがin situで調製される、請求項59に記載の方法。
- 前記cDNAアンプリコン構築物がPCRによってさらに増幅される、請求項59または60のいずれかに一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1504464.7A GB2536446B (en) | 2015-03-17 | 2015-03-17 | PCR method |
GB1504464.7 | 2015-03-17 | ||
PCT/GB2016/050558 WO2016146968A1 (en) | 2015-03-17 | 2016-03-03 | Pcr method |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018507706A JP2018507706A (ja) | 2018-03-22 |
JP2018507706A5 JP2018507706A5 (ja) | 2018-08-02 |
JP6940412B2 true JP6940412B2 (ja) | 2021-09-29 |
Family
ID=53016243
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017548462A Active JP6940412B2 (ja) | 2015-03-17 | 2016-03-03 | Pcr方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11499182B2 (ja) |
EP (1) | EP3271475A1 (ja) |
JP (1) | JP6940412B2 (ja) |
CN (1) | CN107406891B (ja) |
AU (1) | AU2016231995B2 (ja) |
CA (1) | CA3017443A1 (ja) |
GB (1) | GB2536446B (ja) |
HK (1) | HK1244036A1 (ja) |
NZ (1) | NZ735738A (ja) |
WO (1) | WO2016146968A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108486101B (zh) * | 2018-04-03 | 2021-01-08 | 艾吉泰康生物科技(北京)有限公司 | 一种快速捕获建库的方法 |
CN108774639B (zh) * | 2018-05-31 | 2023-05-30 | 澳門帝傑數碼基因有限公司 | 一种定向聚合的荧光探针pcr |
US20220411861A1 (en) | 2019-09-11 | 2022-12-29 | Parlanca Limited | A Multiplex Method of Preparing a Sequencing Library |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6207242B1 (en) * | 1995-12-28 | 2001-03-27 | Hoffman Environmental System, Inc. | Laminated package with enhanced interior and exterior |
WO2001006012A1 (en) * | 1999-07-14 | 2001-01-25 | Packard Bioscience Company | Derivative nucleic acids and uses thereof |
GB0013260D0 (en) * | 2000-05-31 | 2000-07-19 | Neuronova Ab | Method |
GB0019179D0 (en) * | 2000-08-07 | 2000-09-27 | Potter Colin G | Genetic analysis with a universal probe system |
AUPS204502A0 (en) * | 2002-05-01 | 2002-06-06 | Nucleics Pty Ltd | A method for increasing the affinity of an oligonucleotide for a target nucleic acid |
US7176002B2 (en) * | 2002-05-16 | 2007-02-13 | Applera Corporation | Universal-tagged oligonucleotide primers and methods of use |
EP1602733A1 (en) * | 2004-06-02 | 2005-12-07 | Keygene N.V. | Detection of target nucleotide sequences using an asymmetric oligonucleotide ligation assay |
US9657347B2 (en) * | 2004-04-20 | 2017-05-23 | University of Utah Research Foundation and BioFire Defense, LLC | Nucleic acid melting analysis with saturation dyes |
EP1954706B1 (en) * | 2005-11-30 | 2012-03-28 | Epicentre Technologies Corporation | Method using reversibly blocked tagging oligonucleotides |
EP1991698B1 (en) * | 2006-03-01 | 2013-12-18 | Keygene N.V. | High throughput sequence-based detection of snps using ligation assays |
WO2007130967A2 (en) * | 2006-05-01 | 2007-11-15 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Novel oligonucleotide primers and methods for dna replication |
US8486638B2 (en) * | 2008-10-29 | 2013-07-16 | Check-Points Holding B.V. | Method for fast detection and identification of micro-organisms |
US9017971B2 (en) * | 2008-11-05 | 2015-04-28 | Stichting Sanquin Bloedvoorziening | Means and methods for investigating nucleic acid sequences |
WO2010057525A1 (en) | 2008-11-19 | 2010-05-27 | Fondazione Parco Tecnologico Padano | Oligonucleotide primers for nucleotide indexing of polymorphic pcr products and methods for their use |
WO2012054933A2 (en) * | 2010-10-22 | 2012-04-26 | Fluidigm Corporation | Universal probe assay methods |
CN103491871B (zh) * | 2011-04-22 | 2016-04-20 | 皇家飞利浦有限公司 | 患者定位系统 |
EP2729580B1 (en) * | 2011-07-08 | 2015-09-16 | Keygene N.V. | Sequence based genotyping based on oligonucleotide ligation assays |
US8987174B2 (en) * | 2011-10-28 | 2015-03-24 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods for manufacturing molecular arrays |
ES2662825T3 (es) | 2013-02-25 | 2018-04-09 | Seegene, Inc. | Detección de variación de nucleótido en una secuencia de ácidos nucleicos diana |
US11254977B2 (en) * | 2013-03-12 | 2022-02-22 | Life Technologies Corporation | Universal reporter-based genotyping methods and materials |
-
2015
- 2015-03-17 GB GB1504464.7A patent/GB2536446B/en active Active
-
2016
- 2016-03-03 JP JP2017548462A patent/JP6940412B2/ja active Active
- 2016-03-03 CA CA3017443A patent/CA3017443A1/en active Pending
- 2016-03-03 EP EP16709519.9A patent/EP3271475A1/en active Pending
- 2016-03-03 US US15/558,927 patent/US11499182B2/en active Active
- 2016-03-03 WO PCT/GB2016/050558 patent/WO2016146968A1/en active Application Filing
- 2016-03-03 NZ NZ735738A patent/NZ735738A/en unknown
- 2016-03-03 AU AU2016231995A patent/AU2016231995B2/en active Active
- 2016-03-03 CN CN201680019555.8A patent/CN107406891B/zh active Active
-
2018
- 2018-03-14 HK HK18103563.1A patent/HK1244036A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB2536446A (en) | 2016-09-21 |
AU2016231995A1 (en) | 2017-10-12 |
CN107406891A (zh) | 2017-11-28 |
CN107406891B (zh) | 2022-06-24 |
US20180073053A1 (en) | 2018-03-15 |
CA3017443A1 (en) | 2016-09-22 |
NZ735738A (en) | 2024-01-26 |
HK1244036A1 (zh) | 2018-07-27 |
GB201504464D0 (en) | 2015-04-29 |
US11499182B2 (en) | 2022-11-15 |
AU2016231995B2 (en) | 2021-07-15 |
WO2016146968A1 (en) | 2016-09-22 |
JP2018507706A (ja) | 2018-03-22 |
GB2536446B (en) | 2020-06-03 |
EP3271475A1 (en) | 2018-01-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2015063154A1 (en) | Blocking primers in multiplex pcr based assays | |
JP6940412B2 (ja) | Pcr方法 | |
CA3029167C (en) | Method for producing dna library and method for analyzing genomic dna using the dna library | |
WO2015155723A1 (en) | Universal controls for sequencing assays | |
KR101525495B1 (ko) | 덤벨 구조 올리고뉴클레오티드, 이를 포함한 핵산 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법 | |
EP2798078B1 (en) | Method and primer set for detecting mutation | |
US20080199857A1 (en) | Method of increasing specificity of nucleic acid hybridization using zwitterionic compound | |
CN109415762B (zh) | 通过多重扩增双重信号扩增的目标核酸序列的检测方法 | |
US9523120B2 (en) | Method of amplifying a nucleic acid | |
US20220195510A1 (en) | Protocols and kits for multiplex amplification and ngs-specific tagging | |
US20180073082A1 (en) | Dumbbell-structure oligonucleotide, nucleic acid amplification primer comprising same, and nucleic acid amplification method using same | |
WO2018212318A1 (en) | Set of random primers and method for preparing dna library using the same | |
CN111334562A (zh) | 一种含有修饰引物的核酸扩增方法和试剂盒 | |
CN105603055B (zh) | 多重聚合酶链式反应方法及其应用 | |
CN116042928B (zh) | 用于扩增和检测消化道病毒核酸序列的引物组 | |
CN108699594B (zh) | 靶标序列中所需核酸区的选择性扩增 | |
CN117126924A (zh) | 一种核酸扩增方法及其应用 | |
US20190119746A1 (en) | Oligonucleotides for selective amplification of nucleic acids | |
CN115261508A (zh) | 一种同时检测多种病毒的方法、检测多种病毒的系统及其应用 | |
Whitcombe | 6 Using Scorpion Primers | |
US20110117547A1 (en) | Target dna detection method and target dna detection kit | |
US20140315202A1 (en) | Method for assembling multiple target loci to single nucleic acid sequence | |
JP2005278443A (ja) | オリゴヌクレオチド及びそれを用いた淋菌の検出方法 | |
JP2014187904A (ja) | 血液から塩基多型を検出する方法 | |
JP2014223026A (ja) | 核酸配列の欠失または導入を判定する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181217 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200127 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200422 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200626 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201127 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210301 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210823 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210902 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6940412 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |