CN115261508A - 一种同时检测多种病毒的方法、检测多种病毒的系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测多种病毒的方法、引物组及试剂盒。所述方法包括：识别病毒基因组序列中富含AT碱基的序列作为目标序列；针对目标序列自动化、高通量地设计特异性引物；设计特定的Tm值计算公式计算反应变性及退火温度，并据此设置核酸扩增反应条件；在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应。本发明靶向传统核酸扩增方法通常需要规避的富含AT碱基的序列，拓展候选靶标区域；通过基于海量基因组数据的特异性排查，以及针对富含AT区域的Tm值的精确计算，从而对双链DNA进行局部解链，降低核酸扩增技术中普遍存在的非特异性扩增的可能性。该方法有效地拓展病毒核酸扩增技术的应用范围，同时在引物设计通量、反应特异性等方面显著提升反应性能。

Description

一种同时检测多种病毒的方法、检测多种病毒的系统及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种病毒核酸扩增方法、检测多种病毒的系统及其应用，所述方法是一种专门针对病毒基因组中富含AT碱基的序列进行核酸扩增的方法。
背景技术
核酸扩增技术(nucleic acid amplification technology，NAAT)是一类分子生物学技术的总称，这类技术通过引物、DNA聚合酶和其它试剂在特定温度下进行反应，实现微量核酸的快速、特异性扩增，可广泛应用于疾病诊断、病原微生物检测、食品安全检测、动植物检疫以及涉及分子克隆的各项应用，如测序、基因克隆、基因操作、等位基因分析、突变检测等。其中聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)是最早实现应用的核酸扩增技术，它模仿DNA在体内复制的过程，通过一对特异的寡核苷酸引物与待扩增DNA片段互补，再经过若干个循环的变性、退火、延伸过程，实现DNA片段的指数级扩增。PCR技术由Cetus公司的Mullis于1985年发明，随后Saiki等人将热稳定DNA聚合酶引入PCR反应体系，解决了早期PCR技术因热变性循环过程中DNA聚合酶钝化导致需要不断人工添加聚合酶的缺点，大大提高了核酸扩增效率并使该技术可以实现自动化，自此以后，以PCR为代表的核酸扩增技术得到广泛的推广和应用，也极大的推动了分子生物学的发展。
众所周知，现有核酸扩增技术通常会避开富含GC或AT的区域，其原因在于，这些区域易通过自身互补配对形成发夹环二级结构，从而阻碍引物与模板的结合；即使引物与模板能够勉强结合，也容易影响DNA聚合酶延模板链的延伸，从而导致DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。因此，为了提高反应成功率，传统的核酸扩增技术对扩增区域的碱基组成具有选择偏好性，其引物设计往往集中在GC含量40％～60％的区域，以45％～55％为最适宜，不同扩增技术略有差别，如PCR的引物设计建议G+C含量为40％～60％(见分子克隆实验指南第四版，表7-1引物设计)，LAMP引物设计建议G+C含量为40％～65％(见AGuide to LAMP primer designing(PrimerExplorer V3))。然而，自然界中生物体的核酸碱基组成差别巨大，如疟原虫基因组AT碱基含量约为82％，周慧琦等研究了2670株细菌和古细菌，发现其基因组GC含量变化范围从14％到75％(周慧琦,2014)。从检测角度讲，现有核酸扩增技术的碱基组成选择偏好性忽略了大量潜在的靶序列，放大了目标对象被成功检出的难度；从基因操作角度讲，该选择偏好性导致相当多的目标序列难以被顺利扩增，从而难以开展进一步分子操作。如能针对传统核酸扩增方法所回避的GC碱基含量、AT碱基含量非均衡域设计适当的引物，避免形成二级结构，同时设置适宜的反应条件，顺利开展核酸扩增实验，将显著增加目标对象被检出的成功率，同时使得更多序列能够被扩增进而方便地实施下游分子操作。
针对GC碱基含量、AT碱基含量非均衡区域开展核酸扩增反应，其关键步骤是引物设计环节。鉴于以上分析，领域内公开发布的种属特异基因(或序列)通常来自于GC含量40％～60％甚至45％～55％的区域，因而无法应用于针对GC、AT碱基含量非均衡区域的引物设计。另外，此类序列中连续存在的GC-rich或AT-rich区，其碱基组成多样性相比其它区域偏弱，又为特异性引物的设计带来额外的困难。因此首先需要提出一套能够针对GC、AT碱基含量非均衡序列进行高通量、自动化、高效率的引物设计算法流程。
除了扩增区域选择和引物设计外，扩增区域和引物的Tm值计算也是扩增过程能否顺利完成的重要影响因素。扩增区域和引物的Tm值通常按照最近邻二态模型进行计算，但是不同研究者及引物生产公司采用的具体计算公式各有不同，如分子克隆实验指南第四版中建议的引物Tm计算公式为Tm＝4×(G,C数)+2×(A,T数)，TaKaRa公司建议的引物Tm计算公式为Tm＝4×(G,C数)+2×(A,T数)+32-2×(总碱基数)；生工生物的引物Tm计算公式为Tm(0.05M Na+)＝59.94+1×(GC的百分含量)-(675/引物序列长度)。对于GC、AT碱基含量非均衡区域而言，应当如何设计模型进行引物Tm值计算，成为确保实验成功的重要因素。
综上所述，领域内亟需发展一种针对传统核酸扩增技术难以涉及的区域的核酸扩增技术，能够高通量、自动化地设计特异性引物，计算其Tm值，并设置适宜的变性温度、退火温度等反应条件，拓展核酸扩增技术的应用范围，提升扩增的特异性，满足核酸检测、分子遗传学研究等多方面的需求。
发明内容
本发明提出了一种创新的病毒核酸扩增方法以及该方法在水产病毒检测中的应用。该方法以富含AT的核酸序列为扩增目标，进行目标序列识别、引物设计、变性温度及退火温度计算、模板局部解链的核酸扩增等。首先，采用自动化的引物设计流程，充分利用公共数据资源中丰富的基因组序列信息，高通量地设计针对富含AT的目标序列的特异性引物对。其次，拟合了符合富含AT序列特点的Tm值计算公式，可根据理论扩增产物序列及引物的序列长度、碱基组成等因素计算变性温度和退火温度；考虑到富含AT的核酸序列变性温度显著低于GC含量40％～60％以及高GC的序列，因此将计算所得的理论扩增产物序列Tm值作为最低变性温度，在该温度下，能够在不添加任何化学变性剂的前提下，对双链DNA的富含AT区域进行局部解链，进而启动核酸扩增反应。
本发明一方面在引物设计环节引入公共数据资源中的海量基因组数据，进行序列特异性排查；另一方面，在变性温度设置环节有别于传统核酸扩增方法在93～95℃变性温度下打开所有双链结构，而是通过降低变性温度仅打开富含AT序列，从而在源头上极大地减少了非靶向区域发生非特异扩增的可能性。这两方面的设计策略显著降低了核酸扩增反应中常见的非特异性扩增的可能性，在此基础上形成了针对富含AT序列的核酸扩增方法。该方法的引物设计步骤采用C语言和Perl语言编程实现，具有高通量、自动化的特点，整个扩增方法特异性强、成功率高，有效地拓展了传统核酸扩增技术的应用范围，显著提升了反应性能。
本发明中，所述核酸扩增方法包括识别目标基因组中兼具通用性和特异性的目标序列；从目标序列中筛识别出富含AT碱基的靶序列；针对靶序列自动化、高通量地设计特异性引物；设计特定的Tm值计算公式计算反应变性及退火温度，并据此设置核酸扩增反应条件；在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应。
具体包括如下步骤：
(1)在病毒基因组序列中兼具通用性和特异性的目标序列；
(2)从上述目标序列中识别富含AT碱基的靶序列；
(3)针对所述靶序列设计核酸扩增引物；
(4)基于GC的百分含量、引物序列长度、引物对的理论扩增产物序列长度计算反应变性温度及退火温度，并设置核酸扩增反应条件；
(5)根据序列扩增长度、反应变性温度及退火温度筛选合适的单一病毒引物引物对并组成检测多种病毒的引物组。
(6)在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
本发明步骤(1)中，通过多序列比对的方法获得目标序列，当序列数目大于200，或序列长度大于1500，或序列间相似度预估大于80％时，优选Muscle；若序列不符合以上情况，则选择MAFFT，序列彼此长度相似时使用globalpair参数，序列间异质性很强时选择genafpair参数；特别地，对于序列数目小于100且序列长度小于1000，而准确度要求很高的特殊场景，则优选T-coffee进行多序列比对。
本发明步骤(1)中，将待检测对象基因组设定成集合A，非检测对象基因组设定成集合B，所述通用性指集合A中所有序列的多序列比对结果中，该序列每1kb范围内最多存在3个非连续错配；所述目标序列特异性指该序列与集合B中所有非目标序列存在4个以上连续错配。
本发明步骤(2)中，识别富含AT碱基序列的方法为从目标序列第一个碱基开始滑动宽度为1500bp的窗口，步长为20～200bp。针对每次窗口所在位置包含的序列计算AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于55％的区域作为靶序列。优选地，保留序列AT碱基含量在60-80％的区域作为靶目标序列。
本发明步骤(3)中，所述引物的设计方法，包括：(3.1)针对一条目标序列进行单条引物设计，得到候选引物；(3.2)对所述候选引物进行理化性质判定，筛选符合条件的单条引物；(3.3)将步骤(3.2)筛选得到的单条引物组合成引物对；(3.4)对所述引物对进行通用性、特异性的判定；(3.5)输出符合条件的引物对，得到所述特异性引物。
本发明中，可以采用任何能实现高通量的引物设计的编程语言来实现，如可操作性强、速度较快的C、Perl等编程语言实现。
步骤(3.1)中，针对目标序列设计候选引物，候选引物需满足以下条件：a)引物序列长度在20bp～36bp之间；b)AT碱基含量在60％～80％，c)连续GC数≤5；同时记录所述候选引物匹配到目标序列上的位置信息、正负链信息。
其中，优选地，所述AT碱基含量为60％～75％。
其中，所述“连续GC数”是指引物序列中连续碱基G或者连续碱基C的数量，如引物序列AAGGGGGTTCCAGGCATTA中连续GC数为5/2/2。
步骤(3.2)中，对满足上述(3.1)条件的单条引物进行理化性质判定，包含但不限于3’端稳定性、5’端稳定性和/或二级结构稳定性等物理化学性质，保留符合要求的单条引物。
其中，所述“符合要求的单条引物”是指具备3’端稳定性、5’端稳定性和二级结构稳定性的单条引物。
步骤(3.3)中，对上述步骤(3.2)筛选得到的单条引物，根据其匹配到目标序列上的位置信息、正负链信息，将单条引物组合成引物对；引物对的理论扩增产物序列的长度应在200bp～600bp之间。根据公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值；以引物对Tm差值≤3℃，以及引物之间不能发生相互作用为条件，对引物对进行筛选，得到候选引物对。其中，GC的百分含量是指引物中的碱基G和C的个数占引物总碱基个数的百分比；引物序列长度是指引物的碱基个数。
步骤(3.4)中，对步骤(3.3)得到的候选引物对中的每一条引物做通用性、特异性判定。其中通用性判定指检查引物对是否严格匹配到所有的目标序列(如某待测物种的多个品系，例如SARS-CoV-2的多个病毒株基因组)；
特异性判定指检查单条引物是否不能与所有目标序列之外的非目标序列发生特异性匹配，所述非目标序列指除待扩增核酸序列之外的其它核酸序列，所述特异性匹配指不大于2个错配的匹配。通过通用性和特异性判定的候选引物可进入下一步骤。步骤(3.5)中，输出符合条件的引物对，即得到所述核酸扩增反应的引物对。
本发明所述步骤(4)中，所述反应变性温度的计算公式为0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/引物对的理论扩增产物序列长度)，记为Tma；其中，GC的百分含量是指引物对的理论扩增产物序列中的碱基G和C的个数占引物对的理论扩增产物序列总碱基个数的百分比。
本发明所述步骤(4)中，所述反应退火温度为上述步骤(3.3)中两条引物的Tm值的平均值，记为Tmb。即，根据公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，将所述Tm值取平均值即为所述反应退火温度，记为Tmb；其中，GC的百分含量是指引物中的碱基G和C的个数占引物总碱基个数的百分比。
本发明所述步骤(5)中，所述引物组合的筛选条件包括不同病毒扩增序列长度至少相差50bp，反应变性温度最多相差2℃，反应退火温度最多相差2℃。
本发明所述步骤(6)中，所述核酸扩增反应条件包括：在变性温度下反应5秒，在退火温度下反应5秒，在延伸温度下反应20秒，以上过程重复30-40次。其中变性温度根据需要可在Tma±5℃之间调整；退火温度根据需要可在Tmb
±3℃之间调整；延伸温度为72℃。
本发明还提供了所述方法在检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)中的应用。
本发明还提供了所述方法在检测传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)中的应用。
本发明还提供了所述方法在同时检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)中的应用。
按本发明所述的设计方法获得的引物对为：
引物对A：
SVCV-F1：5’-GGATTAGACTTGATTGACAC-3’(SEQ ID NO：1)
SVCV-R1：5’-TCTTTCCCTTTATATACACCATT-3’(SEQ ID NO：2)；
按本发明所述方法计算的引物对退火温度为61.32℃±3℃，优选的退火温度为61℃；按照本发明所述方法计算的变性温度为81.96℃±5℃，优选的变性温度为85℃；理论扩增片段大小为341bp。
按本发明所述的设计方法获得的引物对为：
引物对C：
SVCV-F2：5’-TAATTTCAGACGACATTGAATATCTCA-3’(SEQ ID NO：5)
SVCV-R2：5’-AACAGAGTCAATTTGTGCAG-3’(SEQ ID NO：6)；
按本发明所述方法计算的引物对退火温度为62.8℃±3℃，优选的退火温度为61℃；按照本发明所述方法计算的变性温度为82.1℃±5℃，优选的变性温度为85℃；理论扩增片段大小为358bp。
按本发明所述的设计方法获得的引物对为：
引物对B：
IHNV-F：5’-TCTGTCAATACGTTTGGACT-3’(SEQ ID NO：3)
IHNV-R：5’-ATGTTCTCACTTGTTAGAGTCTCTT-3’(SEQ ID NO：4)
按本发明所述方法计算的引物对退火温度为63.5℃±3℃，优选的退火温度为61℃；按照本发明所述方法计算的变性温度为82.64℃±5℃，优选的变性温度为85℃；理论扩增片段大小为271bp。
本发明还提供了如上所述的方法或如上所述的引物对同时在鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)相关基因或区域的扩增和/或检测中的应用。
本发明还提供了如上所述的引物对在制备扩增和/或同时检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)相关基因或区域的产品中的应用。
本发明还提供了一种诊断试剂及其在同时检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)中的应用，所述诊断试剂包括如上所述的引物对。
本发明还提供了如上所述的方法或如上所述的引物对在鲤春病毒血症病毒(SVCV)或传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)相关基因或区域的扩增和/或检测中的应用。
本发明还提供了如上所述的引物对在制备扩增和/或检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)或传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)相关基因或区域的产品中的应用。
本发明还提供了一种诊断试剂及其在检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)或传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)中的应用，所述诊断试剂包括如上所述的引物对。
本发明还提供了一种同时检测多种病毒的检测系统，其特征在于，所述系统采用如上所述的方法，所述系统包括：
筛选模块，起其用于筛选单一病毒基因组序列中兼具通用性和特异性的目标序列；
识别模块，其用于从上述目标序列中识别富含AT碱基的靶序列；
设计模块，其用于针对所述靶序列设计核酸扩增引物；
计算模块，其用于基于GC的百分含量、引物序列长度、引物对的理论扩增产物序列长度计算反应变性温度及退火温度；
组成模块，其用于根据序列扩增长度、反应变性温度及退火温度筛选合适的单一病毒引物引物对并组成检测多种病毒的引物组；
扩增模块，其用于设置核酸扩增反应条件，在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
本发明的有益效果在于，本发明靶向传统核酸扩增方法通常需要规避的富含AT碱基的序列，极大地拓展了候选靶标区域；通过基于海量基因组数据的特异性排查，以及针对富含AT区域的Tm值的精确计算，从而对双链DNA进行局部解链，大大降低了核酸扩增技术中普遍存在的非特异性扩增的可能性。该方法有效地拓展了传统核酸扩增技术的应用范围，同时在引物设计通量、反应特异性等方面显著提升了反应性能，可满足核酸检测、分子遗传学研究等多方面的需求。
附图说明
图1为本发明SVCV引物阳性模板扩增曲线。
图2为本发明SVCV引物阳性模板扩增熔解曲线。
图3为本发明SVCV引物阳性模板扩增电泳胶图。
图4为本发明SVCV引物变性温度扩增曲线。
图5为本发明SVCV引物变性温度熔解曲线。
图6为本发明SVCV退火温度57～61℃扩增曲线。
图7为本发明SVCV退火温度57～61℃熔解曲线。
图8为本发明SVCV退火温度57～61℃电泳胶图。
图9为本发明SVCV引物一步法扩增产物电泳胶图。
图10为本发明SVCV及IHNV引物阳性模板扩增曲线。
图11为本发明SVCV及IHNV引物阳性模板扩增熔解曲线。
图12为本发明SVCV及IHNV引物阳性模板扩增电泳胶图。
图13为本发明86℃变性，引物阳性模板扩增曲线。
图14为本发明IHNV引物阳性模板扩增熔解曲线。
图15为本发明IHNV引物阳性模板扩增电泳胶图。
图16为本发明IHNV退火温度57～61℃扩增曲线。
图17为本发明IHNV退火温度57～61℃熔解曲线。
图18为本发明IHNV退火温度57～61℃电泳胶图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1鲤春病毒血症病毒(SVCV)特异性序列的扩增用于SVCV的特异性检测
本发明针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组筛选富含AT的序列并设计特异性引物，根据计算的引物Tm和目标序列Tm设置反应条件进行核酸扩增，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在目标序列，进而确定待测样品中是否存在鲤春病毒血症病毒。具体步骤如下：
(1)在鲤春病毒血症病毒基因组序列中兼具通用性和特异性的目标序列：使用2019年8月5号从NCBI的FTP上下载的有完整基因组序列的细菌、古菌和病毒的数据，共2896个全基因组序列。设定集合A，其包含所有鲤春病毒血症病毒基因组序列；设定集合B，其包所有含非鲤春病毒血症病毒基因组序列。使用Muscle进行多序列比对，保留同时满足以下两点条件的序列作为目标序列：1、集合A中所有序列的多序列比对结果中，每1kb范围内最多存在3个非连续错配的序列；2、与集合B中所有非目标序列存在4个以上连续错配。
(2)富含AT碱基的靶序列的筛选：从上述目标序列第一个碱基开始滑动宽度为1500bp的窗口，步长为50bp；每次滑动前计算一次序列AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为候选靶序列。以上过程采用perl脚本实现。
(3)特异性引物的设计：
根据PCR引物的特性及本发明的需求，设定引物的AT碱基含量为60％～75％、3’端稳定性ΔG<4、5’端稳定性ΔG<3及引物序列长度(20～36bp)等特性参数，同时设定单条引物不能产生发卡结构、自身不能发生相互作用等条件，以步骤(2)中的候选靶序列作为单条引物设计的候选序列，计算得出符合上述设定条件的单条引物。通过公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，并记录每条引物在目标序列上的位置、正负链信息(即来源于正链还是负链)以及引物的长度等信息。
根据单条引物的位置信息进行引物配对，保留同时满足引物对Tm差值<3℃以及引物对扩增区域在200～600bp两个条件的引物对作为候选引物对。系统输出满足条件的引物对，其中引物对的数量可预先设置，在本实施例中引物对的数量预先设置为10。以上高通量、自动化引物设计流程采用C、Perl脚本实现。
程序运行后在AT富集区设计出PCR反应引物对10个，随机选择一个引物组进行有效性验证。所述引物对的序列为：
SVCV-F1：5’-GGATTAGACTTGATTGACAC-3’(SEQ ID NO：1)
SVCV-R1：5’-TCTTTCCCTTTATATACACCATT-3’(SEQ ID NO：2)
所述引物的AT碱基含量分别为60％和70％，所述引物对的理论扩增产物序
列的AT百分含量为60％。
(4)PCR反应变性温度和退火温度的计算：
使用公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算可知，引物SVCV-F的Tm＝62.18℃，SVCV-R的Tm＝60.45℃，该引物对平均Tm值为61.32℃；使用公式0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/扩增产物序列长度)计算扩增区域理论变性温度为81.96℃。
(5)核酸扩增反应及结果检测：
以质粒DNA标准品为模板的核酸扩增反应体系配置如下表1所示，以鲤春病毒血症病毒RNA模板的核酸扩增反应体系配置如下表2所示。根据计算结果，用实时荧光定量PCR仪确定适用的变性温度、退火温度及溶解曲线；测试了以鲤春病毒血症病毒RNA模板下的检测灵敏度。86℃变性5秒，61℃退火5秒，72℃延伸20秒作为一个工作循环，推荐以上过程重复35次。
在使用普通梯度PCR仪反应完成后可通过以下方式判定扩增结果：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列。
表1.鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus)DNA质粒扩增反应体系
体系 体积(μl) 终浓度
R300 MIX(TaKaRaTaq<sup>TM</sup>HS Perfect Mix) 12.5 /
SYBR Green Ⅰ(25×) 1 1×
SVCV-F1/SVCV-R1(10μM) 1.25+1.25 0.5μM
100％DMSO 0.5 2％
DNA模板 0/1 /
ddH2O Up to 25 /
表2.鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus)核酸RNA扩增反应体系
Figure BDA0003049592380000101
Figure BDA0003049592380000111
图1/2/3分别展示了本发明针对鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carpvirus)的核酸扩增反应在适合温度下的实时荧光定量PCR的扩增曲线、溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳结果，其中“SVCV”指该变性温度下阳性模板的扩增结果，“NTC”为其对应的阴性模板扩增结果，“M”指Marker DL2000。图1阳性模板及阴性模板扩增情况符合预期。图2熔解曲线为单一峰，无非特异反应。图3SVCV为阳性模板扩增电泳鉴定结果，若扩增产物电泳后在341bp处有一条单一的条带，则为阳性；若扩增产物电泳后无条带，则为阴性。
(6)变性温度的优化测试：
参考步骤(5)中的反应体系和条件，进一步将变性温度降低到85℃和84℃，图4/5分别展示了本发明针对SVCV引物优化后的变性温度的扩增曲线和熔解曲线。图4中84℃和85℃指该变性温度下阳性模板的扩增结果；NTC，为其对应的阴性模板扩增结果。图5熔解曲线为单一峰，无非特异反应。
(7)退火温度的优化测试：
参考步骤(6)中的反应体系和条件，图6/7/8分别分别展示了本发明针对SVCV引物在85℃的变性温度时，退火温度分别从57到61℃的扩增曲线总图、熔解曲线总图和电泳胶图。图6中57℃～61℃指该退火温度下阳性模板的341扩增结果；NTC，为其对应的阴性模板扩增结果。图5熔解曲线为单一峰，无非特异反应。图8SVCV为阳性模板扩增电泳鉴定结果，若扩增产物电泳后在bp处有一条单一的条带，则为阳性；若扩增产物电泳后无条带，则为阴性。
(8)本方法检测性能：
图9展示了本发明针对SVCV引物在适宜温度下以鲤春病毒血症病毒基因组RNA为模板一步法扩增产物的电泳胶图(反应体系见表2)。图中1×RNA、10-1RNA、10-2RNA、10-3RNA分别为SVCV病毒RNA模板原液以及对原液进行10-1、10-2、10-3倍梯度稀释模板。PTC为SVCV病毒阳性模板的扩增结果；NTC，为其对应的阴性模板扩增结果。电泳结果中，在PTC和1×RNA条带均在341bp处有扩增产物的电泳条带，为阳性结果。
实施例2同时检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的实验
本发明针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)基因组筛选富含AT的序列并设计特异性引物并组成引物组，根据计算的引物Tm和目标序列Tm设置反应条件进行核酸扩增，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在目标序列，进而确定待测样品中是否存在鲤春病毒血症病毒和传染性造血器官坏死病病毒中的一种或多种。具体步骤如下：
(1)在鲤春病毒血症病毒基因组序列中兼具通用性和特异性的目标序列：使用2019年8月5号从NCBI的FTP上下载的有完整基因组序列的细菌、古菌和病毒的数据，共2896个全基因组序列。设定集合A，其包含所有鲤春病毒血症病毒基因组序列；设定集合B，其包所有含非鲤春病毒血症病毒基因组序列。使用Muscle进行多序列比对，保留同时满足以下两点条件的序列作为目标序列：1、集合A中所有序列的多序列比对结果中，每1kb范围内最多存在3个非连续错配的序列；2、与集合B中所有非目标序列存在4个以上连续错配。
(2)富含AT碱基的靶序列的筛选：从上述目标序列第一个碱基开始滑动宽度为1500bp的窗口，步长为50bp；每次滑动前计算一次序列AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为候选靶序列。以上过程采用perl脚本实现。
(3)特异性引物的设计：
根据PCR引物的特性及本发明的需求，设定引物的AT碱基含量为60％～75％、3’端稳定性ΔG<4、5’端稳定性ΔG<3及引物序列长度(20～36bp)等特性参数，同时设定单条引物不能产生发卡结构、自身不能发生相互作用等条件，以步骤(2)中的候选靶序列作为单条引物设计的候选序列，计算得出符合上述设定条件的单条引物。通过公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，并记录每条引物在目标序列上的位置、正负链信息(即来源于正链还是负链)以及引物的长度等信息。
根据单条引物的位置信息进行引物配对，保留同时满足引物对Tm差值<3℃以及引物对扩增区域在200～600bp两个条件的引物对作为候选引物对。系统输出满足条件的引物对，其中引物对的数量可预先设置，在本实施例中引物对的数量预先设置为100。以上高通量、自动化引物设计流程采用C、Perl脚本实现。
通过同样的方法设计出传染性造血器官坏死病病毒扩增引物对100个。使用公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算每条引物的Tm并计算该引物对平均Tm值作为反应退火温度；使用公式0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/扩增产物序列长度)计算每个引物对扩增区域的变性温度。
以不同病毒扩增序列长度至少相差50bp、反应变性温度最多相差2℃、反应退火温度最多相差2℃为条件筛选引物组合。系统输出满足条件的引物组合，数量可预先设置，在本实施例中引物组合的数量预先设置为10。随机选择一个引物组进行有效性验证。所述引物组合的序列为：
引物对A：
SVCV-F2：5’-TAATTTCAGACGACATTGAATATCTCA-3’(SEQ ID NO：5)
SVCV-R2：5’-AACAGAGTCAATTTGTGCAG-3’(SEQ ID NO：6)；
引物对B：
IHNV-F：5’-TCTGTCAATACGTTTGGACT-3’(SEQ ID NO：3)
IHNV-R：5’-ATGTTCTCACTTGTTAGAGTCTCTT-3’(SEQ ID NO：4)
所述引物对A的AT碱基含量分别为70％和60％，理论平均退火温度为62.77℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为358bp，AT百分含量为60％，理论变性温度为82.1℃。
所述引物对B的AT碱基含量分别为60％和64％，理论平均退火温度为63.5℃；所述引物对的理论扩增产物序列片段长度为271bp，AT的百分含量为56％，理论变性温度为82.64℃。
(4)核酸扩增反应及结果检测：
以质粒DNA标准品为模板的核酸扩增反应体系配置如下表3所示，以病毒RNA模板的核酸扩增反应体系配置如下表4所示。根据计算结果，用实时荧光定量PCR仪确定适用的变性温度、退火温度及溶解曲线；测试了以鲤春病毒血症病毒RNA模板下的检测灵敏度。86℃变性5秒，61℃退火5秒，72℃延伸20秒作为一个工作循环，推荐以上过程重复35次。
在使用普通梯度PCR仪反应完成后可通过以下方式判定扩增结果：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列。
表3.两种病毒质粒标准品扩增反应体系
Figure BDA0003049592380000131
Figure BDA0003049592380000141
表4.两种病毒核酸RNA扩增反应体系
体系 体积(μl) 终浓度
R300 MIX(TaKaRaTaq<sup>TM</sup>HS Perfect Mix) 12.5 /
AMV(10U/μL) 5U 0.5
SYBRGreenⅠ(25×) 1 1×
SVCV-F2/SVCV-R2(10μM) 1.25+1.25 0.5μM
IHNV-F/IHNV-R(10μM) 1.25+1.25 0.5μM
100％DMSO 0.5 2％
RNA模板 0/1 /
ddH2O Up to 25 /
图10/11/12分别展示了本发明针对鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia ofcarpvirus)的核酸扩增反应在适合温度下的实时荧光定量PCR的扩增曲线、溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳结果。扩增曲线中SVCV、IHNV单独核酸RNA及两者混合RNA均正常起峰，空白对照未起峰，结果符合预期。溶解曲线中SVCV、IHNV单独核酸RNA形成两个单独的峰形，两者混合RNA峰形较宽且覆盖两个单独核酸扩增产生的峰形，提示其中可能存在混合产物，结果符合预期。琼脂糖凝胶电泳结果中“M”指Marker DL2000，“阴”指阴性模板扩增结果，“IH”指IHNV病毒RNA模板扩增结果，“SV”指SVCV病毒RNA模板扩增结果，“IHSV”指两种病毒RNA混合模板扩增结果。图12中，IHNV病毒RNA模板在271bp出有一条单一的条带；SVCV病毒RNA模板在358bp处有一条单一条带；两者混合模板在各自预期片段大小处各有一条条带，且两条条带区分清晰。本实施例中设计的引物可以有效检测SVCV和IHNV单独或同时存在的样本，两组引物间不产生非特异性扩增或产生的非特异性扩增不足以影响检测结果。
实施例3传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)特异性序列的扩增用于IHNV的特异性检测
本发明针对传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)基因组筛选富含AT的序列并设计特异性引物，根据计算的引物Tm和目标序列Tm设置反应条件进行核酸扩增，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在目标序列，进而确定待测样品中是否存在传染性造血器官坏死病病毒。具体步骤如下：
(1)传染性造血器官坏死病病毒基因组序列中兼具通用性和特异性的目标序列：使用2019年8月5号从NCBI的FTP上下载的有完整基因组序列的细菌、古菌和病毒的数据，共2896个全基因组序列。设定集合A，其包含所有传染性造血器官坏死病病毒基因组序列；设定集合B，其包所有含非传染性造血器官坏死病病毒基因组序列。使用Muscle进行多序列比对，保留同时满足以下两点条件的序列作为目标序列：1、集合A中所有序列的多序列比对结果中，每1kb范围内最多存在3个非连续错配的序列；2、与集合B中所有非目标序列存在4个以上连续错配。
(2)富含AT碱基的靶序列的筛选：从上述目标序列第一个碱基开始滑动宽度为1500bp的窗口，步长为50bp；每次滑动前计算一次序列AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于55％的区域作为候选靶序列。以上过程采用perl脚本实现。
(3)特异性引物的设计：
根据PCR引物的特性及本发明的需求，设定引物的AT碱基含量为60％～75％、3’端稳定性ΔG<4、5’端稳定性ΔG<3及引物序列长度(20～36bp)等特性参数，同时设定单条引物不能产生发卡结构、自身不能发生相互作用等条件，以步骤(2)中的候选靶序列作为单条引物设计的候选序列，计算得出符合上述设定条件的单条引物。通过公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，并记录每条引物在目标序列上的位置、正负链信息(即来源于正链还是负链)以及引物的长度等信息。
根据单条引物的位置信息进行引物配对，保留同时满足引物对Tm差值<3℃以及引物对扩增区域在200～600bp两个条件的引物对作为候选引物对。系统输出满足条件的引物对，其中引物对的数量可预先设置，在本实施例中引物对的数量预先设置为10。以上高通量、自动化引物设计流程采用C、Perl脚本实现。
程序运行后在AT富集区设计出PCR反应引物对10个，随机选择一个引物组进行有效性验证。所述引物对的序列为：
IHNV-F：5’-TCTGTCAATACGTTTGGACT-3’(SEQ ID NO：3)
IHNV-R：5’-ATGTTCTCACTTGTTAGAGTCTCTT-3’(SEQ ID NO：4)
所述引物的AT碱基含量分别为60％和64％，所述引物对的理论扩增产物序列的AT百分含量为56％。
(4)PCR反应变性温度和退火温度的计算：
使用公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算可知，引物IHNV-F的Tm＝62.18℃，IHNV-R的Tm＝64.816℃，该引物对平均Tm值为63.5℃；使用公式0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/扩增产物序列长度)计算扩增区域变性温度为82.64℃。
(5)核酸扩增反应及结果检测：
以质粒DNA标准品为模板的核酸扩增反应体系配置如下表5所示，以传染性造血器官坏死病病毒RNA模板的核酸扩增反应体系配置如下表6所示。根据计算结果，用实时荧光定量PCR仪确定适用的变性温度、退火温度及溶解曲线；测试了以传染性造血器官坏死病病毒RNA模板下的检测灵敏度。优选86℃变性5秒，61℃退火5秒，72℃延伸20秒作为一个工作循环，推荐以上过程重复35次。
在使用普通梯度PCR仪反应完成后可通过以下方式判定扩增结果：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断扩增结果是否为阳性，即待测样品中是否存在目标序列。
表5.传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)DNA质粒扩增反应体系
Figure BDA0003049592380000161
Figure BDA0003049592380000171
表6.传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)核酸RNA扩增反应体系
体系 体积(μl) 终浓度
R300 MIX(TaKaRa Taq<sup>TM</sup>HS Perfect Mix) 12.5 /
AMV(10U/μL) 5U 0.5
SYBR GreenⅠ(25×) 1 1×
IHNV-F/IHNV-R(10μM) 1.25+1.25 0.5μM
100％DMSO 0.5 2％
RNA模板 0/1 /
ddH2O Upto25 /
图13/14/15分别展示了本发明针对传染性造血器官坏死病病毒的核酸扩增反应在适合温度下的实时荧光定量PCR的扩增曲线、溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳结果，其中“PTC”指该变性温度下阳性质粒模板的扩增结果，“NTC”为其对应的阴性模板扩增结果，“IHNV”指该变性温度下病毒核酸模板的扩增结果，“M”指Marker DL2000。图13阳性模板及阴性模板扩增情况符合预期。图14熔解曲线为单一峰，无非特异反应。图15扩增产物电泳鉴定结果，PTC及IHNV模板扩增产物电泳后在271bp处有一条单一的条带，结果为阳性；NTC扩增产物电泳后无条带，结果为阴性。
图16/17/18分别分别展示了本发明针对传染性造血器官坏死病病毒引物在86℃的变性温度时，退火温度分别从57到61℃的扩增曲线总图、熔解曲线总图和电泳胶图。图16中57℃～61℃指该退火温度下阳性模板的扩增结果；图17为熔解曲线峰图。两者结合分析发现57℃退火温度下针对空白模板发生非特异性扩增，其它条件下扩增结果符合预期。图18为阳性模板扩增电泳鉴定结果，若扩增产物电泳后在271bp处有一条单一的条带，则为阳性；若扩增产物电泳后无条带，则为阴性；电泳结果显示引物在57℃～61℃退火温度下针对阳性模板均能产生符合预期的特异性条带，在58℃～61℃退火温度下针对空白模板均不能产生扩增产物，但是在57℃退火温度下针对空白模板产生较多的引物二聚体等非特异性扩增产物条带，该结果与定量PCR结果相符。综合以上实验结果及理论计算数值，选定61℃作为引物退火温度。
本发明还提供了一种同时检测多种病毒的检测系统，其特征在于，所述系统采用如上所述的方法，所述系统包括：
筛选模块，起其用于筛选单一病毒基因组序列中兼具通用性和特异性的目标序列；
识别模块，其用于从上述目标序列中识别富含AT碱基的靶序列；
设计模块，其用于针对所述靶序列设计核酸扩增引物；
计算模块，其用于基于GC的百分含量、引物序列长度、引物对的理论扩增产物序列长度计算反应变性温度及退火温度；
组成模块，其用于根据序列扩增长度、反应变性温度及退火温度筛选合适的单一病毒引物引物对并组成检测多种病毒的引物组；
扩增模块，其用于设置核酸扩增反应条件，在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
参考文献
周慧琦.(2014).基因组GC含量与碱基、密码子和氨基酸使用偏好的关系.(mastermaster),电子科技大学,(67)
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海生物信息技术研究中心
<120> 一种同时检测多种病毒的方法、检测多种病毒的系统及其应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggattagact tgattgacac 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctttccctt tatatacaccatt 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tctgtcaata cgtttggact 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgttctcac ttgttagagt ctctt 25
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taatttcaga cgacattgaa tatctca 27
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacagagtca atttgtgcag 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aagggggttc caggcatta 19

Claims (15)

1.一种同时检测多种病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)筛选单一病毒基因组序列中兼具通用性和特异性的目标序列；
(2)从上述目标序列中识别富含AT碱基的靶序列；
(3)针对所述靶序列设计核酸扩增引物；
(4)基于GC的百分含量、引物序列长度、引物对的理论扩增产物序列长度计算反应变性温度及退火温度；
(5)根据序列扩增长度、反应变性温度及退火温度筛选合适的单一病毒引物引物对并组成检测多种病毒的引物组；
(6)设置核酸扩增反应条件，在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，通过多序列比对获得目标序列，当序列数目大于200，或序列长度大于1500，或序列间相似度预估大于80％时，优选Muscle；若序列不符合以上情况，则选择MAFFT，序列彼此长度相似时使用globalpair参数，序列间异质性很强时选择genafpair参数；特别地，对于序列数目小于100且序列长度小于1000，而准确度要求很高的特殊场景，则优选T-coffee进行多序列比对。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将所有目标病毒基因组设定成集合A，将所有非目标病毒基因组设定成集合B；所述目标序列通用性指在集合A中所有序列的多序列比对结果中，该序列每1kb范围内最多存在3个非连续错配；所述目标序列特异性指该序列与集合B中所有非目标序列存在4个以上连续错配。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，对所述目标序列，从特征序列中识别AT-Rich区域作为候选靶序列：从特征序列第一个碱基开始，以20～200bp为步长滑动1500bp长度的窗口，计算每个窗口中的碱基组成，保留AT含量大于55％的序列作为候选靶序列。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述引物的设计方法包括：(3.1)针对一条候选靶序列进行单条引物设计，得到候选引物；(3.2)对所述候选引物进行理化性质判定，筛选符合要求的单条引物；(3.3)将所述步骤(3.2)筛选得到的单条引物组合成引物对；(3.4)输出符合条件的引物对，得到所述特异性引物对。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3.1)中，所述候选引物需满足以下条件：a)引物序列长度在20bp～36bp之间；b)AT碱基含量在60％～80％；c)连续GC数≤5；同时记录所述候选引物匹配到所述目标序列上的位置信息、正负链信息；和/或，步骤(3.2)中，对满足上述(3.1)条件的所述单条引物进行理化性质判定，包含3’端稳定性、5’端稳定性和/或二级结构稳定性。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3.3)中，对上述步骤(3.2)筛选得到的单条引物，根据所述单条引物匹配到所述目标序列上的位置信息、正负链信息，将所述单条引物组合成引物对；所述引物对的理论扩增产物序列的长度应在200bp～600bp之间；根据公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值；以引物对Tm差值≤3℃，以及引物之间不能发生相互作用为条件，对引物对进行筛选，得到候选引物对；其中，GC的百分含量是指引物中的碱基G和C的个数占引物总碱基个数的百分比；引物序列长度是指引物的碱基个数。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述反应变性温度的计算公式为0.357×(GC的百分含量)×100+70.582-(990/引物对的理论扩增产物序列长度)，记为Tma；其中，GC的百分含量是指引物对的理论扩增产物序列中的碱基G和C的个数占引物对的理论扩增产物序列总碱基个数的百分比；和/或，根据公式0.466×(GC的百分含量)×100+66.04-(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值，对所述Tm值取平均值即为所述反应退火温度，记为Tmb；其中，GC的百分含量是指引物中的碱基G和C的个数占引物总碱基个数的百分比。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，不同病毒扩增序列长度至少相差50bp，反应变性温度最多相差2℃，反应退火温度最多相差2℃。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述核酸扩增反应条件包括：在所述变性温度下反应5秒，在所述退火温度下反应5秒，在延伸温度下反应20秒，以上过程重复30-40次；其中所述变性温度根据需要可在Tma±5℃之间调整；所述退火温度根据需要可在Tmb±3℃之间调整；所述延伸温度为72℃。
11.如权利要求1～10之任一项所述的方法获得的引物对。
12.如权利要求11所述的引物对，其特征在于，所述引物对A为：
SVCV-F1：5’-GGATTAGACTTGATTGACAC-3’(SEQ ID NO：1)
SVCV-R1：5’-TCTTTCCCTTTATATACACCATT-3’(SEQ ID NO：2)；
引物对B：
IHNV-F：5’-TCTGTCAATACGTTTGGACT-3’(SEQ ID NO：3)；
IHNV-R：5’-ATGTTCTCACTTGTTAGAGTCTCTT-3’(SEQ ID NO：4)；
引物对C：
SVCV-F2：5’-TAATTTCAGACGACATTGAATATCTCA-3’(SEQ ID NO：5)；
SVCV-R2：5’-AACAGAGTCAATTTGTGCAG-3’(SEQ ID NO：6)。
13.一种诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包括如权利要求11或12所述的引物对。
14.如权利要求1～10之任一项所述的方法在用于富含AT区的目标核酸序列进行核酸扩增中的应用、如权利要求1～10之任一项所述的方法或如权利要求11或12所述的引物对鲤春病毒血症病毒及传染性造血器官坏死病毒相关基因或区域的扩增和/或检测中的应用、如权利要求1～10之任一项所述的方法或如权利要求11或12所述的引物对在制备扩增和/或检测鲤春病毒血症病毒及传染性造血器官坏死病毒相关基因或区域的产品中的应用。
15.一种同时检测多种病毒的检测系统，其特征在于，所述系统采用如权利要求1～9之任一项所述的方法，所述系统包括：
筛选模块，起其用于筛选单一病毒基因组序列中兼具通用性和特异性的目标序列；识别模块，其用于从上述目标序列中识别富含AT碱基的靶序列；
设计模块，其用于针对所述靶序列设计核酸扩增引物；
计算模块，其用于基于GC的百分含量、引物序列长度、引物对的理论扩增产物序列长度计算反应变性温度及退火温度；
组成模块，其用于根据序列扩增长度、反应变性温度及退火温度筛选合适的单一病毒引物引物对并组成检测多种病毒的引物组；
扩增模块，其用于设置核酸扩增反应条件，在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。
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