CN108456716A - 用于检测靶基因突变体变异的方法、组合物和试剂盒 - Google Patents
用于检测靶基因突变体变异的方法、组合物和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108456716A CN108456716A CN201810128026.2A CN201810128026A CN108456716A CN 108456716 A CN108456716 A CN 108456716A CN 201810128026 A CN201810128026 A CN 201810128026A CN 108456716 A CN108456716 A CN 108456716A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tss
- target
- sequence
- mutant
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了用于检测含有过量野生型核酸的样品中靶核酸的稀有变化、突变或多态性的方法、组合物和试剂盒,本发明使用通用PCR引物和通用检测序列扩增和检测不同靶序列,从而可以在单管反应中检测多个靶序列中的任何靶序列的存在并且定量多个靶序列的总量,本发明用于检测稀有突变体的方法具有高特异性和选择性,可容易地针对不同靶序列进行优化,并且可以适应复用自动化,本发明还公开了用于检测靶基因/染色体的拷贝数变异的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年2月19日提交的美国临时专利申请第62/460,806号 和2018年2月4日提交的美国专利申请第15/888,042号的权益,所述临时专利 和专利申请的内容以参考的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及分子诊断学领域中的方法和技术,特别是涉及用于检测含有过量 野生型序列的样品中靶核酸的稀有突变体变异的方法、组合物和试剂盒。使用通 用PCR引物和通用检测序列,本发明提供一种用于在单管反应中同时检测多达数 千个靶序列的方法。
背景技术
本发明涉及用于检测含有过量野生型核酸的样品中靶核酸的稀有改变、突变 或多态性的方法、组合物和试剂盒。本发明使用通用PCR引物进行扩增,并使用 通用检测序列来检测不同的靶序列,从而可以检测多个靶序列中的任意靶序列的 存在并且在单管反应中定量多个靶序列的总量。本发明用于检测稀有突变体的方 法具有高特异性和选择性,可容易地针对不同靶序列进行优化,并且可以适应复 用自动化。
核酸的许多突变体变异(例如单核苷酸多态性(SNPs)、插入/缺失、基因融合、 具有改变的甲基化模式的变异和拷贝数变异)与遗传性疾病、疾病的易感性、耐 药性的倾向性以及疾病的进展有关,这些突变体变异可以被用作用于疾病的诊断、 预测和治疗的重要生物标志物。因此,用于有效检测突变体变异的方法和技术在 临床应用(包括诊断早期疾病、检测产前遗传性疾病、作出预后预测和设计有效 的治疗模式)中发挥越来越重要的作用。在许多情况下,要求在野生型序列或替 代变异的高背景下检测和定量稀有疾病相关的突变体变异。例如,一些低丰度体 细胞突变被证明与癌症预后和治疗效果有关,并且在母体DNA的背景中对小部分 的胎儿DNA的测定对于产前遗传性疾病的检测是必不可少的。对于循环无细胞 DNA样品中的体细胞突变或胎儿DNA的检测要求具有高灵敏度和特异度的方法。
尽管在临床应用中有很大的潜力,但对在过量野生型序列或替代变异存在下 以高特异性和准确性检测稀有突变体带来了巨大的技术挑战。野生型序列的量常 常比生物样品中的稀有突变体变异的量高100倍以上,从而导致对轻微突变体的 检测受到很大抑制。检测方法可能不具备足够的灵敏度以便对轻微突变体进行检 测。包括连接、杂交、野生型阻断剂、DNA聚合酶或核酸酶在内的各种方法已试 图克服所述问题。另外,临床样品中的起始物受到限制(例如,5-20ng的总DNA) 并且需要进行多次诊断测试,这对测试方法的高灵敏度和特异度提出了严格要求。
等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)是一种广泛应用的用于选择性地扩 增和检测突变体变异的方法(Wu DY,Ugozzoli L,Pal BK,Wallace RB,Proc Natl Acad SciUSA 1989;86:2757-2760;Chen X和Sullivan PF,The Pharmacogeonomics Journal 2003;3:77-96)。AS-PCR利用与突变等位基因的靶 多态位点为互补的等位基因特异性PCR引物来选择性地扩增突变体变异。AS-PCR 的选择性和特异性主要是取决于DNA聚合酶的保真性,所述DNA聚合酶在具有错 配的3'末端的情况下以比具有匹配的3'末端的情况低得多的效率使引物延伸。 然而,指数式PCR扩增使得此辨别力快速衰减并且经常发生明显的错配扩增。此 方法的鉴别能力也受到野生型与突变等位基因的比率及在多态性碱基附近的序 列的影响。
可以通过LigAmp测定来检测单核苷酸突变,所述LigAmp测定是基于DNA 连接酶的序列特异性来辨别在连接位点处的匹配DNA双链体与错配DNA双链体 (Shi C等人.NatMethods.2004年11月;1(2):141-7和美国专利第8,679,788 号)。在LigAmp测定中,两个寡核苷酸相邻地杂交到DNA模板。只有当感兴趣的 突变体变异存在时,可以将寡核苷酸连接到一起并通过实时聚合酶链反应(PCR) 进行检测。这是用于检测单核苷酸突变的敏感方法。然而,所述方法取决于DNA 连接酶的序列特异性,并且非特异性寡核苷酸连接会导致假阳性检测。
另一个方法利用匹配DNA双链体和错配DNA双链体的杂交强度的差异来选择 性地扩增突变等位基因的扩增子(美国专利出版物第2004/0091905号、第 2015/0315636号)。此方法利用与野生型等位基因的多态性区域的序列为完全互 补但不与突变等位基因为互补的野生型阻断探针来选择性地阻止野生型等位基 因的扩增子的扩增,并且利用突变等位基因特异性报告基因来检测突变等位基因 的扩增子。此方法的应用要求野生型等位基因和突变等位基因的多态性序列是已 知的,并且要求对各突变等位基因的显著优化。
然而,这些方法并非是理想的。突变等位基因的扩增子的制作使用用于各等 位基因的独特引物,并且取决于使用等位基因特异性引物的指数式扩增。突变体 扩增子的检测也取决于等位基因特异性报告探针。因此,突变等位基因的检测需 要对各等位基因进行显著优化。对用于各等位基因的特定PCR引物和检测探针的 要求增加了各测定的成本并且导致难以制定复用测定,因为用于不同引物和检测 探针的条件不太可能被同时优化。当突变等位基因的量为非常低时,由于指数式 扩增所导致的误差变得更加明显并导致假阳性结果。因此,急需开发出可以敏感 且准确地检测和定量感兴趣的稀有突变体、并且可以容易地优化不同靶序列的复 用检测且可以自动检测大量样品的可靠稳定的技术。本发明满足了此需求并且也 提供其他益处。
发明内容
本发明提供一种用于检测含有过量野生型序列的样品中靶基因的稀有突变 体变异的方法。使用通用PCR引物和通用检测序列,本发明提供一种用于在单管 反应中同时检测多达数千个靶序列的方法。不同于利用突变体特异性探针来扩增 并检测突变体特异性产物的大部分突变体检测方法,本发明将突变体鉴别反应从 通用扩增与检测反应中分离出来。本发明首次使用突变体变异而不是野生型序列 作为模板并利用突变体捕获探针来产生耐外切核酸酶的突变体特异性连接产物, 并且利用外切核酸酶消化去除外切核酸酶敏感核酸。本发明然后将通用PCR引物 用于扩增,并且将通用检测机制用于对突变体特异性连接产物的检测。此方法利 用野生型阻断探针来阻止以野生型序列作为模板的耐外切核酸酶的DNA产物的 产生,从而进一步提高产生耐外切核酸酶的突变体特异性产物的特异性和选择性。 此特征对于低频突变体变异的选择性扩增(例如,<1%的总靶基因群)是特别重要 的。外切核酸酶清除步骤对于建立具有很小的背景噪声和干扰的稳定高效检测方 法而言是必不可少的。此方法还提供用于在对突变体特异性连接产物实施PCR 扩增和检测之前对突变体特异性连接产物进行线性扩增的手段。此方法还提供一 种用于选择性地扩增具有未知突变体的突变体变异的方法。
此方法的一个显著特征是在单个反应中利用一对通用PCR引物和一个通用 检测探针对多个靶序列进行检测。为了检测不同的突变体变异或靶基因,只需对 捕获探针的靶特异性部分进行定制,同时对于不同的捕获探针而言通用引物识别 与通用检测部分可以保持不变。在此方法中,可以在类似的条件下对相同基因的 不同突变体和不同基因的突变体进行扩增和检测,从而实现检测过程的简单优化 和自动化以及不同靶序列的测量变异的显著减小。也可以将各突变体特异性探针 或各组的突变体特异性探针连结到不同的检测探针(例如不同的荧光染料),从而 提供用于不同靶序列的复用检测的方法。尽管此方法具有对靶基因的突变体变异 进行检测的特征,但也可以应用于检测任何靶序列是否为突变体或野生型序列。 通过使用不同的靶特异性序列同时使用相同的通用PCR引物和通用检测序列,此 方法可以用于检测多个靶序列中的任一靶序列的存在或者定量核酸样品中多个 靶序列的总量,这显著节省了样品使用、人力和成本。例如,此方法可以用于同 时检测与单个疾病相关的多个基因突变中的任何基因突变的存在。此方法可以用 于检测靶染色体中数百或数千个基因位点的量以便判定拷贝数变异。
一种用于检测核酸样品中的靶序列的方法,包括以下步骤:
(a)提供含有靶特异性部分和通用引物结合与通用检测部分的靶捕获探针;
(b)从下列中选择靶捕获探针:
(i)一条多核苷酸单链,所述单链从5'到3'末端依次包括5'-靶特异性 序列(5'-TSS)、正向通用引物结合序列(正向UPBS)、可断裂位点、反向通 用引物结合序列(反向UPBS)和3'-靶特异性序列(3'-TSS),并且具有插入 正向UPBS和5'-TSS之间或者反向UPBS与3'-TSS之间的通用检测序列; 或者
(ii)两条多核苷酸单链,包括包含耐外切核酸酶的5'末端、反向UPBS 和在3'末端的3'-TSS的第一多核苷酸链,以及包含在5'末端的5'-TSS、正 向UPBS和耐外切核酸酶的3'末端的第二多核苷酸链,并且具有插入正向 UPBS与5'-TSS之间或者反向UPBS与3'-TSS之间的通用检测序列;
(c)在其中靶捕获探针的3'-TSS和5'-TSS退火到样品中的靶序列而形成双 链体核酸的条件下,使靶捕获探针与核酸样品接触;
(d)执行靶选择性连接,其中使用靶序列作为模板将靶捕获探针的3'-TSS 与5'-TSS加以连接而形成线性或环状耐外切核酸酶的靶特异性连接产物;
(e)任选地,利用外切核酸酶来消化敏感的核酸,酶消化后,失活外切核酸 酶并且/或者纯化耐外切核酸酶的靶特异性连接产物;
(f)在可断裂位点使环状耐外切核酸酶的靶特异性连接产物(如果存在)断 裂,从而获得线性靶特异性连接产物;
(g)通过使用识别通用引物结合序列或其互补序列的通用PCR引物的聚合酶 链反应(PCR),而扩增线性靶特异性连接产物或线性耐外切核酸酶的靶特异性连 接产物;以及
(h)利用识别通用检测序列或其互补序列的序列特异性报告探针检测或定量 线性靶特异性连接产物或线性耐外切核酸酶的靶特异性连接产物,作为靶序列的 测量。
靶捕获探针可以是一条多核苷酸单链或两条多核苷酸单链,这些多核苷酸单 链被设计成选择性地使用靶序列作为模板而产生耐外切核酸酶的靶特异性连接 产物。然后对耐外切核酸酶的靶特异性连接产物进行分离和纯化,同时利用外切 核酸酶对其他核酸(包括未连接的靶捕获探针、来自核酸样品的单链和双链DNA 序列和非特异性连接产物)进行消化。此方法中所使用的外切核酸酶可以是单个 酶或多个酶,应当具有3'->5'和5'->3'外切核酸酶活性,并且可以同时消化 ssDNA和dsDNA。正向UPBS和反向UPBS是通用引物结合序列,所述序列可以用 于不同靶捕获探针,以用于不同靶序列的PCR扩增。PCR引物被设计成使得PCR 扩增子包括连接的3'-TSS和5'-TSS。可断裂位点包括对光、酶或化学裂解敏感的且用于将环状靶特异性连接产物转换成线性靶特异性连接产物的化学基团。通 用检测序列是可以与序列特异性报告探针杂交以便生成可检测信号的预定序列。 报告探针可以是,例如,探针(赛默飞世尔科技公司,沃尔瑟姆市,马萨 诸塞洲)、报告探针(西格玛奥德里奇公司,圣路易斯,密苏里州)或者 分子信标探针。
在一些实施方式中,靶捕获探针用于捕获靶基因的突变体变异,因此被称为 突变体捕获探针。突变体捕获探针用于捕获突变序列并且在上述方法的步骤(d) 中形成突变体特异性连接产物。突变体捕获探针选择性地捕获靶基因的野生型序 列中的突变体变异,从而可以在过量野生型序列的存在下对稀有突变等位基因进 行检测。
在一些实施方式中,所述方法还包括多次重复步骤(c)和(d)以实现突变体特 异性连接产物的线性扩增。基于在样品中突变体变异的丰度,步骤可重复1-100 次。在理想的情况下,一个突变体特异性连接产物对应于样品中的突变体变异的 一个拷贝。此线性扩增可以提高低频突变体变异的检测灵敏度和检测限。
在一些实施方式中,线性突变体特异性连接产物或线性耐外切核酸酶的突变 体特异性连接产物的扩增与检测同时发生。
在一些实施方式中,在步骤(c)中加入与突变体变异中突变区域的野生型对 应区域的序列为互补的阻断探针,并且阻断探针阻断以野生型序列作为模板的耐 外切核酸酶的连接产物的形成。使用阻断探针可以大幅地减少基于野生型序列的 连接产物的产生,因此大幅地降低假阳性的发生和背景噪声,并且提高检测灵敏 度和特异度。
在一些实施方式中,突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS退火到靶基因的突 变序列处或与之靠近的位点。在一些实施方式中,突变体捕获探针的3'-TSS和/ 或5'-TSS包括与一部分的突变序列为互补的序列。在一些实施方式中,突变体 捕获探针的3'-TSS含有在其3'末端的突变核苷酸,并且/或者突变体捕获探针 的5'-TSS含有在其5'末端的突变核苷酸。
在一些实施方式中,利用包括不同靶特异性序列和相同引物结合序列和相同 检测序列的多个突变体捕获探针检测靶基因的多个突变体变异的存在。多个突变 体捕获探针可包括与相同靶基因的不同突变体变异为互补的靶特异性序列。多个 突变体捕获探针可包括与不同靶基因的突变体变异为互补的靶特异性序列。在一 些实施方式中,将多个突变体捕获探针分为多组,其中各组的成员具有不同的靶 特异性序列,共有对于所述组为特异性的通用检测序列,并且在不同组的所有成 员中共有相同的通用引物结合序列。
在一些实施方式中,突变体捕获探针的3'-TSS含有在其3'末端的突变核苷 酸,并且/或者突变体捕获探针的5'-TSS含有在其5'末端的突变核苷酸。在一 些实施方式中,突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS相邻地退火到突变体变异的 突变区域;并且耐外切核酸酶的突变体特异性连接产物是通过由突变体捕获探针 和突变序列所构成的双链体中的3'-TSS与5'-TSS的直接连接而形成。
在一些实施方式中,突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS退火到靶基因从而 在突变核苷酸的位点处形成具有单核苷酸缺口的DNA双链体。耐外切核酸酶的突 变体特异性连接产物是通过利用DNA聚合酶使具有与突变核苷酸为互补的核苷 酸的3'-TSS延伸并随后利用DNA连接将延伸的3'-TSS与5'-TSS加以连接(单核 苷酸延伸(SNE)和连接)而形成。DNA聚合酶优选地为缺乏5'->3'外切核酸酶活性 且不表达链置换活性的热稳定DNA聚合酶。在一些实施方式中,在延伸反应期间 仅提供一种类型的匹配核苷酸。在一些实施方式中,在延伸反应期间提供所有四 种类型的核苷酸和野生型阻断探针。
在一些实施方式中,突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS退火到靶基因而形 成具有与突变位点重叠的多核苷酸缺口的DNA双链体,并且耐外切核酸酶的突变 体特异性连接产物是通过利用DNA聚合酶从3'-TSS的3'末端开始的多核苷酸延 伸(PNE)和随后利用DNA连接将延伸的3'-TSS与5'-TSS加以连接而形成。
在一些实施方式中,3'-TSS的3'末端与突变核苷酸为互补,并且DNA聚合 酶仅可以使用突变体变异作为模板而仅使3'-TSS的3'末端延伸。优选地,DNA 聚合酶是缺乏3'->5'和5'->3'外切核酸酶活性且不表达链置换活性的热稳定 DNA聚合酶。
在一些实施方式中,突变区域的位点是已知的但突变核苷酸的具体序列是未 知的。突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS被设计成与突变区域的上游和下游的 区域为互补。并且3'-TSS和5'-TSS退火到靶基因而形成具有与突变位点重叠的 多核苷酸缺口的DNA双链体。在步骤(c)中加入与突变区域的野生型对应区域为 互补的不可延伸的阻断探针,其中所述不可延伸的阻断探针阻止3'-TSS和/或 5'-TSS退火到野生型序列和/或使用野生型序列作为模板利用DNA聚合酶的 3'-TSS的延伸。阻断探针被选择为与野生型基因的互补序列具有高结合强度以 及当把假想突变体导入互补序列时结合强度的显著损失。在一些实施方式中,不 可延伸的阻断探针的序列与3'-TSS和/或5'-TSS重叠。在一些实施方式中,不可延伸的阻断探针包括修饰核苷酸。修饰核苷酸可以是肽核酸、锁核酸或者连结 到小沟结合物的核苷酸。
在一些实施方式中,此方法用于检测与野生型序列相比时具有突变(例如核 苷酸置换、缺失、插入、基因融合或者其任意组合)的突变体变异。
在一些实施方式中,核酸样品是RNA样品。3'-TSS和5'-TSS退火到靶RNA 而形成RNA-DNA双链体。为了将RNA-DNA双链体中的DNA链加以连接,可以利用 例如可以将在DNA-RNA双链体中的相邻DNA链加以连接的T4DNA连接酶来执行 以RNA作为模板的DNA连接(美国专利出版物第20100184618号;Nilsson M等 人.Nucleic acids Res.2001,29(2):578-581)。在一些实施方式中,利用逆 转录酶使以RNA为模板的3'-TSS延伸。然后,将延伸产物加以连接从而利用以 RNA作为模板的DNA连接而形成耐外切核酸酶的突变体特异性连接产物。在一些 实施方式中,核酸样品是RNA样品,所述RNA样品首先被转换成cDNA样品,然 后实施如本文中所描述的相同方法。
在一些实施方式中,所述方法用于检测靶基因的甲基化。靶基因的未甲基化 和甲基化形式分别被看作是野生型和突变基因。通过将所有非甲基化胞嘧啶转换 成尿嘧啶并且保持甲基化胞嘧啶作为胞嘧啶不变,而对靶基因进行修饰。可以通 过假定U->C突变在经修饰靶基因中的假定甲基化位点的存在,对靶基因的甲基 化进行检测。
在一些实施方式中,所述方法用于检测具有第一基因部分、融合位点和第二 基因部分的基因融合突变体。在一些实施方式中,突变体捕获探针的3'-TSS与 第一基因的区域为互补,并且突变体捕获探针的5'-TSS与第二基因的区域为互 补。在一些实施方式中,3'-TSS包括与具有第一和第二基因的部分的区域为互 补的序列,并且5'-TSS包括与第二基因的区域为互补的序列。在一些实施方式 中,3'-TSS包括与第一基因的区域为互补的序列,并且5'-TSS包括与具有第一 和第二基因的部分的区域为互补的序列。在一些实施方式中,3'-TSS和5'-TSS 相邻地退火到基因融合突变体。在一些实施方式中,3'-TSS和5'-TSS退火到基 因融合突变体而形成具有单核苷酸或多核苷酸缺口的双链体。此外,在步骤(c) 中加入与包括基因融合位点的野生型序列为互补的阻断探针。
在一些实施方式中,基因融合突变体具有已知的第一基因部分、已知的融合 位点和未知的第二基因部分。为了检测具有未知融合序列的融合突变体,首先将 样品中的核酸连结到在两个末端或5'末端的预定的序列标签。突变体捕获探针 的3'-TSS被设计成包括与第一基因中的融合位点的上游区域为互补的序列, 5'-TSS被设计成包括与5'序列标签为互补的序列,并且在步骤(c)中加入与包括 基因融合位点的野生型序列为互补的阻断探针,这可以基于融合突变体而选择性 地形成突变体特异性连接产物。使用通用PCR引物和通用检测序列,此方法可以 选择性扩增并同时检测具有特定融合连接的所有未知融合突变体。
在一些实施方式中,所述方法用于检测靶基因的野生型序列。使用野生型靶 序列作为模板通过连接或延伸连接将靶捕获探针的3'-TSS与5'-TSS加以连接而 形成线性或环状耐外切核酸酶的靶特异性连接产物,所述野生型靶序列可以利用 通用PCR引物和通用检测序列进行扩增和检测。在一些实施方式中,将包括具有 相同通用引物结合序列和相同通用检测序列的不同靶特异性序列的多个靶捕获 探针用于同时检测多个靶序列。
在一些实施方式中,所述方法用于通过对靶基因/染色体中的多个基因位点 的总拷贝数与内参基因/染色体的总拷贝数进行比较,而对靶基因/染色体的拷贝 数变异进行检测。所述方法使用两组靶捕获探针,包括具有与靶基因/染色体中 的不同基因位点的序列为互补的3'-TSS和5'-TSS的第一组以及具有与内参基因 /染色体中的不同基因位点的序列为互补的3'-TSS和5'-TSS的第二组。这两组 共有相同的引物结合序列,但具有不同的检测序列。靶基因/染色体中的不同基 因位点与内参基因/染色体的总拷贝数的比率用于判定拷贝数变异的存在。
在一些实施方式中,此方法可以用于检测不同样品中相同基因的拷贝数变异。 在此情况下,靶捕获探针具有相同的靶特异性部分并且将不同检测序列用于不同 样品。一旦利用具有不同检测序列的靶捕获探针单独地捕获用于不同样品的靶特 异性连接产物,则将它们合并到一起并且可以利用各自的序列特异性报告探针检 测不同样品的基因拷贝数。
在一些实施方式中,本发明提供一种用于检测含有过量野生型序列的核酸样 品中靶基因的突变体变异的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)含有靶特异性部分和通用引物结合与通用检测部分的突变体捕获探针, 所述突变体捕获探针包括:
(i)一条多核苷酸单链,所述单链从5'到3'末端依次包括5'-靶特异性 序列(5'-TSS)、正向通用引物结合序列(正向UPBS)、可断裂位点、反向通 用引物结合序列(反向UPBS)和3'-靶特异性序列(3'-TSS),并且具有插入正 向UPBS与5'-TSS之间或者反向UPBS与3'-TSS之间的通用检测序列,或者
(ii)两条多核苷酸单链,包括包含耐外切核酸酶的5'末端、反向UPBS 和在3'末端的3'-TSS第一多核苷酸链,以及包含在5'末端的5'-TSS、正 向UPBS和耐外切核酸酶的3'末端的第二多核苷酸链,并且具有插入正向 UPBS与5'-TSS之间或者反向UPBS与3'-TSS之间的通用检测序列;
(b)DNA连接酶;
(c)识别通用检测序列的序列特异性报告探针;
(d)外切核酸酶;
(e)任选地DNA聚合酶;以及
(f)说明手册。
在一些实施方式中,3'-TSS含有在其3'末端的突变核苷酸,并且/或者 5'-TSS含有在其5'末端的突变核苷酸,并且3'-TSS和5'-TSS相邻地退火到突 变体变异的突变区域。
在一些实施方式中,3'-TSS和5'-TSS退火到靶基因而形成具有单核苷酸缺 口的NA双链体,其中所述单核苷酸缺口位于突变核苷酸的位点处。
在一些实施方式中,3'-TSS和5'-TSS退火到靶基因而形成具有多核苷酸的 DNA双链体,其中所述多核苷酸缺口与突变区域重叠。
在一些实施方式中,试剂盒还包括与突变体变异中突变区域的野生型对应区 域的序列为互补的不可延伸的阻断探针。
在一些实施方式中,试剂盒包括多个突变体捕获探针,各突变体捕获探针具 有与靠近或在突变区域处的各自靶基因序列的区域为互补的一对靶特异性序列, 并且其中所有突变体捕获探针具有相同的正向UPBS和反向UPBS和相同的检测序 列。在一些实施方式中,试剂盒包括多个突变体捕获探针,这些突变体捕获探针 包括与相同靶基因的不同突变体变异的序列为互补的靶特异性序列。在一些实施 方式中,试剂盒包括多个突变体捕获探针,这些突变体捕获探针包括与不同靶基 因的突变提变异的序列为互补的靶特异性序列。在一些实施方式中,试剂盒包括 不同组的突变体捕获探针,各组具有耦合到不同检测信号的不同检测序列。
在试剂盒的一些实施方式中,外切核酸酶包括具备5'->3'和3'->5'外切核 酸酶活性且可以消化ssDNA和dsDNA的一种或多种酶。
在一些实施方式中,DNA聚合酶缺乏5'->3'外切核酸酶活性并且不表达链置 换活性。
在一些实施方式中,本发明提供一种用于检测和定量核酸样品中的靶基因的 试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)含有靶特异性部分和通用引物结合与通用检测部分的靶捕获探针,所述 靶捕获探针包括:
(i)一条多核苷酸单链,所述单链从5'到3'末端依次包括5'-TSS、正 向UPBS、可断裂位点、反向UPBS和3'-TSS,并且具有插入正向UPBS与5'-TSS 之间或者反向UPBS与3'-TSS之间的通用检测序列;或者
(ii)两条多核苷酸单链,包括包含耐外切核酸酶的5'末端、反向UPBS 和在3'末端的3'-TSS的第一多核苷酸链,以及包含在5'末端的5'-TSS、 正向UPBS和耐外切核酸酶的3'末端的第二多核苷酸链,并且具有插入正向 UPBS与5'-TSS之间或者反向UPBS与3'-TSS之间的通用检测序列;
(b)DNA连接酶;
(c)对于检测序列为特异性的报告探针;
(d)外切核酸酶;
(e)任选地DNA聚合酶;以及
(f)说明手册。
在一些实施方式中,试剂盒提供多个靶捕获探针,各靶捕获探针具有对于各 自的靶基因序列的区域为互补的一对靶特异性序列,并且所有靶捕获探针具有相 同的正向UPBS和反向UPBS和相同的检测序列。在一些实施方式中,多个靶捕获 探针包括与靶基因或靶染色体的不同区域为互补的靶特异性序列。在一些实施方 式中,将多个靶捕获探针分为多组,各组具有耦合到不同检测信号的不同检测序 列。在一些实施方式中,将靶捕获探针分为对于靶基因/染色体中的多个基因位 点为特异性的第一组以及对于内参基因/染色体中的多个基因位点为特异性的第 二组。试剂盒可以用于检测与内参基因/染色体相比的靶基因/染色体的拷贝数变 异。
附图说明
图1示出了两种类型的靶捕获探针的结构。
A示出了包括一条多核苷酸单链的靶捕获探针。B示出了包括两条多核苷酸 单链的靶捕获探针。
其中,3'-TSS是指3'-靶特异性序列,5'-TSS是指5'-靶特异性序列。
图2示出了利用一条多核苷酸单链的突变体捕获探针检测突变体变异的工 流程作图。
其中,3'-TSS是指3'-靶特异性序列,5'-TSS是指5'-靶特异性序列。
图3示出了利用两条多核苷酸单链的突变体捕获探针检测突变体变异的工 作流程图。
其中,3'-TSS是指3'-靶特异性序列,5'-TSS是指5'-靶特异性序列。
图4示出了使用突变体变异作为模板并利用突变体选择性连接而制作耐外 切核酸酶的突变体特异性连接产物的工作流程图。
A示出了通过直接连接的选择。B示出了通过单核苷酸延伸(SNE)和连接的选 择。
其中,3'-TSS是指3'-靶特异性序列,5'-TSS是指5'-靶特异性序列。
图5示出了使用突变体变异作为模板并利用突变体选择性连接而制作耐外 切核酸酶的突变体特异性连接产物的工作流程图。
A示出了通过使用突变体特异性多核苷酸延伸(PNE)和连接的选择。B示出了 通过使用野生型阻断探针的选择。
其中,3'-TSS是指3'-靶特异性序列,5'-TSS是指5'-靶特异性序列。
图6示出了基于PCR的用于制作捕获探针的流程图。
其中,3'-TSS是指3'-靶特异性序列,5'-TSS是指5'-靶特异性序列,NE1 指限制性核酸内切酶限制位点1,NE2是指限制性核酸内切酶限制位点2,NE3 为限制性核酸内切酶限制位点3,UUU是指三个连续的尿嘧啶核苷酸,TSS是指 靶特异性序列(包括3’-和5’-靶特异性序列),ssDNA是指单链DNA,dsDNA 是指双链DNA。
图7示出了用于制作捕获探针的延伸连接的流程图。
其中,NE1指限制性核酸内切酶限制位点1,NE2是指限制性核酸内切酶限 制位点2,NE3为限制性核酸内切酶限制位点3,UUU是指三个连续的尿嘧啶核苷 酸,TSS是指靶特异性序列(包括3’-和5’-靶特异性序列),dsDNA是指双 链DNA。
具体实施方式
定义:除非另有定义,本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所 属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。
用来描述本发明的术语“一个”和“一种和“所述”应当被解释为同时包括 单数和复数,除非另有说明或者上下文中清楚地指出。类似地,用于描述本发明 的复数术语(例如核酸、核苷酸和DNA),也应当被解释成同时包括单数和复数, 除非另有说明或者上下文中清楚地指出。
本文中所使用的术语“核酸样品”是指从任何来源获得的DNA或RNA序列的 群体。例如,核酸样品可从细胞、组织、器官、任何其他生物和环境来源制备。 具体地,核酸样品可由患者的组织、体液或细胞样品(如尿液、淋巴液、脊髓液、 滑液、血清、血浆、唾液、皮肤、粪便、痰、血细胞)、肿瘤细胞/组织、器官以 及可以用于分子诊断和预诊目的的体外细胞培养成分的样品而制备。核酸样品可 包括循环无细胞DNA、基因组序列、亚基因组序列、染色体序列、PCR产物、cDNA 序列、smRNA序列、rRNA序列、mRNA序列或者全转录组序列。DNA或RNA序列可 以连结到在一个或两个末端处的预选的序列标签。序列标签是与核酸样品中的所 有序列为非互补的预定序列。
本文中所使用的术语“靶基因”是指使用者特别感兴趣的DNA或RNA的区域 或位点,例如其与疾病或耐药性有关。靶基因可以是蛋白质的DNA编码区域、基 因的调控区以及mRNA、smRNA、miRNA或rRNA的区域。就核酸序列而言,靶基因 通常具有各种形式。在人群中最常见和普遍的形式是“野生型序列”或“野生型 基因”。具有相对于野生型序列的突变的其他形式被看作是“突变体变异”。突 变包括,例如,核苷酸置换、插入、缺失、基因融合及其任意组合。其中在突变 体变异与野生型序列之间出现序列差异的位置是突变区域。本文中所使用的突变 区域是指包括核苷酸置换、插入、缺失和基因融合的实际位点的序列的连续部分。 与野生型序列相比,突变体变异可以具有一个以上的突变区域。
本文中所使用的术语“靶捕获探针”是指包括靶特异性部分和通用引物结合 与通用检测部分的ssDNA或dsDNA探针,所述探针可以用于退火到靶序列并且选 择性地制作可以由通用引物结合序列和通用检测序列扩增和检测的耐外切核酸 酶的靶特异性连接产物。在一些实施方式中,靶捕获探针包括一条多核苷酸单链, 所述多核苷酸单链从5'到3'末端依次包括5'-靶特异性序列(5'-TSS)、正向通 用引物结合序列(正向UPBS)、可断裂位点、反向通用引物结合序列(反向UPBS) 和3'-靶特异性序列(3'-TSS),并且具有插入正向UPBS与5'-TSS之间或者反向 UPBS与3'-TSS之间的通用检测序列。在一些实施方式中,靶捕获肽具有两条多 核苷酸单链,这两条多核苷酸单链包括包含耐外切核酸酶的5'末端、反向UPBS 和在3'末端的3'-TSS的第一多核苷酸链,以及包括5'-TSS、正向UPBS和耐外 切核酸酶的3'末端的第二多核苷酸链,并且具有插入正向UPBS与5'-TSS之间 或者反向UPBS与3'-TSS之间的通用检测序列。靶捕获探针的5'-TSS和3'-TSS 退火到靶序列的相同的链,并且仅当靶序列存在于样品中时可以通过直接连接或 延伸/连接而加以连接而形成耐外切核酸酶的连接产物。
靶捕获探针可以用于捕获可以利用相同的引物序列进行扩增并且利用相同 的检测序列进行检测的多个靶序列。
本文中所使用的术语“突变体捕获探针”是指靶捕获探针,所述靶捕获探针 可以用于退火到靶基因的突变体变异并且选择性地使用突变体变异作为模板而 制作耐外切核酸酶的突变体特异性连接产物。所述突变体捕获探针优选地为单链 DNA。所述突变体捕获探针具有靶特异性部分(3'-TSS和5'-TSS)、通用引物识别 部分(正向UPBS和反向UPBS)和通用检测部分。它可以是一条可环化多核苷酸单 链或者两条多核苷酸单链,各多核苷酸单链具有一个耐外切核酸酶的末端。突变 体捕获探针的主要功能是选择性地将突变体变异的序列信息转换成耐外切核酸 酶的突变体特异性连接产物。然后,可以利用识别通用引物结合位点的PCR引物 对突变体特异性连接产物进行PCR扩增并且利用识别通用检测位点序列特异性 报告探针进行检测。在一些实施方式中,突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS 包括杂交到与突变区域重叠或靠近突变区域的靶基因的一个区域的序列。在一些 实施方式中,3'-TSS和/或5'-TSS包括一部分的突变序列,并且特定地杂交到 突变体变异。在一些实施方式中,与野生型序列为互补的阻断探针用于阻止以所 述野生型序列作为模板的耐外切核酸酶的DNA产物的形成,从而允许耐外切核酸 酶的突变体特异性连接产物的选择性形成。
本文中所使用的术语“靶特异性序列(TSS)”是指与靶序列的一个独特区域 为互补的序列。靶特异性序列的长度应当足以使TSS特定地杂交到靶序列中的互 补序列。所述长度可以是,例如,10至40个核苷酸、优选地15-30个核苷酸、 最优选地18-25个核苷酸。突变体捕获探针具有分别位于探针的3'和5'末端的 3'-TSS和5'-TSS。突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS退火到与突变区域重叠 或靠近突变区域的靶基因的区域。在一些实施方式中,3'-TSS和/或5'-TSS包 括与允许突变体捕获探针选择性退火到突变体变异的突变序列的一部分为互补 的序列。例如,3'-TSS和/或5'-TSS可具有与突变核苷酸匹配的末端核苷酸。 在一些实施方式中,3'-TSS和5'-TSS相邻地退火到突变体变异的突变区域。在 一些实施方式中,3'-TSS和5'-TSS退火到靶基因而形成具有单核苷酸或多核苷 酸缺口的核酸双链体,其中单核苷酸或多核苷酸缺口占据突变区域的位点。在一 些实施方式中,靶捕获探针具有退火到靶基因的野生型序列的所选区域的 3'-TSS和5'-TSS。靶捕获探针用于检测野生型靶序列的存在。在一些实施方式 中,靶特异性序列包括与样品中靶序列预定序列标签为互补的序列。
本文中所使用的术语“通用引物结合序列”是指与核酸样品中的所有序列为 非互补并且用于PCR引物结合目的的预定序列。PCR引物可结合到通用引物结合 序列自身或其互补序列。PCR引物被设计成使得所形成的PCR产物包括靶捕获探 针的连接的3'-TSS和5'-TSS。
本文中所使用的术语“可断裂位点”是指对光、酶或化学裂解敏感的化学基 团。可断裂位点可包括RNA序列、修饰核苷酸和/或其他非核苷酸化学基团。在 一些实施方式中,可断裂位点可包括可以被核糖核酸酶所裂解的RNA序列。在一 些实施方式中,可断裂位点包括尿嘧啶核苷酸,可以利用尿嘧啶DNA糖苷酶将所 述尿嘧啶核苷酸转换成无碱基核苷酸并且由脱嘌呤嘧啶内切核酸酶裂解。在一些 实施方式中,可断裂位点包括对化学裂解敏感的修饰核苷酸。例如,5-羟基-dCTP、5-羟基-dUTP、7-去氮-7-硝基-dATP、7-去氮-7-硝基-dGTP是经过KMnO4和吡咯 烷处理的化学裂解的修饰核苷酸(Wolf JL等人.Proc Natl AcadSci USA.,2002,99(17):11073-8)。在一些实施方式中,可断裂位点包括可以通过暴 露于紫外光而裂解的可光裂解化学基团。所述可光裂解化学基团可以是,例如, 可从集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)(珊瑚村,爱荷华州) 购得的9原子可光裂解核苷酸间隔区(PC间隔区)。PC间隔区的光裂解释放具有 5'磷酸酯的寡核苷酸。
本文中所使用的术语“耐外切核酸酶的末端”是指并入核苷酸序列的一个末 端的化学基团或修饰物,所述化学基团或修饰物导致核苷酸序列对外切核酸酶消 化具有抗性。所述化学基团或修饰物可以是修饰核苷酸类似物或与核苷酸无关的 其他化学结构。例如,可以将两个以上的磷酰胺酯和一硫代磷酸酯和/或二硫代 磷酸酯连结基并入在多核苷酸的5'或3'末端从而导致对多核苷酸外切核酸酶具 有抗性(美国专利第5256755号)。可以将反转的3'-3'或5'-5'核苷酸连结基并 入多核苷酸的一个末端,以抑制外切核酸酶的降解。也可以将其他修饰物(例如 2'-氟核苷酸、吗啉寡核苷酸、肽核酸和锁核酸)并入多核苷酸的末端以抑制外切 核酸酶降解(Iyer AK和He J.Curr Org Synth.2011,8(4):604-614)。
本文中所使用的术语“通用检测序列”是指与靶基因为非互补并且可以杂交 到序列特异性报告探针以便释放可检测信号的预定核苷酸序列。“序列特异性报 告探针”是指包括特定的核苷酸序列和报告基团的报告探针,当所述报告基团结 合到其互补序列时可以发出报告信号。优选的报告信号为荧光信号。通过耦联到 不同的荧光团,可以将不同序列特异性报告探针用于相同的反应以便对不同靶序 列进行复用检测。在5'-TSS与正向UPBS之间或者在3'-TSS与反向UPBS之间插 入通用检测序列。序列特异性报告探针被设计成杂交到通用检测序列自身或其在 互补链上的互补序列,使得仅在PCR扩增期间当合成包括连接的3'-TSS和 5'-TSS的新DNA链时生成可检测信号。例如,在5'-TSS与正向UPBS之间插入 通用检测序列,并且结合到报告探针的序列是在PCR扩增期间所合成的其在互补 链中的互补序列。在PCR扩增期间报告探针杂交到其互补序列将引发可检测信号 的释放。相同的通用检测序列可以用于不同的捕获探针,以便检测不同突变体变 异或野生型靶基因。存在许多序列特异性的报告探针,当结合到特定的序列时, 这些探针经过结构变化或由酶裂解,从而形成可以发出可检测信号的产物 (Marras SAE等人.Clinica Chimica Acta2006,363:48-60)。序列特异性报 告探针包括但不限于:5'-核酸酶探针(Holl PM等人.Proc.Natl Acad. Sci.USA,1991,88:7276-7280,和Woo THS等人.Anal.Biochem.1998, 256:132-134)、探针(Thelwell N等人.Nucl Acids Res2000, 28(19):3752-3761)和分子信标探针(Tyagi S和Kramer FR Nat.Biotechnol.1996,14:303-308,和Kostrikis LG等人.Science,1998,279:1228-1229)、 照明探针(Svanvik N等人.Anal Biochem,2000,281:26-35)和相邻探针 (Cardullo RA等人.ProcNatl Acad Sci USA,1988,85:8790-4)。
本文中所使用的术语“阻断探针”是指与靶基因的野生型序列的一个区域为 互补但与感兴趣突变体变异的相应区域不互补的核酸或修饰核酸探针。由阻断探 针和突变体变异所构成的双链体具有至少一个错配,从而导致与由阻断探针和野 生型序列所构成的双链体相比,所述双链体较不稳定。通过选择正确的退火温度, 阻断探针将选择性地杂交到野生型序列但不杂交到突变体变异。增加在完全匹配 与错配的探针靶双链体之间的杂交强度的差异的核酸的修饰对于本发明是优选 的,其包括但不限于肽核酸和锁核酸。例如,可以导入小沟结合物,以增加在完 全互补与错配的探针靶杂合物之间的稳定性差异(Kutyavin IV等人.Nucleic Acids Res.2000,28:655-61)。阻断探针特异性地结合到与突变体变异中的突 变区域相对应的野生型序列中的一个区域。阻断探针可以与突变体捕获探针的 3'-TSS和/或5'-TSS部分地重叠。阻断探针可以阻止TSS退火到野生型序列, 并且/或者使用野生型序列作为模板而抑制3'-TSS的延伸。在一些实施方式中, 阻断探针被修饰为不可延伸的,例如具有在3'末端或磷酸化3'末端的2',3'-双 脱氧核苷酸。
本文中所使用的术语“靶选择性连接”是指用于使用靶序列作为模板而选择 性地将靶捕获探针的3'-TSS与5'-TSS加以连接以形成耐外切核酸酶的靶特异性 连接产物的方法。3'-TSS和5'-TSS两者退火到靶序列的相同的链,并且仅当靶 序列存在于样品时可以通过直接连接或者延伸/连接而将3'-TSS与5'-TSS的末 端加以连接。
本文中所使用的术语“突变体选择性连接”是指用于使用突变体变异作为模 板而选择性地将突变体捕获探针的3'-TSS与5'-TSS加以连接以形成耐外切核酸 酶的突变体特异性连接产物的方法。选择性连接是通过使用突变体特异性TSS 而实现,所述突变体特异性TSS特异性地退火到突变体变异和/或野生型阻断探 针,所述野生型阻断探针基于野生型序列特异性地阻止耐外切核酸酶的产物的形 成。在一些实施方式中,3'-TSS和5'-TSS相邻地退火到突变体变异的突变区域, 并且耐外切核酸酶的突变体特异性连接产物通过3'-TSS与5'-TSS的直接连接而 形成。在一些实施方式中,3'-TSS和5'-TSS退火到靶基因以形成在突变核苷酸 的位点处具有单核苷酸缺口的DNA双链体。耐外切核酸酶的突变体特异性连接产 物通过单核苷酸延伸和连接而形成。任选地,野生型阻断探针可以用于进一步提高选择性和特异性。在一些实施方式中,3'-TSS和5'-TSS退火到靶基因以形成 具有与突变区域重叠的多核苷酸缺口的DNA双链体。就具有已知突变的突变体变 异而言,3'-TSS可以被设计成包括在3'末端的已知突变,这可以使3'-TSS特异 性地退火到突变体变异。耐外切核酸酶的突变体特异性连接产物通过DNA聚合和 连接而形成。就其中突变区域是已知的但特异性突变是未知的突变体变异而言, 3'-TSS和5'-TSS分别被设计成与突变区域的上游和下游序列为互补。基于野生 型序列并利用野生型阻断探针来阻止延伸,仅当3'-TSS退火到突变体变异时可 以利用DNA聚合酶而延伸并且进一步与5'-TSS连接以形成耐外切核酸酶的突变 特异性产物。
使用独特设计的靶捕获探针,本发明提供一种用于简便且稳定地检测核酸样 品中的靶序列的单管反应。所述方法包括以下步骤:
(a)提供含有靶特异性部分和通用引物识别与通用检测部分的靶捕获探针;
(b)从下列中选择靶捕获探针:
(i)一条多核苷酸单链,所述单链从5'到3'末端依次包括5'-TSS、正 向UPBS、可断裂位点、反向UPBS和3'-TSS,并且具有插入正向UPBS与5'-TSS 之间或者反向UPBS与3'-TSS之间的通用检测序列,或者
(ii)两条多核苷酸单链,包括包含耐外切核酸酶的5'末端、反向UPBS 和在3'末端的3'-TSS的第一多核苷酸链,以及包含在5'末端的5'-TSS、 正向UPBS和耐外切核酸酶的3'末端的第二多核苷酸链,并且具有插入正向UPBS与5'-TSS之间或者反向UPBS与3'-TSS之间的通用检测序列;
(c)在其中靶捕获探针的3'-TSS和5'-TSS退火到互补靶序列以形成双链体 核酸的条件下,使靶捕获探针与核酸样品接触;
(d)执行靶选择性连接,其中使用靶序列作为模板将靶捕获探针的3'-TSS 与5'-TSS加以连接以形成线性或环状耐外切核酸酶的靶特异性连接产物;
(e)任选地,利用外切核酸酶消化敏感的核酸,酶消化后,失活外切核酸酶 并且/或者纯化耐外切核酸酶的靶特异性连接产物;
(f)在可断裂位点处使环状耐外切核酸酶的靶特异性连接产物(如果存在) 断裂,以获得线性靶特异性连接产物;
(g)利用识别通用引物结合序列或其互补序列的通用PCR引物,通过聚合酶 链反应扩增线性靶特异性连接产物或线性耐外切核酸酶的靶特异性连接产物;以 及
(h)使用识别通用检测序列的序列特异性报告探针,检测或定量线性靶特异 性连接产物或线性耐外切核酸酶的靶特异性连接产物,作为靶序列的测量。
本发明提供一种含有靶特异性序列(TSS)、通用引物结合序列(UPBS)和通用 检测序列的独特靶捕获探针。所述方法开始于在允许捕获探针的3'-TSS和 5'-TSS退火到互补靶序列的条件下,将靶捕获探针加入到疑似含有感兴趣靶序 列的变性核酸样品中。如果靶序列存在于样品中,则通过3'-TSS和5'-TSS的靶 选择性连接将生成靶特异性连接产物。为了增加靶特异性连接产物的量,可以多 次重复变性、退火和靶选择性连接步骤,以便实现靶特异性连接产物的线性扩增。 靶捕获探针被设计成使得靶特异性连接产物耐外切核酸酶。然后,通过包括在样 品中的非连接的靶捕获探针和核酸序列的敏感核酸的外切核酸酶消化,而纯化所 述耐外切核酸酶的靶特异性连接产物。当靶捕获探针是可环化的一条多核苷酸单 链时,所形成的靶特异性连接产物为具有可断裂位点的环状形式。通过使可断裂位点断裂,可以使环状靶特异性连接产物线性化。然后,可以使用一对通用PCR 引物对线性化的靶特异性连接产物进行PCR扩增,并利用识别通用检测序列的序 列特异性报告探针进行检测或定量。可以将检测和扩增合并到PCR中,优选地为 定量PCR法。靶特异性连接产物也可以通过例如测序分析、凝胶电泳分析和质谱 分析。
本发明的一个方面是提供一种用于简便且稳定敏感地检测样品中的靶序列 的单管反应。本发明可以在一个单管中对靶序列进行选择、纯化、扩增和检测, 这大大地简化了操作过程并显著地减少了污染的机会。
本发明的另一方面是将靶鉴别反应从扩增和检测反应中分离出去。本发明利 用靶捕获探针和靶选择性连接将样品中靶序列的表征转换成靶特异性连接产物。 然后,利用通用引物结合序列和通用检测序列扩增和检测靶特异性连接产物。此 方法大大地简化了用于检测不同靶序列的优化过程,显著地减小了由于引物效率 的差异所导致的变化,允许在一个反应中对多个靶序列进行检测,并且容易适应 于复用和自动测定。
本发明的另一方面特别适用于在过量野生型序列的存在下对稀有突变体进 行检测。靶捕获探针可以被设计成是突变体捕获探针,所述突变体捕获探针包括 对于感兴趣突变体变异为特异性的3'-TSS和5'-TSS。突变体捕获探针的3'-TSS 和5'-TSS可以被设计成含有部分突变序列,或者紧邻突变位点。本发明使用阻 断探针来阻止野生型特异性连接产物的形成,并且利用线性扩增来增加突变体特 异性连接产物的量,从而进一步提高突变提变异检测的特异性和选择性。本发明 的另一方面是选择性扩增和检测具有未知突变(包括具有未知融合序列的融合突 变)的突变体变异。所述方面通过基于野生型序列利用野生型阻断探针来阻止连 接产物的形成,从而允许基于突变体变异的连接产物的选择性产生而实现。
本发明的另一方面是利用多个靶捕获探针来判定靶基因/染色体的拷贝数变 异。使用具有对于靶或内参基因/染色体中的多个基因位点为特异性的TSS区域 的靶捕获探针的各组,可以容易地确定靶和内参基因/染色体的拷贝数,其中使 用由所有探针和用于各组探针的检测序列所共有的通用引物序列。此方法可以大 幅地降低由于PCR引物效率的差异所导致的测量变异。
核酸样品
本发明中所使用的核酸样品可以是来自任何来源(尤其是生物来源)的核酸 的任何制剂。在核酸样品中,疑似含有靶的核酸可采用DNA或RNA的形式。在大 多数情况下,在本发明进行测试之前,利用逆转录将RNA转换成DNA。样品中的 DNA可以是双链的、单链的,并且将双链DNA变性为单链DNA。样品中的核酸可 由任何来源制备,包括RNA、mRNA、smRNA、rRNA、cDNA、基因组DNA、细胞器DNA、合成DNA、DNA文库(例如,BAC文库或混合的BAC克隆)、克隆库或者其任 意组合。这些核酸可以是具有在从20到数百、数千或甚至数万个核苷酸范围内 的变化长度的DNA序列。本发明集中于从靶基因的相对较小的突变区域中检索信 息。本发明同样可以很好地应用于短DNA序列及长DNA序列。当使用来自各来源 (例如循环无细胞DNA和甲醛固定的、石蜡包埋(FFPE)的组织DNA)的DNA制剂工 作时(其中由于DNA降解仅可以获得短的DNA片段)这是特别有利的。这些核酸可 含有被加到一个或两个末端的人工序列标签。这些序列标签是与样品中的原始序 列为非互补的唯一预定序列。具有与序列标签为互补的TTS的突变体捕获探针可 以用于捕获具有未知序列的突变体变异。
靶/突变体捕获探针
本发明的一个重要特征在于靶捕获探针的独特设计,所述靶捕获探针用于检 索核酸样品中的靶序列的表征信息并将此信息转换成靶特异性连接产物,利用一 对通用引物扩增所述靶特异性连接产物并且利用通用报告探针进行检测。靶捕获 探针具有一对靶特异性部(3'-TSS和5'-TSS),一对通用引物识别部(正向UPBS 和反向UPBS)和通用检测部。在一些实施方式中,靶捕获探针包括可环化多肽, 所述可环化多肽从5'到3'末端依次包括5'-TSS、正向UPBS、可断裂位点、反向 UPBS和3'-TSS,并且具有插入正向UPBS与5'-TSS之间或者反向UPBS与3'-TSS 之间的通用检测序列(图1A)。此可环化靶捕获探针可以退火到靶序列,并且通 过将3'-TSS与5'-TSS加以连接而产生环状耐外切核酸酶的靶特异性连接产物。 在对其进行PCR扩增和检测前,可以通过使可断裂位点断裂而使此环状靶特异性 连接产物线性化。在一些实施方式中,靶捕获探针包括两条多核苷酸单链,包括 含有耐外切核酸酶的5'末端、反向UPBS和在3'末端的3'-TSS的第一多核苷酸 链,以及含有在5'末端的5'-TSS、正向UPBS和耐外切核酸酶的3'末端的第二 多核苷酸链,并且具有插入正向UPBS和5'-TSS之间或者反向UPBS与3'-TSS 之间的通用检测序列(图1B)。这对靶捕获探针可以退火到靶序列,并且通过将 3'-TSS与5'-TSS连接而产生线性耐外切核酸酶的靶特异性连接产物。
3'-TSS和5'-TSS被设计成分别与靶序列中的相同链上的第一和第二区域为 互补。靶序列的第一和第二区域可彼此相邻或者彼此间隔一个或多个核苷酸。TSS 的长度在10至40个核苷酸、优选地15至25个核苷酸、更优选地18至22个核 苷酸中变化。3'-TSS具有自由3'羟基末端并且5'-TSS具有自由5'磷酸化末端, 从而当相邻地退火在靶序列中时允许其通过直接连接而连接。或者可以通过DNA 聚合使3'-TSS延伸,并且延伸的3'-TSS可以连接到5'-TSS。
在一些实施方式中,靶序列是靶基因的突变体变异,因此靶捕获探针是突变 体捕获探针。在一些实施方式中,靶序列被设计成使得突变体捕获探针的3'-TSS 和/或5'-TSS包括末端突变核苷酸,并且它们相邻地退火到突变体变异的突变区 域,从而通过直接连接将3'-TSS与5'-TSS加以连接而形成突变体特异性连接产 物(图4A)。当3'-TSS和5'-TSS退火到野生型序列时,由于错配的末端核苷酸, 所述连接不出现。为了进一步提高特异性,利用阻断探针来防止3'-TSS和5'-TSS 退火到野生型序列。
在一些实施方式中,突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS被设计成退火到靶 序列从而形成在突变核苷酸的位点处具有一个单核苷酸缺口的DNA双链体(图 4B)。退火后,在仅与突变核苷酸相匹配的一种类型的核苷酸的存在下执行单核 苷酸延伸和连接,由此产生突变体特异性连接产物。在一些实施方式中,存在在 单个突变位点具有不同核苷酸的多个突变体变异。无论突变的具体序列如何,只 需要检测是否存在突变。可以在三种类型的核苷酸存在下执行单核苷酸延伸和随 后的连接,其中第四核苷酸是与野生型基因型相匹配的核苷酸。另外,可以添加 阻断探针以阻止3'-TSS和5'-TSS退火到野生型序列。
在一些实施方式中,突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS被设计成退火到靶 序列以形成在突变区域的位点处具有多核苷酸缺口的DNA双链体(图5A、图5B)。 突变体特异性连接产物是通过使用DNA聚合酶的DNA聚合使3'-TSS延伸直到与 5'-TSS相邻,然后将延伸的3'-TSS和5'-TSS加以连接而形成。优选的是,这 里所使用的DNA聚合酶不具有5'->3'外切核酸酶活性并且不表达链置换活性。 这种酶的例子是DNA聚合酶I、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶的克列诺片段。 如果突变序列是已知的,则3'-TSS和任选地5'-TSS可包括一部分的突变序列, 具体地,3'-TSS可具有在其3'末端的突变核苷酸。这允许3'-TSS和5'-TSS优 选地退火到与野生型序列相比的突变体变异。此外,可以加入用于野生型序列的 阻断探针,以提高特异性。如果突变序列是未知的但突变的位点是已知的,则将 3'-TSS和5'-TSS设计成位于突变区域的侧面。与突变位点的野生型对应序列为 互补的阻断探针可以用于对突变体变异进行选择。阻断探针将与野生型序列形成 完全匹配的双链体,同时在阻断探针与突变体变异之间所形成的双链体将具有至 少一个错配。阻断探针野生型双链体的解链温度Tm将高于阻断探针突变体变异 双链体的Tm。通过选择在这两个解链温度之间的退火温度,阻断探针选择性地阻 止以所述野生型序列作为模板的延伸。基于这两个解链温度之间的差异,选择性 阻断可能不完全,并且可能会出现假阳性。判定检测信号是否来自突变体变异或 野生型序列的部分阻断的一种方法是对检测信号与仅占优势的野生型的信号进行比较。或者,可以对扩增的TSS连接产物进行测序分析,以判定突变体变异的 存在。
在一些实施方式中,突变体变异是其中第一融合基因的融合位置为已知但第 二融合基因序列为未知的基因融合突变。本发明可以用于检测这种具有未知序列 的基因融合突变体的存在。首先,将5'序列标签连接到疑似含有基因融合突变 的核酸。3'-TSS被设计成与融合位置的第一融合基因上游的一个区域为互补。 5'-TSS被设计成与序列标签为互补。阻断探针被设计成与在融合位置中的野生 型序列的区域为互补,所述阻断探针将在融合位置中特异性地杂交到野生型序列, 但不杂交到基因融合突变体。突变体捕获探针退火到融合突变体变异并且通过 DNA聚合从3'-TSS开始延伸直到延伸的链到达5'-TSS,可以将它们连接到一起 而形成对于融合突变体为特异性的连接产物。另一方面,阻断探针阻止以所述野 生型序列作为模板的3'-TSS退火到野生型序列和/或3'-TSS的延伸,从而导致不形成以野生型序列为模板的连接产物。阻断探针的长度可以具有至少20至40、 40至100、100至200、200至400个以上的核苷酸、优选地40至150个核苷酸。 阻断探针需包括融合连接位点,优选地位于阻断探针序列的中部。只要融合连接 被阻断探针所覆盖,则不要求融合连接的准确位点是已知的。使用阻断探针将允 许仅使用基因融合突变体变异作为模板的3'-TSS延伸。此方法可以用于从具有 此特定基因融合位置的所有基因融合突变体中获得序列信息。
在一些实施方式中,靶捕获探针用于检测靶基因的野生型序列。靶捕获探针 可以用于在单管反应中检测多个靶序列。包括具有相同通用引物结合序列和相同 通用检测序列的不同靶特异性序列的多个靶捕获探针可以用于同时检测多个靶 序列。在一些实施方式中,可以将多个靶捕获探针分为不同组,各组具有不同的 检测序列但共有相同的引物结合序列。在一些实施方式中,所述方法用于检测靶 基因/染色体的拷贝数变异。将包括第一组和第二组靶捕获探针的多个靶捕获探 针加入到核酸样品中。第一组的靶捕获探针具有与靶基因/染色体中的不同基因 位点的序列为互补的3'-TSS和5'-TSS,并且第一组的所有靶捕获探针共有第一 通用检测序列。第二组的靶捕获探针具有与内参基因/染色体中的不同基因位点 的序列为互补的3'-TSS和5'-TSS,并且第二组的所有靶捕获探针共有第二通用 检测序列。所有的靶捕获探针优选地具有相同的引物结合序列。使用用于所有靶 捕获探针的相同引物结合序列,可以使由不同PCR引物的PCR效率差异所导致的 扩增变化最小化。优选地,使为分析所选择的基因位点均匀地分布于靶和内参基 因中,并且彼此不重叠。在靶和内参基因/染色体中所选择基因位点的数量是相 同的。利用与不同荧光团耦联的不同序列特异性报告探针来识别第一和第二检测 序列。这允许使用用于检测的不同荧光团在相同的管中对靶和内参基因/染色体 的量进行测量。优选地,利用数字PCR测定在靶基因/染色体和内参基因/染色体 中的多个基因位点的拷贝数,以便对由第一和第二检测序列的各自序列特异性报 告探针所发出的荧光进行检测。靶基因/染色体与内参基因/染色体的拷贝数的比 率用于判定拷贝数变异的存在。
在一些实施方式中,此方法可以用于检测不同样品中的相同基因的拷贝数变 异,例如患者样品相对于正常样品的比率。在此情况下,具有相同靶特异性部分 和不同检测序列的靶捕获探针用于不同样品。一旦利用具有不同检测序列的靶捕 获探针单独地捕获用于不同样品的靶特异性连接产物,则将其汇集到一起并且利 用各自的序列特异性报告探针对不同样品的基因拷贝数进行检测。
阻断探针
阻断探针包括与野生型序列的一个区域完全互补但不与突变体变异中的相 应区域互补的核苷酸序列。阻断探针与野生型序列构成完全匹配的双链体,同时 阻断探针突变体双链体具有至少一个错配。完全匹配的双链体的解链温度(Tm1) 通常高于具有错配的双链体的解链温度(Tm2)。通过在Tm1和Tm2之间选择退火温度, 能够发现使大部分的野生型序列与阻断探针杂交的退火温度,同时大部分的突变 序列未被占据。因此,需要发现导致在完全匹配与错配双链体之间稳定性的更大 差异的核苷酸修饰物。一个例子是肽核酸探针(PNA)。PNA是其中脱氧核糖磷酸 酯主链被通过肽键而连结的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元所取代的DNA模拟物。 PNA可以与互补DNA形成双链体。与相应的DNA-DNA双链体相比,PNA-DNA双链 体中的单碱基错配的不稳定性要大得多,从而使PNA-DNA双链体成为用于阻断探针的良好候选者。另一个例子是锁核酸探针(LNA)。LNA为修饰RNA,其中核糖基 团的2'氧与4'碳通过额外的桥而连接。LNA核苷酸可以与正常核苷酸形成碱基 配对并且可以与DNA和RNA残留物混合。由LNA核苷酸所制成的阻断探针可以具 有提高的特异度和灵敏度。阻断探针也可以连结到小沟结合物以提高探针的特异 性和辨别错配核苷酸的能力。还希望包括使阻断探针耐外切核酸酶且不可延伸的 修饰物。例如,将两个以上的磷酰胺酯和硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯连结基 加在多核苷酸的5'或3'末端,可以导致多核苷酸耐外切核酸酶。将2',3'-双脱 氧核苷酸合并到3'末端或者加入3'末端磷酸化可以使阻断探针变得不可延伸。
靶/突变体选择性连接
本发明的一个主要特征是利用靶捕获探针实施靶选择性连接从而将靶序列 的表征信息捕获入靶特异性连接产物。所述靶捕获探针包括3'和5'靶特异性序 列,所述序列首先退火到样品中的靶序列的相同链,然后通过直接连接或延伸/ 连接而连接从而形成靶特异性连接产物。仅当靶序列存在于样品中时可以产生靶 特异性连接产物。靶特异性连接产物的各拷贝是样品中靶序列的表征。靶捕获探 针可以用于捕获靶基因的野生型或者突变体变异。
在一个优选实施方式中,突变体捕获探针用于利用突变体选择性连接来捕获 突变体变异,这通过使用突变体特异性序列捕获突变体变异和/或利用野生型阻 断探针基于野生型序列阻止连接产物的形成而实现。
第一类型的突变体选择性连接是适用于具有已知突变的突变体的突变体特 异性连接。突变体捕获探针的3'-TSS或5'-TSS被设计成与突变核苷酸准确匹配, 优选地至少一个突变核苷酸位于3'-TSS的3'末端和/或5'-TSS的5'末端。 3'-TSS和5'-TSS被设计成相邻地退火到突变体变异的突变区域。将突变体捕获 探针与核酸样品加以混合,实施变性、退火和连接的循环以形成突变体特异性连 接产物。当突变体变异存在于核酸样品中时,3'-TSS和5'-TSS将相邻地退火到 突变区域并且利用热稳定DNA连接酶连接到一起而形成突变体特异性连接产物。 如果需要,可以多次重复变性、退火和连接的循环,以实现突变体特异性连接产 物的线性扩增。选择退火温度使得在TSS与野生型序列之间的错配杂交是不稳定的。此外,可以加入与野生型序列完全互补的阻断探针,以阻止突变体捕获探针 退火到野生型序列,因此进一步提高退火特异性。由于DNA连接酶的序列特异性, 在探针与野生型序列的错配双链体中很少发生或不发生连接。为了提高连接特异 性,可以在升高的连接温度下(例如,50-65℃)执行连接。热稳定连接酶的例子 包括从荷兰阿姆斯特丹MRC获得的“连接酶65”和从新英格兰生物实验室(New England Biolabs)(伊普斯威奇市,马萨诸塞洲)获得的Taq连接酶。此方法利 用DNA连接酶的序列特异性和阻断探针的特异性阻断来选择突变体变异,从而提 供相当高的选择性和特异性。
第二类型的突变体选择性连接将单核苷酸延伸与适用于具有已知或未知突 变的突变体的连接加以组合。3'-TSS和5'-TSS被设计成退火到具有一个核苷酸 缺口的突变体变异的突变区域,其中所述缺口位于突变核苷酸的位点处。不要求 突变核苷酸的具体序列是已知的。在一个实施方式中,突变体捕获探针退火到靶 序列,并且四种类型的核苷酸中的仅一种类型与DNA聚合酶和DNA连接酶一起提 供。仅当提供匹配的核苷酸时,可以发生单核苷酸延伸和随后的连接。合适的 DNA聚合酶应当具备5'->3'DNA聚合酶活性且不具备5'->3'外切核酸酶活性, 并且不表达链置换活性。在一些实施方式中,突变核苷酸的具体序列为未知的或 者无论突变核苷酸的具体序列如何,都需要判定是否存在突变体变异。在DNA聚合酶、所有四种类型的核苷酸、DNA连接酶和野生型阻断探针的存在下,上述 突变体捕获探针退火到靶序列。因为野生型序列杂交到阻断探针并且无法退火到 突变体捕获探针,所以仅突变体变异可以退火到突变体捕获探针并指导突变体特 异性连接产物的产生。为了提高特异性,在反应中仅提供四种类型的核苷酸中的 三种,其中与野生型基因型匹配的核苷酸不包括在反应中。此方法利用DNA聚合 酶和DNA连接酶的序列特异性及阻断探针的特异性阻断来选择突变体变异,从而 提供非常高的选择性和特异性。
第三类型的突变体选择性连接涉及多个核苷酸的DNA聚合和连接,这可以用 于检测具有已知或未知突变的突变体。3'-TSS和5'-TSS被设计成退火到具有多 核苷酸缺口的突变体变异的突变区域,其中所述缺口包括突变区域。不要求突变 区域的序列是已知的。在一个实施方式中,突变区域的序列是已知的。3'-TSS 可以被设计成包括与具有在3'末端的一个突变核苷酸的突变区域的一部分相匹 配的序列。5'-TSS可被设计成与突变区域下游的序列为互补,或者可以与突变 区域部分重叠。所述突变体捕获探针将特异性地退火到突变体变异并且使用突变 体变异作为模板制作突变体特异性连接产物。适合于此应用的DNA聚合酶应当不 具备3'->5'或5'->3'外切核酸酶活性并且不表达链置换活性,例如从新英格兰 生物实验室(New England Labs)获得的硫化叶菌DNA聚合酶IV。此外,阻断探 针可以用于基于野生型序列阻止连接产物的形成。
在一些实施方式中,突变区域的序列是未知的。3'-TSS和5'-TSS被设计成 分别退火到在突变区域的上游和下游的靶序列。与假定突变区域的野生型对应序 列为完全互补的不可延伸阻断探针用于选择性地基于野生型序列阻止3'-TSS退 火到野生型序列和/或3'-TSS的延伸,从而实现突变序列信息的选择性捕获。阻 断探针可包括与3'-TSS部分重叠的序列。在一些实施方式中,突变体是融合基 因,其中下游融合基因序列是未知的。突变体具有第一上游融合基因和第二下游 融合基因,其中融合位点是已知的但第二下游融合基因的序列是未知的。应当把 序列标签加到核酸样品中的核酸的末端。用于将序列标签连接到核酸的一个末端 或两个末端的方法在本领域中是已知的(美国专利申请第20160304948号和第 20120156729号;Head SR等人.Biotechniques.2015,56(2):61-passim)。 3'-TSS可以被设计成与基因融合位点的第一融合基因上游的一个区域为互补。 5'-TSS被设计成与靶基因的5'序列标签为互补。不可延伸的阻断探针被设计成 与位于基因融合连接点处的野生型序列的一个区域为互补。在不可延伸阻断探针 存在下,使用3'-TSS作为延伸引物而实施DNA聚合。因为3'-TSS退火到野生型 序列被不可延伸阻断探针所阻止,所以3'-TSS优选地退火到基因融合突变体变 异并且完成融合突变体的延伸和连接产物。此方法可以用于检测具有此特定基因 融合位点的所有不同基因融合突变体。
外切核酸酶处理
靶选择性连接产生耐外切核酸酶的靶特异性连接产物,所述产物可以是具有 两个耐外切核酸酶末端的环状产物或线性产物。外切核酸酶处理用于去除样品中 的非连接的靶捕获探针和核酸。优选地,这里所使用的外切核酸酶应当具有 3'->5'和5'->3'外切核酸酶活性并且能够消化ssDNA和dsDNA。所述外切核酸酶 可以是单个外切核酸酶或者多个外切核酸酶的混合物。酶消化后,通过加热(例 如,95℃,20分钟)而使外切核酸酶失活。如果靶特异性连接产物是环状的,可 以通过使可断裂位点断裂而使其线性化。存在用于并入对光、酶或化学裂解敏感 的可断裂位点的许多方法,如本文中其他地方所描述。一个优选方法是将多个 dU合并入可断裂位点,这些dU可以被尿嘧啶DNA糖苷酶转换成无碱基核苷酸并 且被AP内切核酸酶裂解。
扩增和检测
靶捕获探针具有通用引物结合序列和通用检测序列,所述序列可以用于对不 同靶序列进行扩增和检测的不同探针。使用用于不同靶基因的PCR扩增的通用引 物可以大幅地减小由于不同PCR引物的PCR效率的差异所导致的变化。这简化了 用于不同靶的复用PCR的优化过程,并且使其容易地适应于自动操作。虽然通常 使用靶序列特异性检测探针,但使用用于检测不同靶序列的通用序列特异性检测 探针是本发明的独特特征。无论靶序列中的差异如何,使用通用检测探针可以使 检测效率最大化。使用通用检测探针可以在单个管中检测数十、数百、甚至数千 个不同靶序列。这对于检测多种疾病相关突变中的一个是否存在于患者的样品中 或者测量染色体中的数百或数千个基因位点以便检测拷贝数变异是特别有用的。
序列特异性报告探针包括可以检测样品中的互补序列的靶识别序列。当序列 特异性报告探针杂交到其互补序列时可发出可检测信号(例如,荧光信号)。需要 提供具有在PCR过程期间杂交到检测序列或其互补序列但不干扰PCR的过程的报 告探针。一个例子是5'-核酸酶探针,所述探针包括寡核苷酸探针,所 述探针具有附着到5'-末端的荧光团和在3'-末端的淬灭基团。在不活化的情况 下,3'-末端淬灭基团将淬灭5'-末端荧光团的荧光。在引物延伸期间探针退火到检测序列或者其互补序列。当DNA聚合酶到达探针的5'末端 时,DNA聚合酶的5'到3'外切核酸酶活性使探针降解并且从其中释放出5'荧光 团,从而允许荧光团发出荧光。为了检测具有连接的3'-TSS和5'-TSS或者其互 补序列的DNA链,报告探针结合序列应当位于连接的TSS的下游。例如,报告探 针结合序列可以位于靶特异性连接产物中的3'-TSS与反向UPBS之间,或者位于 互补链上的正向UPBS的互补序列与5'-TSS之间。优选地选择互补链上的报告探 针结合序列,因为互补链可以仅在PCR扩增期间而产生。当选择突变体特异性连 接产物的链上的报告结合序列时,剩余的未连接的突变体特异性探针可生成假阳 性信号并增大背景噪声。另一个例子是分子信标探针,这是一种具有内部淬灭荧 光团的发夹状寡核苷酸。当分子信标探针与其互补序列结合时,淬灭基团与荧光 团分离并且使荧光恢复。分子信标探针在退火温度下退火到检测序列,并且在延 伸温度下从检测序列中分离。分子信标探针可以用于实时监测检测序列的形成。 优选的是,分子信标探针结合序列位于原始突变体特异性连接产物链的互补链上。 这些序列特异性报告探针可以使用于检测含有通用检测序列或其互补序列的 PCR产物的实时产生的定量PCR或数字PCR中。
捕获探针的制备
本发明中所使用的捕获探针包括突变体和靶捕获探针两种形式。第一形式具 有可以容易地化学合成的两个多肽,各多肽长度为大约40-70个核苷酸。第二形 式具有长度为大于100个核苷酸的多核苷酸单链。就长度为大于100个核苷酸的 多核苷酸单链而言,化学合成的产率和效率变得非常低。本文中公开的是一种用 于制作具有大于100个的核苷酸的一条多核苷酸单链捕获探针的方法。此方法的 另一方面是将多个尿嘧啶核苷酸合并到捕获探针的可断裂位点。
捕获探针具有对于各探针为特异性的靶特异性部分(3'-TSS和5'-TSS)和可 以被不同探针所共有的通用部分,并且包括通用引物结合序列(正向UPBS和反向 UPBS)、通用检测序列和可断裂位点。策略是首先在头对头的方向上化学合成 3'-TSS和5'-TSS以及探针的通用部的部分,其中合成的多核苷酸单链的总长度 不大于100个核苷酸。将两个限制性核酸内切酶限制位点(NE1-NE2位点)导入 3'-TSS和5'-TSS之间使得利用双链DNA的限制性核酸内切酶的消化准确地在本 链(即检索链)的3'-TSS的3'末端和5'-TSS的5'末端形成两个切口(参见图6)。 适用于本发明的限制性核酸内切酶组合,例如,为Nt.BsmA1和NbBsrDI。合 成的多核苷酸可包括,例如,从5'到3'的反向UPBS(20nt)、3'-TSS(20nt)、 NE1-NE2位点(12nt)、5'-TSS(20nt)和通用检测序列(20nt)。
其次,执行PCR扩增从而加入包括多个dU区域或作为可断裂位点的核酸内 切酶限制位点的通用部的剩余部分。例如,正向引物包括5'-(正向UPBS,通用 检测序列)-3',以及反向引物包括5'-(3xdU、NE3位点、反向UPBS)-3'。NE3 是不同于NE1和NE2位点的第三切口酶限制位点,并且NE3切口酶可以在没有 dU的情况下在非检索链上形成切口。
通过平端连接使PCR产物环化。NE3切口酶用于在非检索链上形成切口,并 且外切核酸酶用于消化非检索链,从而留下具有dU可断裂位点的单链环状检索 链。或者,核酸内切酶限制位点可以代替dU作为可断裂位点。
合成匹配的寡核苷酸,所述寡核苷酸具有与检索链上的NE1-NE2位点为互补 的中心区域及位于两个末端的随机核苷酸序列。随机核苷酸序列的长度可以是2 至10、优选地4-6个核苷酸。将匹配的寡核苷酸退火到检索链上的NE1-NE2位 点并且利用NE1和NE2切口酶在3'-TSS和5'-TSS的准确末端切出两个切口,并 且形成单链捕获探针其中完整的通用区域包括位于中部的dU可断裂位点以及位 于两个末端的3'-TSS和5'-TSS。
另一个用于将核苷酸序列加到化学合成探针中的方法采用延伸连接策略(参 见图7)。完整的捕获探针包括靶特异性部分(约40个核苷酸)和通用部分(约70 个核苷酸)。利用加入到两个末端的切口酶限制位点(10-12个核苷酸),最终多 核苷酸产物的长度为130-134个核苷酸。合成具有小于100个核苷酸的包括切口 酶限制位点、3'-TSS、5'-TSS和部分通用序列的部分探针。使完整通用序列退 火到部分探针的部分通用序列。使用部分探针作为模板使完整通用序列的3'延 伸以充满3'末端。使用与3'切口酶限制位点为互补的序列作为5'引物,并且使 3'延伸直到其到达完整通用序列的5'末端,所述5'末端可以连接以形成具有切 口酶限制位点、靶特异性序列和完整通用序列的完整探针(参见图6)。5'引物与耐外切核酸酶的末端混合,以便制作耐受外切核酸酶处理的完整探针。在延伸/ 连接反应后,通过外切核酸酶处理将部分探针去除同时完整探针可耐外切核酸酶 处理。将一对匹配的寡核苷酸加入到在两个末端具有切口酶限制位点的完整探针 中。利用这两种限制酶在靶特异性序列的准确末端进行酶切,因此形成在两个末 端具有靶特异性序列和在中间的通用序列的完整捕获探针。
实施例
以下实施例用于进一步说明本发明,但不限制本发明的范围。
实施例1.EGFR突变体的同步检测
表皮生长因子受体(EGFR)是具有多种癌症相关突变的受体酪氨酸激酶。具有 所谓的EGFR的激活突变的患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物(如吉非替尼 和厄罗替尼)敏感。TKI敏感性EGFR突变包括L858R、L861Q、G719S、T783A等。 另一组EGFR突变使得具有这些突变的患者形成TKI耐药性,包括T790M、L747S、 D761Y、V769M等。本发明可以用于在单一反应中检测患者是否携带敏感性或耐 药性EGFR突变。
突变体捕获探针设计
两组突变体捕获探针被设计用于上述八种EGFR突变。用于检测敏感突变体 的第一组具有四个突变体捕获探针,各突变体捕获探针具有与L858R、L861Q、 G719S或T783A突变体的突变区域为互补的一对靶特异性序列。用于检测耐药性 突变体的第二组具有四个突变体捕获探针,各捕获探针具有与T790M、L747S、 D761Y或V769M突变体的突变区域为互补的一对靶特异性序列。各探针的3'-TSS 和5'-TSS被设计成相邻地退火到突变区域,其中具有3'末端核苷酸的3'-TSS 与突变核苷酸相匹配。第一组和第二组探针共有相同的通用引物结合序列,但各 组具有在所述组中所共有的不同通用检测序列。将两组突变体捕获探针合并而制 作混合探针。就各突变区域而言,制作与跨越突变区域的野生型区域为互补的60个核苷酸长的野生型阻断探针。所述阻断探针可以连结到小沟结合物以提高 其特异度。
突变体特异性连接产物的产生
循环DNA从患者的血样中制备并被分裂成200bp的片段。将合并的突变体 捕获探针、合并的阻断探针、循环DNA样品、热稳定Taq DNA连接酶在适当的反 应缓冲液中加以混合。如果样品中存在八种突变中的任一种,则执行变性、退火 和连接的循环10次以生成突变体特异性连接产物。10次反应循环后,突变DNA 的初始量被扩增十倍。然后,反应混合物经由外切核酸酶消化,从而将非连接的 捕获探针和DNA序列从样品中降解出来。DNA连接酶和外切核酸酶可以在95℃下 失活30分钟。在外切核酸酶的失活之后,将包括EGFR野生型序列的基因组DNA 样品加入反应混合物中,以用作内参DNA。
扩增和检测
将通用PCR引物、三个序列特异性探针、用于内参DNA扩增的引物、 TaqDNA聚合酶、dNTP和合适的缓冲成分加入到反应混合物中。这三个序列特异 性探针具有不同的荧光团,包括用于检测两个EGFR突变体组的通用检测 序列的两个探针和用于检测内参DNA的一个探针。执行qPCR并检测发出的荧光, 以便基于检测到的匹配荧光的类型来判定患者是否携带至少一种药物敏感突变 体、耐药突变体或两者。
实施例2.HER2基因中的拷贝数变异的检测
本发明的方法特别适合于通过与内参基因/染色体比较测量靶基因/染色体 中的多个位点的拷贝数而计算基因或染色体的拷贝数变异。本实施例利用本发明 的方法来判定癌症患者中的HER2基因的拷贝数变异。所使用的内参基因为已知 具有正常拷贝数的核糖核酸酶P。
靶捕获探针的设计
化学合成分别用于HER2基因和核糖核酸酶P基因的50个靶捕获探针。用于 各捕获探针的靶特异性序列均等地分布在HER2或核糖核酸酶P基因上并且没有 任何重叠。各3'-TSS和5'-TSS具有20个核苷酸并且被设计成退火到具有5-核 苷酸缺口的靶基因。所有的捕获探针共有相同的通用PCR引物结合序列。以HER2 和核糖核酸酶P作为靶的捕获探针含有分别耦合到FAM和VIC荧光团的不同通用 检测序列。将所有100个捕获探针合并到一起以制作混合探针。
靶特异性连接产物的产生
将基因组DNA样品与合并的靶捕获探针、热稳定Taq DNA连接酶、DNA聚合 酶、dNTP在适当的反应缓冲液中加以混合。执行变性、退火、DNA聚合和连接的 循环一次,以产生靶特异性连接产物。然后,反应混合物经由外切核酸酶消化从 而使样品中的非连接的捕获探针和DNA序列降解。DNA连接酶和外切核酸酶可以 在95℃下失活30分钟。
CNV的扩增和测定
将通用PCR引物、两个序列特异性探针、Taq DNA聚合酶、dNTP和 合适的缓冲成分加入到反应混合物中。用于识别HER2特异性和核糖核酸酶P特 异性连接产物中的通用检测序列的序列特异性探针分别含有FAM荧光团 和VIC荧光团。在反应混合物中执行数字PCR,并且通过对分别具有FAM荧光团 和VIC荧光的室的数量进行计数而对HER2基因和内参基因、核糖核酸酶P的拷 贝数进行计数。通过计算HER2与核糖核酸酶P基因的拷贝数之间的比率,判定 拷贝数变异。
虽然出于清晰和理解的目的已较为详细地描述了本发明,但本领域技术人员 应当理解的是在不脱离本发明真实范围的前提下可以在形式和细节上作出各种 变更。上面所提及的所有附图、表格、附录、专利、专利申请和出版物以参考的 方式并入本文。
Claims (54)
1.一种用于检测核酸样品中的靶序列的方法,包括以下步骤:
(a)提供含有靶特异性部分和通用引物结合与通用检测部分的靶捕获探针;
(b)从下列中选择靶捕获探针:
(i)一条多核苷酸单链,所述单链从5'到3'末端依次包括5'-靶特异性序列(5'-TSS)、正向通用引物结合序列(正向UPBS)、可断裂位点、反向通用引物结合序列(反向UPBS)和3'-靶特异性序列(3'-TSS),并且具有插入所述正向UPBS与所述5'-TSS或者所述反向UPBS与所述3'-TSS之间的通用检测序列,或者
(ii)两条多核苷酸单链,包括包含耐外切核酸酶的5'末端、反向UPBS和在所述3'末端的3'-TSS的第一多核苷酸链,以及包含在所述5'末端的5'-TSS、正向UPBS和耐外切核酸酶的3'末端的第二多核苷酸链,并且具有插入所述正向UPBS与所述5'-TSS之间或者所述反向UPBS与所述3'-TSS之间的通用检测序列;
(c)在其中所述靶捕获探针的3'-TSS和5'-TSS退火到所述核酸样品中的互补序列而形成双链体核酸的条件下,使所述靶捕获探针与所述核酸样品接触;
(d)执行靶选择性连接,其中将所述靶捕获探针的3'-TSS与5'-TSS加以连接而形成线性或环状耐外切核酸酶的靶特异性连接产物;
(e)任选地,利用外切核酸酶来消化敏感的核酸,在所述酶消化后,失活所述外切核酸酶并且/或者纯化所述耐外切核酸酶的靶特异性连接产物;
(f)在所述可断裂位点处使所述环状耐外切核酸酶的靶特异性连接产物(如果存在)断裂,从而获得线性靶特异性连接产物;
(g)通过使用识别所述通用引物结合序列或其互补序列的通用PCR引物的聚合酶链反应(PCR),而扩增所述线性靶特异性连接产物或所述线性耐外切核酸酶的靶特异性连接产物;以及
(h)利用识别所述通用检测序列或其互补序列的序列特异性报告探针检测或定量所述线性靶特异性连接产物或所述线性耐外切核酸酶的靶特异性连接产物,作为所述靶序列的测量。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶捕获探针是用于捕获靶基因的突变体变异,并且起突变体捕获探针的作用,从而在所述步骤(d)中执行突变体选择性连接而形成突变体特异性连接产物。
3.根据权利要求2所述的方法,还包括多次重复所述步骤(c)和(d)以实现所述突变体特异性连接产物的线性扩增。
4.根据权利要求3所述的方法,其中重复所述步骤(c)和(d)达1-100次。
5.根据权利要求2所述的方法,其中在步骤(c)中加入与所述突变体变异中的所述突变区域的野生型对应区域的序列为互补的阻断探针,并且所述阻断探针阻断以所述野生型序列作为模板的耐外切核酸酶的连接产物的形成。
6.根据权利要求2所述的方法,其中热稳定DNA连接酶用于所述3'-TSS与所述5'-TSS的连接。
7.根据权利要求2所述的方法,其中所述外切核酸酶包括具有5'->3'和3'->5'外切核酸酶活性的,且可以消化单链和双链DNA的一种或多种外切核酸酶。
8.根据权利要求2所述的方法,其中所述线性突变体特异性连接产物或所述线性耐外切核酸酶的突变体特异性连接产物的扩增和检测同时发生。
9.根据权利要求2所述的方法,其中所述序列特异性报告探针一旦被激活可以发出荧光信号。
10.根据权利要求2所述的方法,其中所述突变体捕获探针的3'-TSS和/或5'-TSS退火到所述靶基因的突变序列处或与之靠近的位点。
11.根据权利要求2所述的方法,其中所述突变体捕获探针的3'-TSS和/或5'-TSS包括与所述突变序列的一部分为互补的序列。
12.根据权利要求2所述的方法,其中所述可断裂位点包括对光、酶或化学裂解敏感的化学基团。
13.根据权利要求2所述的方法,其中包括不同的靶特异性序列和相同的引物结合序列和相同的检测序列的多个突变体捕获探针用于检测靶基因的多个突变体变异。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述多个突变体捕获探针包括与所述相同靶基因的不同突变体变异为互补的靶特异性序列。
15.根据权利要求13所述的方法,其中所述多个突变体捕获探针包括与不同靶基因的突变体变异为互补的靶特异性序列。
16.根据权利要求2所述的方法,其中将多个突变体捕获探针分为多组,其中各组的成员具有不同的靶特异性序列,共有对于所述组为特异性的通用检测序列,并且在不同组的所有成员中共有相同的通用引物结合序列。
17.根据权利要求2所述的方法,其中与所述野生型序列相比,所述突变体变异中的突变可以是核苷酸置换、缺失、插入、基因融合或者其任意组合。
18.根据权利要求2所述的方法,其中所述突变体捕获探针的3'-TSS含有在其3'末端的突变核苷酸,并且/或者所述突变体捕获探针的5'-TSS含有在其5'末端的突变核苷酸。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS相邻地退火到所述突变体变异的突变区域;并且其中所述耐外切核酸酶的突变体特异性连接产物是通过所述3'-TSS与所述5'-TSS的直接连接而形成。
20.根据权利要求2所述的方法,其中所述突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS退火到所述核酸样品中的所述靶基因而形成在突变核苷酸的位点处具有单核苷酸缺口的DNA双链体;并且其中所述耐外切核酸酶的突变体特异性连接产物是通过利用DNA聚合酶使具有与所述突变核苷酸为互补的所述单个核苷酸的所述3'-TSS延伸及随后的DNA连接以便将所述延伸的3'-TSS与所述5'-TSS加以连接而形成。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述DNA聚合酶是缺乏5'->3'外切核酸酶活性且不表达链置换活性的热稳定DNA聚合酶。
22.根据权利要求2所述的方法,其中所述突变体捕获探针的3'-TSS和5'-TSS退火到所述靶基因而形成具有多核苷酸缺口的DNA双链体,其中所述耐外切核酸酶的突变体特异性连接产物是通过利用DNA聚合酶使多核苷酸从所述3'-TSS的3'末端开始延伸和随后的DNA连接以便将所述延伸的3'-TSS与5'-TSS加以连接而形成。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述3'-TSS的3'末端与突变核苷酸为互补,并且其中DNA聚合酶仅可以使用所述突变体作为模板而使所述3'-TSS的3'末端延伸。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述DNA聚合酶是缺乏3'->5'和5'->3'外切核酸酶活性且不表达链置换活性的热稳定DNA聚合酶。
25.根据权利要求2所述的方法,其中所述突变体变异的突变区域的位点是已知的但所述突变核苷酸的具体序列是未知的,其中所述3'-TSS和所述5'-TSS被设计成与所述突变区域的上游和下游的区域互补,并且其中在步骤(c)中加入与所述突变区域的所述野生型对应区域为互补的不可延伸的阻断探针,其中所述不可延伸的阻断探针阻止所述3'-TSS和/或所述5'-TSS退火到所述野生型序列和/或DNA聚合酶使用所述野生型序列作为模板使所述3'-TSS延伸。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述不可延伸的阻断探针的序列与所述3'-TSS和/或5'-TSS重叠。
27.根据权利要求25所述的方法,其中所述不可延伸的阻断探针包括修饰核苷酸。
28.根据权利要求27所述的方法,其中所述修饰核苷酸可以是肽核酸、锁核酸或连结到小沟结合物的核苷酸。
29.根据权利要求2所述的方法,其中所述核酸样品是RNA样品,并且其中通过以RNA作为模板的DNA连接而将所述3'-TSS与所述5'-TSS加以连接。
30.根据权利要求29所述的方法,其中通过使用逆转录酶而执行以RNA为模板的所述3'-TSS的延伸。
31.根据权利要求2所述的方法,其中所述方法是用于检测所述靶基因的甲基化的存在,其中通过将所有非甲基化胞嘧啶转换成尿嘧啶而对所述靶基因进行修饰,同时所述甲基化胞嘧啶作为胞嘧啶保持不变,其中对所述靶基因的甲基化的检测是检测在所述修饰靶基因中假定甲基化位点处所述U->C突变的存在。
32.根据权利要求2所述的方法,其中所述方法用于检测具有第一基因部分、融合位点和第二基因部分的基因融合突变体。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述突变体捕获探针的3'-TSS与所述第一基因的区域为互补,并且所述突变体捕获探针的5'-TSS与所述第二基因的区域为互补。
34.根据权利要求32所述的方法,其中所述3'-TSS包括与具有所述第一和第二基因的部分区域为互补的序列,并且所述5'-TSS包括与所述第二基因的区域为互补的序列。
35.根据权利要求32所述的方法,其中所述3'-TSS包括与所述第一基因的区域为互补的序列,并且所述5'-TSS包括与具有所述第一基因和所述第二基因的部分区域为互补的序列。
36.根据权利要求32所述的方法,其中所述3'-TSS和所述5'-TSS相邻地退火到所述基因融合突变体。
37.根据权利要求32所述的方法,其中所述3'-TSS和所述5'-TSS退火到所述基因融合突变体而形成具有单核苷酸或多核苷酸缺口的双链体。
38.根据权利要求32所述的方法,其中在步骤(c)中加入与包括所述基因融合位点的野生型序列为互补的阻断探针。
39.根据权利要求32所述的方法,其中所述基因融合突变体具有已知的第一基因部分、已知的融合位点和未知的第二基因部分。
40.根据权利要求39所述的方法,其中所述3'-TSS包括与所述第一基因中的区域为互补的序列并且所述5'-TSS包括与连接到所述未知第二基因的预定序列标签为互补的序列,并且其中在步骤(c)中加入与包括所述基因融合位点的野生型序列为互补的阻断探针。
41.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶捕获探针用于检测靶基因的野生型序列。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述方法用于检测靶基因/染色体的拷贝数变异,其中多个靶捕获探针用于检测所述靶基因/染色体和内参基因/染色体的多个基因位点。
43.根据权利要求42所述的方法,其中将所述多个靶捕获探针分为两组,各组具有不同的检测序列并且分别对于所述靶基因/染色体和所述内参基因/染色体的序列为特异性的。
44.一种用于检测含有过量野生型序列的核酸样品中的靶基因的突变体变异的试剂盒,包括:
(a)含有靶特异性部分和通用引物结合与通用检测部分的突变体捕获探针,包括:
(i)一条多核苷酸单单链,该单链从5'到3'末端依次包括5'-靶特异性序列(5'-TSS)、正向通用引物结合序列(正向UPBS)、可断裂位点、反向通用引物结合序列(反向UPBS)和3'-靶特异性序列(3'-TSS),并且具有插入所述正向UPBS与所述5'-TSS之间或者所述反向UPBS与所述3'-TSS之间的通用检测序列;或者
(ii)两条多核苷酸单链,包括包含耐外切核酸酶的5'末端、反向UPBS和在所述3'末端的3'-TSS的第一多核苷酸链,以及包含在所述5'末端的5'-TSS、正向UPBS和耐外切核酸酶的3'末端的第二多核苷酸链,并且具有插入所述正向UPBS与所述5'-TSS之间或者所述反向UPBS与所述3'-TSS之间的通用检测序列;
(b)DNA连接酶;
(c)识别所述通用检测序列的序列特异性报告探针;
(d)外切核酸酶;
(e)任选地DNA聚合酶;以及
(f)说明手册。
45.根据权利要求44所述的试剂盒,其中所述3'-TSS含有在其3'末端的突变核苷酸并且/或者所述5'-TSS含有在其5'末端的突变核苷酸,并且所述3'-TSS和所述5'-TSS相邻地退火到所述突变体变异的突变区域。
46.根据权利要求44所述的试剂盒,其中所述3'-TSS和所述5'-TSS退火到所述靶基因而形成具有单核苷酸缺口的DNA双链体,其中所述单核苷酸缺口位于突变核苷酸的位点处。
47.根据权利要求44所述的试剂盒,其中所述3'-TSS和所述5'-TSS退火到所述靶基因而形成具有多核苷酸的DNA双链体,其中所述多核苷酸缺口与突变区域重叠。
48.根据权利要求44所述的试剂盒,还包括不可延伸的阻断探针,所述阻断探针包括与在所述突变体变异中的所述突变序列的野生型对应序列为互补的序列。
49.根据权利要求44所述的试剂盒,包括多个突变体捕获探针,各突变体捕获探针具有与靠近突变区域或在突变区域处的各自靶基因序列的区域为互补的一对TSS,并且其中所有的所述突变体捕获探针具有相同的正向UPBS和反向UPBS及相同的检测序列。
50.一种用于检测和定量核酸样品中的靶基因的试剂盒,包括:
(a)含有靶特异性部分和通用引物结合与通用检测部分的靶捕获探针,包括:
(i)一条多核苷酸单链,该单链从5'到3'末端依次包括5'-TSS、正向UPBS、可断裂位点、反向UPBS和3'-TSS,并且具有插入所述正向UPBS与所述5'-TSS之间或者所述反向UPBS与所述3'-TSS之间的通用检测序列,或者
(ii)两条多核苷酸单链,包括包含耐外切核酸酶的5'末端、反向UPBS和在所述3'末端的3'-TSS的第一多核苷酸链,以及包含在所述5'末端的5'-TSS、正向UPBS和耐外切核酸酶的3'末端的第二多核苷酸链,并且具有插入所述正向UPBS与所述5'-TSS之间或者所述反向UPBS与所述3'-TSS之间的通用检测序列;
(b)DNA连接酶;
(c)对于所述检测序列为特异性的报告探针;
(d)外切核酸酶;
(e)任选地DNA聚合酶;以及
(f)说明手册。
51.根据权利要求50所述的试剂盒,其中所述试剂盒包括多个靶捕获探针,各靶捕获探针具有与各自靶基因序列的区域为互补的一对靶特异性序列,其中所有的所述靶捕获探针具有相同的正向UPBS和反向UPBS及相同的通用检测序列。
52.根据权利要求51所述的试剂盒,其中所述多个靶捕获探针包括与靶基因或靶染色体的不同区域为互补的靶特异性序列。
53.根据权利要求50所述的试剂盒,其中将多个靶捕获探针分为多组,各组具有耦合到不同检测信号的不同通用检测序列。
54.根据权利要求53所述的试剂盒,其中将所述多个靶捕获探针分为第一组和第二组,其中所述第一组的靶捕获探针对于靶基因/染色体中的多个基因位点为特异性,并且第二组的靶捕获探针对于内参基因/染色体中的多个基因位点为特异性,并且其中所述试剂盒用于检测所述靶基因/染色体的拷贝数变异。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762460806P | 2017-02-19 | 2017-02-19 | |
US62/460806 | 2017-02-19 | ||
US15/888,042 US20180237853A1 (en) | 2017-02-19 | 2018-02-04 | Methods, Compositions and Kits for Detection of Mutant Variants of Target Genes |
US15/888042 | 2018-02-04 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108456716A true CN108456716A (zh) | 2018-08-28 |
Family
ID=63166976
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810128026.2A Pending CN108456716A (zh) | 2017-02-19 | 2018-02-08 | 用于检测靶基因突变体变异的方法、组合物和试剂盒 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20180237853A1 (zh) |
CN (1) | CN108456716A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113993985A (zh) * | 2019-04-05 | 2022-01-28 | 康奈尔大学 | 用于生成具有人工代谢的动态材料的系统和方法 |
CN114072522A (zh) * | 2019-06-10 | 2022-02-18 | 博雷亚尔基因组学有限公司 | 连接的靶标捕获 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111118119B (zh) * | 2019-12-18 | 2023-09-26 | 杭州瑞普基因科技有限公司 | 利用碱基错配的阻滞物对目标突变进行富集和检测的方法 |
CN112359083B (zh) * | 2020-11-11 | 2023-01-24 | 天津大学 | 一种基于锁式探针技术生成单链环状dna的方法及其应用 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006081426A2 (en) * | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Applera Corporation | Compositions and methods for terminating a sequencing reaction at a specific location in a target dna template |
CN101370945A (zh) * | 2005-10-14 | 2009-02-18 | 克利夫兰州立大学 | 用于鉴别大量野生型dna背景中多个dna突变标记的方法 |
CN103255201A (zh) * | 2012-02-16 | 2013-08-21 | 北京宏微特斯生物科技有限公司 | 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒 |
CN104204228A (zh) * | 2012-02-14 | 2014-12-10 | 康奈尔大学 | 使用组合的核酸酶、连接和聚合酶反应用于核酸序列的相对定量、表达或拷贝变化的方法 |
WO2015081229A2 (en) * | 2013-11-26 | 2015-06-04 | Lc Sciences Llc | Selective amplification of nucleic acid sequences |
CN104995309A (zh) * | 2012-12-07 | 2015-10-21 | 因维蒂公司 | 多重核酸检测方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030175749A1 (en) * | 2001-12-08 | 2003-09-18 | Jong-Yoon Chun | Annealing control primer and its uses |
WO2013062931A2 (en) * | 2011-10-24 | 2013-05-02 | Furchak Jennifer | A molecular beacon based assay for the detection of biomarkers of breast cancer metastasis |
WO2018061695A1 (ja) * | 2016-09-29 | 2018-04-05 | 富士フイルム株式会社 | マルチプレックスpcrに供するプライマーの設計方法 |
JPWO2018061699A1 (ja) * | 2016-09-29 | 2019-06-24 | 富士フイルム株式会社 | マルチプレックスpcrに供するプライマーの設計方法 |
-
2018
- 2018-02-04 US US15/888,042 patent/US20180237853A1/en not_active Abandoned
- 2018-02-08 CN CN201810128026.2A patent/CN108456716A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006081426A2 (en) * | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Applera Corporation | Compositions and methods for terminating a sequencing reaction at a specific location in a target dna template |
CN101370945A (zh) * | 2005-10-14 | 2009-02-18 | 克利夫兰州立大学 | 用于鉴别大量野生型dna背景中多个dna突变标记的方法 |
CN104204228A (zh) * | 2012-02-14 | 2014-12-10 | 康奈尔大学 | 使用组合的核酸酶、连接和聚合酶反应用于核酸序列的相对定量、表达或拷贝变化的方法 |
CN103255201A (zh) * | 2012-02-16 | 2013-08-21 | 北京宏微特斯生物科技有限公司 | 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒 |
CN104995309A (zh) * | 2012-12-07 | 2015-10-21 | 因维蒂公司 | 多重核酸检测方法 |
WO2015081229A2 (en) * | 2013-11-26 | 2015-06-04 | Lc Sciences Llc | Selective amplification of nucleic acid sequences |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
A. AYDIN等: "Efficient and cost-effective single nucleotide polymorphism detection with different fluorescent applications", 《BIOTECHNIQUES》 * |
T. A. BORODINA等: "Ligation detection reaction-TaqMan procedure for single nucleotide polymorphism detection on genomic DNA", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113993985A (zh) * | 2019-04-05 | 2022-01-28 | 康奈尔大学 | 用于生成具有人工代谢的动态材料的系统和方法 |
CN114072522A (zh) * | 2019-06-10 | 2022-02-18 | 博雷亚尔基因组学有限公司 | 连接的靶标捕获 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20180237853A1 (en) | 2018-08-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105934523B (zh) | 核酸的多重检测 | |
AU672760B2 (en) | Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting | |
EP2470675B1 (en) | Detection and quantification of hydroxymethylated nucleotides in a polynucleotide preparation | |
CN105899680B (zh) | 核酸探针和检测基因组片段的方法 | |
US20090247415A1 (en) | Strategies for trranscript profiling using high throughput sequencing technologies | |
CN110628880B (zh) | 一种同步使用信使rna与基因组dna模板检测基因变异的方法 | |
CN110079592B (zh) | 用于检测基因突变和已知、未知基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的探针和方法 | |
US8043808B2 (en) | CpG-amplicon and array protocol | |
CN108456716A (zh) | 用于检测靶基因突变体变异的方法、组合物和试剂盒 | |
CN108699553A (zh) | 用于筛选甲状腺癌中突变的组合物和方法 | |
SG185543A1 (en) | Assays for the detection of genotype, mutations, and/or aneuploidy | |
JP6234463B2 (ja) | 核酸の多重分析の方法 | |
CN109844137A (zh) | 用于鉴定嵌合产物的条形码化环状文库构建 | |
JP2023130376A (ja) | 癌関連変異を検出するためのキットおよび方法 | |
KR101358416B1 (ko) | 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법 | |
JP2008161165A (ja) | 競合オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子検出法 | |
US20180100180A1 (en) | Methods of single dna/rna molecule counting | |
CN112639127A (zh) | 用于对基因改变进行检测和定量的方法 | |
US20230046513A1 (en) | Pcr method and pcr kit for increasing allelic discrimination | |
JP5687414B2 (ja) | 多型の識別方法 | |
CN116640854B (zh) | 分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物 | |
WO2024049276A1 (ko) | 다중 표적 dna의 선택적 증폭용 조성물 및 이를 이용한 증폭 방법 | |
US20240076739A1 (en) | Method for detecting presence or proportion of donor in receptor sample, and kit | |
KR20180033911A (ko) | 표적 핵산 또는 유전적 변이를 다중 검출하는 방법 | |
JP5530185B2 (ja) | 核酸検出方法及び核酸検出用キット |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180828 |