CN117355614A - 用于检测单碱基突变的引物组和方法 - Google Patents
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Abstract
用于检测单碱基突变的引物组和方法。所述引物组包含以下引物：‑识别引物，所述识别引物从5’端到3’端由以下组成：(a)与所述待检测核酸序列中的一段连续核苷酸互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸的5’端起始于所述预期突变位点下游的第一个核苷酸，和(b)与所述待检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的未突变核苷酸或所预期的突变核苷酸互补的核苷酸，‑扩增引物，所述扩增引物能够扩增使用所述识别引物扩增所述待检测核酸序列得到的扩增产物，其中所述识别引物比扩增引物少1至19个核苷酸。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月20日提交的申请号为202110425621.4的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引入并入本文。
本申请涉及生物检测领域，特别地，涉及用于检测单碱基突变的引物组和方法。
核酸的单碱基突变检测非常重要，其不仅可以评估核酸质量，更重要的是，其可用于单核苷酸分型检测。当前，非常多的疾病与单碱基突变密切相关。若能有效识别和检测出这些突变基因，则可实现疾病的提前预警，便于早期治疗。这些基因的准确识别依赖于单碱基突变检测技术。现有的单碱基突变检测方法包括测序法，微阵列法，质谱法，溶解曲线，Taqman法等。测序法是单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分析的金标准，能用于检测已知的SNP，也能用于发现未知的SNP，但是在测序法中，每个样品的每个位点均需要经聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增，跑胶和切胶纯化，再测序，所涉及的步骤多且分散，成本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大量样品和多位点的检测。微阵列法的通量高，适用于全基因组SNP扫描，但是其准确度偏低，需要使用第二种方法进行验证。质谱法快捷、所需样品量极少，但是质谱法前处理工艺复杂，适用于已经优化的特定SNP检测，不适用于未做过的新SNP检测。溶解曲线法的通量高且简便，但可供进行溶解曲线法的仪器少，且对专业技术要求高，需要专业人员操作。
由于以上方法需要多步反应，时间成本高，对技术要求高，因此，一步快速 检测法倍受青睐。Taqman法是一步反应法，其主要依赖特异性酶的选择性和高成本的荧光分子修饰来进行单碱基突变检测。另外，现有的Taqman法主要是依靠在引物序列设计中人为引入错配碱基和酶改进技术来提高方法的选择性；但是，不当错配碱基的引入可能得到不正确的结果，因此需要进行多次实验以验证，而且酶的改进复杂度高且价格贵。
因此，开发可以实现简单快速且低成本的一步法检测的新技术或设计是一个具备市场竞争价值的新方向。
发明内容
本申请提供了一种用于核酸的单碱基突变检测的新方法，该方法利用长度不同的两个PCR引物(短链引物和长链引物)，它们二者与待检测的目标序列有不同的结合力，短链引物能够先与匹配的目标核酸序列识别杂交，能够实现不平衡PCR。
本专利方法的原理的示例性示意图请见图1。具体地，当短链引物的3’末端的核苷酸与目标核酸序列的单碱基突变位点不能正确配对时，短链引物与目标核酸序列的结合力大大减弱而难于杂交，导致无扩增产物；而当短链引物的3’末端的核苷酸与目标核酸序列的单碱基突变位点正确配对时，在合适的退火温度下可以扩增得到扩增产物，长链引物与短链引物扩增出的产物有强的杂交力，在此条件下可正常结合并复制短链引物的扩增产物，通过多个PCR循环放大后，由长链引物和短链引物产生的正确的特异性扩增产物被指数倍的扩增。PCR扩增产物进行凝胶电泳后，可以明显发现目标序列存在碱基突变时，凝胶电泳没有条带，而不存在碱基突变时，凝胶电泳有明显条带，由此可实现核酸的单碱基突变检测。若采用定量PCR或DNA芯片技术，则可实现单碱基突变的定性和定量检测。本申请方法相比现有方法操作简便、成本低、不需要苛刻的反应条件。
在第一方面，本申请提供了用于检测目标核酸序列中的单碱基突变的方法。所述“检测目标核酸序列中的单碱基突变”包括检测核酸序列的预期单碱基突变位点上是否存在突变和检测(即鉴定)核酸序列的预期单碱基突变位点上的核苷酸。
因此，本申请提供了一种用于检测核酸序列的预期单碱基突变位点上是否存 在突变的方法，所述方法包括：
提供包含待检测的核酸序列的样品；
使用引物组通过聚合酶链反应扩增样品中的待检测核酸序列，所述引物组包含以下引物：
识别引物，所述识别引物从5’端到3’端包含：(a)与所述待检测核酸序列中的一段连续核苷酸互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸的5’端起始于所述预期突变位点下游的第一个核苷酸，和(b)与所述待检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的未突变核苷酸互补的核苷酸，
扩增引物，所述扩增引物能够扩增使用所述识别引物扩增所述待检测核酸序列得到的扩增产物，
其中所述识别引物比扩增引物少1至19个核苷酸；以及
检测反应产物中是否存在特异性扩增产物，特异性扩增产物的存在指示所述待检测核酸序列的预期突变位点上不存在单碱基突变。
本申请还提供了一种用于检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的核苷酸的方法，所述方法包括：
提供包含待检测的核酸序列的样品；
使用引物组通过聚合酶链反应扩增样品中的核酸序列，所述引物组包含以下引物：
识别引物，所述识别引物从5’端到3’端由以下组成：(a)与所述待检测核酸序列中的一段连续核苷酸互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸的5’端起始于所述预期突变位点下游的第一个核苷酸，和(b)与所述待检测核酸序列的预期单碱基突变位点上所预期存在的核苷酸互补的核苷酸，和
扩增引物，所述扩增引物能够扩增使用所述识别引物扩增所述待检测核酸序列得到的扩增产物，
其中所述识别引物比扩增引物少1至19个核苷酸；以及
检测反应产物中是否存在特异性扩增产物，特异性扩增产物的存在指示所述待检测核酸序列的预期突变位点上存在所预期存在的核苷酸。
在本申请的上下文中，所述“核酸序列”可以是双链或单链核酸，例如双链DNA、单链DNA或RNA。
在本申请的上下文中，所述“单碱基突变”是指因核酸序列上的单个碱基的替换而产生的突变。
在本申请的上下文中，术语“识别引物”可以与“短链引物”、“引物1”、“短链引物1”互换使用。所述“识别引物”为短链引物(与常规PCR引物长度对比)，能够仅靠3’末端的碱基来实现SNP识别，避免了引入第二个人为错配碱基，确保方法的特异性。在所述用于检测核酸序列的预期单碱基突变位点上是否存在突变的方法中，所述“识别引物”是与未突变的核酸序列的一段连续核苷酸互补的核苷酸序列，其中该引物的3’端核苷酸与所述待检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的未突变的核苷酸对应互补。而在所述用于检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的核苷酸的方法中，所述“识别引物”是与预期突变成的核酸序列的一段连续核苷酸互补的核苷酸序列，其中该引物的3’端核苷酸与所述待检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的预期突变成的核苷酸对应互补。例如，若未突变的核酸序列的预期单碱基突变位点上的核苷酸为A，则在所述用于检测核酸序列的预期单碱基突变位点上是否存在突变的方法中，所述识别引物的3’端核苷酸为互补的T；而在所述用于检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的核苷酸的方法中，所述识别引物的3’端核苷酸为预期突变成的核苷酸的互补核苷酸(例如预期突变成G，则识别引物的3’端核苷酸为C)。
在本申请的上下文中，术语“扩增引物”可以与“长链引物”、“引物2”、“长链引物2”互换使用。所述扩增引物即为在常规的普通PCR中使用的引物。普通PCR引物长度一般在15至30个核苷酸之间，常用的引物长度为18至27个核苷酸。在本申请的用于检测目标核酸序列中的单碱基突变的方法中，所述“扩增引物”能够与使用所述识别引物扩增所述待检测核酸序列得到的扩增产物中的一段连续核苷酸互补。从序列上看，所述“扩增引物”可以由与所述待检测的核酸序列中的一段连续核苷酸相同的连续核苷酸组成。
在本申请的上下文中，所述“预期单碱基突变位点”是指待检测核酸序列上是否存在突变的位点，其既可以是通过现有技术已知的容易出现单碱基突变的位点，也可以是要判断是否存在单碱基突变的任意核苷酸位点。
在所述用于检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的核苷酸的方法中，所述预期单碱基突变位点上的“所预期存在的核苷酸”是指待检测的位点上可能存在的核苷酸，其既可以是通过现有技术已知的在该位点上容易出现的核苷酸，也可以是任意可能存在的核苷酸。例如，在一些实施方式中，可以将识别引物的(b)中的核苷酸选择为A、C、T、G中的1、2、3或4种，使用这些引物相应地同时或顺次进行1、2、3或4种PCR反应来判断待检测位点上的核苷酸。
在用于检测目标核酸序列中的单碱基突变的方法的一些实施方式中，所述识别引物比扩增引物少1至19个核苷酸。在一些优选实施方式中，所述识别引物比扩增引物少2至16个核苷酸，例如少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸。在另一些优选实施方式中，所述识别引物比扩增引物少3至15个核苷酸，例如少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在一个最优的实施方案中，所述识别引物比扩增引物少2至8个核苷酸，例如少2、3、4、5、6、7或8个核苷酸。
在用于检测目标核酸序列中的单碱基突变的方法的一些实施方式中，所述识别引物的长度为11至16个核苷酸，例如11、12、13、14、15或16个核苷酸。在一些优选实施方式中，所述识别引物的长度为12至15个核苷酸。在一个具体实施方式中，所述识别引物长度为12个核苷酸。
在用于检测目标核酸序列中的单碱基突变的方法的一些实施方式中，所述扩增引物的长度为15至30个核苷酸，例如15至27个核苷酸，例如15至25个核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一个优选实施方式中，所述扩增引物的长度为16至20个核苷酸。在一个具体实施方案中，所述扩增引物长度为20个核苷酸。
在用于检测目标核酸序列中的单碱基突变的方法的一些优选的实施方式中，所述识别引物的长度为12个核苷酸且所述扩增引物的长度为20个核苷酸，或者，所述识别引物的长度为15个核苷酸且所述扩增引物的长度为20个核苷酸，或者，所述识别引物的长度为13个核苷酸且所述扩增引物的长度为20个核苷酸，或者，所述识别引物的长度为14个核苷酸且所述扩增引物的长度为20个核苷酸。
本申请方法的扩增反应(即所述聚合酶链反应)在扩增反应混合物中进行。所述混合物包含完成引物延伸反应或核酸扩增所需的试剂，此类试剂的非限制性 实例包括引物、聚合酶、缓冲液、辅因子(例如二价或单价阳离子)、核苷酸(例如dNTP)。
在本申请的方法中，所述聚合酶链反应使用DNA聚合酶进行。所述DNA聚合酶可以是本领域已知的常用DNA聚合酶。在一些实施方式中，所述DNA聚合酶为高保真聚合酶。在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自：热启动Taq聚合酶、TaqNova Stoffel DNA聚合酶、HiFi-KAPA聚合酶和Hemo KlenTaq聚合酶，例如，DNA聚合酶(热启动Taq聚合酶(E00049，金斯瑞生物科技有限公司)，TaqNova Stoffel DNA聚合酶((RP810，BLIRT)，HiFi-KAPA聚合酶2X(KK2601，Roche)，Hemo KlenTaq聚合酶(M0332S，NEB)等。在一个优选的实施方式中，所述DNA聚合酶为HiFi-KAPA聚合酶；
在本申请方法的一些实施方式中，所述聚合酶链反应可以包括预变性步骤、循环扩增步骤和终延伸步骤，所述循环扩增步骤中的各循环可以包括变性、退火和延伸步骤。在一些实施方式中，所述循环扩增步骤进行18-30个循环，例如20个循环。在一些实施方式中，所述循环扩增步骤中每个循环的条件为98℃，10s；45～52℃，15～30s；72℃，15s。在一些实施方式中，所述退火的温度为44至52℃，例如44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃或52℃，优选45至50℃。在一个具体实施方案中，所述退火温度为45℃。在另一个具体实施方案中，所述退火温度为50℃。
在本申请的方法中，所述扩增步骤之后和检测步骤之前可以不包括或包括纯化扩增产物的步骤。所述纯化可以使用本领域公知的核酸纯化方法进行，如凝胶电泳法。
本申请的上下文中，所述“特异性扩增产物”是指由本申请的引物组(即识别引物和扩增引物)扩增的具有特定长度的产物。在一些实施方式中，所述特异性扩增产物的长度为至少40个核苷酸，可以为50个以上核苷酸，例如70至700个核苷酸，例如70至120个核苷酸。
所述特异性扩增产物的检测可以通过选自以下的检测方法来进行：凝胶电泳、质谱、SYBR I荧光法、SYBR II荧光法、SYBR金、Pico绿、T0T0-3、嵌入染料检测、荧光共振能量转移(FRET)、分子信标检测等。
本申请方法的一些实施方式中，所述聚合酶链反应为普通PCR，且所述反应产物的检测采用凝胶电泳进行。
本申请方法的一些实施方式中，所述聚合酶链反应为荧光定量PCR反应。例如，所述聚合酶链反应使用用于荧光定量PCR的荧光染料进行，例如使用SYBR I、SYBR II或SYBR金等。
在第二方面，本申请提供了一种用于检测核酸序列中的单碱基突变的引物组，所述引物组包含以下引物：
识别引物，所述识别引物从5’端到3’端由以下组成：(a)与所述待检测核酸序列中的一段连续核苷酸互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸的5’端起始于所述预期突变位点下游的第一个核苷酸，和(b)与所述待检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的未突变核苷酸或所预期的突变核苷酸互补的核苷酸，
扩增引物，所述扩增引物能够扩增使用所述识别引物扩增所述待检测核酸序列得到的扩增产物，
其中所述识别引物比扩增引物少1至19个核苷酸。
对于所述引物组的一些实施方式中，所述识别引物比扩增引物少2至16个核苷酸，优选地，所述识别引物比扩增引物少3至15个核苷酸。在另一些优选实施方案中，所述识别引物比扩增引物少2至8个核苷酸，例如少2、3、4、5、6、7或8个核苷酸。
在第三方面，本申请提供了本申请的引物组在制备用于检测核酸序列中的单碱基突变的混合物、试剂盒或生物检测装置中的用途。
在第四方面，本申请提供了一种混合物，其包含本申请的引物组，DNA聚合酶，和待检测的核酸序列。在一些实施方式中，所述混合物还包含用于检测扩增产物的试剂，例如SYBR I、SYBR II或SYBR金等。在一些实施方式中，所述混合物还包含完成引物延伸反应或核酸扩增所需的其他试剂，例如缓冲液、辅因子(例如二价或单价阳离子)、核苷酸(例如dNTP)等。
在第五方面，本申请提供了一种用于检测核酸序列中的单碱基突变的试剂盒，其包含本申请的引物组。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含DNA聚合酶。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含用于检测扩增产物的试剂，例如SYBR I、 SYBR II或SYBR金等。在一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于核酸固定、杂交和/或检测所需的试剂和/或材料，例如固体支持物(例如多孔板)、缓冲液、核酸标准品等。在一些实施方式中，所述试剂盒包含核酸芯片。在一些实施方式中，所述试剂盒还包括说明本申请方法的使用说明书。
在第六方面，本申请提供了一种用于检测核酸序列中的单碱基突变的生物检测装置，其包含本申请的引物组。所述检测装置的非限制示例包括，微流控装置。
在第一方面中描述的特征、定义和优选项同样适用于第二方面至第六方面。
参考以下附图更详细地描述本发明：
图1示例性显示了本申请的不平衡PCR方法的原理，其中①表示待检测的核酸序列，②表示识别引物，③表示扩增引物。
图2显示了使用不同长度的短链引物和长链引物的组合对目标序列进行PCR所得产物的凝胶电泳图，其中a泳道示出的是11nt+20nt引物的PCR产物，b泳道示出的是12nt+20nt引物的PCR产物，c泳道示出的是11nt+12nt引物的PCR产物，d泳道示出的是12nt+12nt引物的PCR产物，最右侧为分子量标记(从上到下的分子量依次是：3000、2000、1500、1000、700、500、250、100bp)。
图3显示了使用短链引物(15nt)和长链引物(20nt)的组合对目标序列进行PCR所得产物的凝胶电泳图，泳道1是目标序列，泳道2是单碱基突变的目标序列，最左侧为分子量标记(从上到下条带分子量依次是：1031、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp)。
图4显示了不同退火温度下进行PCR所得产物的凝胶电泳图，泳道1是目标序列，泳道2是单碱基突变的目标序列，泳道3为分子量标记(从上到下的分子量依次是：45℃图为1031、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp；50、51和52℃图为3000、2000、1500、1000、700、500、250、100bp)。
图5显示了不平衡PCR和常规PCR检测单碱基突变的对比实验，其中泳道1 是常规PCR方法检测目标序列得到的产物，泳道2是常规PCR方法检测单碱基突变序列得到的产物，泳道3是不平衡PCR检测目标序列得到的产物，泳道4是不平衡PCR检测单碱基突变序列得到的产物。最后一个泳道为分子量标记(从上到下的分子量依次是：3000、2000、1500、1000、700、500、250、100bp)。
图6显示了本发明方法的重复性实验。泳道1是显示的是模板为目标序列的PCR结果，泳道2是单碱基突变序列作为模板的PCR结果，泳道3是分子量标记(从上到下的分子量依次是：3000、2000、1500、1000、700、500、250、100bp)。
图7显示了经纯化的PCR产物的凝胶电泳图及其浓度，泳道1和3是目标序列作为模板的经纯化的PCR产物，泳道2和4是单碱基突变的序列作为模板的经纯化的PCR产物，最后一个泳道为分子量标记(从上到下的分子量依次是：3000、2000、1500、1000、700、500、250、100bp)。
图8显示了利用不平衡PCR检测单碱基突变的未知突变型，其中泳道1是SEQ ID NO:3作为引物1，泳道2是SEQ ID NO:4作为引物1，泳道3是SEQ ID NO:5作为引物1，泳道4是SEQ ID NO:6作为引物1，泳道5是以水替代目标序列的空白对照，最左侧泳道为分子量标记(从上到下的分子量依次是：3000、2000、1500、1000、700、500、250、100bp)。
图9显示了实时荧光定量PCR检测单碱基突变，其中a图显示扩增曲线图，b图显示熔解曲线图。
除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：利用不平衡PCR检测单碱基突变
1.1引物设计
以下序列和引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
待检测的目标序列为5’-CTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA
AGAAATCTCGATGGAGTGGG(SEQ ID NO:1)。相对于所述目标序列存在单碱基突变的序列为5’-CTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA
TGAAATCTCGATGGAGTGGG(SEQ ID NO:2)。
其中短链引物1为检测是否存在单碱基突变的特异性引物，且序列3’端的最后一个碱基杂交于目标序列中的突变位点。共设计了碱基个数分别为11nt、12nt、13nt、14nt和15nt的5组短链引物1，序列见下表1。
表1：碱基个数分别为11nt、12nt、13nt、14nt和15nt的5组短链引物1
| 引物名称 | 序列 |
| 1-11nt-1 | 5’-TCGAGATTTC T(SEQ ID NO:23) |
| 1-11nt-2 | 5’-TCGAGATTTC A(SEQ ID NO:24) |
| 1-11nt-3 | 5’-TCGAGATTTC G(SEQ ID NO:25) |
| 1-11nt-4 | 5’-TCGAGATTTC C(SEQ ID NO:26) |
| 1-12nt-1 | 5’-ATCGAGATTTC T(SEQ ID NO:3) |
| 1-12nt-2 | 5’-ATCGAGATTTC A(SEQ ID NO:4) |
| 1-12nt-3 | 5’-ATCGAGATTTC G(SEQ ID NO:5) |
| 1-12nt-4 | 5’-ATCGAGATTTC C(SEQ ID NO:6) |
| 1-13nt-1 | 5’-CATCGAGATTTC T(SEQ ID NO:7) |
| 1-13nt-2 | 5’-CATCGAGATTTC A(SEQ ID NO:8) |
| 1-13nt-3 | 5’-CATCGAGATTTC G(SEQ ID NO:9) |
| 1-13nt-4 | 5’-CATCGAGATTTC C(SEQ ID NO:10) |
| 1-14nt-1 | 5’-CCATCGAGATTTC T(SEQ ID NO:11) |
| 1-14nt-2 | 5’-CCATCGAGATTTC A(SEQ ID NO:12) |
| 1-14nt-3 | 5’-CCATCGAGATTTC G(SEQ ID NO:13) |
| 1-14nt-4 | 5’-CCATCGAGATTTC C(SEQ ID NO:14) |
| 1-15nt-1 | 5’-TCCATCGAGATTTC T(SEQ ID NO:15) |
| 1-15nt-2 | 5’-TCCATCGAGATTTC A(SEQ ID NO:16) |
| 1-15nt-3 | 5’-TCCATCGAGATTTC G(SEQ ID NO:17) |
| 1-15nt-4 | 5’-TCCATCGAGATTTC C(SEQ ID NO:18) |
长链引物2为通用引物，其杂交短链引物1的扩增产物。共设计了碱基个数分别为12nt和20nt的两种长链引物2，序列见下表2：
表2：碱基个数分别为12nt和20nt的2条长链引物2
| 引物名称 | 序列 |
| 2-12nt | 5’-CTTTACTTACTA(SEQ ID NO:22) |
| 2-20nt | 5’-CTTTACTTACTACACCTCAG(SEQ ID NO:19) |
1.2不平衡PCR扩增：
PCR反应体系为20μL，包括ddH2O 7μL，实施例1.1设计的短链引物1(10μmol·L
-1)1μL，实施例1.1设计的长链引物2(10μmol·L
-1)1μL，模板DNA(目标序列或单碱基突变的序列)(1nmol·L
-1)1μL，HiFi-KAPA聚合酶2X(KK2601，Roche)10μL。
PCR反应在Biometra T1 thermolcycler热循环仪(C1000 Touch，Bio-Rad)上进行。反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，退火温度下(45℃、50℃、51℃或52℃)30s，72℃延伸15s，20个循环；72℃延伸5min。
1.3凝胶电泳测试：
取实施例1.2中2μL PCR产物与0.5μL质粒大抽染料(Goldview，北京赛百盛)混匀，将混合液加入2.5％的琼脂糖凝胶(Invitrogen)孔内，进行凝胶电泳，并收集胶图(DYY-8C型，北京六一生物；120V，20min)。
1.4结果
在选定PCR退火温度为50℃时，测试了采用不同长度的引物1(11nt和12nt)和不同长度的引物2(12nt和20nt)的组合进行PCR反应扩增目标序列的结果，具体反应引物和结果见下表3，对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳的电泳图见图2。可见，12nt的短链引物1和20nt的长链引物2可以很好的扩增出目标序列条带。
表3：
| 短链引物1 | 长链引物2 | 是否出现目标序列条带 | |
| a | 11nt(SEQ ID NO:23) | 20nt(SEQ ID NO:19) | 是(弱但可辨识) |
| b | 12nt(SEQ ID NO:3) | 20nt(SEQ ID NO:19) | 是 |
| c | 11nt(SEQ ID NO:23) | 12nt(SEQ ID NO:22) | 否 |
| d | 12nt(SEQ ID NO:3) | 12nt(SEQ ID NO:22) | 否 |
在选定PCR退火温度为50℃时，测试了长度为15nt的短链引物1(SEQ ID NO:15)和长度为20nt的长链引物2(SEQ ID NO:19)进行PCR反应扩增目标序列(SEQ ID NO:1)和相对于目标序列存在单碱基突变的序列(SEQ ID NO:2)的结果。对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳的电泳图见图3，其中泳道1为目标序列为模板，泳道2为相对于目标序列存在单碱基突变的序列为模板。可见，短链引物1(15nt)和长链引物2(20nt)的组合也可以扩增出目标序列条带。其并不扩增相对于目标序列存在单碱基突变的序列。
选定引物1长度为12nt(SEQ ID NO:3)，引物2长度为20nt(SEQ ID NO:19)，采用不同退火温度(45℃、50℃、51℃、52℃)进行PCR。琼脂糖凝胶电泳的电泳图见图4，其中泳道1为目标序列为模板，泳道2为相对于目标序列存在单碱基突变的序列为模板。可见，45℃和50℃作为退火温度效果更好，51℃和52℃作为退火温度也有效果。
实施例2：不平衡PCR和常规PCR检测单碱基突变的对比实验
1.1不平衡PCR
待检测的目标序列为实施例1中的SEQ ID NO:1，相对于所述目标序列存在单碱基突变的序列为实施例1中的SEQ ID NO:2，所用短链引物1为5’-ATCGAGATTTCT(SEQ ID NO:3)，所用长链引物2为5’-CTTTACTTACTACACCTCAG(SEQ ID NO:19)。
PCR扩增条件如下：反应体系为20μL，包括ddH
2O 7μL，引物1(10μmol·L
-1)1μL，引物2(10μmol·L
-1)1μL，模板DNA(目标序列或相对于所述目标序列存在单碱基突变的序列)(1nmol·L
-1)1μL，HiFi-KAPA聚合酶2X 10μL。
PCR反应在Biometra T1 thermolcycler热循环仪上进行。反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，退火温度(45℃或50℃)下30s，72℃延伸15s，20个循环；72℃延伸5min。
1.2常规PCR
待检测的目标序列为实施例1中的SEQ ID NO:1，相对于所述目标序列存在单碱基突变的序列为实施例1中的SEQ ID NO:2，所用引物序列为常规PCR引物1(CCCACTCCATCGAGATTTCT，SEQ ID NO:20)，常规PCR引物2(CTTTACTTACTACACCTCAG，SEQ ID NO:21)。
PCR扩增条件如下：反应体系为20μL，包括ddH
2O 7μL，常规PCR引物1(10μmol·L
-1)1μL，常规PCR引物2(10μmol·L
-1)1μL，模板DNA(目标序列或相对于所述目标序列存在单碱基突变的序列)(1nmol·L
-1)1μL,HiFi-KAPA聚合酶2X 10μL。
PCR反应在Biometra T1thermolcycler热循环仪(C1000Touch，Bio-Rad)上进行。反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸15s，20个循环；72℃延伸5min。
3.凝胶电泳测试：取实施例2.1和2.2中2μL PCR产物样品分别与0.5μL质粒大抽染料(Goldview，北京赛百盛)混匀，将混合液加入2.5％的琼脂糖凝胶(Invitrogen)孔内，进行凝胶电泳，并收集胶图(DYY-8C型，北京六一生物；120V，20min)。
结果如图5所示，其中泳道1是常规PCR方法检测目标序列得到的产物，泳道2是常规PCR方法检测单碱基突变序列得到的产物，泳道3是不平衡PCR检测目标序列得到的产物，泳道4是不平衡PCR检测单碱基突变序列得到的产物。可见，利用常规PCR方法时，单碱基突变序列与目标序列作为模板均出现明显条带，这表明表示利用常规PCR引物容易引起非特异性扩增。而利用不平衡PCR方法时，只有目标序列出现明显条带，而单碱基突变序列未显示出条带，这表示不平衡PCR方法能准确识别单碱基突变，减少非特异性扩增。
实施例3：不平衡PCR检测单碱基突变的重复性
待检测的目标序列为实施例1中的SEQ ID NO:1，相对于所述目标序列存在单碱基突变的序列为实施例1中的SEQ ID NO:2，所用短链引物1为5’-ATCGAGATTTCT(SEQ ID NO:3)，所用长链引物2为5’-CTTTACTTACTACACCTCAG(SEQ ID NO:19)。
PCR扩增条件如下：反应体系为20μL，包括ddH
2O 7μL，引物1(10μmol·L
-1)1μL，引物2(10μmol·L
-1)1μL，模板DNA(目标序列或相对于所述目标序列存在单碱基突变的序列)(1nmol·L
-1)1μL，HiFi-KAPA聚合酶2X 10μL。
PCR反应在Biometra T1 thermolcycler热循环仪上进行。反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，50℃退火下30s，72℃延伸15s，20个循环；72℃延伸5min。
凝胶电泳测试：2μL PCR产物样品与0.5μL质粒大抽染料(Goldview，北京赛百盛)混匀，将混合液加入2.5％的琼脂糖凝胶(Invitrogen)孔内，进行凝胶电泳，并收集胶图(DYY-8C型，北京六一生物；120V，20min)。
如图6a所示，泳道1是显示的是模板为目标序列的PCR结果，可见得到明亮条带，泳道2是单碱基突变序列作为模板的PCR结果，可见并没有得到明显条带；泳道3是分子量标记。由此可见，利用本发明的方法可以明显的识别出单碱基突变。图6b是在与图6a相同的条件下进行的重复性实验，由所得的凝胶电泳图可见，本发明的方法具备良好的重复性。
实施例4：不平衡PCR产物纯化及浓度测定
将实施例2的不平衡PCR中得到的PCR产物经过smart beads(翌圣生物)纯化，按照制造商提供的说明进行以下操作：1)将磁珠由冰箱中取出，在室温下平衡至少30分钟。2)涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。3)取1.0×的Hieff
Smarter DNA Clean Beads至DNA溶液(PCR产物EP管)中，室温孵育5分钟。4)将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5分钟)，小心移除上清。5)保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后，小心移除上清。6)重复步骤5，总计漂洗2次。7)保持PCR管始终置于磁力架中，开盖以空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约 5分钟)。8)将PCR管从磁力架中取出，加入21μL ddH
2O，使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5分钟。9)将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后(约5分钟)，小心移取20μL上清至新PCR管中，勿触碰磁珠，可得到纯的双链DNA产物。
进行凝胶电泳测试，2μL经纯化的PCR产物样品与0.5μL质粒大抽染料(Goldview，北京赛百盛)混匀，将混合液加入2.5％的琼脂糖凝胶(Invitrogen)孔内，进行凝胶电泳，并收集胶图(DYY-8C型，北京六一生物；120V，20min)。如图7a所示，泳道1和3是目标序列作为模板的经纯化的PCR产物，泳道2和4是单碱基突变的序列作为模板的经纯化的PCR产物，可见，泳道1和3出现明显的目标条带，而突变序列则不会产生条带。如图7b所示，以Thermo Scientific
TM NanoDrop
TM One Microvolume UV-Vis Spectrophotometers可测得这些纯化产物的浓度。
实施例5：利用不平衡PCR检测单碱基突变的未知突变型
待检测的目标序列为实施例1中的SEQ ID NO:1，以蒸馏水代替目标序列作为阴性对照，所用短链引物1为5’-ATCGAGATTTCT(SEQ ID NO:3)、5’-ATCGAGATTTCA(SEQ ID NO:4)、5’-ATCGAGATTTCG(SEQ ID NO:5)或5’-ATCGAGATTTCC(SEQ ID NO:6)，所用长链引物2为5’-CTTTACTTACTACACCTCAG(SEQ ID NO:19)。
PCR扩增条件如下：反应体系为20μL，包括ddH
2O 7μL，引物1(10μmol·L
-1)1μL，每条引物1单独进行一次PCR，引物2(10μmol·L
-1)1μL，目标序列作为模板DNA(1nmol·L
-1)1μL，HiFi-KAPA聚合酶2X 10μL。
PCR反应在Biometra T1 thermolcycler热循环仪上进行。反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，特定的退火温度(45℃或50℃)30s，72℃延伸15s，20个循环；72℃延伸5min。
凝胶电泳测试：2μL PCR产物样品与0.5μL质粒大抽染料(Goldview，北京赛百盛)混匀，将混合液加入2.5％的琼脂糖凝胶(Invitrogen)孔内，进行凝胶电泳，并收集胶图(DYY-8C型，北京六一生物；120V，20min)。
结果如图8所示。其中泳道1是SEQ ID NO:3作为引物1，泳道2是SEQ ID NO:4作为引物1，泳道3是SEQ ID NO:5作为引物1，泳道4是SEQ ID NO:6作为引物1，泳道5是以水替代目标序列的空白对照，最左侧泳道为分子量标记。可见，只有与模板DNA完全匹配的SEQ ID NO:3作为引物时出现目的条带。即，通过使用在与目标突变位点配对处具有4种不同碱基的4种引物，本申请的不平衡PCR方法可以用于准确确定目标位点处的碱基，说明本申请方法能够非常准确的识别出单碱基突变型。
实施例6：实时荧光定量PCR检测单碱基突变
本实施例将不平衡PCR方法应用于实时荧光定量PCR。待检测的目标序列为实施例1中的SEQ ID NO:1，相对于所述目标序列存在单碱基突变的序列为实施例1中的SEQ ID NO:2，所用短链引物1为5’-ATCGAGATTTCT(SEQ ID NO:3)，所用长链引物2为5’-CTTTACTTACTACACCTCAG(SEQ ID NO:19)。通过将模板序列换成水来设置空白对照组。
qPCR扩增条件如下：反应体系为20μL，包括ddH
2O 6μL，引物1(10μmol·L
-1)1μL，引物2(10μmol·L
-1)1μL，模板DNA(目标序列或相对于所述目标序列存在单碱基突变的序列)(1nmol·L
-1)1μL，DNA聚合酶(HiFi-KAPA聚合酶2X)10μL，SYBR Green I(20x)(KGM030，凯基生物)1μL。
实时荧光定量PCR反应在qPCR仪器(型号：QuantStudio 5，厂家：ABI)上进行，反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，特定的退火温度(45℃或50℃)30s，72℃延伸15s，20个循环；72℃延伸5min。为了得到溶解度曲线，继续95℃反应15s；60℃反应1分钟，95℃变性1秒。
由图9a可见，以目标序列作为模板的反应的荧光信号明显上升，而单碱基突变序列和空白对照信号非常弱或无明显信号增长。图9b是熔解曲线，其中目标序列的峰位置说明利用本申请的方法得到了正确的产物。此实施例说明可以将本申请方法能够应用于荧光定量PCR用于单碱基突变的检测。
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围 的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
Claims (25)
- 一种用于检测核酸序列的预期单碱基突变位点上是否存在突变的方法，所述方法包括：提供包含待检测的核酸序列的样品；使用引物组通过聚合酶链反应扩增样品中的待检测核酸序列，所述引物组包含以下引物：识别引物，所述识别引物从5’端到3’端包含：(a)与所述待检测核酸序列中的一段连续核苷酸互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸的5’端起始于所述预期突变位点下游的第一个核苷酸，和(b)与所述待检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的未突变核苷酸互补的核苷酸，扩增引物，所述扩增引物能够扩增使用所述识别引物扩增所述待检测核酸序列得到的扩增产物，其中所述识别引物比扩增引物少1至19个核苷酸；以及检测反应产物中是否存在特异性扩增产物，特异性扩增产物的存在指示所述待检测核酸序列的预期突变位点上不存在单碱基突变。
- 一种用于检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的核苷酸的方法，所述方法包括：提供包含待检测的核酸序列的样品；使用引物组通过聚合酶链反应扩增样品中的核酸序列，所述引物组包含以下引物：识别引物，所述识别引物从5’端到3’端由以下组成：(a)与所述待检测核酸序列中的一段连续核苷酸互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸的5’端起始于所述预期突变位点下游的第一个核苷酸，和(b)与所述待检测核酸序列的预期单碱基突变位点上所预期存在的核苷酸互补的核苷酸，和扩增引物，所述扩增引物能够扩增使用所述识别引物扩增所述待检测 核酸序列得到的扩增产物，其中所述识别引物比扩增引物少1至19个核苷酸；以及检测反应产物中是否存在特异性扩增产物，特异性扩增产物的存在指示所述待检测核酸序列的预期突变位点上存在所预期存在的核苷酸。
- 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述识别引物比扩增引物少2至16个核苷酸，优选为，少3至15个核苷酸。
- 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述识别引物的长度为11至16个核苷酸，优选为12至15个核苷酸。
- 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，所述扩增引物的长度为15至25个核苷酸，优选为16至20个核苷酸。
- 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述识别引物的长度为12个核苷酸且所述扩增引物的长度为20个核苷酸，或者，所述识别引物的长度为15个核苷酸且所述扩增引物的长度为20个核苷酸。
- 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述聚合酶链反应使用DNA聚合酶进行，所述DNA聚合酶优选为高保真聚合酶。
- 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述聚合酶链反应使用DNA聚合酶进行，所述DNA聚合酶选自：热启动Taq聚合酶、TaqNova Stoffel DNA聚合酶、HiFi-KAPA聚合酶和Hemo KlenTaq聚合酶。
- 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述聚合酶链反应中采用的退火温度为44至52℃。
- 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述聚合酶链反应中采用的退火温度为45至50℃。
- 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述聚合酶链反应为普通PCR，且所述反应产物的检测采用凝胶电泳进行。
- 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述聚合酶链反应为荧光定量PCR反应。
- 根据权利要求12所述的方法，其中所述聚合酶链反应使用用于荧光定 量PCR的荧光染料进行。
- 一种用于检测核酸序列中的单碱基突变的引物组，所述引物组包含以下引物：识别引物，所述识别引物从5’端到3’端由以下组成：(a)与所述待检测核酸序列中的一段连续核苷酸互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸的5’端起始于所述预期突变位点下游的第一个核苷酸，和(b)与所述待检测核酸序列的预期单碱基突变位点上的未突变核苷酸或所预期的突变核苷酸互补的核苷酸，扩增引物，所述扩增引物能够扩增使用所述识别引物扩增所述待检测核酸序列得到的扩增产物，其中所述识别引物比扩增引物少1至19个核苷酸，优选为少3至15个核苷酸。
- 根据权利要求14所述的引物组，其中所述识别引物的长度为11至16个核苷酸，优选为12至15个核苷酸。
- 根据权利要求14或15所述的引物组，其中所述扩增引物的长度为15至25个核苷酸，优选为16至20个核苷酸。
- 根据权利要求14至16中任一项所述的引物组，其中所述识别引物的长度为12个核苷酸且所述扩增引物的长度为20个核苷酸，或者，所述识别引物的长度为15个核苷酸且所述扩增引物的长度为20个核苷酸。
- 权利要求14至17中任一项所述的引物组在制备用于检测核酸序列中的单碱基突变的混合物、试剂盒或生物检测装置中的用途。
- 一种混合物，其包含权利要求14至17中任一项所述的引物组，DNA聚合酶，和待检测的核酸序列。
- 一种用于检测核酸序列中的单碱基突变的试剂盒，其包含权利要求14至17中任一项所述的引物组。
- 根据权利要求20所述的试剂盒，其还包含DNA聚合酶。
- 一种用于检测核酸序列中的单碱基突变的生物检测装置，其包含权利要求14至17中任一项所述的引物组。
- 根据权利要求19所述的混合物或根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述DNA聚合酶为高保真聚合酶。
- 根据权利要求19所述的混合物或根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述DNA聚合酶选自：热启动Taq聚合酶、TaqNova Stoffel DNA聚合酶、HiFi-KAPA聚合酶和Hemo KlenTaq聚合酶。
- 根据权利要求19所述的混合物或根据权利要求20或21所述的试剂盒，其还包含用于检测扩增产物的试剂。
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