CN114277108B - 用于snp位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于SNP位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法。所述引物探针组合包括：一条反向引物，所述反向引物能够与待测靶标序列特异性配对结合；一条通用探针，所述探针不与任何已知物种的基因序列配对结合，且所述探针上修饰有检测基团；两条正向引物，所述两条正向引物的3’端最末一个碱基分别能够与待测靶标序列的一个SNP位点特异性配对结合，所述两条正向引物的5’端与所述通用探针部分或全部相同。利用所述引物探针组合或包括所述引物探针组合的试剂盒进行SNP位点检测的方法操作简便快捷、闭管检测、重复性好、仪器和试剂成本均低且准确性高。

Description

用于SNP位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于PCR技术和分子生物学技术领域，具体涉及一种用于SNP位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法。

背景技术

SNP，即单核苷酸多态性，是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异而引起的一种DNA序列多态性。SNP研究具有广泛意义，在农业领域中，可以进行性状基因的精细定位、分子辅助育种、种子资源鉴定等；在基础医学领域中，主要应用于疾病的分子遗传机制研究、疾病基因定位、药物敏感或疾病易感性位点筛选等；在临床医学领域中，则主要应用于个性化医疗指导、遗传病辅助诊断、辅助生殖等。

目前现有的基因突变检测试剂，多采用TaqMan水解探针法、扩增阻滞系统(AmplificationRefractory Mutation System,ARMS)、竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)和高分辨熔解曲线分析(High-ResolutionMelting Analysis，HRM)等。

TaqMan水解探针法方法需要设计一对特异性的PCR引物和一条与模板互补的特异性探针，且探针的结合位点位于两条引物之间，探针上5'端和3'端分别标记了一个荧光基团(供体)和一个淬灭基团(受体)，当TaqMan探针呈完整的游离状态时，荧光基团与淬灭基团相距较近，淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，发生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，从而导致仪器检测不到荧光信号；在PCR扩增过程中，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的探针，荧光报告基团和淬灭基团相距变远，从而释放出荧光信号。而且可设计针对野生型和突变的探针，用不同荧光标记，实现在一管内同时检测。但目前此法中的野生型和突变型探针往往无法完全避免交叉反应，在检测时容易产生假阳性的结果。此现象可通过在突变点附近引入错配碱基得到一定程度纠正，但引入错配碱基的种类和位置需要进行筛选，同时探针合成价格昂贵且周期较长。由于同一个基因在多个点都存在突变的可能，或者同一疾病或生理现象可由多个基因突变引起，而每一个突变点都需要专属的探针，这又进一步增加了试剂开发成本和用户的使用成本。

ARMS法利用DNA聚合酶缺乏3’外切酶活性的特点，如果引物的3’末端碱基不能与靶核酸序列正确的互补配对，那么靶核酸序列就不能被有效的扩增。理论上在进行基因突变检测时，需要一条通用探针与之配合的突变型引物和野生型引物，其中突变型引物的3’末端与突变型基因完全匹配，但与野生型基因不匹配。在进行突变基因检测时，由于突变型引物与野生型模板不能完全配对，引物的延伸被阻滞，从而实现突变基因的检测。但目前ARMS法中的突变型引物往往无法完全阻滞非特异性的模板扩增，在检测时容易产生假阳性的结果。此现象可通过在突变点附近引入错配碱基得到一定程度纠正。虽然此方法只需要对引物进行大量筛选，节约了试剂成本和缩短了开发周期。但由于野生和突变型使用同一条探针，所以无法实现在一管内同时检测。另外，对于同一个基因存在多点突变，且突变点彼此之间距离较远的情况，或者要同时检测多个基因的情况，还是需要多条探针才能解决，因此试剂开发成本和用户的使用成本也居高不下。

KASP法针对等位基因SNP位点设计的两个正向引物和一个通用反向引物；每条正向引物尾部有特异性序列，可与5’荧光标记的信号寡核苷酸序列相同。而两种5’不同荧光标记的信号寡核苷酸则分别与一条与之互补的3’淬灭基团标记的信号寡核苷酸的结合。第一轮PCR，能够和模板互补的正向引物得到延伸，无法和模板互补的正向引物无法延伸；第二轮PCR，正向引物互补的特异性序列得以延伸，这步完成把通用标签序列引入与SNP对应的PCR产物。随着PCR循环数增加，扩增子数量呈指数增长，荧光探针更多地退火到新合成的互补链上，发出荧光。不同颜色荧光即反映不同SNP类型。此法需要4条信号寡核苷酸，不同的突变点可以共同。相较于需要使用多条专属探针的方法而言，成本下降了许多。但与ARMS法一样，也容易产生假阳性。另一方面，体系中存在7条寡核苷酸，而且两条5’荧光标记的信号寡核苷酸还会作为第二轮PCR的引物，这进一步增加了非特异性扩增的风险。

HRM法是利用饱和型dsDNA染料可以插入DNA双链小沟中(PCR产物)的特性，通过实时监测升温过程中dsDNA解链，荧光染料脱落，荧光信号减弱或消失的过程，高分辨记录熔解曲线，从而对样品进行检测。HRM技术利用dsDNA的物理性质，准确反映DNA序列碱基配对特异性与解链温度变化的情况，无需使用特异性标记探针，不受突变种类和突变位点的限制，具有高灵敏度和特异性、高通量、操作简单灵活、成本低等优点。但是点突变导致的Tm值变化非常小，如颠换纯合突变子的温差在0.8～1.4℃之间，转换纯合突变子的温差甚至小于0.4℃。因此普通荧光PCR仪的分辨率根本不能胜任此方法，需要特定的PCR仪才能进行。并且PCR仪每个孔之间的温度差就可能达到0.1℃，所以每个反应孔里还需要另外加入高低两个已知Tm值的双链DNA内标，以便仪器进行温度校正。这样一来，体系中原本的两条引物变成了6条，为了降低非特异性扩增的风险，势必要将4条内标引物的3’端进行封闭修饰，也会增加一定的成本。同时，由于离子浓度等因素也会导致细微的Tm值变化，那么样本来源、核酸提取方法和核酸加样量等必须保持完全一致。这就意味着HRM体系的抗干扰能力较差。

进行HRM分析的另一个必要条件是饱和染料。所谓饱和染料是指染料相对于dsDNA要相对过量，以使dsDNA没有更多位置结合染料，在dsDNA升温解链时，饱和染料从双链上脱落，荧光信号同步减弱，准确反应出样品熔解温度(Tm)、熔解曲线的不同。SYBR Green I等染料广泛用于qPCR，但属于非饱和染料，不能封闭dsDNA的所有小沟位置，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。这样，DNA双链高温逐步变性时，部分荧光染料分子会随机结合到尚未解链的双链DNA空置的小沟位置，染料分子发生重排，造成荧光信号混乱，特异性下降，不能准确反映dsDNA解链过程。目前使用的饱和染料均为进口产品，货期长且购买渠道比较局限。

因此，本领域需要一种操作简便快捷、闭管检测、重复性好、仪器和试剂成本均低而准确性高的SNP位点检测方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种用于SNP位点检测的引物探针组合，利用所述引物探针组合或包括所述引物探针组合的试剂盒进行SNP位点检测的方法操作简便快捷、闭管检测、重复性好、仪器和试剂成本均低且准确性高。

为此，本发明第一方面提供了一种用于SNP位点检测的引物探针组合，其包括：

一条反向引物，所述反向引物能够与待测的靶标序列特异性配对结合；

一条通用探针，所述探针不与任何已知物种的基因序列配对结合，且所述探针上修饰有检测基团；

两条正向引物，所述两条正向引物的3’端最末一个碱基分别能够与待测靶标序列的一个SNP位点特异性配对结合，所述两条正向引物的5’端与所述通用探针部分或全部相同。

在本发明的一些实施方式中，所述两条正向引物的5’端与所述通用探针的相似性不同，使得两条正向引物的反向互补序列与所述通用探针的退火温度Tm值相差5℃以上。

在本发明的另一些实施方式中，所述检测基团包括第一检测基团和第二检测基团，且所述第一检测基团和第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化。

在本发明的一些实施方式中，所述第一检测基团为荧光报告基团，所述第二检测基团为淬灭基团或其它能够与所述第一检测基团通过荧光共振能量转移产生信号变化的修饰基团。

本发明第二方面提供了一种用于SNP位点检测的试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的引物探针组合。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括扩增试剂；优选地，所述扩增试剂包括DNA聚合酶和dNTPs；进一步优选地，所述DNA聚合酶为Taq酶。

本发明第三方面提供了一种利用如本发明第一方面所述的引物探针组合或者第二方面所述的试剂盒检测SNP位点的方法，其包括以下步骤：

S1，将待测样本的核酸模板、所述的引物探针组合以及扩增试剂混合，形成反应体系；

S2，对所述反应体系进行PCR扩增；

S3，判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况；

其中，所述PCR扩增时的退火温度设置为在所述两条正向引物的反向互补序列与通用探针的不同退火温度Tm值之间的温度。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3包括以下步骤：

S3-1，对步骤S2中PCR扩增后的产物进行熔解曲线分析判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况；优选地，还包括：

S3-2，采集步骤S2中PCR扩增所产生的信号变化，结合所述信号变化产生的扩增曲线判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况。

在本发明的另一些实施方式中，当获得的熔解曲线在野生型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰时，表明所述待测样本为野生型，其核酸模板中未发生SNP位点突变；当获得的熔解曲线在突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰时，表明所述待测样本为突变型，其核酸模板中发生了SNP位点突变；当获得的熔解曲线在野生型和突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内均出现熔解峰时，表明所述待测样本为杂合型，其核酸模板中发生了SNP位点突变；

优选地，当获得的熔解曲线在野生型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰，且在设定的循环数范围内获得的扩增曲线不呈S形时，表明所述待测样本为野生型，其核酸模板中未发生SNP位点突变；当获得的熔解曲线在突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰，且在设定的循环数范围内获得的扩增曲线呈S形时，表明所述待测样本为突变型，其核酸模板中发生了SNP位点突变；当获得的熔解曲线在野生型和突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内均出现熔解峰，且在设定的循环数范围内获得的扩增曲线呈S形时，表明所述待测样本为杂合型，其核酸模板中发生了SNP位点突变。

在本发明的一些实施方式中，所述反应体系中，反向引物的浓度为80-200nM；和/或所述通用探针的浓度为80-200nM；所述两条正向引物的浓度分别为20-50nM。

本发明的有益效果如下：

(1)成本低：本发明所提供的引物探针组合中的通用探针，在检测不同的SNP位点时可以共用。开发时不需要合成大量的探针以供筛选，只需要合成价格相当低廉的引物，可将开发成本降至前者的二十分之一，同时也将开发周期缩短至五分之一。利用所述引物探针组合进行SNP位点检测的方法所采用的所使用的DNA聚合酶可以是应用范围最广泛的Taq酶，并不需要外切酶活性缺失的特殊聚合酶类，同时通用探针也是在PCR技术里最普通的探针，不需要任何额外的修饰。且利用所述引物探针组合进行SNP位点检测的方法中，不同型别的待测样本的核酸模板的Tm值在较优的情况下差距会达到5℃以上，任何一款荧光PCR仪都能胜任。因此，本发明的所述方法的成本较以前的方法都有大幅下降。

(2)准确性高：本发明的PCR反应管中只有4条寡核苷酸，体系较为简单，相较于使用多条寡核苷酸的方法，发生非特异性扩增的风险较低。除了熔解曲线可以起到初步分型的作用外，还引入扩增曲线加以佐证，进一步避免了假阳性的可能。同时熔解曲线还可以帮助区分杂合子，这可以为基础研究、生育指导等领域提供更多有效信息。

(3)操作简单：本发明采用实时荧光PCR+熔解曲线的方法，操作简便程度远远大于琼脂糖凝胶电泳、微板ELISA、斑点杂交等方法，用时仅90分钟左右，且全程闭管运行，发生污染的风险非常低。

附图说明

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

图1为本发明所述引物探针组合的设计原理图。

图2为实施例1中对人FUT2基因G428A突变位点进行检测时的扩增曲线图。

图3为实施例1中对人FUT2基因G428A突变位点进行检测时的熔解曲线图。

图4为实施例2中对人FUT3基因T59G突变位点进行检测时的扩增曲线图。

图5为实施例2中对人FUT3基因T59G突变位点进行检测时的熔解曲线图。

图6为实施例3中对人FUT3基因T202C突变位点进行检测时的扩增曲线图。

图7为实施例3中对人FUT3基因T202C突变位点进行检测时的熔解曲线图。

图8为实施例4中对人FUT3基因T1067A突变位点进行检测时的扩增曲线图。

图9为实施例4中对人FUT3基因T1067A突变位点进行检测时的熔解曲线图。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

利用本发明所提供的引物探针组合进行SNP位点检测的原理如下：本发明所述引物探针组合中包括两条正向引物，两条正向引物的3’端最末一个碱基分别能够与待测靶标序列的一个SNP位点特异性配对结合，也即其中一条正向引物能够与野生型的未发生单碱基突变的核酸互补，另一条正向引物能够与突变型的发生单碱基突变的核酸互补。利用上述引物探针组合进行PCR扩增时，能够和核酸模板互补的正向引物得到延伸，无法和核酸模板互补的正向引物无法延伸；与正向引物互补的特异性序列得以延伸，这时通用探针与新生成的反向PCR产物匹配，形成双链状态。通用探针在单链状态因分子柔性使其成卷曲状，而在杂交或退火延伸形成双链状态后，因氢键作用而使其固定为较为刚性的双螺旋结构，使得该探针上标记的检测基团之间的距离发生变化，从而产生可检测的信号。通用探针若设计为分子信标探针，则由于荧光基团和淬灭基团距离更近，因此背景更低，扩增曲线的增辐会更大。PCR结束以后，紧接着进行熔解曲线分析。针对野生型和突变型的正向引物的反向互补序列与通用探针的退火温度Tm值相差明显，较优的情况下差距会达到5℃以上。若获得的熔解曲线在野生型待测样本的核酸模板的Tm值范围内出现熔解峰时，表明所述待测样本为野生型，其核酸模板中未发生SNP位点突变；当获得的熔解曲线在突变型待测样本的核酸模板的Tm值范围内出现熔解峰时，表明所述待测样本为突变型，其核酸模板中发生了SNP位点突变；当获得的熔解曲线在野生型待测样本和突变型待测样本的核酸模板的Tm值范围内均出现熔解峰时，表明所述待测样本为杂合型，其核酸模板中发生了SNP位点突变。利用所述引物探针组合进行SNP位点检测的方法基于荧光PCR技术，通过实时荧光PCR仪，进行同步核酸扩增与检测。

因此，本发明第一方面所涉及的用于SNP位点检测的引物探针组合，其包括：

一条反向引物，所述反向引物能够与待测的靶标序列特异性配对结合；

一条通用探针，所述探针不与任何已知物种的基因序列配对结合，且所述探针上修饰有检测基团；

两条正向引物，所述两条正向引物的3’端最末一个碱基分别能够与待测靶标序列的一个SNP位点特异性配对结合，所述两条正向引物的5’端与所述通用探针部分或全部相同。

本发明中，所述反向引物、正向引物与待测靶标序列的退火温度在60℃±2的范围内。

本发明中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3’-末端提供游离3’-OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3’-OH基团，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。

本发明中，术语“正向引物”，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；术语“反向引物”，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。应理解，当正义链和反义链的指定发生互换时，对应的正向和反向引物命名也可随之互换。也即，本发明中的正向引物和反向引物是相对而言的，当引物探针组合中，包括一条能够与待测的靶标序列特异性配对结合的正向引物，以及两条3’端最末一个碱基分别能够与待测靶标序列的一个SNP位点特异性配对结合，且5’端与所述通用探针部分或全部相同的反向引物时，该引物探针组合同样有效。

本发明中，术语“探针”是指用于检测SNP位点是否存在的经检测基团修饰的寡核苷酸。在本发明的一些具体的实施方式中，本发明的探针可选自由以下项组成的组：在单链状态下因分子柔性成卷曲状的寡核苷酸、在单链状态下能够形成发夹结构的寡核苷酸、在单链状态下能够形成茎环结构的寡核苷酸、在单链状态下能够形成假结结构的寡核苷酸，和在单链状态下能够形成三螺旋结构的寡核苷酸。

需要注意的是，本发明的探针能够与对应引物的扩增产物发生退火并延伸或者发生杂交，探针上的检测基团因此被整合到产生的双链中。与单链形态相比，探针的双链形态使得位于检测基团之间的距离发生变化(增加)，而这种距离的变化并非是检测基团的水解或释放而引起的。

在本发明的一些实施方式中，所述两条正向引物的5’端与所述通用探针的相似性不同，使得两条正向引物的反向互补序列与通用探针的退火温度Tm值相差5℃以上。

本发明中，术语“Tm”为熔解温度(melting temperature)，是指吸光值增加到最大值的一半时的温度称为DNA的解链温度或熔点。术语“Tm值”为DNA的熔解温度，是DNA变性过程中紫外吸收达到最大值一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同，DNA中C-G含量越高，Tm值就越大。

在本发明的另一些实施方式中，所述检测基团包括第一检测基团和第二检测基团，且所述第一检测基团和第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化。

在本发明的一些实施方式中，所述第一检测基团为荧光报告基团，所述第二检测基团为淬灭基团或其它能够与所述第一检测基团通过荧光共振能量转移产生信号变化的修饰基团。

在本发明的一些具体实施方式中，所述第一检测基团例如可选自以下项所组成的组：FAM、HEX、VIC、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5。

在本发明的另一些具体实施方式中，所述第二检测基团例如可选自以下项所组成的组：TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、QXL和DDQI。

本发明第二方面涉及一种用于SNP位点检测的试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的引物探针组合。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括扩增试剂；优选地，所述扩增试剂包括DNA聚合酶和dNTPs；进一步优选地，所述DNA聚合酶为Taq酶。

在本发明的另一些实施方式中，所述扩增试剂还包括一些促进PCR反应的试剂，例如KCl、MgCl₂、Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)等。

本发明中，所述试剂盒中的各组分可以单独分装的形式存在，或可以预先混合的形式存在。

本发明第三方面涉及一种利用如本发明第一方面所述的引物探针组合或者第二方面所述的试剂盒检测SNP位点的方法，其包括以下步骤：

S1，将待测样本的核酸模板、所述的引物探针组合以及扩增试剂混合，形成反应体系；

S2，对所述反应体系进行PCR扩增；

S3，判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况；

其中，所述PCR扩增时的退火温度设置为在所述两条正向引物的反向互补序列与通用探针的不同退火温度Tm值之间的温度。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3包括以下步骤：

S3-1，对步骤S2中PCR扩增后的产物进行熔解曲线分析判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况；优选地，还包括：

S3-2，采集步骤S2中PCR扩增所产生的信号变化，结合所述信号变化产生的扩增曲线判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况。

在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增的反应条件例如可以为：30℃-55℃退火及延伸10-600秒；90℃-96℃预变性2-10分钟；90℃-95℃变性10-60秒，50℃-75℃退火及延伸30-90秒，35-50个循环，采集荧光。

在本发明的一些具体实施方式中，所述PCR扩增的反应条件例如可以为：37℃退火及延伸180秒；95℃预变性2分钟；95℃变性15秒，60℃退火及延伸30秒，4 0个循环，采集荧光。

本发明中，“预变性”和“变性”的目的是破坏双链DNA上成对的互补碱基之间的氢键，从而允许双链分开成两条单链。

在本发明的一些实施方式中，对PCR扩增后的产物进行熔解曲线分析的反应条件例如可以是：90℃-95℃变性10-600秒；30℃-55℃退火10-600秒；将温度从35-45℃逐渐升温至85-95℃，升温过程实时采集荧光信号，升温的速率为0.03-0.08℃/s，升温结束后获得一条熔解曲线。

在本发明的一些具体实施方式中，对PCR扩增后的产物进行熔解曲线分析的反应条件例如可以是：95℃变性60秒；35℃退火180秒；将温度从40℃逐渐升温至85℃，升温过程实时采集荧光信号，升温的速率为0.04℃/s，升温结束后获得一条熔解曲线。

在本发明的另一些实施方式中，当获得的熔解曲线在野生型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰时，表明所述待测样本为野生型，其核酸模板中未发生SNP位点突变；当获得的熔解曲线在突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰时，表明所述待测样本为突变型，其核酸模板中发生了SNP位点突变；当获得的熔解曲线在野生型和突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内均出现熔解峰时，表明所述待测样本为杂合型，其核酸模板中发生了SNP位点突变。

在本发明的一些优选的实施方式中，当获得的熔解曲线在野生型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰，且在设定的循环数范围内获得的扩增曲线不呈S形时，表明所述待测样本为野生型，其核酸模板中未发生SNP位点突变；当获得的熔解曲线在突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰，且在设定的循环数范围内获得的扩增曲线呈S形时，表明所述待测样本为突变型，其核酸模板中发生了SNP位点突变；当获得的熔解曲线在野生型和突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内均出现熔解峰，且在设定的循环数范围内获得的扩增曲线呈S形时，表明所述待测样本为杂合型，其核酸模板中发生了SNP位点突变。

在本发明的一些实施方式中，所述反应体系中，反向引物的浓度为80-200nM；和/或所述通用探针的浓度为80-200nM；所述两条正向引物的浓度分别为20-50nM。

实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

下述实施例中，首先提取若干例人类全血样本的核酸，经荧光PCR扩增后作熔解曲线分析。将野生型的扩增产物与通用探针的退火温度设置在50～60℃范围内，将突变性的扩增产物与通用探针的退火温度设置在60～70℃范围内。若获得的熔解曲线在50～70℃范围内均没有出现明显熔解曲线峰值，则判定为空白，意味着全血样本中的白细胞过少或样本降解或核酸提取失败。若获得的熔解曲线只在50～60℃出现明显熔解曲线峰值，初步判定为野生型，这时若荧光PCR扩增过程中在设定的扩增循环数范围内获得的扩增曲线不呈明显S形，证明探针与PCR产物杂交效率很低，则可确认为野生型，样本的核酸中未发生特定的SNP位点突变；若获得的熔解曲线只在60～70℃出现明显熔解曲线峰值，初步判定为突变型，这时若荧光PCR扩增过程中在设定的扩增循环数范围内获得的扩增曲线呈明显S形，证明探针与PCR产物杂交效率较高，则可确认为突变型，样本的核酸中发生了特定的SNP位点突变；若获得的熔解曲线同时在50～60℃和60～70℃均出现明显熔解曲线峰值，初步判定为杂合型，这时若荧光PCR的扩增过程中在设定的扩增循环数范围内获得的扩增曲线呈明显S形，则可确认为杂合型，样本的核酸中发生了特定的SNP位点突变。

另外，再另外设计普通的扩增引物，用普通PCR仪对同样的核酸模板进行扩增，结束以后将PCR产物送测序公司进行Sanger测序。最后将两种方法学的结果进行比对。

下述实施例中，PCR程序(PCR扩增+熔解曲线的分析)的操作步骤如表1所示。

表1

实施例1：人FUT2基因中G428A突变的检测。

检测过程中采用的引物探针组合如表2所示。

表2

利用表2所示的引物探针组合对102例全血样本进行测试，测试过程中获得的扩增曲线和熔解曲线分别如图2和3所示。通过对熔解曲线和扩增曲线进行分析后获得的测试结果与测序结果比对，结果如表4所示。其中测序时采用的引物如表3所示。

表3

序列号	名称	序列(5'-3')
			SEQ ID No.21	FUT2F-15	CCTCTTTGTCTTTACGGTTTCCA
SEQ ID No.22	FUT2R-969	GGCAATCCCTGTCCACTCC

表4

从表4可知，利用本发明的引物探针组合对人FUT2基因G428A突变检测结果和测序结果100％匹配。101例野生型均无Ct值，Tm值约为54℃，标准差仅为0.06℃，证明其重复性相当好。仅有一例杂合型，其Ct值为32.11，且在54和66℃均有熔解峰，这与预期相符。

实施例2：人FUT3基因T59G突变的检测。

检测过程中采用的引物探针组合如表5所示。

表5

利用表5所示的引物探针组合对97例全血样本进行测试，测试过程中获得的扩增曲线和熔解曲线分别如图4和5所示。通过对熔解曲线和扩增曲线进行分析后获得的测试结果与测序结果比对，结果如表7所示。其中测序时采用的引物如表6所示。

表6

序列号	名称	序列(5'-3')
			SEQ ID No.23	FUT3F-33M	CTCCTCTCTCCTCTCTTCCCAG
SEQ ID No.24	FUT3R-1351	CCGCCGACATCCTCAGTAG

表7

从表7可知，利用本发明的引物探针组合对人FUT3基因T59G突变检测结果和测序结果100％匹配。50例野生型均无Ct值，仅在55℃有熔解峰，突变型5例，仅在69℃有熔解峰。杂合型42例，在55和69℃均有熔解峰，这与预期相符。突变型和杂合型均有Ct值。野生位点的Tm值约为55℃，标准差仅为0.15℃，突变点的Tm值约为69℃，标准差仅为0.09℃，证明其重复性相当好。

实施例3：人FUT3基因T202C突变的检测。

检测过程中采用的引物探针组合如表8所示。

表8

利用表8所示的引物探针组合对104例全血样本进行测试，测试过程中获得的扩增曲线和熔解曲线分别如图6和7所示。通过对熔解曲线和扩增曲线进行分析后获得的测试结果与测序结果比对，结果如表9所示。其中测序时采用的引物同实施例2。

表9

从表9可知，利用本发明的引物探针组合对人FUT3基因T202C突变检测结果和测序结果100％匹配。100例野生型均无Ct值，仅在53℃有熔解峰。杂合型4例，在53和60℃均有熔解峰，这与预期相符。突变型和杂合型均有Ct值。野生位点的Tm值约为53℃，标准差仅为0.14℃，突变点的Tm值约为60℃，标准差仅为0.07℃，证明其重复性相当好。

实施例4：人FUT3基因T1067A突变的检测。

检测过程中采用的引物探针组合如表10所示。

表10

利用表10所示的引物探针组合对102例全血样本进行测试，测试过程中获得的扩增曲线和熔解曲线分别如图8和9所示。通过对熔解曲线和扩增曲线进行分析后获得的测试结果与测序结果比对，结果如表11所示。其中测序时采用的引物同实施例2。

表11

/>

从表11可知，利用本发明的引物探针组合对人FUT3基因T1067A突变检测结果和测序结果100％匹配。81例野生型均无Ct值，仅在53℃有熔解峰,突变型1例，仅在66℃有熔解峰。杂合型20例，在53和66℃均有熔解峰，这与预期相符。突变型和杂合型均有Ct值。野生位点的Tm值约为53℃，标准差仅为0.14℃，突变点的Tm值约为66℃，标准差仅为0.11℃，证明其重复性相当好。

对比例1：采用Taqman水解探针对人FUT2基因G428A突变和人FUT3基因T59G突变进行检测，并与本发明的引物探针检测结果进行对比。

合成含人FUT2和人FUT3基因的质粒，分别有野生型、突变型以及二者等比例混合而成的杂合型，针对G428A突变和T59G突变设计引物和Taqman水解探针，分别如表12和13所示，其中突变型探针用FAM标记荧光，而野生型探针用VIC荧光标记。

采用本发明的引物探针组合与Taqman水解探针法同时检测三种质粒，结果如表14所示。

表12：针对G428A突变所设计引物和Taqman水解探针

序列号	名称	序列(5'-3')
			SEQ ID No.13	FUT2-428F1	GAACTACCACCTGAACGACTGGAT
SEQ ID No.14	FUT2-428R1	GGGTGAACTCCTGGAGGATCT
			SEQ ID No.15	FUT2-428PM1	CTCCTAGACCTTCT(5‘-FAM,3’-MGB)
SEQ ID No.16	FUT2-428PW1	TACCCCTGCTCCTGGA(5‘-VIC,3’-MGB)

表13：针对T59G突变所设计引物和Taqman水解探针

序列号	名称	序列(5'-3')
			SEQ ID No.17	FUT3-59F2	GCAGCCAAGCCACAATGG
SEQ ID No.18	FUT3-59R2	ACACGCAGGTAGGAGAAGAAACA
			SEQ ID No.19	FUT3-59PM1	CTGGCCGCACGGCT(5‘-FAM,3’-BHQ1)
SEQ ID No.20	FUT3-59PW1	CCGCACTGCTATTTCAGCT(5‘-VIC,3’-BHQ1)

表14

/>

由表14可以看出，采用本发明的引物探针组合的测试结果与预期100％相符，不仅有熔解曲线进行判定，还能用扩增曲线进行佐证，野生型和突变型的Tm值差距在10℃以上，最大程度上避免了假阳性的产生。而Taqman水解探针法的确存在非特异信号的干扰，不管检测什么型别，相反的型别总有不同程度的扩增信号出现，G428A的突变型和杂合子差距太小，而T59G的野生型和杂合子差距太小，完全不能区分。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

序列表

<110> 上海交通大学附属第一人民医院、迈克生物股份有限公司

<120> 用于SNP位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法

<130> 2021

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> FUT2-428FM3(人工序列)

<400> 1

tccgcctatc agaacatcgt caagtgcggc tacccctgct ctta 44

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> FUT2-428FW4(人工序列)

<400> 2

accgcttatc tgaacatcgt caagaacggc tacccctgct actg 44

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> FUT3-59WF2(人工序列)

<400> 3

tcagcctatc acaacatcgt caagtccgct gtctggcagc act 43

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> FUT3-59MF4(人工序列)

<400> 4

tccgcctatc agaacatcgt caagagctgt ctggccgccc g 41

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> FUT3-59RT1(人工序列)

<400> 5

ggacacacgc aggtaggaga ag 22

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> FUT3-202MF4(人工序列)

<400> 6

tccgcctatc agatcatcgt caagagccac cctcctgatc ctgttac 47

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> FUT3-202WF3(人工序列)

<400> 7

tccgcctatt agaacatcct cacgaacacc ctcctgatcc tgccat 46

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> FUT3-202R1(人工序列)

<400> 8

gggacagagc cacagggat 19

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> FUT3-1067MF3(人工序列)

<400> 9

tccgccaatc agaacatcgt caagagccag acggtgcgca gtaa 44

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> FUT3-1067WF8(人工序列)

<400> 10

tccgccattc agaacatagt caagaccaga cggtgagcag cat 43

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> FUT3-1067R2(人工序列)

<400> 11

caggtgaacc aagccgc 17

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> P21-1MR16P1(人工序列)

<400> 12

tccgcctatc agaacatcgt caagagc 27

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> FUT2-428F1(人工序列)

<400> 13

gaactaccac ctgaacgact ggat 24

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> FUT2-428R1(人工序列)

<400> 14

gggtgaactc ctggaggatc t 21

<210> 15

<211> 14

<212> DNA

<213> FUT2-428PM1(人工序列)

<400> 15

ctcctagacc ttct 14

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> FUT2-428PW1(人工序列)

<400> 16

tacccctgct cctgga 16

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> FUT3-59F2(人工序列)

<400> 17

gcagccaagc cacaatgg 18

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> FUT3-59R2(人工序列)

<400> 18

acacgcaggt aggagaagaa aca 23

<210> 19

<211> 14

<212> DNA

<213> FUT3-59PM1(人工序列)

<400> 19

ctggccgcac ggct 14

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> FUT3-59PW1(人工序列)

<400> 20

ccgcactgct atttcagct 19

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> FUT2F-15(人工序列)

<400> 21

cctctttgtc tttacggttt cca 23

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> FUT2R-969(人工序列)

<400> 22

ggcaatccct gtccactcc 19

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> FUT3F-33M(人工序列)

<400> 23

ctcctctctc ctctcttccc ag 22

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> FUT3R-1351(人工序列)

<400> 24

ccgccgacat cctcagtag 19

Claims (13)

1.一种用于SNP位点检测的引物探针组合，其包括：

一条反向引物，所述反向引物能够与待测靶标序列特异性配对结合；

一条通用探针，所述探针不与任何已知物种的基因序列配对结合，且所述探针上修饰有检测基团；

两条正向引物，所述两条正向引物的3’端最末一个碱基分别能够与待测靶标序列的一个SNP位点特异性配对结合，所述两条正向引物的5’端与所述通用探针部分或全部相同；

所述两条正向引物的5’端与所述通用探针的相似性不同，使得两条正向引物的反向互补序列与所述通用探针的退火温度Tm值相差5℃以上。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述检测基团包括第一检测基团和第二检测基团，且所述第一检测基团和第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化。

3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一检测基团为荧光报告基团，所述第二检测基团为淬灭基团或其它能够与所述第一检测基团通过荧光共振能量转移产生信号变化的修饰基团。

4.根据权利要求1所述引物探针组合，其特征在于，所述SNP位点为人FUT2基因中G428A突变位点、人FUT3基因T59G突变位点、人FUT3基因T202C突变位点、人FUT3基因T1067A突变中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的引物探针组合，其特征在于所述人FUT2基因中G428A突变位点检测的引物探针组合是由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.14和SEQ ID No.12组成；

所述人FUT3基因T59G突变位点检测的引物探针组合是由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.12组成；

所述人FUT3基因T202C突变检测的引物探针组合是由SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8和SEQ ID No.12组成；

所述用于人FUT3基因T1067A突变检测的引物探针组合是由SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12组成。

6.一种用于SNP位点检测的试剂盒，其包括如权利要求1-5中任意一项所述的引物探针组合。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括DNA聚合酶和dNTPs。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq酶。

9.一种权利要求1-5中任意一项所述的引物探针组合在制备检测SNP位点检测试剂中的应用，其特征在于，所述检测试剂的使用方法包括以下步骤：

S1，将待测样本的核酸模板、所述的引物探针组合以及扩增试剂混合，形成反应体系；

S2，对所述反应体系进行PCR扩增；

S3，判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况；

其中，所述PCR扩增时的退火温度设置为在所述两条正向引物的反向互补序列与通用探针的不同退火温度Tm值之间的温度。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤S3包括以下步骤：

S3-1，对步骤S2中PCR扩增后的产物进行熔解曲线分析判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况；

S3-2，采集步骤S2中PCR扩增所产生的信号变化，结合所述信号变化产生的扩增曲线判断所述待测样本的核酸模板中SNP位点突变情况。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，当获得的熔解曲线在野生型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰时，表明所述待测样本为野生型，其核酸模板中未发生SNP位点突变；当获得的熔解曲线在突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰时，表明所述待测样本为突变型，其核酸模板中发生了SNP位点突变；当获得的熔解曲线在野生型和突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内均出现熔解峰时，表明所述待测样本为杂合型，其核酸模板中发生了SNP位点突变。

12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，当获得的熔解曲线在野生型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰，且在设定的循环数范围内获得的扩增曲线不呈S形时，表明所述待测样本为野生型，其核酸模板中未发生SNP位点突变；当获得的熔解曲线在突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内出现熔解峰，且在设定的循环数范围内获得的扩增曲线呈S形时，表明所述待测样本为突变型，其核酸模板中发生了SNP位点突变；当获得的熔解曲线在野生型和突变型的扩增产物与通用探针的退火温度Tm值范围内均出现熔解峰，且在设定的循环数范围内获得的扩增曲线呈S形时，表明所述待测样本为杂合型，其核酸模板中发生了SNP位点突变。

13.根据权利要求10-12中任意一项所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，反向引物的浓度为80-200nM；和/或所述通用探针的浓度为80-200nM；所述两条正向引物的浓度分别为20-50nM。

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