KR101358416B1 - 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법 - Google Patents

리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 유전자 또는 이의 돌연변이의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)으로 증폭된 표적 유전자의 증폭산물에 대하여, 표적 유전자의 5' 영역 및 3' 영역에 각각 상보적으로 결합하는 제 1 프로브 및 제 2 프로브를 사용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 리가제 반응산물에 대해, 상기 반응산물에 포함된 제 1 프로브에 상보적으로 결합하는 절단효소 증폭 프라이머, 제 2 프로브의 절단효소 인식 염기서열을 인지하는 절단 효소, 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭반응에 의한 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 표적 유전자 또는 이의 돌연변이의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법은 임의의 짧은 길이의 DNA 조각을 대량 합성하여 질량분석하기 때문에 민감도, 특이도 및 재현성이 우수할 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 표적 유전자의 여러 개의 돌연변이 여부를 동시에 신속 정확하게 분석할 수 있어 유전적 요인에 의한 질병의 예방, 조기 진단 및 개인 맞춤 의약품 개발과 처방뿐만 아니라, 현장진단을 위한 바이오센서의 플랫폼으로 유용하다.

Description

리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법{Method for Detecting Target Genes or Their Mutations Using Ligase Reaction and Nicking Amplification Reaction}
본 발명은 표적 유전자 또는 이의 돌연변이의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 중합효소연쇄반응의 산물에 대하여, 표적 유전자가 존재하거나 표적 유전자 내 돌연변이가 존재하는 경우, 리가제 반응 산물이 형성되도록 한 후, 절단효소증폭반응을 수행하여, 표적 유전자 또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.
사람의 유전적 질환을 일으키는 유전자의 돌연변이 분석은 기본적으로 유전자의 염기서열분석 방법(DNA Sequencing) 을 통해 확인한다. 그러나 이 분석법은 유전자의 염기서열 전체를 분석해야하기 때문에 많은 한계가 있다. 한 시료의 분석에 많은 양의 데이터가 필요하므로 시간과 비용 및 인력이 많이 소모되며, 다수 시료의 유전자 돌연변이 분석을 위해서는 각각 다른 분석 조건이 필요하므로 한 번의 검사로 하나의 시료 밖에 검사를 할 수 없어 다수의 시료를 동시에 분석하기에 적합하지 못하다.
이에 따라 최근에는 다수의 샘플에 대하여 동시에 정확하게 분석할 수 있는 기술들이 개발되고 있으며, 이 기술들은 기존의 유전자 염기서열분석 방법을 빠르게 대체해 나가고 있다. 특히 다수 시료의 자동 분석이 가능한 질량분석 방법이 각광받고 있으며, 생체 시료의 질량분석을 위해서는 MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry)를 주로 이용한다. MALDI-TOF MS는 시료가 레이저와 매트릭스에 의해 이온화되고, 이온화된 시료가 레이저에 의해 매트릭스에서 떨어져나가 검출기까지 도달하는 시간을 측정하여 시료의 질량을 분석하는 장비로서, 이온화 과정에서 매트릭스를 이용하기 때문에 이온화 과정 중에 시료의 자체적 손상이 적어 단백질이나 DNA 등 비교적 분자량이 큰 생체 시료의 질량분석에 주로 이용된다 (Karas et al., Anal . Chem ., 60:2299, 1988).
MALDI-TOF MS를 이용한 표적 유전자의 돌연변이 검출에는 주로 단일염기연장반응(Single Base Extension, SBE) 과 리가제 연쇄반응 (Ligase reaction, LCR) 이 이용된다. 단일염기연장반응은 DNA 중합효소에 의해 프라이머를 한 개의 다이디옥시뉴클레오티드 (ddNTP) 염기만 연장시키는 방법으로, 표적 유전자의 돌연변이 위치 직전까지의 서열과 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 결합시킨 후, 중합효소를 이용해 연장시킴으로써 돌연변이 위치에 해당하는 염기에 상보적인 하나의 염기가 연장된 산물을 생산한다. DNA를 구성하는 네 개의 염기(아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 티민(T)) 는 각각의 질량이 다르므로, 단일염기연장반응으로 얻어진 산물은 질량분석을 통해 해당 위치에 어떤 염기서열을 가지고 있는지 파악할 수 있다(Ross et al ., Nat . Biotechnol., 16:1347, 1998). 리가제 연쇄반응은 서로 인접한 두 가닥의 왼쪽 프로브와 오른쪽 프로브가 분석하고자 하는 유전자 서열과 완전히 상보적으로 결합한 경우에만 리가제에 의해서 연결되는 특징을 이용한 기술로, 두 개의 프로브가 서로 인접한 부분에서 완전히 상보적인 경우에만 리가제에 의해 하나로 연결된 산물이 생성되고, 두 개의 프로브가 서로 인접한 부분에서 상보적이지 않을 경우에는 하나로 연결된 산물이 생성되지 않는다. 이를 MALDI-TOF MS 분석을 통해 확인하면, 해당 위치에 어떤 염기 서열을 가지고 있는지 쉽게 파악할 수 있다 (Jurinke et al ., Anal . Biochem ., 237:174, 1996).
그러나 단일염기연장반응을 이용한 질량분석의 경우, DNA를 구성하는 네 종류 염기의 질량차이가 크지 않아 질량분석 신호간에 중첩이 빈번히 일어나기 때문에, 모든 표적 유전자 돌연변이 위치의 염기서열이 무엇인지 정확하게 파악하기 어려운 단점이 있다. 또한 리가제 연쇄반응은 두 가닥의 프로브가 연결되는 반응이므로, 리가제 연쇄반응 산물이 MALDI-TOF MS 분석에서 실험적으로 허용될 수 있는 질량보다 큰 경우가 많아 대량의 돌연변이 분석에는 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 표적 유전자의 돌연변이를 동시에 다중 분석할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 리가제 반응으로 돌연변이 염기서열에 특이적인 리가제 프로브 산물을 얻은 후, 이를 절단효소 증폭반응을 이용하여 질량분석이 용이한 작은 DNA 조각으로 증폭 생성하여 이를 질량분석하였다. 본 방법을 통해 다양한 검체를 대상으로 표적 유전자 내의 여러 개의 돌연변이 여부를 동시에 신속 정확하게 분석할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 표적 유전자 또는 표적 유전자 내의 여러 개의 돌연변이 여부를 동시에 신속 정확하게 분석할 수 있는 새로운 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)으로 증폭된 표적 유전자의 증폭산물에 대하여, 표적 유전자의 돌연변이 위치를 중심으로 5' 영역 및 3' 영역에 각각 상보적으로 결합하는 제 1 프로브 및 제 2 프로브를 사용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 리가제 반응산물에 대해, 상기 반응산물에 포함된 제 1 프로브에 상보적으로 결합하는 절단효소 증폭 프라이머, 제 2 프로브의 절단효소 인식 염기서열을 인지하는 절단 효소, 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭반응에 의한 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 표적 유전자의 돌연변이 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)으로 증폭된 표적 유전자의 증폭산물에 대하여, 표적 유전자의 5' 영역 및 3' 영역에 각각 상보적으로 결합하는 제 1 프로브 및 제 2 프로브를 사용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 리가제 반응산물에 대해, 상기 반응산물에 포함된 제 1 프로브에 상보적으로 결합하는 절단효소 증폭 프라이머, 제 2 프로브의 절단효소 인식 염기서열을 인지하는 절단 효소 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭반응에 의한 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 표적 유전자의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법은 임의의 짧은 길이의 DNA 조각을 대량 합성하여 질량분석하기 때문에 민감도, 특이도 및 재현성이 우수할 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 표적 유전자의 여러 개의 돌연변이 여부를 동시에 신속 정확하게 분석할 수 있어 유전적 요인에 의한 질병의 예방, 조기 진단 및 개인 맞춤 의약품 개발과 처방뿐만 아니라, 현장진단을 위한 바이오센서의 플랫폼으로 유용하다.
도 1은 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자의 돌연변이 진단용 질량분석 방법 원리를 나타낸 개략도이다(wild: 돌연변이가 없는 경우; mutant: 돌연변이가 있는 경우).
도 2는 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 검출용 질량분석 방법 원리를 나타낸 개략도이다.
도 3은 PCR을 이용하여 BRCA 1 유전자의 exon 11 위치를 증폭한 결과를 나타낸 아가로즈젤 전기영동 결과이다(첫 번째 줄(1): DNA 마커; 두 번째 줄(2): 돌연변이가 없는 정상 DNA; 그 외에 다른 줄(3~7): 각각 서로 다른 돌연변이를 가지는 환자의 DNA; 증폭된 유전자의 크기는 약 3.3 kbp).
도 4는 리가제 반응 산물을 확인하기 위한 폴리아크릴아마이드젤 전기영동 결과이다(첫 번째 줄: DNA 마커; 2 ~ 5 번째 줄: 돌연변이가 없는 경우; 6 ~ 9 번째 줄: 돌연변이가 있는 경우; 10 번째 줄: 리가제 연쇄반응을 수행하지 않았을 경우).
도 5는 절단효소 증폭반응 산물과 상보적인 염기서열을 가지고, 5‘ 말단에 형광염료를, 3’말단에 소광제(quencher)를 포함하는 분자비콘 형태의 DNA 절편 검출 프로브를 이용하여 절단효소 증폭반응 산물을 형광으로 확인한 결과이다.
도 6은 절단효소 증폭반응 이후 최종 결과를 확인하는 질량분석 결과이다. 돌연변이가 있는 경우에만 절단효소 증폭반응의 산물인 DNA 절편의 질량 분석 피크가 나타난다. (wild: 돌연변이가 없는 경우, mutant: 돌연변이가 있는 경우)
본 발명은 일 관점에서 (a) 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)으로 증폭된 표적 유전자의 증폭산물에 대하여, 표적 유전자의 돌연변이 위치를 중심으로 5' 영역 및 3' 영역에 각각 상보적으로 결합하는 제 1 프로브 및 제 2 프로브를 사용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 리가제 반응산물에 대해, 상기 반응산물에 포함된 제 1 프로브에 상보적으로 결합하는 절단효소 증폭 프라이머, 제 2 프로브의 절단효소 인식 염기서열을 인지하는 절단 효소, 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭반응에 의한 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 표적 유전자의 돌연변이 검출방법에 있어서,
상기 제 1 프로브는 5' 말단에 상기 표적 유전자에 존재하는 돌연변이 위치와 상보적인 염기를 가지며, 3' 말단에 절단효소 증폭반응을 위한 프라이머 혼성화 염기서열을 포함하고, 상기 제 2 프로브는 3' 말단에 표적 유전자에 존재하는 돌연변이 위치와 상보적인 염기를 가지며, 5' 말단에 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 돌연변이 검출방법에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 (a) 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)으로 증폭된 표적 유전자의 증폭산물에 대하여, 표적 유전자의 5' 영역 및 3' 영역에 각각 상보적으로 결합하는 제 1 프로브 및 제 2 프로브를 사용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 리가제 반응산물에 대해, 상기 반응산물에 포함된 제 1 프로브에 상보적으로 결합하는 절단효소 증폭 프라이머, 제 2 프로브의 절단효소 인식 염기서열을 인지하는 절단 효소 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭반응에 의한 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 존재를 확인하는 단계는 방법을 포함하는 표적 유전자의 검출방법에 있어서,
상기 제 1 프로브는 3' 말단에 절단효소 증폭반응을 위한 프라이머 혼성화 염기서열을 포함하고, 상기 제 2 프로브는 5' 말단에 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 BRCA 1 exon11에 존재하는 5 종의 변이부위에 대하여, 중합효소연쇄반응으로 상기 표적 유전자의 돌연변이 부위를 증폭하고, 이로부터 리가제 반응 및 절단효소 증폭반응을 통하여 얻어진 증폭산물에 대하여, 형광검출법 및 MALDI-TOF MS를 포함하는 공지된 다양한 방법을 사용하여 변이염기를 가진 표적 유전자 검출능을 확인한 결과, 검출능이 우수함을 확인하였다(도 5 및 도 6).
본 발명의 표적 유전자의 돌연변이 검출방법은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 증폭된 표적 유전자의 서열에 돌연변이가 존재할 경우에만 리가제 반응(Ligase reaction)이 일어날 수 있으며, 표적 유전자의 서열에 돌연변이가 존재하지 않을 경우에는 리가제 반응 산물이 생성되지 않는 원리를 이용하며, 상기 리가제 반응 산물은 절단효소 증폭반응의 주형이 되므로, 리가제 반응 산물이 존재해야 절단효소 증폭반응이 일어나는 원리로 돌연변이 또는 표적 유전자 존재유무를 판독할 수 있다.
본 발명에서의 용어 '중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)'은 DNA를 증폭시키는 분자생물학적 기술로서, 다중 PCR(multiplex-PCR), 네스티드 PCR(nested PCR), 정량적 PCR(quantitative PCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(RT-PCR) 및 터치다운 PCR(touchdown PCR) 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서 중합효소연쇄반응의 목적은 증폭 횟수에 따른 증폭산물의 정량적 측정을 목적으로 하기 보다는 반응 후의 높은 수득률을 얻는 것인 바, 일반적인 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서의 용어 '리가제 반응(Ligase reaction)'은 유전자 합성법의 하나로서, 특정 길이의 2종의 프로브를 타겟 서열에 나란히 혼성화되도록 한 후, 이 때 형성되는 이중 나선의 닉(nick) 부위를 DNA ligase에 의하여 통상의 핵산의 연결 원리에 입각한 통상적인 접합(ligation)을 통해 2종의 프로브를 단일 가닥상태로 연결하는 반응이다. 따라서 핵산의 연결을 유도하는 리가제(ligase)로서 당업계에서 통상적으로 사용되는 효소를 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에서의 용어 '닉(nick)'은 연결되어있지 않은 인접한 두 가닥의 핵산 사이를 의미하며, 인위적으로 두 가닥의 핵산을 인접하게 배치하거나 한 가닥의 핵산을 절단효소에 의해 절단됐을 때 생성되며, 상기 효소의 이중쇄 핵산 분자의 단지 하나의 쇄의 절단 활성을 나타내는 반응을 '니킹(nicking) 또는 절단'이라고 한다.
본 발명의 리가제 반응(Ligase reaction)에 사용되는 프로브는 표적 유전자와의 혼성화에 사용되며, 표적 유전자 또는 표적 유전자의 돌연변이 위치 한 부위당 두 개의 프로브가 필요하다.
상기 프로브는 표적 유전자의 중앙 위치를 기준으로, 또는 돌연변이 위치를 기준으로 왼쪽(제1 프로브)과 오른쪽(제2 프로브)에 각각 상보적으로 결합하는 특징이 있다. 만일 상기 두 프로브가 상보적으로 표적 유전자에 혼성화되었을 경우에는 제1 프로브의 5'-P 말단과 제2 프로브의 3'- OH 말단을 연결하는 리가제의 특성에 의하여, 도 1 및 도 2과 같이, 프로브가 접합하게 되고 완전한 이중나선을 형성하게 되며, 표적 유전자가 존재하지 않거나, 돌연변이가 없는 경우에는 리가제 반응이 일어나지 않는다.
본 발명의 돌연변이 검출에 사용되는 리가제 반응용 프로브는 제1 프로브의 5' 말단 또는 제2 프로브의 3' 말단에 돌연변이 위치와 상보적인 염기를 가질 수 있다.
본 발명의 표적 유전자 검출에 사용되는 리가제 반응용 제1 프로브 및 제2 프로브는 일부 서열이 표적 유전자의 왼쪽 및 오른쪽에 각각 상보적인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 제1 프로브의 3' 말단에는 절단효소 증폭 반응을 위한 프라이머가 혼성화할 수 있는 추가의 염기 서열이 존재하며, 제2 프로브의 5' 말단에는 절단효소 증폭 반응을 위한 절단효소 인식 부위와 절단효소 증폭 반응에 의해 DNA 절편을 생성하는데 주형으로 사용되는 염기서열이 존재한다. 상기 프라이머 혼성화 염기서열은 리가제 반응의 제1 프로브와 모두 동일하며, 절단효소 증폭 반응의 산물 염기서열은 MALDI-TOF MS 분석에서 실험적으로 허용될 수 있는 질량보다 약 ≤ 10,000 Da로 작은 특징이 있다.
본 발명에서 제1 프로브의 서열 상에 존재하는 절단효소 증폭반응을 위한 프라이머가 혼성화 할 수 있는 염기서열은 리가제 반응 프로브와 교차반응이 일어나지 않는 범위 내에서 어느 서열이든 사용할 수 있다.
본 발명의 용어, '절단효소'는 완전한 또는 부분적 이중쇄 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 인식하고, 인식 서열에 대해 특이적 위치에서 핵산 분자의 단지 하나의 쇄 만을 절단시키는 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 상기 인식서열은 절단효소에 따라 다르며, 예를 들어 N.BstNB I은 5'-GAGTCNNNNN-3' (N 은 임의의 염기)서열을 인식하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 제2 프로브에 포함된 절단효소 인식부위는 공지된 절단효소 인식서열을 삽입함으로써, 제조될 수 있으며, 공지된 절단효소의 인식부위는 당업자에게 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 리가제 반응(Ligase reaction)에 사용하는 효소는 90N 리가제, E. coli DNA 리가제, Taq DNA 리가제, T4 DNA 리가제 및 Ampligase 리가제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, DNA 결합 활성을 가지는 리가제라면 어떤 것이든 사용할 수 있다.
또한 상기 리가제 반응은 단일의 표적 유전자 또는 돌연변이 검출이 가능할 뿐만 아니라, 복수의 타겟을 인지하는 복수의 프로브를 사용하여, 한 번의 반응으로 수행할 수 있다. 이 경우에는 각각의 리가제 프로브 염기서열 중 표적 유전자와 혼성화되는 부분의 melting temperature(Tm) 값의 오차를 5 ℃ 이내로 되도록 각각의 돌연변이 위치에 맞는 리가제 프로브를 선정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)은 리가제 반응 산물을 주형으로 이용하여 수행한다. 리가제 반응 산물이 존재할 경우, 절단효소 증폭반응이 일어나 절단효소 증폭반응의 산물이 산출되지만, 리가제 반응 산물이 존재하지 않을 경우, 절단효소 증폭 반응이 일어나지 못하여 절단효소 증폭 반응의 산물이 생기지 않는 원리를 이용한다(도 1 및 도 2).
본 발명에 있어서, 상기 절단효소 증폭반응에 사용되는 절단효소는 Nb.BtsⅠ Nt.BstNBⅠ, Nb.BbvCⅠ, Nt.BbvCⅠ 및 Nt.AlwⅠ으로 구성된 군으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 65 ℃ 이하에서 활성을 가지는 DNA 절단효소라면 어떤 것이든 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 절단효소 증폭반응에 사용되는 중합효소는 Klenow DNA 중합효소, Bsu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소 및 Bst DNA 중합효소로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 65 ℃ 이하에서 중합 활성 및 치환 활성을 가지는 DNA 중합효소라면 어떤 것이든 사용할 수 있다.
상기 중합효소로 증폭된 산물은 리가제 반응의 제2 프로브의 5' 말단에 존재하는 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 특징이 있다.
본 발명의 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)의 결과로 증폭된 DNA 절편의 생성유무를 확인하는 단계에서는 분석될 샘플 내의 특정 핵산 서열의 존재 또는 부재를 결정하는 정성적 검출을 또한 허용한다. 정성적 검출은 당업계에 공지된 방법에 따른 표지 기의 결정을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 절단효소 증폭반응 산물을 정제한 후, MALDI-TOF MS 기기를 사용한 질량분석을 통하여 절단효소 증폭반응 산물의 피크가 검출되는지 여부를 판단할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에서 상기 (d) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 MALDI-TOF MS((Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry))를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 한다.
MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry)는 시료가 레이저와 매트릭스에 의해 이온화되고, 이온화된 시료가 레이저에 의해 매트릭스에서 떨어져나가 검출기까지 도달하는 시간을 측정하여 시료의 질량을 분석하는 장비로서, DNA를 구성하는 네 개의 염기, 즉 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 티민(T)의 질량이 서로 다르기 때문에, 이로 구성된 산물은 질량분석을 통해 해당 위치에 어떤 염기서열을 가지고 있는지 파악할 수 있으므로, 형광 물질 등의 라벨을 달지 않아도 리가제 반응 산물을 검출할 수 있으며, 절단효소 증폭반응 산물의 길이를 조절함으로써 다량의 표적 유전자 돌연변이를 한 번에 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서, 상기 (d) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 절단효소 증폭반응 산물에 대해 상보적인 염기서열을 가지며, 형광물질(fluorophore)와 소광제(Quencher)를 포함하는 분자 비콘(molecular beacon) 형태의 프로브를 이용할 수 있다.
본 발명의 용어 '분자 비콘(molecular beacon)'은 5‘과 3’ 말단에 형광체와 소광체가 자리 잡고 있으며, 머리핀(stem-and-loop) 구조를 가지고 있기 때문에 인접한 형광체와 소광체간의 에너지 이동에 의해 형광이 소멸되어 있다가 상보적인 서열을 지닌 목표 DNA를 만나면 머리핀 구조가 풀리면서 목표 DNA와 DNA 이중합체를 형성하여 형광이 복원되는 반면, 하나 이상의 염기가 불일치하는 목표 DNA를 만나는 경우에는 머리핀 구조를 계속 유지하면서 형광이 계속 소멸되는 성질을 지니는 DNA 탐침이다. 따라서 분자 비콘은 단일염기 다양성 분석, 실시간 핵산 분석, 실시간 정량적 중합효소연쇄반응, 의료분석진단기 등에 응용될 수 있다.
본 발명의 분자 비콘(molecular beacon) 상태의 프로브는 5'-말단에는 형광물질(fluorophore)이, 3'-말단에는 소광제(quencher)이 표지된 단일가닥 의 RNA 또는 DNA를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 프로브에 표지될 수 있는 형광물질로는 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), Cy5, Cy3, 텍사스 레드(Texas Red) 등의 공지된 형광물질들을 이용할 수 있고, 소광제로는 댑실(dabsyl), 댑실(dabcyl), 블랙홀소광제(blackhole quencher) 등의 기존의 소광제로 널리 알려진 것들을 이용할 수 있다. 또한, 소광제 대신 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 작용을 할 수 있는 또 다른 형광물질을 표지하여 이용할 수도 있으며, 형광물질과 소광제 선택에 있어서는 당업자에게는 자명한 일이다.
본 발명은 의학적, 진단용 및 법의학적 용도에, 예를 들어 인간 또는 수의학 의약에서, 예를 들어 병원체, 예를 들어 인간 병원체 또는 가축 또는 애완 동물의 병원체로부터의 핵산에 존재하는 표적 유전자 검출에 적절하다. 특히, 예를 들어 바이러스 또는 박테리아를 검출할 수 있다.
추가로 바람직한 용도에는 유전학적 변이성, 예를 들어 인간에서의 SNP의 검출 또는 의약 저항성, 내성 또는 불내성 또는 알러지의 검출이 포함된다. 또한, 본 발명은 장애, 알러지 및 불내성의 소인 또는 위험 증가와 관련이 있는 돌연변이를 결정하기 위한 유전자형 결정, 특히 인간의 유전자형 결정에 적절하다. 본 발명은 유전자 변형 유기체 또는 계통, 박테리아 또는 바이러스의 유기체 또는 계통, 뿐만 아니라 유전자 변형된 가축 동물 등의 검출에 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 질환, 예를 들어 유전자 질환, 알러지 질환, 자가면역 질환 또는 감염성 질환의 신속한 진단에 특히 적절하다.
또한, 본 발명은, 예를 들어 연구 목적으로, 유전자의 기능 및/또는 발현을 검출하는데 적절하다.
상기 핵산은 천연의 핵산이거나 천연의 핵산으로부터 유도된다. 천연의 표적 핵산은 생물학적 샘플로부터 수득된다. 바람직한 생물학적 샘플에는 하나 이상의 포유류 조직, 바람직하게는 사람 조직(예를 들면, 혈액, 혈장/혈청, 모발, 피부, 림프절, 비장, 간 등) 및/또는 세포 또는 세포주가 포함된다. 생물학적 샘플은 하나 이상의 사람 조직 및/또는 세포를 포함할 수 있다. 포유류 및/또는 사람 조직 및/또는 세포는 하나 이상의 종양 조직 및/또는 세포를 추가로 포함할 수 있다.
생물학적 샘플로부터 핵산 집단을 분리시키는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고 용이하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 BRCA1 유전자 돌연변이 진단용 질량 분석
(1) 표적 유전자의 증폭
표적 유전자는 돌연변이가 일어날 경우 유방암의 유전적 원인이 되는 BRCA 1 유전자 중 exon 11 위치이며, 이에 포함된 돌연변이는 1041 (AGC 결손, T 삽입), 1835 (A 결손), 2552 (C 결손), 3932 (T 중복), 4184 (TCAA 결손) 이다. 이를 증폭하기 위한 프라이머(Integrated DNA Technologies, USA)는 3,323 bp의 길이를 가지며 BRCA 1의 exon 11에 상보적으로 결합하는 특징이 있다(표 1).
타겟 방향 프라이머 염기 서열 (5' -> 3') 특징
BRCA 1 유전자 exon 11 F CAG GGT AGT TCT GTT TCA AAC TTG C 서열번호 1
R GTT CCA ATA CCT AAG TTT GAA TCC ATG C 서열번호 2
돌연변이 진단을 하고자 하는 BRCA 1 유전자를 증폭하기 위하여, 실제 환자에서 추출한 유전자를 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 상기 5 개의 돌연변이 위치를 포함하는 3.3 kbp의 최종 증폭 산물을 얻었다. 실제 환자의 샘플에서 추출한 유전자, 0.25 μM의 프라이머 세트, 1X PCR reaction buffer (60 mM Tris-SO4, 20 mM (NH4)2SO4 , 2 mM MgSO4, 3 % glycerol, 0.06 % NP-40, 0.05 % Tween-20), 0.2 mM dNTPs 및 2.5 U LongAmp. Taq polymerase (New England Biolabs, USA) 을 혼합하여 반응 혼합물을 제조하였으며, C1000 thermo-cycler (Bio-Rad, USA) 를 이용하여 DNA를 증폭시켰다. PCR의 조건은 이중가닥 DNA를 denaturation 시키기 위하여 95 ℃에서 5 분간 가열한 다음, 95 ℃에서 50 초, 58 °C에서 30 초, 65 ℃에서 180 초의 사이클을 40 번 반복한 뒤, 65 ℃에서 7 분간의 마지막 extension 과정을 거쳤으며, 상기 PCR 산물은 아가로오스 전기영동 (agarose gel electrophoresis) 을 이용하여 PCR 여부와 크기를 확인하였다(도 3).
(2) 리가제 반응
돌연변이 위치의 유전자 염기서열 분석을 위하여, BRCA 유전자의 PCR 증폭산물을 이용해 리가제 반응을 수행하였다. 총 5 개의 돌연변이 위치에서 각각 리가제 반응이 일어나며, 돌연변이의 경우에만 리가제 반응 결과물을 얻는다.
PCR을 이용해 증폭한 표적 유전자, 1 μM의 프로브 세트(Integrated DNA Technologies, USA), 1X ligase reaction buffer (10 mM Tris-HCl, 600 μM ATP, 2.5 mM MgCl2, 2.5 mM Dithiothreitol, 0.1 % Triton X-100), 및 1 U 9°N DNA Ligase (New England Biolabs, USA) 를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하였으며, C1000 thermo-cycler (Bio-Rad, USA) 를 이용하여 리가제 반응을 수행하였다. 리가제 반응의 조건은 이중가닥 DNA를 denaturation 시키기 위하여 95 ℃에서 5 분간 가열한 다음, 55 °C에서 15 분간의 ligation 과정을 거쳤으며, 상기 리가제 반응 산물은 폴리아크릴아마이드젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 을 이용하여 리가제 반응의 결과물을 확인하였다(도 4). 각각의 리가제 프로브는 표 2와 같다.
위치 방향 프로브 염기서열 (5' -> 3') Tm*(℃)
1041
(AGC 결손, T 삽입)		 L(서열번호 3) ATTTATTACAGAATTCAGCCTTTTCTACATTGTGATTGCCCTATCGCACGAGG 54.0
R(서열번호 4) TGGCGTGTACGCAGTGTAAAGCTTGCTAAGCCAGGCTGTTT 55.8
1835
(A 결손)		 L(서열번호 5) ATCTATTGGGTTAGGATTTTTCTCATTCTGAGTGATTGCCCTATCGCACGAGG 56.2
R(서열번호 6) TGGCGTGTACGCAGTGTAAAGGTTTTGAAAGCAGATTCTTTTTCGAGTG 55.6
2552
(C 결손)		 L(서열번호 7) TGGGTTTTCAAATGCTGCACACGTGATTGCCCTATCGCACGAGG 57.0
R(서열번호 8) TGGCGTGTACGCAGTGTAAAGTGGAACAACCATGAATTAGTCCCT 56.2
3932
(T 중복)		 L(서열번호 9) AACTGCAGTCATTTAAGCTATTCTTCAAGTGATTGCCCTATCGCACGAGG 55.3
R(서열번호 10) TGGCGTGTACGCAGTGTAAAGGCCTTTGCCAATATTACCTGGTT 55.9
4184
(TCAA 결손)		 L(서열번호 11) CTTATTTTCTTCCAAGCCCGTTCCGTGATTGCCCTATCGCACGAGG 56.4
R(서열번호 12) TGGCGTGTACGCAGTGTAAAGCTAAGTTTGAATCCATGCTTTGCTCTT 56.1
(*Tm은 추가적인 염기서열이 포함되지 않은, 표적 유전자와 직접적으로 혼성화 되는 부분 염기서열의 melting temperature이다.)
(3) 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)
리가제 반응 결과물을 이용하여 질량분석에 필요한 DNA 절편을 증폭 생성하기 위해 절단효소 증폭반응을 수행하였다. 표적 유전자에 돌연변이가 있을 경우에만 리가제 반응 산물이 존재하므로 절단효소 증폭 반응 결과물이 산출된다. 리가제 반응의 결과물, 1 aμM의 프라이머(Integrated DNA Technologies, USA), 1X NEBuffer 2 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol), 1 μM dNTPs, 2.5 U Klenow fragment polymerase (3´→5´ exo-), 및 1 U Nb. BtsI nicking enzyme (New England Biolabs, USA) 을 혼합하여 반응 혼합물을 제조하였으며, 항온 반응기에서 절단효소 증폭반응을 수행하였다. 절단효소 증폭반응의 조건은 37 ℃에서 2 시간 반응 하였으며, 상기 절단효소 증폭반응 산물은 이와 완벽히 상보적인 분자 비콘 형태의 검출 프로브를 이용하여 생성 유무를 확인하였다. 이 검출 프로브는 5‘ 말단에 형광 물질, 3‘ 말단에 소광제가 삽입되어, 절단효소 증폭반응 산물이 없을 때는 형광 신호가 발생되지 않으나, 절단효소 증폭반응 산물이 존재할 경우 형광신호가 발생되어 절단효소 증폭반응의 결과물을 확인하였다(도 5).
위치 프라이머 염기 서열 (5' -> 3') Tm*(℃) 특징
절단효소 증폭반응의 공통 프라이머
(nicking primer)		 CCT CGT GCG ATA GGG CAA TCA C 60.2 서열번호 13
(4) 질량분석
MALDI-TOF MS를 이용하여 절단효소 증폭반응의 산물을 질량분석하여 실제 사람의 유전자에 돌연변이가 존재하는지 여부를 확인하였다. 우선, 절단효소 증폭반응 산물 외에 다른 불순물을 제거하기 위해 Ziptip(Millipore Corporation, USA) 을 이용하여 반응용액을 정제하였다. 반응이 완료된 용액은 0.2 M TEAA (triethylammonium acetate buffer) 용액과 1:1로 섞은 후, 50 % 아세토나이트릴 용액과 0.1 M TEAA 용액으로 세척된 Ziptip으로 수 차례 파이펫팅을 한다. 다시 Ziptip을 세척하기 위해 0.1 M TEAA 용액으로 세척한 후, 50 % 아세토나이트릴 용액으로 정제된 산물을 추출한다. 정제가 완료된 산물은 3-HPA(3-Hydroxypicolinic acid)를 50 % 아세토나이트릴 용액에 50 mg/ml로 섞은 후, 이 용액을 100 mg/ml AHC(Diammonium hydrogen citrate) 용액과 10:1로 혼합하여 제조된 매트릭스와 1:1로 섞어 MTP 384 groung steel MALDI-TOF MS 기판 위에 2 μl 를 올린 후 완전 건조시킨다. 건조된 시료를 포함하는 MALDI 기판을 Autoflex Ⅲ (Bruker Daltonics, Germany) MALDI-TOF MS 장치에 넣고 시료에 포함된 DNA 절편의 질량을 측정한다. 절단효소 증폭반응 산물의 질량이 측정되는 경우, 처음에 추출한 BRCA 유전자에 돌연변이가 있음을 확인할 수 있었다(도 6).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 첨가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (18)

  1. (a) 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)으로 증폭된 표적 유전자의 증폭산물에 대하여, 표적 유전자의 돌연변이 위치를 중심으로 5' 영역 및 3' 영역에 각각 상보적으로 결합하는 제 1 프로브 및 제 2 프로브를 사용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 리가제 반응산물에 대해, 상기 반응산물에 포함된 제 1 프로브에 상보적으로 결합하는 절단효소 증폭 프라이머, 제 2 프로브의 절단효소 인식 염기서열을 인지하는 절단 효소, 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 증폭반응에 의한 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 표적 유전자의 돌연변이 검출방법에 있어서,
    상기 제 1 프로브는 5' 말단에 상기 표적 유전자에 존재하는 돌연변이 위치와 상보적인 염기를 가지며, 3' 말단에 절단효소 증폭반응을 위한 프라이머 혼성화 염기서열을 포함하고,
    상기 제 2 프로브는 3' 말단에 표적 유전자에 존재하는 돌연변이 위치와 상보적인 염기를 가지며, 5' 말단에 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 돌연변이 검출방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 리가제 반응에 사용하는 효소는 90N 리가제, E. coli DNA 리가제, Taq DNA 리가제, T4 DNA 리가제 및 앰플리가제(Ampligase) 리가제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 절단효소는 Nb.BtsⅠ, Nt.BstNBⅠ, Nb.BbvCⅠ, Nt.BbvCⅠ, 및 Nt.AlwⅠ으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 중합효소는 Klenow DNA 중합효소, Bsu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소 및 Bst DNA 중합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 MALDI-TOF MS((Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry))를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)의 결과로 증폭된 DNA 절편과 상보적인 염기서열을 가지며, 형광물질(Fluorophore)와 소광제(Quencher)를 포함하는 분자 비콘(molecular beacon) 형태의 프로브를 이용하여 확인하는 것을 특징을 하는 돌연변이 검출방법.
  11. (a) 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)으로 증폭된 표적 유전자의 증폭산물에 대하여, 표적 유전자의 5' 영역 및 3' 영역에 각각 상보적으로 결합하는 제 1 프로브 및 제 2 프로브를 사용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 리가제 반응산물에 대해, 상기 반응산물에 포함된 제 1 프로브에 상보적으로 결합하는 절단효소 증폭 프라이머, 제 2 프로브의 절단효소 인식 염기서열을 인지하는 절단 효소 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 증폭반응에 의한 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 존재를 확인하는 단계는 방법을 포함하는 표적 유전자의 검출방법에 있어서,
    상기 제 1 프로브는 3' 말단에 절단효소 증폭반응을 위한 프라이머 혼성화 염기서열을 포함하고,
    상기 제 2 프로브는 5' 말단에 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제11항에 있어서, 상기 (a) 단계의 리가제 반응에 사용하는 효소는 90N 리가제, E. coli DNA 리가제, Taq DNA 리가제, T4 DNA 리가제 및 앰플리가제(Ampligase) 리가제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 (b) 단계의 절단효소는 Nb.BtsⅠ, Nb.BtsⅠ Nt.BstNBⅠ, Nb.BbvCⅠ, Nt.BbvCⅠ, 및 Nt.AlwⅠ으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 (b) 단계의 중합효소는 Klenow DNA 중합효소, Bsu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소 및 Bst DNA 중합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 MALDI-TOF MS((Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry)를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)의 결과로 증폭된 DNA 절편과 상보적인 염기서열을 가지며, 형광물질(Fluorophore)와 소광제(Quencher)를 포함하는 분자 비콘(molecular beacon) 형태의 프로브를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
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KR102138183B1 (ko) * 2019-04-23 2020-07-28 한국과학기술원 미세액적 기반의 nesba 테크닉을 이용하여 표적 rna를 진단하는 방법
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090081670A1 (en) * 2007-07-14 2009-03-26 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7014994B1 (en) * 1999-03-19 2006-03-21 Cornell Research Foundation,Inc. Coupled polymerase chain reaction-restriction-endonuclease digestion-ligase detection reaction process

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090081670A1 (en) * 2007-07-14 2009-03-26 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Analytical Biochemistry, Vol. 237, Article No. 0225, pp.174-181 (1996) *
Analytical Biochemistry, Vol. 237, Article No. 0225, pp.174-181 (1996)*

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