WO2018061695A1 - マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法 - Google Patents

マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018061695A1
WO2018061695A1 PCT/JP2017/032262 JP2017032262W WO2018061695A1 WO 2018061695 A1 WO2018061695 A1 WO 2018061695A1 JP 2017032262 W JP2017032262 W JP 2017032262W WO 2018061695 A1 WO2018061695 A1 WO 2018061695A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amplification
priority
candidate
amplification candidate
primer
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/032262
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
尭之 辻本
Original Assignee
富士フイルム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士フイルム株式会社 filed Critical 富士フイルム株式会社
Priority to JP2018542323A priority Critical patent/JP6768815B2/ja
Priority to EP17855653.6A priority patent/EP3521424A4/en
Priority to CN201780060228.1A priority patent/CN109790537A/zh
Publication of WO2018061695A1 publication Critical patent/WO2018061695A1/ja
Priority to US16/368,488 priority patent/US20190221292A1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G16C20/50—Molecular design, e.g. of drugs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G16C20/20—Identification of molecular entities, parts thereof or of chemical compositions
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G16C20/60—In silico combinatorial chemistry
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G16C20/90—Programming languages; Computing architectures; Database systems; Data warehousing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for designing primers used for multiplex PCR.
  • PCR method is widely used as a technique for efficiently and accurately performing gene analysis by amplifying only a necessary specific gene region and performing reading only in the base sequence.
  • a method of selectively amplifying a plurality of gene regions by simultaneously supplying a plurality of types of primers to a certain PCR reaction system is called multiplex PCR.
  • Multiplex PCR is a useful technique for noninvasive prenatal diagnosis because it efficiently amplifies multiple regions from a small amount of DNA.
  • Patent Document 1 describes a method for designing primers used in multiplex PCR with respect to m amplification candidate regions arranged in the coordinate order on the same chromosome.
  • m is an integer of 1 or more.
  • a candidate primer corresponding to the first amplification candidate region X1 is selected from the base sequence of the DNA to be amplified.
  • the candidate primer is selected from the melting temperature of the primer, the GC content, the length of the base sequence, the specificity of the base sequence, the hairpin structure, and the score representing difficulty in forming the primer / dimer.
  • Tm melting temperature; Melting Temperature
  • GC content length of the nucleotide sequence
  • Tm melting temperature; Melting Temperature
  • specific base sequence P 11 is the highest score indicating the superiority of the primer candidate
  • P 12 is the second highest candidate
  • P 12 is the nth candidate. Call it 1n .
  • the n ′ primer candidates P 21 , P 22 ,..., P 2n ′ corresponding to the second amplification candidate region X 2 are also selected in the same manner as described above.
  • primer candidates P m1 , P m2 ,..., P mk corresponding to the m-th amplification candidate region X m are selected.
  • primers in different amplification candidate regions have complementary base sequences at unintended locations.
  • Primers that have a low possibility of forming primer dimers between primers in different amplification candidate regions are primers that can be used in multiplex PCR.
  • primer design conditions such as complementarity / specificity are very strict. Primers that can be used in multiplex PCR may not be employed for all amplification candidate regions for which primers to be subjected to multiplex PCR are to be designed.
  • amplification target regions for which primers that can be used in multiplex PCR can be reduced, resulting in the following problems.
  • the first problem is that an amplification target region that fails to be amplified by multiplex PCR is generated, and the number of regions necessary for analysis such as genotyping cannot be secured.
  • the second problem is that even if the number of regions necessary for analysis such as genotyping can be ensured, high accuracy cannot be achieved.
  • the present invention can secure the necessary number of regions even when direct multiplex PCR is performed on a small amount of DNA sample with low redundancy such as genomic DNA extracted from a single cell.
  • Another object of the present invention is to provide a method for designing a primer for multiplex PCR that can achieve high accuracy.
  • the present inventor has lost at least a part of the region to be amplified due to chromosomal deletion or DNA fragmentation.
  • primer incompatibility may be manifested in an in vitro multiplex PCR experiment system. Even if the number of regions required for analysis such as genotyping can be ensured, as a cause that high accuracy cannot be achieved, if the mutation frequency of the mutation included in the amplification target region is not close to 0.5, the desired accuracy can be obtained. It has been found that more regions are needed to achieve.
  • the present inventor assigns priorities to the amplification candidate regions and designs primers for PCR amplification of the amplification candidate regions according to the priorities.
  • the range affected by partial deletion of chromosomes or DNA fragmentation is limited by ensuring a large distance between amplification candidate regions whose wiring ranks are changed, and amplification by multiplex PCR
  • the priority is set such that the lower the number of primer candidates that can be designed in the amplification candidate region, the higher the priority.
  • the present invention provides the following [1] to [6].
  • [1] A primer design method for multiplex PCR, in which priorities are assigned to amplification candidate regions on the same chromosomal DNA, and primers for PCR amplification of the amplification candidate regions are designed according to the priorities.
  • the above-mentioned priority order is given by a method of assigning priorities to amplification candidate regions on the same chromosomal DNA including the following steps, and a method for designing primers for multiplex PCR:
  • the calculation means searches the amplification candidate area having the smallest coordinate value from the identification information and coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches priority order information of the first priority to the amplification candidate area, A first priority setting step stored in the storage means;
  • the calculation means searches the amplification candidate area having the maximum coordinate value from the identification information and the coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches the priority information of the second highest priority to the amplification candidate area, A second priority setting step stored in the storage means; and From the identification information, the coordinate information, and the priority information of the amplification candidate area stored in the
  • n is an integer that satisfies 3 ⁇ n
  • k is an integer that satisfies 3 ⁇ k ⁇ n
  • i and j are 1 ⁇ i ⁇ k ⁇ 1, 1 ⁇ j ⁇ k ⁇ 1, and i R i and r j are r min ⁇ r i ⁇ r max , r min ⁇ r j ⁇ r max , and r i ⁇ r j , where r min and r max are It is the minimum value and the maximum value of the coordinate values of the amplification candidate regions.
  • a primer design method for multiplex PCR which prioritizes amplification candidate regions on the same chromosomal DNA and designs primers for PCR amplification of the amplification candidate regions according to the priority.
  • the above-mentioned priority order is given by a method of assigning priorities to amplification candidate regions on the same chromosomal DNA including the following steps, and a method for designing primers for multiplex PCR: A step in which identification information and coordinate information of n amplification candidate regions on the same chromosomal DNA are input via the input means and stored in the storage means;
  • the calculation means searches for the amplification candidate area having the maximum coordinate value from the identification information and coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches priority order information of the first priority to the amplification candidate area, A first priority setting step stored in the storage means;
  • the calculation means searches the amplification candidate area having the minimum coordinate value from the identification information and coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches priority order information
  • n is an integer that satisfies 3 ⁇ n
  • k is an integer that satisfies 3 ⁇ k ⁇ n
  • i and j are 1 ⁇ i ⁇ k ⁇ 1, 1 ⁇ j ⁇ k ⁇ 1, and i R i and r j are r min ⁇ r i ⁇ r max , r min ⁇ r j ⁇ r max , and r i ⁇ r j , where r min and r max are It is the minimum value and the maximum value of the coordinate values of the amplification candidate regions.
  • a primer design method for multiplex PCR in which priorities are assigned to amplification candidate regions on the same chromosomal DNA, and primers for PCR amplification of the amplification candidate regions are designed according to the priorities.
  • the above-mentioned priority order is given by a method for assigning priorities to amplification candidate regions on the same chromosomal DNA comprising the following steps, and a method for designing primers for multiplex PCR:
  • the calculation means searches the amplification candidate area having the smallest coordinate value from the identification information and coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches priority order information of the first priority to the amplification candidate area, A first priority setting step stored in the storage means; and
  • the calculation means uses the identification information R k-1 and the coordinate value r k of the amplification candidate area whose priority is k ⁇ 1
  • T r k ⁇ 1 + t
  • T r k ⁇ 1 + t ⁇ r max
  • an amplification candidate region having a coordinate value not less than r k ⁇ 1 + t and not more than r max and having no priority information is searched, and amplification candidates satisfying the condition are searched If there is an area, the amplification candidate area having the smallest coordinate value with a coordinate value of r k ⁇ 1 + t and having no priority information is given priority k and stored in the storage means;
  • the amplification candidate region having the smallest coordinate value with the coordinate value equal to or greater than r min and which has not been prioritized is given a priority rank k, and stored in the storage means.
  • n is an integer satisfying 3 ⁇ n
  • k is an integer satisfying 2 ⁇ k ⁇ n
  • t is a real number satisfying t>
  • r min and r max is the minimum value and the maximum value of the coordinate values of the n amplification candidate regions, respectively.
  • a primer design method for multiplex PCR in which priorities are assigned to amplification candidate regions on the same chromosomal DNA, and primers for PCR amplification of the amplification candidate regions are designed according to the priorities.
  • the above-mentioned priority order is given by a method for assigning priorities to amplification candidate regions on the same chromosomal DNA comprising the following steps, and a method for designing primers for multiplex PCR: A step in which identification information and coordinate information of n amplification candidate regions on the same chromosomal DNA are input via the input means and stored in the storage means;
  • the calculation means searches for the amplification candidate area having the maximum coordinate value from the identification information and coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches priority order information of the first priority to the amplification candidate area, A first priority setting step stored in the storage means; and
  • the calculation means uses the identification information R k-1 and the coordinate value r k of the amplification candidate area whose priority is k ⁇ 1 from
  • the amplification candidate region having the smallest coordinate value with the coordinate value equal to or greater than r min and which has not been prioritized is given a priority rank k, and stored in the storage means.
  • n is an integer satisfying 3 ⁇ n
  • k is an integer satisfying 2 ⁇ k ⁇ n
  • t is a real number satisfying t>
  • r min and r max is the minimum value and the maximum value of the coordinate values of the n amplification candidate regions, respectively.
  • a method for designing primers for multiplex PCR which gives priority to amplification candidate regions on the same chromosome, and designs primers for PCR amplification of the amplification candidate regions according to the priority
  • the above-mentioned priority order is given by a method for assigning priorities to amplification candidate regions on the same chromosomal DNA comprising the following steps, and a method for designing primers for multiplex PCR: Identification information of n amplification candidate regions on the same chromosomal DNA and information on the number of candidate primers are input via the input means and stored in the storage means; and The calculation means searches the amplification candidate area having the kth smallest number of candidate primers from the amplification candidate area identification information and primer candidate number information stored in the storage means, and the amplification candidate area has the k-th priority.
  • K-th priority order setting step for attaching priority order information and storing it in the storage means;
  • n is an integer that satisfies n ⁇ 2
  • k is an integer that satisfies 1 ⁇ k ⁇ n.
  • a k-th priority setting step of calculating, searching for an amplification candidate region with the k-th smallest mutation frequency difference, adding priority level k-th priority information to the amplification candidate region, and storing the priority level information in the storage means; The k-th priority setting process is repeated from k 1
  • the necessary number of regions can be ensured.
  • the number of amplification target regions that fail PCR amplification under the influence of chromosome deletion or DNA fragmentation can be reduced, and the number of regions necessary for analysis such as genotyping can be secured. Can do.
  • the number of amplification target regions that fail PCR amplification can be reduced by employing primers that can be used in more multiplex PCR with respect to amplification candidate regions with a small number of primer candidates, The number of areas required for analysis such as genotyping can be secured. Furthermore, according to the present invention, it is possible to achieve high accuracy with a smaller number of regions by increasing the ratio of the region in which the mutation frequency of the included mutation is close to 0.5 to the amplification target region.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing hardware used for setting priorities in the present invention.
  • FIG. 2 is a flowchart showing the priority setting method according to the first aspect of the present invention.
  • FIG. 3 is a flowchart showing another embodiment of the priority setting method according to the first aspect of the present invention.
  • FIG. 4 is a flowchart showing the priority setting method according to the second aspect of the present invention.
  • FIG. 5 is a flowchart showing another embodiment of the priority setting method according to the second aspect of the present invention.
  • FIG. 6 is a conceptual diagram showing a conventional priority setting method. Priorities are given to the amplification candidate regions in order from the smallest coordinate.
  • FIG. 7 is a conceptual diagram showing a priority setting method according to the first aspect of the present invention. Priority is given to the amplification candidate regions in a dichotomized manner. In order to amplify 5 out of 9 amplification candidate regions on the same chromosomal DNA, primers were designed for R01, R03, R05, R07, and R09.
  • FIG. 8 is a conceptual diagram showing a priority setting method according to the second aspect of the present invention. Priorities are assigned to the amplification candidate regions based on the distance threshold. In order to amplify 5 out of 9 amplification candidate regions on the same chromosomal DNA, primers were designed for R01, R02, R05, R06, and R09.
  • FIG. 9 is a conceptual diagram showing a conventional priority setting method. Priorities are given to the amplification candidate regions in order from the smallest coordinate. Of the nine candidate regions for amplification R01 to R09 on the same chromosomal DNA, two of R07 and R08 cannot be amplified.
  • FIG. 10 is a conceptual diagram for explaining the priority setting method according to the third aspect of the present invention. Priorities are given to amplification candidate regions in order from the smallest number of primer candidates.
  • FIG. 11 is a conceptual diagram showing a conventional priority setting method. Priorities are given to the amplification candidate regions in order from the smallest coordinate. When five candidate amplification regions out of nine are amplified and subjected to genotyping analysis, high analysis accuracy cannot be obtained.
  • FIG. 12 is a conceptual diagram for explaining the priority setting method according to the fourth aspect of the present invention. Priorities are given to the amplification candidate regions in order from the SNP mutation frequency close to 0.5. High amplification accuracy can be obtained by amplifying five amplification candidate regions out of nine and performing genotyping analysis.
  • FIG. 13 is a flowchart for explaining a primer design method (1) for multiplex PCR.
  • FIG. 14 is a flowchart for explaining a primer design method (2) for multiplex PCR. After setting the priority order of the amplification candidate regions, the target regions are selected in the order of priority, and primers are designed.
  • FIG. 15 is a flowchart for explaining a primer design method (3) for use in the multiplex PCR of the present invention. After setting the priority order of the amplification candidate regions, the target region is selected, the base sequences of the primer candidates are designed, and then each step is performed in the order of priority to design the primers.
  • FIG. 14 is a flowchart for explaining a primer design method (2) for multiplex PCR. After setting the priority order of the amplification candidate regions, the target regions are selected in the order of priority, and primers are designed.
  • FIG. 15 is a flowchart for explaining a primer design method (3) for use in the multiplex PCR of the present invention. After setting the priority order of the amplification candidate regions, the target region is selected, the base sequences of the primer candidates are designed, and then each step is
  • FIG. 16 is a flowchart for explaining a modification of the primer designing method (3) for use in the multiplex PCR of the present invention.
  • the priority order of the amplification candidate region is set, and the subsequent steps are performed in the order of priority to design the primer.
  • FIG. 17 is a diagram showing how priorities are assigned to amplification candidate regions in Comparative Example 1. Priorities were assigned to the amplification candidate regions in order from the smallest coordinate. Of the 10 candidate amplification regions for which primers were designed, X06, X07, and X08 are not amplified because of the lack of chromosomal DNA. Therefore, there is a possibility that the number of areas necessary for analysis may not be reached.
  • FIG. 18 is a diagram illustrating how to assign priorities to amplification candidate regions in the first embodiment. Priority was given to the amplification candidate regions in a dichotomy. X06, X07, and X08 on the chromosomal DNA are deficient but have no effect because they are not included in the 10 candidate amplification regions for which primers were designed.
  • FIG. 19 is a diagram illustrating how to assign priorities to amplification candidate regions in the second embodiment. Priorities were assigned to the amplification candidate regions based on the distance threshold. X06, X07, and X08 on the chromosomal DNA are deficient but have no effect because they are not included in the 10 candidate amplification regions for which primers were designed.
  • a range represented by using “to” means a range including both ends described before and after “to” in the range.
  • “A to B” for A and B represents a range including A and B.
  • the amplification candidate region is a region on the genomic DNA, and refers to a candidate region that is PCR-amplified for purposes such as genotyping or chromosome number quantification.
  • the apparatus (also referred to as “hardware” or “execution apparatus”) that executes the priority setting method according to the present invention will be described with reference to FIG.
  • priorities are set by calculating means (CPU; Central Processing Unit) 11, storage means (memory) 12, auxiliary storage means (storage) 13, input means (keyboard) 14, and display.
  • hardware including means (monitor) 16.
  • the apparatus may further include auxiliary input means (mouse) 15 and output means (printer) 17.
  • the input means (keyboard) 14 is a means for inputting instructions and data to the apparatus.
  • the auxiliary input means (mouse) 15 is used in place of or together with the input means (keyboard) 14.
  • the calculation means (CPU) 11 is a means for performing calculation processing.
  • the storage means (memory) 12 is a means for storing the result of the arithmetic processing of the arithmetic means (CPU) 11 and storing the input from the input means (keyboard) 14.
  • the auxiliary storage means (storage) 13 is a storage for storing an operating system, a program for determining the required number of loci, and the like. A part of the auxiliary storage means (storage) 13 can be used to expand the storage means (memory) 12 (virtual memory).
  • the first aspect of the present invention provides a solution to the first problem that an amplification target region that fails to be amplified by multiplex PCR occurs and the number of regions necessary for analysis such as genotyping cannot be secured. It is to provide. Hereinafter, description will be made with reference to FIGS. 1, 2, and 3 as appropriate.
  • a first aspect of the present invention is a primer for multiplex PCR, which prioritizes amplification candidate regions on the same chromosomal DNA and designs primers for PCR amplification of the amplification candidate regions according to the priority. This is the design method.
  • the priorities are given by a method of assigning priorities to amplification candidate regions on the same chromosomal DNA including the following steps.
  • the calculation means 11 searches for the amplification candidate area having the smallest coordinate value from the identification information and the coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches priority order information having the first priority to the amplification candidate area.
  • First priority order setting step (S12 in FIG. 2) stored in the storage means 12.
  • the calculation means 11 searches the amplification candidate area having the maximum coordinate value from the identification information and coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches priority order information of the second highest priority to the amplification candidate area.
  • Second priority setting step (S13 in FIG. 2) stored in the storage means 12.
  • the identification information of the amplification candidate region stored in the storage unit from the coordinate information and the priority information, the coordinate values priority is i-position r i DN is R i amplified candidates
  • An amplification candidate region whose region and priority are jth, whose coordinate value is rj , and whose identification name is Rj , and between the amplification candidate region Ri and the amplification candidate region Rj , Is searched for an amplification candidate region R i and an amplification candidate region R j that satisfy the condition that there is at least one amplification candidate region that has not yet been prioritized.
  • K-th priority setting step (S15 in FIG. 2).
  • n is an integer that satisfies 3 ⁇ n
  • k is an integer that satisfies 3 ⁇ k ⁇ n
  • i and j are 1 ⁇ i ⁇ k ⁇ 1, 1 ⁇ j ⁇ k ⁇ 1, and i R i and r j are r min ⁇ r i ⁇ r max , r min ⁇ r j ⁇ r max , and r i ⁇ r j , where r min and r max are It is the minimum value and the maximum value of the coordinate values of the amplification candidate regions.
  • how to assign the first and second priorities may be as follows.
  • the computing means 11 searches the amplification candidate area having the maximum coordinate value from the identification information and coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches priority order information of the first priority to the amplification candidate area.
  • the calculation means 11 searches for the amplification candidate area having the smallest coordinate value from the identification information and coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches priority order information of the second highest priority to the amplification candidate area.
  • Second priority setting step (S13 ′ in FIG. 3) stored in the storage means 12.
  • a first aspect of the present invention is a primer for multiplex PCR, which prioritizes amplification candidate regions on the same chromosomal DNA and designs primers for PCR amplification of the amplification candidate regions according to the priority.
  • the design method includes an amplification candidate region selection step, a first priority setting step, a second priority setting step, and a kth priority setting step, and the kth priority setting step is k
  • the amplification candidate region selection step is a step of selecting n amplification candidate regions on the same chromosomal DNA. Identification information and coordinate information of n amplification candidate regions are input (S11 in FIGS. 2 and 3).
  • n is an integer satisfying n ⁇ 3.
  • n is preferably 5 or more, more preferably 10 or more, still more preferably 50 or more, still more preferably 100 or more, and even more preferably 500 or more. If primers for multiplex PCR can be designed for more amplification candidate regions, it becomes easier to satisfy the required number of regions. It has already been described that even when priorities are given to all n amplification candidate regions, it is not always possible to design primers for multiplex PCR for all n amplification candidate regions. It is as follows.
  • the first priority order setting step is a step of assigning the highest priority to one of the two candidate amplification regions, the amplification candidate region Rmin and the amplification candidate region Rmax (S12 in FIG. 2; FIG. 3). S12 ′). That is, the first priority is given to the amplification candidate region Rmin , or the first priority is given to the amplification candidate region Rmax .
  • Second priority setting process In the second priority order setting step, among the two candidate amplification regions, ie, the candidate amplification region R min and the candidate amplification region R max , the second priority is given to the other one except the one given the first priority. It is a process (S13 in FIG. 2; S13 ′ in FIG. 3). That is, in the first priority setting step, when the first priority is given to the amplification candidate region Rmin , the second priority is given to the amplification candidate region Rmax , and the first priority setting is performed. in step, when attached to first place priority on amplification the candidate region R max becomes prioritizing 2-position amplification candidate region R min.
  • ⁇ Kth priority order setting step> In the k-th priority setting step, when the priorities from the first to the (k ⁇ 1) th are already assigned, the amplification candidate regions R i and the priority j are assigned the priority i.
  • the amplification candidate region having the coordinate value closest to the coordinate (r i + r j ) / 2 of the midpoint of the obtained amplification candidate region R j is given priority k (S14 to S16 in FIGS. 2 and 3).
  • r i and r j are the coordinates of the amplification candidate region R i and the amplification candidate region R j , respectively.
  • one set may be selected at random, but the smaller coordinate is given priority or the larger coordinate is given priority You may adopt a policy such as.
  • R 1 is R min or R max given the first priority in the first priority setting step
  • R 2 is given the second priority in the second priority setting step.
  • k is an integer satisfying 3 ⁇ k ⁇ n. i and j are 1 ⁇ i ⁇ k ⁇ 1, 1 ⁇ j ⁇ k ⁇ 1, and i ⁇ j. r i and r j are r min ⁇ r i ⁇ r max , r min ⁇ r j ⁇ r max , and r i ⁇ r j .
  • priority setting ends. Further, identification information and priority information of the amplification candidate region is output (S17 in FIGS. 2 and 3).
  • the priority order for the amplification candidate region is set so that the priority order does not overlap.
  • R06 which is the middle point between R05 and R07, was given the seventh priority.
  • R04 corresponding to the midpoint between R03 and R05 was given priority 8th.
  • 9 Since there are no amplification candidate regions that have not been ranked yet, ranking has been completed.
  • the second aspect of the present invention is another solution to the first problem that there is an amplification target region that fails to be amplified by multiplex PCR, and the number of regions necessary for analysis such as genotyping cannot be secured. It provides a means.
  • description will be given with reference to FIGS. 1, 4 and 5 as appropriate.
  • a second aspect of the present invention is a primer for multiplex PCR, which prioritizes amplification candidate regions on the same chromosomal DNA and designs primers for PCR amplification of the amplification candidate regions according to the priority.
  • This is the design method.
  • the priorities are given by a method of assigning priorities to amplification candidate regions on the same chromosomal DNA comprising the following steps.
  • the calculation means 11 searches for the amplification candidate area having the smallest coordinate value from the identification information and the coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches priority order information having the first priority to the amplification candidate area.
  • a first priority setting step (S22 in FIG. 4) stored in the storage unit 12.
  • n is an integer satisfying 3 ⁇ n
  • k is an integer satisfying 2 ⁇ k ⁇ n
  • t is a real number satisfying t>
  • r min and r max is the minimum value and the maximum value of the coordinate values of the n amplification candidate regions, respectively.
  • the method of assigning the first priority may be as follows.
  • the computing means 11 searches the amplification candidate area having the maximum coordinate value from the identification information and coordinate information of the amplification candidate area stored in the storage means, and attaches priority order information of the first priority to the amplification candidate area.
  • a second aspect of the present invention is a primer for multiplex PCR, which prioritizes amplification candidate regions on the same chromosomal DNA and designs primers for PCR amplification of the amplification candidate regions according to the priority.
  • the priorities are assigned by a method for assigning priorities.
  • the amplification candidate region selection step is a step of selecting n amplification candidate regions on the same chromosomal DNA.
  • n is an integer satisfying n ⁇ 3.
  • n is preferably 5 or more, more preferably 10 or more, still more preferably 50 or more, still more preferably 100 or more, and even more preferably 500 or more. If primers for multiplex PCR can be designed for more amplification candidate regions, it becomes easier to satisfy the required number of regions. It has already been described that even when priorities are given to all n amplification candidate regions, it is not always possible to design primers for multiplex PCR for all n amplification candidate regions. It is as follows.
  • an amplification candidate region having the minimum coordinate r min is defined as R min
  • an amplification candidate region having the maximum coordinate r max is defined as R max .
  • Identification information and coordinate information of n amplification candidate regions are input (S21 in FIGS. 4 and 5).
  • the first priority setting step is present between the two amplification candidate region of the amplification candidate region R min and the amplification candidate region R max, amplification with coordinates r 1 satisfying r min ⁇ r 1 ⁇ r max the candidate region R 1 is a step of attaching a first priority (S22 in FIG. 4; S22 'in FIG. 5). That is, the amplification candidate region R min may be given the first priority, the amplification candidate region R max may be given the first priority, or both of the amplification candidate region R min and the amplification candidate region R max . Different amplification candidate regions may be given the first priority.
  • ⁇ Kth priority order setting step> In the k-th priority setting step, when priorities from the first to the (k ⁇ 1) th are already assigned, the priority k is given to the amplification candidate regions satisfying the predetermined conditions (FIGS. 4 and 4). 5 of S23 to S28).
  • t is a real number that satisfies t> 0, and may be referred to as a “threshold value” in the present invention.
  • (1) -1 When there is an amplification candidate region that has not yet been prioritized
  • (1) -2 When there is no amplification candidate region that has not yet been prioritized
  • the priority ranking k is given to the amplification candidate region that has the smallest coordinate value with coordinates equal to or larger than (r k-1 + t) and has not yet been prioritized.
  • t represents the distance between the amplifying candidate region R k priority (k-1) position of amplification the candidate region R k-1 and priority k position. The larger t is, the larger the distance between R k-1 and R k is, and usually the influence on each other is smaller.
  • the priority ranking k is given to the amplification candidate region having the smallest coordinate value with the coordinate equal to or greater than r min and not yet prioritized.
  • k is an integer satisfying 2 ⁇ k ⁇ n.
  • t is a real number satisfying t> 0, and can be appropriately set according to the chromosomal DNA size or the coordinates of the amplification candidate region, but is preferably 100,000 or more, more preferably 1,000,000 or more, More preferably, it is 5,000,000 or more.
  • priority setting ends.
  • the priority order for the amplification candidate region is set so that the priority order does not overlap.
  • a primer for use in multiplex PCR wherein priorities are assigned to amplification candidate regions on the same chromosome, and primers for PCR amplification of the amplification candidate regions are designed according to the priorities. It is a design method.
  • the priorities are given by a method of assigning priorities to amplification candidate regions on the same chromosomal DNA including the following steps.
  • the calculation means 11 searches the amplification candidate area having the kth smallest number of primer candidates from the amplification candidate area identification information and primer candidate number information stored in the storage means, and the amplification candidate area has priority k-th rank.
  • n is an integer that satisfies n ⁇ 2
  • k is an integer that satisfies 1 ⁇ k ⁇ n.
  • a third aspect of the present invention is a primer for multiplex PCR, which prioritizes amplification candidate regions on the same chromosomal DNA and designs primers for PCR amplification of the amplification candidate regions according to the priority.
  • priorities are set such that the lower the number of primer candidates that can be designed in the amplification candidate region, the higher the priority.
  • the number of candidate primers is as shown in FIG. 9 or FIG.
  • the candidate primer is the base sequence of the candidate primer created in “Preparation of candidate primer base sequence” in the method of designing primers and the like described later.
  • a plurality of primer pairs for amplifying the amplification candidate region are created.
  • priorities are given to the amplification candidate regions in order from the smallest coordinate as in the prior art. When priorities are given in the order of coordinates, complementarity conditions become more severe as the number of amplification candidate regions increases.
  • FIG. 10 shows priorities of amplification candidate regions in order of increasing number of candidate primers according to the third aspect of the present invention. When priorities are given in ascending order of the number of candidate primers, the conditions for complementarity become more severe as the number of regions increases. -As a result of examining dimer formation, etc., primer pairs adopted as primers that can be used in multiplex PCR are not too few, and as a result, the possibility of successful amplification is higher than in the past.
  • a fourth aspect of the present invention provides a solution to the problem that high accuracy cannot be achieved even if the number of regions necessary for analysis such as genotyping can be secured. To do. Hereinafter, description will be made with reference to FIG. 1 as appropriate.
  • a fourth aspect of the present invention is a primer design method for multiplex PCR, in which priority is given to amplification candidate regions, and primers for PCR amplification of the amplification candidate regions are designed according to the priorities. .
  • the priorities are assigned by a method of assigning priorities to amplification candidate regions on chromosomal DNA including the following steps.
  • the mutation frequency difference of the amplification candidate region having the identification name R i and the mutation frequency VF i
  • n is an integer that satisfies n ⁇ 2
  • k is an integer that satisfies 1 ⁇ k ⁇ n.
  • the priority is given higher as the mutation frequency of the mutation included in the amplification candidate region is closer to 0.5.
  • a fourth aspect of the present invention is a primer design method for multiplex PCR, in which priority is given to amplification candidate regions, and primers for PCR amplification of the amplification candidate regions according to the priority are designed.
  • the priorities are assigned such that the priority is higher as the mutation frequency of mutations included in the amplification candidate region is closer to 0.5.
  • VNP of SNP Single Nucleotide Polymorphism; single nucleotide polymorphism.
  • F. Variariant Frequency; mutation frequency
  • ⁇ V. F. Absolute value of difference from mutation frequency 0.5
  • FIG. 11 and FIG. Prioritize amplification candidate regions from R01 to R09 from 1st to 9th, create primers for the top 5 amplification candidate regions, perform amplification by multiplex PCR, SNP typing, and mother-child determination, When calculating the accuracy of mother-child determination, the example shown in FIG. 11 has higher accuracy and lower accuracy than the example shown in FIG.
  • a primer for PCR amplification of the desired amplification candidate region is designed by the primer designing method used for multiplex PCR described below.
  • B Primers for generating at least one base sequence of candidate primers for PCR amplification of the target region based on the base sequences of the neighboring regions at both ends of the target region on the genomic DNA.
  • Candidate base sequence creation process For all the combinations for selecting two candidate primer base sequences from the candidate primer base sequences created in the candidate primer base sequence creating step, the comparison is made with respect to the two base sequences included in the combination.
  • a local alignment step of obtaining a local alignment score by performing pairwise local alignment under the condition that the partial sequence to be included includes the 3 ′ end of the two base sequences.
  • E Preliminarily including the 3 ′ ends of the two base sequences included in the combination for all the combinations for selecting the base sequences of the two candidate primers from the base sequences of the candidate primers selected in the first stage selection step.
  • a global alignment process in which a global alignment score is obtained by performing pair-wise global alignment on a base sequence with a set sequence length.
  • G Primer adopting step in which the candidate primer base sequence selected in both the first step selecting step and the second step selecting step is adopted as a primer base sequence for PCR amplification of the target region. .
  • both the steps (c) and (d) and the steps (e) and (f) are optional. May be in the same order or simultaneously. That is, after performing the step (c) and the step (d), the step (e) and the step (f) may be performed, or the step (e) and the step (f) are performed. Thereafter, the step (c) and the step (d) may be performed. The step (c) and the step (d) may be performed in parallel with the step (e) and the step (f). You may go.
  • step (e) and the step (c) are respectively The step e ′) and the following step (c ′) are preferable.
  • step (E ′) The 3 ′ ends of the two base sequences included in the above combinations are selected for all combinations that select the base sequences of the two candidate primers from the base sequences of the candidate primers created in the primer candidate base sequence creating step.
  • the said (e) process is the following (e ') process. It is preferable that (E ′) The 3 ′ ends of the two base sequences included in the above combinations are selected for all combinations that select the base sequences of the two candidate primers from the base sequences of the candidate primers created in the primer candidate base sequence creating step.
  • B 1 Base sequences of candidate primers for PCR amplification of the first target region are determined based on the base sequences of the neighboring regions at both ends of the first target region on the genomic DNA, respectively, First step of creating candidate primer sequences, one by one.
  • C 1 For all of the combinations for selecting two candidate primer sequences from the candidate primer sequences prepared in the first step of preparing the candidate primer sequences, the two candidate sequences included in the combination are selected.
  • the first step of local alignment in which a local alignment score is obtained by performing pairwise local alignment under the condition that the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the two base sequences.
  • D 1 A first step selection first step of performing a first step selection of a base sequence of candidate primers for PCR amplification of the first target region based on the local alignment score.
  • (E 1 ) 3 ′ end of two base sequences included in the above combinations for selecting all the base sequences of two candidate primers from the base sequences of candidate primers selected in the first step selection first step A first step of global alignment, in which a global alignment score is obtained by performing global alignment in a pairwise manner on a base sequence having a predetermined sequence length including (F 1 ) A second step selection first step of performing a second step selection of a primer candidate base sequence for PCR amplification of the first target region based on the global alignment score. (G 1 ) The base sequence of the primer candidate selected in both the first step selection first step and the second step selection first step is the base sequence of the primer for PCR amplification of the first target region.
  • First step of primer adoption which is adopted as a sequence.
  • B 2 base sequences of candidate primers for PCR amplification of the second target region based on the base sequences of the neighboring regions at both ends of the second target region on the genomic DNA, respectively, Second step of creating candidate primer sequences, one by one.
  • the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the two base sequences with respect to the two base sequences included in the combination.
  • the second step of local alignment in which a local alignment score is obtained by performing pairwise local alignment under the above condition.
  • D 2 First step selection second step of selecting the first step of the base sequence of candidate primers for PCR amplification of the second target region based on the local alignment score.
  • (E 2 ) Combination of selecting the candidate primer base sequences from the primer candidate base sequences selected in the first step selection second step and the primer base sequences already employed and the base sequence of one primer candidate And for all combinations that select the base sequences of one already adopted primer, global alignment is performed in a pair-wise manner with respect to the base sequences having a preset sequence length including the 3 ′ ends of the two base sequences included in the combination.
  • the second step of global alignment in which a global alignment score is obtained.
  • (F 2 ) A second step selection second step of performing a second step selection of a primer candidate base sequence for PCR amplification of the second target region based on the global alignment score.
  • (G 2 ) The base sequence of the primer for PCR amplification of the second target region using the base sequence of the candidate primer selected in both the first step selection second step and the second step selection second step 2nd step of primer adoption which is adopted as a sequence.
  • both the steps (c 1 ) and (d 1 ) both the steps (c 1 ) and (d 1 )
  • the steps (e 1 ) and (f 1 ) Both steps may be in any order or simultaneously. That is, after performing the step (c 1 ) and the step (d 1 ), the step (e 1 ) and the step (f 1 ) may be performed, or the step (e 1 ) and the step (f 1 ) After performing step (c 1 ) and step (d 1 ), step (c 1 ), step (d 1 ), step (e 1 ) and step (c 1 ) The step (f 1 ) may be performed in parallel.
  • the (e 1) step and the (f 1) after step, when performing said (c 1) step and the (d 1) step, the (e 1) step and the (c 1) Step are preferably the following (e 1 ′) step and the following (c 1 ′) step, respectively.
  • (E 1 ′) For all combinations for selecting the base sequences of the two candidate primers from the base sequences of the candidate primers created in the first step of creating the candidate primer base sequence, 3 of the two base sequences included in the combination 'First step of global alignment in which a global alignment score is obtained by performing pairwise global alignment on a base sequence having a predetermined sequence length including the end.
  • All the combinations for selecting the base sequences of the two candidate primers from the base sequences of the candidate primers selected in the second step selection first step are compared with the two base sequences included in the combination.
  • the first step of local alignment in which a local alignment score is obtained by performing pairwise local alignment under the condition that the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the two base sequences.
  • the a (c 1) step and the (d 1) step and the (e 1) step and the (f 1) step if performed in parallel, the above (e 1) step, following Preferably, the step (e 1 ′) is used.
  • (E 1 ′) For all combinations for selecting the base sequences of the two candidate primers from the base sequences of the candidate primers created in the first step of creating the candidate primer base sequence, 3 of the two base sequences included in the combination 'First step of global alignment in which a global alignment score is obtained by performing pairwise global alignment on a base sequence having a predetermined sequence length including the end.
  • both the steps (c 2 ) and (d 2 ) both the steps (c 2 ) and (d 2 )
  • the steps (e 2 ) and (f 2 ) Both steps may be in any order or simultaneously. That is, after performing the step (c 2 ) and the step (d 2 ), the step (e 2 ) and the step (f 2 ) may be performed, or the step (e 2 ) and the step (f) 2 ) After performing the step, the step (c 2 ) and the step (d 2 ) may be performed, the step (c 2 ) and the step (d 2 ), the step (e 2 ) and the step and the (f 2) step may be performed in parallel.
  • the (e 2 ) step and the (c 2 ) step are performed after the (e 2 ) step and the (f 2 ) step are performed.
  • the (e 2 ) step and the (c 2 ) step are performed.
  • (E 2 ′) A combination of selecting a primer candidate base sequence prepared from the primer candidate base sequence prepared in the second step of creating a primer candidate base sequence and a base sequence of two primer candidates from the already adopted primer base sequence and one primer candidate For all of the combinations for selecting the base sequence and the base sequence of one already adopted primer, pair-wise with respect to the base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ end of the two base sequences included in the combination.
  • the second step of global alignment in which global alignment is performed to obtain a global alignment score.
  • the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the two base sequences with respect to the two base sequences included in the combination.
  • the second step of local alignment in which a local alignment score is obtained by performing pairwise local alignment under the above condition.
  • step (e 2) step and the (d 2) step and the (e 2) step and the (f 2) process, if carried out concurrently, the above (e 2) step, the following The step (e 2 ′) is preferable.
  • (E 2 ′) A combination of selecting a primer candidate base sequence prepared from the primer candidate base sequence prepared in the second step of creating a primer candidate base sequence and a base sequence of two primer candidates from the already adopted primer base sequence and one primer candidate For all of the combinations for selecting the base sequence and the base sequence of one already adopted primer, pair-wise with respect to the base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ end of the two base sequences included in the combination The second step of global alignment, in which global alignment is performed to obtain a global alignment score.
  • the base of the primer for PCR amplification of the third and subsequent target regions not yet selected from the three or more target regions, wherein the at least one target region includes three or more target regions When the arrangement is adopted, the steps from the step (a 2 ) to the step (g 2 ) are repeated for the third and subsequent target regions.
  • the following steps are carried out after setting the priority order to the amplification candidate regions.
  • priorities are set for the amplification candidate regions after (b-0) the plurality of primer candidate base sequence creation steps and (c-1) the first local alignment step, and (c -1) Steps after the first local alignment step are performed.
  • B-0 base sequences of candidate primers for PCR amplification of each of the plurality of target regions based on the base sequences of the neighboring regions at both ends of each of the plurality of target regions on genomic DNA, A step of creating a plurality of candidate primer sequences each creating at least one each.
  • a priority order is set, which is the order in which primers are designed in the amplification candidate region.
  • (c-1) the first local alignment process and thereafter are performed.
  • priorities may be set before (a-0) the target region multiple selection step.
  • (C-1) Two candidate primers from the candidate nucleotide sequences for PCR amplification of the first target region having the highest priority among the candidate primer sequences prepared in the step of preparing a plurality of candidate primer sequences
  • the pair-wise local comparison is performed on the condition that the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the two base sequences with respect to the two base sequences included in the combination.
  • a first local alignment step in which alignment is performed to determine a local alignment score
  • (D-1) A first first-stage selection step of selecting a first stage of a candidate nucleotide sequence for PCR amplification of the first target region based on the local alignment score.
  • (E-1) For all combinations for selecting the base sequences of two candidate primers from the base sequences of candidate primers selected in the first first stage selection step, 3 of the two base sequences included in the combination 'First global alignment step of obtaining a global alignment score by performing global alignment pairwise on a base sequence having a predetermined sequence length including the end.
  • (F-1) A first second-stage selection step of performing second-stage selection of nucleotide sequences of candidate primers for PCR amplification of the first target region based on the global alignment score.
  • (G-1) PCR amplification of the nucleotide sequence of the candidate primer selected in both the first first stage selection step and the first second stage selection step with the first target region 1st primer adoption process employ
  • (C-2) Primer candidate base sequences for PCR amplification of the second target region with the second highest priority among the candidate primer base sequences created in the step of creating a plurality of candidate primer base sequences and those already adopted
  • the combination of selecting two candidate primer sequences from the primer sequence and the combination of selecting one candidate primer sequence and one already adopted primer sequence are two combinations included in the combination.
  • a second local alignment step of performing local alignment pairwise and obtaining a local alignment score under the condition that the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the two base sequences. .
  • (D-2) A second first-stage selection step of selecting a first stage of a candidate nucleotide sequence for PCR amplification of the second target region based on the local alignment score.
  • (E-2) a combination of selecting a candidate primer base sequence from the primer candidate base sequence selected in the second first-stage selection step and the already adopted primer base sequence and one primer candidate For all of the combinations for selecting the base sequence and the base sequence of one already adopted primer, pair-wise with respect to the base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ end of the two base sequences included in the combination
  • the second global alignment process where global alignment is performed to obtain a global alignment score.
  • (F-2) A second second-stage selection step of performing a second-stage selection of a base sequence of a candidate primer for PCR amplification of the second target region based on the global alignment score.
  • (G-2) PCR amplification of the second target region using the nucleotide sequences of candidate primers selected in both the second first stage selection step and the second second stage selection step Second primer adoption step that is adopted as the base sequence of the primer.
  • both the steps (c-1) and (d-1) the steps (e-1) and ( Both steps of step f-1) may be in any order or simultaneously. That is, after performing the step (c-1) and the step (d-1), the step (e-1) and the step (f-1) may be performed, or the step (e-1) The step (c-1) and the step (d-1) may be performed after the step and the step (f-1) are performed. Alternatively, the step (c-1) and the step (d-1) may be performed. The step, the step (e-1) and the step (f-1) may be performed in parallel.
  • the steps (e-1) and the step (d-1) are performed after the step (e-1) and the step (f-1) are performed
  • the steps (e-1) and The step (c-1) is preferably the following step (e′-1) and the following step (c′-1).
  • E′-1) Two primers from the candidate primer base sequences for PCR amplification of the first target region with the highest priority among the candidate primer base sequences created in the step of creating a plurality of candidate primer base sequences. For all of the combinations for selecting candidate base sequences, a global alignment score is obtained by performing a pair-wise global alignment on a base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ end of the two base sequences included in the combination.
  • a first local alignment step of obtaining a local alignment score by performing pairwise local alignment under the condition that the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the two base sequences.
  • the steps (e-1 Step) is preferably the following step (e′-1).
  • E′-1 Two primers from the candidate primer base sequences for PCR amplification of the first target region with the highest priority among the candidate primer base sequences created in the step of creating a plurality of candidate primer base sequences. For all of the combinations for selecting candidate base sequences, a global alignment score is obtained by performing a pair-wise global alignment on a base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ end of the two base sequences included in the combination. The first global alignment process for
  • both the steps (c-2) and (d-2) both the steps (c-2) and (d-2), the steps (e-2) and ( Both steps of step f-2) may be in any order or simultaneously. That is, after performing the step (c-2) and the step (d-2), the step (e-2) and the step (f-2) may be performed, or the step (e-2) After performing step (f-2) and step (f-2), step (c-2) and step (d-2) may be performed, step (c-1) and step (d-1) The step, the step (e-1) and the step (f-1) may be performed in parallel.
  • the steps (e-2) and the step (d-2) are performed after the step (e-2) and the step (f-2) are performed
  • the steps (e-2) and The step (c-2) is preferably the following step (e′-2) and the following step (c′-2).
  • (E′-2) Among the candidate primer sequences generated in the above-mentioned candidate primer sequence multiple generation step, the candidate primer sequences for PCR amplification of the second target region with the second highest priority and already adopted All of the combinations for selecting the base sequences of two candidate primers from the base sequences of the primers and the combinations for selecting the base sequence of one candidate primer and the base sequence of one already adopted primer are included in the above combinations 2
  • C′-2 Combination of selecting candidate primer base sequences from the candidate primer base sequences selected in the second second stage selection step and the already adopted primer base sequences and one candidate primer And all the combinations for selecting one of the primer sequences already adopted, the two partial sequences included in the combination are compared with the 3 'end of the two base sequences.
  • a second local alignment step in which a local alignment score is obtained by performing pair-wise local alignment under the condition that
  • the steps (e-2) Step) is preferably the following step (e′-2).
  • step (E′-2) Among the candidate primer sequences generated in the above-mentioned candidate primer sequence multiple generation step, the candidate primer sequences for PCR amplification of the second target region with the second highest priority and already adopted All of the combinations for selecting the base sequences of two candidate primers from the base sequences of the primers and the combinations for selecting the base sequence of one candidate primer and the base sequence of one already adopted primer are included in the above combinations 2
  • the at least one amplification candidate region includes three or more amplification candidate regions, three or more target regions are selected in the target region multiple selection step, and the primer candidate base sequence multiple generation step includes the 3 Adopting the base sequence of the primer for PCR amplification of the 3rd and subsequent target regions after the 3rd priority in the case of creating the candidate primer sequences for PCR amplification of each of the two or more target regions
  • the steps from the second local alignment step to the second primer adoption step are repeated for the third and subsequent target regions.
  • Design method (2) priority setting step S200
  • priority setting step S200 priority setting step S200
  • FIG. 14 it is shown as “priority setting”.
  • the priority order of amplification candidate regions is set.
  • target region selection step S101 (FIG. 13), the target region selection first step S201, the target region selection second step S211 (FIG. 14), and the multiple target region selection step S301 (FIGS. 15 and 16) are performed. Collectively, it may be simply referred to as “target region selection step”.
  • the (a) target region selection step is a step of selecting target regions in order of priority from the amplification candidate regions for which the priority is set.
  • target area selection first step is a step of selecting, as a first target region, an amplification candidate region having the highest priority from the amplification candidate regions set with priority.
  • target region selection second step is a step of selecting, as a second target region, an amplification candidate region having the highest priority from among amplification candidate regions that have not been selected among amplification candidate regions for which priority is set. It is.
  • amplification candidate regions are selected one by one in order of priority.
  • the (a-0) target region multiple selection step is a step of selecting a plurality of target regions in descending order of priority from the amplification candidate regions for which priority is set.
  • a plurality of amplification candidate regions are selected in order of priority. Preferably, all the amplification candidate regions for which priority is set are selected.
  • primer candidate base sequence creation step S102 (FIG. 13), primer candidate base sequence creation first step S202, primer candidate base sequence creation second step S212 (FIG. 14), and primer candidate base sequence multiple creation step S302. (FIGS. 15 and 16) may be collectively referred to simply as “primer candidate base sequence creation”.
  • the candidate primer base sequence creation step comprises the step of: Is a step of creating at least one each.
  • Design method (2) Primer candidate base sequence creation first step S202 and primer candidate base sequence creation second step S212
  • “primer candidate base sequence creation first” and “primer candidate base sequence creation second” are shown.
  • primer candidate base sequence creation the base sequence of the candidate primer for PCR amplification of the first target region is determined from the first target region on the genomic DNA.
  • the second candidate primer sequence creation step is for PCR amplification of the second target region
  • at least one base sequence of candidate primers is prepared based on the base sequences of the neighboring regions at both ends of the second target region on the genomic DNA.
  • a candidate candidate base sequence is created for one target region, a primer candidate is selected, and a primer is used, and the same process is repeated for the next target region.
  • the step (b-0) of preparing a plurality of candidate primer sequences includes a plurality of candidate sequences for PCR amplification of each of a plurality of target regions. At least one each is created based on the base sequences of the neighboring regions at both ends of each target region.
  • base sequences of primer candidates are created for all of a plurality of target regions, and selection and adoption are repeated in the subsequent steps.
  • the adjacent areas at both ends of the target area collectively refer to areas outside the 5 ′ end of the target area and areas outside the 3 ′ end of the target area.
  • the inside of the target area is not included in the neighboring area.
  • the length of the neighboring region is not particularly limited, but is preferably not more than a length that can be extended by PCR, and more preferably not more than the upper limit of the length of the DNA fragment desired to be amplified. In particular, it is preferable that the length is easy for concentration selection and / or sequence reading. You may change suitably according to the kind etc. of the enzyme (DNA polymerase) used in PCR.
  • the specific length of the neighboring region is preferably about 20 to 500 bases, more preferably about 20 to 300 bases, still more preferably about 20 to 200 bases, and still more preferably about 50 to 200 bases.
  • Primer design parameters When preparing the nucleotide sequence of candidate primers, the length of the primer, the GC content (refers to the total molar percentage of guanine (G) and cytosine (C) in all nucleobases), melting temperature (two This is the temperature at which 50% of the stranded DNA is dissociated to become single-stranded DNA, and is derived from the melting temperature, sometimes referred to as “Tm value.” The unit is “° C.”), and sequence bias The points to be noted in general primer designing methods are the same.
  • the primer length (number of nucleotides) is not particularly limited, but is preferably 15 mer to 45 mer, more preferably 20 mer to 45 mer, and still more preferably 20 mer to 30 mer. When the length of the primer is within this range, it is easy to design a primer excellent in specificity and amplification efficiency.
  • the GC content of the primer is not particularly limited, but is preferably 40 mol% to 60 mol%, more preferably 45 mol% to 55 mol%. When the GC content is within this range, problems of specificity and a decrease in amplification efficiency due to higher order structures are unlikely to occur.
  • the Tm value of the primer is not particularly limited, but is preferably in the range of 50 ° C to 65 ° C, more preferably in the range of 55 ° C to 65 ° C.
  • the difference in the Tm values of the primers is preferably 5 ° C. or less, more preferably 3 ° C. or less in the primer pair and primer set.
  • the Tm value is calculated using OLIGO Primer Analysis Software (Molecular Biology Insights) or Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribut/software/etc.). be able to.
  • Tm value (° C.) 2 (nA + nT) +4 (nC + nG)
  • the method for calculating the Tm value is not limited to these, and the Tm value can be calculated by various conventionally known methods.
  • the base sequence of the candidate primer is a sequence with no base bias overall. For example, it may be desirable to avoid partially GC rich sequences and partially AT rich sequences. It is also desirable to avoid T and / or C continuity (polypyrimidine) and A and / or G continuation (polypurine).
  • 3' terminal base sequence avoids a GC rich sequence or an AT rich sequence.
  • the 3 ′ terminal base is preferably G or C, but is not limited thereto.
  • a specificity check step for evaluating the specificity of the primer candidate base sequence may be performed (FIG. Not shown).
  • the specificity check is performed by performing local alignment between the base sequence of the chromosomal DNA and the base sequence of the primer candidate. If the local alignment score is less than a preset value, the base sequence of the primer candidate corresponds to the genomic DNA. It can be evaluated that the complementarity is low and the specificity is high.
  • it is desirable that the local alignment is also performed on a complementary strand of chromosomal DNA. This is because the primer is single-stranded DNA, whereas chromosomal DNA is double-stranded.
  • a complementary base sequence may be used instead of the primer candidate base sequence.
  • a homology search may be performed on the genomic DNA base sequence database using the candidate primer base sequences as query sequences.
  • a homology search tool for example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool: Blast) (Altschul, S. A., four others, “Basic Local Alignment Search Tool”, Journal of Molecular Biology, 1990, October, 215, pp. 403-410) and FASTA (Pearson, W. R., 1 other, “Improved tools for biological sequence comparison”, Bulletin of the National Academy of Sciences, National Academy of Sciences, 1988, 4 Month, Vol. 85, p.2444-2448).
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool: Blast
  • FASTA Pearson, W. R., 1 other, “Improved tools for biological sequence comparison”, Bulletin of the National Academy of Sciences, National Academy of Sciences, 1988, 4 Month, Vol. 85, p.2444-2448.
  • the threshold values of the score and the local alignment score are not particularly limited, and can be appropriately set depending on the length of the base sequence of the candidate primer and / or the PCR conditions.
  • nucleotide sequence of the candidate primer is complementary to the nucleotide sequence at an unexpected position on the chromosomal DNA and the specificity is low, when PCR is performed using the primer of the nucleotide sequence, Exclude artifacts because they may amplify artifacts.
  • the local alignment step S103 (FIG. 1), the first local alignment step S203 and the second local alignment step S213 (FIG. 14), and the first local alignment step S303 and the second local alignment step S313 (FIG. 1). 15 and FIG. 16) may be simply referred to as “local alignment process”.
  • the local alignment step includes the above combinations for all combinations for selecting two candidate primer base sequences from the candidate primer base sequences created in the candidate primer base sequence creating step. This is a step of obtaining a local alignment score by performing pairwise local alignment on the two contained base sequences under the condition that the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the two base sequences.
  • local alignment first step includes all combinations for selecting two primer candidate base sequences from the primer candidate base sequences created in the primer candidate base sequence creating first step. For the two base sequences included in the above combination, a local alignment score is obtained by performing pairwise local alignment under the condition that the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the two base sequences.
  • the second step of local alignment is the base of two candidate primers from the base sequence of the candidate primer created in the second step of creating the candidate primer base sequence and the base sequence of the primer already adopted Combination of sequence selection and one candidate primer
  • the partial sequence to be compared is the 3 ′ end of the two base sequences compared to the two base sequences included in the combination. This is a step of obtaining a local alignment score by performing pairwise local alignment under the condition of including.
  • Design method (3) first local alignment step S303 and second local alignment step S313) In FIG. 15 and FIG. 16, they are shown as “first local alignment” and “second local alignment”.
  • the first local alignment step is the first highest priority among the candidate primer base sequences created in the multiple candidate primer base sequence creating step.
  • the partial sequence to be compared with respect to the two base sequences included in the combination is the above And a local alignment score is obtained by performing pairwise local alignment under the condition that the 3 ′ ends of two base sequences are included, and (c-2) the second local alignment step is the above-mentioned primer candidate base Priority among the candidate primer sequences created in the multiple sequence creation process Base sequence of candidate primers for PCR amplification of second target region at position 2, combination of selecting base sequences of two primer candidates from base sequences of already adopted primers, base sequence of one primer candidate and 1
  • the partial sequence to be compared contains the 3 ′ end of the two base sequences with respect to the two base sequences included in the combination.
  • a step of performing local alignment in a pairwise manner to obtain a local alignment score is performed by performing pairwise local alignment under the condition that the 3 ′ ends of two base sequences are included.
  • the combination of base sequences for performing local alignment may be a combination selected by allowing duplication or a combination selected without allowing duplication, but primer / dimer formation between primers of the same base sequence If sex has not yet been evaluated, a combination selected to allow duplication is preferred.
  • the local alignment is an alignment performed on a partial sequence, and a portion having high complementarity can be locally examined.
  • the local alignment is usually performed under the condition that “the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the base sequence” unlike the local alignment performed on the base sequence.
  • the partial sequences to be compared include the 3 ′ ends of both base sequences.
  • the condition that “the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the base sequence”, that is, “the partial sequence to be compared starts from the 3 ′ end of one sequence and 3 ′ of the other sequence”.
  • the local alignment under the condition of “considering only the alignment that ends at the end”, an embodiment in which the partial sequences to be compared include the 3 ′ ends of both base sequences is preferable.
  • the local alignment may insert a gap.
  • Gap means base insertion and / or deletion (indel).
  • a case where bases are complementary between base sequence pairs is regarded as a match (match), and a case where they are not complementary is regarded as a mismatch (mismatch).
  • the alignment is performed so that a score is given to each of the match, mismatch, and indel, and the total score is maximized. What is necessary is just to set a score suitably.
  • the score may be set as shown in Table 1 below. In Table 1, “-” represents a gap (insertion and / or deletion (indel)).
  • dot matrix shown in Table 3 from the base sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2. Specifically, the base sequence of SEQ ID NO: 1 is arranged from left to right in the 5 ′ to 3 ′ direction, the base sequence of SEQ ID NO: 2 is arranged from the bottom to the top, in the direction of 5 ′ to 3 ′, and bases Is entered in a grid that is complementary to obtain a dot matrix shown in Table 3.
  • the alignment (pairwise alignment) can be obtained not only by the dot matrix method exemplified here but also by dynamic programming, word method, or other various methods.
  • first stage selection process S104 (FIG. 13), the first stage selection first process S204 and the first stage selection second process S214 (FIG. 14), and the n first first stage selection process S304 and The second first stage selection step S314 (FIGS. 15 and 16) may be collectively referred to simply as “first stage selection step”.
  • the first step selection step is a step of selecting the first step of the nucleotide sequence of candidate primers for PCR amplification of the target region based on the local alignment score. is there.
  • first step selection first step is a first step of a base sequence of candidate primers for PCR amplification of the first target region based on the local alignment score
  • first step selection second step is a step of selecting a first candidate nucleotide sequence for PCR amplification of the second target region based on the local alignment score. This is a step of selecting stages.
  • Design method (3) first first stage selection step S304 and second first stage selection step S314) In FIG. 15 and FIG. 16, they are shown as “first first stage selection” and “second first stage selection”.
  • the first first-stage selection step is to select candidate primers for PCR amplification of the first target region based on the local alignment score.
  • D-2) a second first-stage selection step is for performing PCR amplification of the second target region based on the local alignment score. This is a step of selecting a first candidate base sequence of a primer candidate.
  • a threshold value of the local alignment score (also referred to as “first threshold value”) is set in advance. If the local alignment score is less than the first threshold, it is determined that the combination of these two base sequences has low dimer formation, and the subsequent steps are performed. On the other hand, if the local alignment score is equal to or higher than the first threshold value, it is determined that the combination of these two base sequences has a high primer-dimer formation property, and the subsequent steps are not performed for the combination.
  • the first threshold is not particularly limited and can be set as appropriate.
  • the first threshold value may be set according to PCR conditions such as the amount of genomic DNA used as a template for the polymerase chain reaction.
  • the first threshold is set to “+3” in the example shown in the “local alignment step”.
  • the local alignment score is “+1” and less than the first threshold value “+3”
  • the global alignment step S105 (FIG. 13), the first global alignment step S205 and the second global alignment step S215 (FIG. 14), and the first global alignment step S305 and the second global alignment step S315 (FIG. 13). 15 and FIG. 16) may be simply referred to as “global alignment process”.
  • Design method (1) Global alignment step S105
  • this is shown as “global alignment”.
  • the global alignment step is included in the above combinations for all combinations for selecting the base sequences of the two candidate primers from the base sequences of the candidate primers selected in the first stage selection step.
  • a global alignment score is obtained by performing pairwise global alignment on a base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ ends of the two base sequences.
  • Global alignment first step is for all combinations for selecting two candidate primer base sequences from the candidate primer base sequences selected in the first step selection first step.
  • a step of obtaining a global alignment score by performing global alignment in a pair-wise manner on a base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ end of two base sequences included in the above combination.
  • the second alignment step includes a combination of selecting the candidate primer base sequences from the primer candidate base sequences selected in the first step selection second step and the primer sequences already employed and one primer candidate.
  • Base sequence and base of one already adopted primer A step of obtaining a global alignment score by performing global alignment in a pair-wise manner with respect to a base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ end of two base sequences included in the combination for all combinations for selecting columns. It is.
  • the first global alignment step includes two candidate primer base sequences from the candidate primer base sequences selected in the first first stage selection step.
  • the step of obtaining a global alignment score by performing global alignment in a pair-wise manner with respect to a base sequence having a predetermined sequence length including the 3 ′ end of two base sequences included in the above combination for all combinations to select Yes (e-2)
  • the second global alignment step consists of the candidate primer base sequence selected in the second first-stage selection step and the base sequence of two candidate primers from the primer base sequence already employed.
  • the global alignment score is the total of the primer candidates created in “Create Primer Candidate Base Sequence” (when the “Local Alignment Step” and “First Stage Selection Step” are performed first, the local alignment score is the first.
  • the global alignment score is the total of the primer candidates created in “Create Primer Candidate Base Sequence” (when the “Local Alignment Step” and “First Stage Selection Step” are performed first, the local alignment score is the first.
  • all of the candidate primers included in the combination are less than the threshold, all of the candidate primers included in the combination.
  • all of the already employed primers only if there are already employed primers
  • a primer is taken out, and a base sequence having a preset sequence length including the 3 ′ end is obtained by performing pair-wise global alignment.
  • the combination of base sequences for performing global alignment may be a combination selected by allowing duplication, or a combination selected without allowing duplication, but primer / dimer formation between primers of the same base sequence If sex has not yet been evaluated, a combination selected to allow duplication is preferred.
  • the global alignment is an alignment performed on the “entire sequence”, and the complementarity of the entire sequence can be examined.
  • the “entire sequence” is the entire base sequence having a preset sequence length including the 3 ′ end of the base sequence of the candidate primer.
  • a gap may be inserted in the global alignment.
  • Gap means base insertion and / or deletion (indel).
  • a case where the bases are complementary between the base sequence pairs is regarded as a match (match), and a case where the bases are not complementary is regarded as a mismatch (mismatch).
  • the alignment is performed so that a score is given to each of the match, mismatch, and indel, and the total score is maximized. What is necessary is just to set a score suitably. For example, the score may be set as shown in Table 1 above. In Table 1, “-” represents a gap (insertion and / or deletion (indel)).
  • the alignment (pairwise alignment) can be obtained by a dot matrix method, a dynamic programming method, a word method, or other various methods.
  • the second stage selection process S106 (FIG. 13), the second stage selection first process S206 and the second stage selection second process S216 (FIG. 14), and the first second stage selection process S306 and the first stage
  • the second stage selection process S316 (FIGS. 15 and 16) may be simply referred to as “second stage selection process”.
  • the second stage selection step is a step of performing the second step selection of the base sequences of candidate primers for PCR amplification of the target region based on the global alignment score. is there.
  • Second stage selection first step is the second step of the base sequence of candidate primers for PCR amplification of the first target region based on the global alignment score
  • second step selection second step is a second step of selecting a second candidate nucleotide sequence for PCR amplification of the second target region based on the global alignment score. This is a process of selecting stages.
  • the first second stage selection step is to select candidate primers for PCR amplification of the first target region based on the global alignment score.
  • the second second stage selection step is for performing PCR amplification of the second target region based on the global alignment score. This is a step of selecting the second stage of the nucleotide sequence of the candidate primer.
  • a global alignment score threshold (also referred to as “second threshold”) is set in advance. If the global alignment score is less than the second threshold, it is determined that the combination of these two base sequences has low dimer formation, and the subsequent steps are performed. On the other hand, if the global alignment score is greater than or equal to the second threshold value, it is determined that the combination of these two base sequences is highly dimer-forming, and the subsequent steps are not performed for that combination.
  • the second threshold value is not particularly limited and can be set as appropriate. For example, the second threshold value may be set according to PCR conditions such as the amount of genomic DNA used as a template for the polymerase chain reaction.
  • the base sequence of the preset base number including the 3 ′ end of the base sequence of each primer is pair-wise globally aligned.
  • the global alignment score obtained in this way can be made less than the second threshold.
  • the second threshold is set to “+3” in the example shown in the “global alignment step”.
  • the global alignment score is “ ⁇ 3”, which is less than the second threshold value “+3”. Therefore, the combination of the base sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 has low primer-dimer formation properties. Judgment can be made.
  • both the “global alignment process” and the “second stage selection process” are first performed, and the combination of the base sequences of the primers that have passed the “second stage selection process”
  • the greater the number of target regions and the greater the number of primer candidate base sequences the greater the effect of reducing the amount of calculation, and the overall processing speed can be increased.
  • ⁇ Amplification sequence length check process> For the combination of primer candidate base sequences determined to have low primer dimer formation in the “first stage selection process” and “second stage selection process”, the end of the primer candidate base sequence on the chromosomal DNA An amplification sequence length check step for calculating the distance between the parts and determining whether the distance is within a preset range may be performed (not shown). If the distance between the end portions of the base sequence is within a preset range, it can be determined that the combination of the base sequences of the candidate primers has a high possibility of appropriately amplifying the target region.
  • the distance between the ends of the primer candidate base sequences is not particularly limited, and can be appropriately set depending on the PCR conditions such as the type of the enzyme (DNA polymerase).
  • primer adoption step S107 (FIG. 13), primer adoption first step S207 and primer adoption second step S217 (FIG. 14), and first primer adoption step S307 and second primer adoption step S317 (FIG. 15 and FIG. 16) may be simply referred to as “primer adoption step”.
  • the primer adoption step is for PCR amplification of the target region using the nucleotide sequence of the candidate primer selected in both the first step selection step and the second step selection step. This is a step employed as the base sequence of the primer.
  • primer adoption first step is a step of selecting a candidate primer nucleotide sequence selected in both the first step selection first step and the second step selection first step. It is a step of adopting a first target region as a base sequence of a primer for PCR amplification
  • primer adoption second step is the first step selection second step and the second step selection second step. In any of these, the selected primer candidate base sequence is used as a primer base sequence for PCR amplification of the second target region.
  • Design method (3) first primer adoption step S307 and second primer adoption step S317)
  • first primer adoption and “second primer adoption”.
  • (g-1) the first primer adoption process was selected in both the first first stage selection process and the first second stage selection process.
  • the base sequences of candidate primers selected in both the selection step and the second second stage selection step are employed as the base sequences of primers for PCR amplification of the second target region.
  • the local alignment score obtained by performing pairwise local alignment for each primer candidate base sequence under the condition that the partial sequence to be compared includes the 3 ′ end of the base sequence is the first.
  • the global alignment score obtained by performing global alignment on a pairwise basis for a base sequence having a preset number of bases including the 3 ′ end of each primer candidate base sequence is less than the second threshold value. Is used as a primer base sequence for amplifying the target region.
  • the base sequence of the candidate primer shown in SEQ ID NO: 1 and the base sequence of the candidate primer shown in SEQ ID NO: 2 can be adopted as the base sequence of the primer for amplifying the target region.
  • a primer may be designed for the amplification candidate region of the next priority.
  • the design method (1) if a primer candidate base sequence for the amplification candidate region of the next priority is created in the primer candidate base sequence creation step S102, the process is performed from the local alignment step S103. If the primer candidate base sequence for the amplification candidate region of the next priority is not created, the amplification candidate region of the next priority has not been selected in the target region selection step S101, so the next in the target region selection step S101.
  • a primer candidate base sequence for the amplification candidate region is created, and then the local alignment step S103 and subsequent steps are performed.
  • the process repeats from the target area selection second step S211.
  • the design method (3) and its modification since the candidate candidate base sequences for the amplification candidate regions already selected in the target region multiple selection step S301 are created in the primer candidate base sequence multiple creation step S302, the second local It repeats from alignment process S313.
  • the feature points in the design of the primers and the like after prioritizing the amplification candidate regions are selected by selecting a plurality of specific target regions, searching for neighboring base sequences, and each of the extracted primer sets.
  • the purpose is to obtain a primer group that includes the target region as an amplification target and does not become complementary to each other by confirming complementarity and selecting a base sequence with less complementarity.
  • the feature point in confirming the complementarity of the base sequence of the primer is that the complementarity of the entire sequence is lowered by using local alignment, and the end of the base sequence of the primer is complemented by using global alignment. The point is to create a primer group so as to be low.
  • Priorities 1 to 17 were assigned to the amplification candidate regions X01 to X17 in ascending order of SNV coordinates.
  • the “priority” column of Table 8 shows the priority of each amplification candidate region.
  • the “priority” column of Table 8 shows the priority of each amplification candidate region.
  • X01 having the smallest SNV coordinate SNV coordinates: 20, 763, 642 was assigned the first priority.
  • X17 having the maximum SNV coordinate (SNV coordinates: 111, 098, 226) was assigned the second priority.
  • X12 SNV coordinates: 67, 800, 935) closest to the midpoint of X01 and X17 (coordinates: 65, 930, 934) was assigned the third priority.
  • X09 (SNV coordinates: 46, 946, 157) closest to the midpoint of X01 and X12 (coordinates: 44, 282, 288.5) was given the fourth priority.
  • X13 (SNV coordinates: 95, 858, 978) that is closest to the midpoint between X12 and X17 (coordinates: 89, 449, 580.5) was assigned the fifth priority.
  • X11 (SNV coordinates: 53, 608, 479) closest to the midpoint between X09 and X12 (coordinates: 57, 373, 546) was assigned the sixth priority.
  • X16 (SNV coordinates: 103, 397, 937) closest to the midpoint between X13 and X17 (coordinates: 103, 478, 602) was assigned the seventh priority.
  • X10 (SNV coordinates: 52, 544, 805) closest to the midpoint between X09 and X11 (coordinates: 50, 277, 318) was assigned the eighth priority.
  • X14 (SNV coordinates: 102, 366, 825) closest to the midpoint of X13 and X16 (coordinates: 99, 628, 457.5) was assigned the ninth priority.
  • X15 (SNV coordinates: 103, 396, 716) closest to the midpoint between X14 and X16 (coordinates: 102, 882, 381) was assigned a priority of 10th.
  • X05 (SNV coordinates: 36, 385, 031) closest to the midpoint between X01 and X09 (coordinates: 33,854, 899.5) was assigned the 11th priority.
  • X04 (SNV coordinates: 27, 845, 654) closest to the midpoint between X01 and X05 (coordinates: 28, 574, 336.5) was assigned a priority of 12th.
  • X08 (SNV coordinates: 36, 886, 469) closest to the midpoint of X05 and X09 (coordinates: 41, 665, 594) was assigned the 13th priority.
  • X02 (SNV coordinates: 24, 798, 120) closest to the midpoint between X01 and X04 (coordinates: 44, 282, 288.5) was assigned 14th priority.
  • X06 (SNV coordinates: 36, 743, 177) closest to the midpoint between X05 and X08 (coordinates: 36, 635, 750) was assigned 15th priority.
  • X03 (SNV coordinates: 25, 265, 103) closest to the midpoint between X02 and X04 (coordinates: 26, 321, 887) was assigned the 16th priority.
  • X07 (SNV coordinates: 36, 801, 415) closest to the midpoint between X06 and X08 (coordinates: 36, 814, 823) was assigned 17th priority.
  • Primers and primer pairs for amplifying the amplification candidate regions by multiplex PCR were designed in order from the amplification candidate region having the highest priority. As a result, it was possible to design primers to be used for multiplex PCR for the amplification candidate regions with the first to the tenth priorities.
  • the “primer” column in Table 10 shows the name, base sequence and sequence number of the primer constituting each primer pair.
  • FIG. 18 shows the physical arrangement of the amplification candidate regions on the chromosomal DNA and the priority order of each amplification candidate region. However, the distance between each area
  • X05 having a coordinate value of 32,845,654 or more obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinate of X04 and having the smallest coordinate value among the amplification candidate regions that have not yet been prioritized (SNV coordinate: 36, 385, 031) was given 3rd priority.
  • X09 SNV coordinates: SNV coordinates having the smallest coordinate value among the amplification candidate areas that have 41,385,031 or more coordinates obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinates of X05 and that have not yet been prioritized. 46, 946, 157) was given 4th priority.
  • X10 SNV coordinate: having the smallest coordinate value among the amplification candidate regions that have 51,946,157 or more obtained by adding 5,000,000 to the SN09 coordinate of X09 and that have not yet been prioritized. 52,544,805) was given the 5th priority.
  • X12 SNV coordinates: SNV coordinates: having the smallest coordinate value among the amplification candidate areas which have 57,544,805 or more coordinates obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinates of X10 and which have not yet been prioritized. 67, 800, 935).
  • X13 SNV coordinates: SNV coordinates: having the smallest coordinate value among the amplification candidate areas that have 72,800,935 or more obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinates of X12 and have not yet been prioritized. 95, 858, 978).
  • X14 SNV coordinates: SNV coordinates: the smallest coordinate value among the amplification candidate areas that have coordinates of 100,858,978 or more obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinates of X13 and that have not yet been prioritized. 102, 366, 825) was given the 8th priority.
  • X17 SNV coordinates: SNV coordinates: the smallest coordinate value of amplification candidate areas having 107,366,825 or more obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinates of X14 and not yet prioritized. 111, 098, 226) was given the 9th priority. Since there is no amplification candidate region that has 116,098,226 or more coordinates obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinate of X17, and has not yet been prioritized, the prioritization has not yet been achieved.
  • X02 SNV coordinates: 24, 798, 120 having the smallest coordinate value among the amplification candidate regions was given the priority ranking of 10.
  • X06 SNV coordinate: SNV coordinate: having the smallest coordinate value among the amplification candidate regions that have 29,798,120 or more obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinate of X02 and that have not yet been prioritized. 36, 743, 177) was given 11th priority.
  • X11 SNV coordinate: having the smallest coordinate value among the amplification candidate regions that have 41,743,177 or more obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinate of X06 and that have not yet been prioritized. 53, 608, 479) was given 12th priority.
  • X15 SNV coordinates: SNV coordinates: the smallest coordinate value among the amplification candidate areas that have coordinates of 58,608,479 or more obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinates of X11 and that have not yet been prioritized. 103, 396, 716) was given the 13th priority. Since there is no amplification candidate region that has a coordinate of 108,396,716 or more obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinate of X15 and has not yet been prioritized, it has not yet been prioritized. X03 (SNV coordinates: 25, 265, 103) having the smallest coordinate value among the amplification candidate regions was given the 14th priority.
  • X07 SNV coordinate: SNV coordinate: having the smallest coordinate value among the amplification candidate regions not yet assigned priority, having coordinates of 30,265,103 or more obtained by adding 5,000,000 to the SNV coordinate of X03 36, 801, 415) was given 15th priority.
  • X16 SNV coordinate: having the smallest coordinate value among the amplification candidate regions that have 41,801,415 or more coordinates obtained by adding 5,000,000 to the SN07 coordinate of X07 and that have not yet been prioritized. 103, 397, 937) was given the 16th priority.
  • Primers and primer pairs for amplifying the amplification candidate regions by multiplex PCR were designed in order from the amplification candidate region having the highest priority. As a result, it was possible to design primers to be used for multiplex PCR for the amplification candidate regions with the first to the tenth priorities.
  • the “primer” column of Table 11 shows the name, base sequence and sequence number of the primer constituting each primer pair.
  • FIG. 19 shows the physical arrangement of the amplification candidate regions on the chromosomal DNA and the priority order of each amplification candidate region. However, the distance between each area
  • Example 1 ⁇ Effects of Examples 1 and 2>
  • the purpose was to design primers and primer pairs to be subjected to multiplex PCR for all 17 candidate amplification regions. As a result of examining the primer specificity and primer-dimer formation properties, etc. Primers and primer pairs could only be designed for 10 candidate amplification regions.
  • the purpose of Example 1 and Example 2 was also to design primers and primer pairs to be subjected to multiplex PCR for all of the 17 candidate amplification regions. However, primer specificity and primer-dimer formation properties, etc. As a result, it was possible to design primers and primer pairs for 10 candidate amplification regions.
  • the number of regions from which the SNV base sequence information can be obtained is the number of primers and primer While the set is further reduced from 10 places where the set could be designed to 7 places, the first and second embodiments are not affected by the loss of X06 to X08.
  • the number of regions necessary for the analysis cannot be ensured due to the lack of X06 to X08, whereas in Examples 1 and 2, X06 to X08 are missing. Depending on this, there is no possibility that the number of areas necessary for the analysis cannot be secured.
  • amplification candidate regions 99 regions Y01 to Y99 including SNP (Single Nucleotide Polymorphism) were selected from the region on human chromosome 13.
  • SNP coordinates are GRCh37. Coordinates based on p13 (Genome Resource Consortium, human genome assembly data, Release 37, Patch 13; GenBank Accession no. CM000675.1). A method of assigning priorities to each amplification candidate region will be described later.
  • ⁇ Comparative example 2> ⁇ Priority setting ⁇ Priorities 1 to 99 were assigned to the amplification candidate regions Y01 to Y99 in ascending order of SNP coordinates. The priority of each amplification candidate region is shown in the “priority” column of Table 12, Table 13, and Table 14.
  • maternal / child determination is performed using n SNP loci having mutation frequencies p 1 , p 2 , p 3 ,..., Pn using cells that are surely derived from the mother and isolated cells that are suspected to be derived from the child.
  • M the average number of SNP loci with different genotypes among others, and the SNP loci with different genotypes in the mother and child
  • G the average number of If
  • F and G are given by the following equations. However, ignore the effects of allele dropouts and allele dropins.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Computing Systems (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、上記優先順位を付ける方法に特徴を有する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法が提供される。

Description

マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法
　本発明は、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法に関する。
　近年発達してきたＤＮＡシーケンサ等により遺伝子解析が手軽に行えるようになっている。しかし、ゲノムの総塩基長は一般に膨大であり、一方でシーケンサのリード能力には制約がある。そこで、必要な特定の遺伝子領域のみを増幅し、その塩基配列に限定してリードを行うことで、効率的かつ精度よく遺伝子解析を行う技術としてＰＣＲ法が普及している。特に、ある１つのＰＣＲ反応系に複数種類のプライマーを同時に供給することで、複数の遺伝子領域を選択的に増幅する手法をマルチプレックスＰＣＲと称する。
　マルチプレックスＰＣＲは少量のＤＮＡから複数の領域を効率よく増幅することから、非侵襲的な出生前診断を行うために有用な技術である。
　特許文献１には、同一染色体上に座標順に配置されたｍ個の増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲにおいて使用するプライマーの設計方法が記載されている。ここで、ｍは１以上の整数である。
　まず、増幅の対象となるＤＮＡの塩基配列から１つめの増幅候補領域Ｘ１に対応するプライマー候補を選び出す。このとき、プライマー候補は、プライマーの融解温度、ＧＣ含量、塩基配列の長さ、塩基配列の特異性、ヘアピン構造およびプライマー・ダイマーの形成のしにくさをあらわすスコアから選び出されるものとする。Ｔｍ（融解温度；Melting Temperature）、ＧＣ含量、および塩基配列の長さが、あらかじめ定めた範囲内に収まっている、増幅候補領域Ｘ１に対応するｎ個のプライマー候補のうち、塩基配列の特異性、ヘアピン構造及びプライマー・ダイマーの形成のしにくさから算出した、プライマー候補の優位性を示すスコアが最も高いものをＰ１１、２番目に高い候補をＰ１２、そしてｎ番目の候補をＰ１ｎと呼ぶことにする。２つめの増幅候補領域Ｘ２に対応するｎ’個のプライマー候補Ｐ２１，Ｐ２２，・・・，Ｐ２ｎ’も、上記と同様に選び出す。すべての増幅候補領域について同様の操作を繰り返し、ｍ番目の増幅候補領域Ｘｍに対応するｋ個のプライマー候補Ｐｍ１，Ｐｍ２，・・・，Ｐｍｋを選び出す。
　次に、選び出されたプライマー候補の中から反応に最適なプライマーの組み合わせを選び出すために、異なる増幅候補領域のプライマー同士が意図しない場所で相補的な塩基配列を持っていないか調べる。異なる増幅候補領域のプライマー同士でプライマー・ダイマーを形成する可能性が低いプライマーが、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーとなる。
特許第５０７９６９４号公報
　ところが、単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡのような冗長性が低い少量ＤＮＡサンプルに対する直接的なマルチプレックスＰＣＲを行う際には、相補性／特異性などのプライマー設計の条件が非常に厳しいため、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計しようとする増幅候補領域の全てに対して、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーを採用することができない場合がある。
　その結果、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーを採用することができた増幅候補領域（以下「増幅対象領域」という場合がある。）の数が少なくなり、以下のような問題が生じている。
　ひとつ目は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないという問題である。
　ふたつ目は、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができても、高い精度を達成できないという問題である。
　そこで、本発明は、単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡのような冗長性が低い少量ＤＮＡサンプルに対する直接的なマルチプレックスＰＣＲを行った場合であっても、必要な領域数を確保することができる、または、高い精度を達成することができる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、考察の末に、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じる原因として、染色体欠損またはＤＮＡ断片化などにより、増幅しようとする領域の少なくとも一部が存在しなくなっている場合があること、また、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーとしてｉｎ　ｓｉｌｉｃｏで採用されたプライマーであっても、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのマルチプレックスＰＣＲ実験系ではプライマー不適合が顕在化する場合があること、さらに、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができても、高い精度を達成できない原因として、増幅対象領域に含まれる変異の変異頻度が０．５に近くないと、所望の精度を達成するためにより多くの領域数を必要とすることを知見した。
　本発明者は、上記課題を解決すべくさらに検討を重ねた結果、増幅候補領域に対して優先順位を付け、優先順位に従って増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法において、有線順位が前後する増幅候補領域の間の距離を大きく確保することにより、染色体の一部欠損またはＤＮＡ断片化等の影響が及ぶ範囲を限定し、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域の数を減らせること、また、優先順位を、増幅候補領域において設計することができるプライマー候補の数が少ないほど優先順位が高くなるように付けることにより、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーとして採用されるプライマーの数を増やし、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域の数を減らせること、さらに、優先順位を、増幅候補領域に含まれる変異の変異頻度が０．５に近いほど優先順位が高くなるように付けることにより、より少ない領域数で所望の精度を達成することができることを知得し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の［１］～［６］を提供する。
　［１］　同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
　上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
　同一染色体ＤＮＡ上のｎ箇所の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
　演算手段が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；
　演算手段が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第２の優先順位設定工程；ならびに、
　演算手段が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｉ位であり座標値がｒｉであり識別名がＲｉである増幅候補領域および優先順位がｊ位であり座標値がｒｊであり識別名がＲｊである増幅候補領域であって、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊを検索し、次いで、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの中点の座標値ｒｉ－ｊをｒｉ－ｊ＝（ｒｉ＋ｒｊ）／２により算出し、さらに、上記中点の座標値ｒｉ－ｊに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する工程検索されたに優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
　上記優先順位ｋ位を付ける工程を、ｋ＝３からｎまで繰り返す。
　ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ－１、１≦ｊ≦ｋ－１、かつ、ｉ≠ｊであり、ｒｉおよびｒｊはｒｍｉｎ≦ｒｉ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｊ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｉ≠ｒｊであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
　［２］　同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
　上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
　同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
　演算手段が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；
　演算手段が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第２の優先順位設定工程；ならびに、
　演算手段が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｉ位であり座標値がｒｉであり識別名がＲｉである増幅候補領域および優先順位がｊ位であり座標値がｒｊであり識別名がＲｊである増幅候補領域であって、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊを検索し、次いで、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの中点の座標値ｒｉ－ｊをｒｉ－ｊ＝（ｒｉ＋ｒｊ）／２により算出し、さらに、上記中点の座標値ｒｉ－ｊに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する工程検索されたに優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
　上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝３からｎまで繰り返す。
　ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ－１、１≦ｊ≦ｋ－１、かつ、ｉ≠ｊであり、ｒｉおよびｒｊはｒｍｉｎ≦ｒｉ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｊ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｉ≠ｒｊであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
　［３］　同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
　上記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
　同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
　演算手段が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；ならびに、
　演算手段が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｋ－１位である増幅候補領域の識別名Ｒｋ－１および座標値ｒｋ－１を検索して、Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔを算出し、
　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ－１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がｒｋ－１＋ｔ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ－１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ＞ｒｍａｘであるとき、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
　上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝２からｎまで繰り返す。
　ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、ｒｋ－１≠ｒｋであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
　［４］　同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
　上記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
　同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
　演算手段が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；ならびに、
　演算手段が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｋ－１位である増幅候補領域の識別名Ｒｋ－１および座標値ｒｋ－１を検索し、Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔを算出し、
　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ－１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がｒｋ－１＋ｔ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ－１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ＞ｒｍａｘであるとき、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
　上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝２からｎまで繰り返す。
　ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、ｒｋ－１≠ｒｋであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
　［５］　同一染色体上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
　上記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
　同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報およびプライマー候補数情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；および、
　演算手段が記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報およびプライマー候補数情報から、プライマー候補数の数がｋ番目に少ない増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
　上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝１からｎまで繰り返す。
　ただし、ｎはｎ≧２を満たす整数であり、ｋは１≦ｋ≦ｎを満たす整数である。
　［６］　増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
　上記優先順位は、以下の工程を備える増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
　染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および変異頻度情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；ならびに、
　演算手段が記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および変異頻度情報から、識別名Ｒｉおよび変異頻度ＶＦｉを持つ増幅候補領域の変異頻度差＝｜０．５－ＶＦｉ｜を算出し、変異頻度差がｋ番目に小さい増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
　上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝１からｎまで繰り返す。
　ただし、ｎはｎ≧２を満たす整数であり、ｋは１≦ｋ≦ｎを満たす整数である。
　本発明によれば、単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡのような冗長性が低い少量ＤＮＡサンプルに対する直接的なマルチプレックスＰＣＲを行った場合であっても、必要な領域数を確保することができる、または、高い精度を達成することができる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法を提供することができる。
　また、本発明によれば、染色体欠損またはＤＮＡ断片化等の影響を受けてＰＣＲ増幅に失敗する増幅対象領域の数を減らすことができ、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができる。
　また、本発明によれば、プライマー候補の少ない増幅候補領域に対して、より多くのマルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーを採用してＰＣＲ増幅に失敗する増幅対象領域の数を減らすことができ、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができる。
　さらに、本発明によれば、含まれる変異の変異頻度が０．５に近い領域の増幅対象領域に占める割合を高めることにより、より少ない領域数で高い精度を達成することができる。
図１は、本発明における優先順位の設定において用いるハードウェアを表す概念図である。 図２は、本発明の本発明の第一の態様の優先順位の設定方法を表すフロー図である。 図３は、本発明の本発明の第一の態様の優先順位の設定方法の別の実施形態を表すフロー図である。 図４は、本発明の本発明の第二の態様の優先順位の設定方法を表すフロー図である。 図５は、本発明の本発明の第二の態様の優先順位の設定方法の別の実施形態を表すフロー図である。 図６は、従来の優先順位の設定方法を示す概念図である。増幅候補領域に対して、座標が小さい方から順に優先順位を付けている。同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域９箇所のうち５箇所を増幅しようとして、Ｒ０１、Ｒ０２、Ｒ０３、Ｒ０４、およびＲ０５についてプライマーを設計し、増幅を試みると、染色体ＤＮＡの増幅候補領域Ｒ０２、Ｒ０３およびＲ０４に該当する３箇所が欠損しているため、Ｒ０１およびＲ０５の高々２箇所しか増幅できない。 図７は、本発明の第一の態様の優先順位の設定方法を示す概念図である。増幅候補領域に対して、二分法的に優先順位を付けている。同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域９箇所のうち５箇所を増幅しようとして、Ｒ０１、Ｒ０３、Ｒ０５、Ｒ０７、およびＲ０９についてプライマーを設計し、増幅を試みると、染色体ＤＮＡの増幅候補領域Ｒ０２、Ｒ０３およびＲ０４に該当する３箇所が欠損しているため、Ｒ０１、Ｒ０５、Ｒ０７、およびＲ０９の４箇所を増幅することができる。 図８は、本発明の第二の態様の優先順位の設定方法を示す概念図である。増幅候補領域に対して、距離閾値に基づいて優先順位を付けている。同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域９箇所のうち５箇所を増幅しようとして、Ｒ０１、Ｒ０２、Ｒ０５、Ｒ０６、およびＲ０９についてプライマーを設計し、増幅を試みると、染色体ＤＮＡの増幅候補領域Ｒ０２、Ｒ０３およびＲ０４に該当する３箇所が欠損しているため、Ｒ０１、Ｒ０５、Ｒ０６、およびＲ０９の４箇所を増幅することができる。 図９は、従来の優先順位の設定方法を表す概念図である。増幅候補領域に対して、座標が小さい方から順に優先順位を付けている。同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域Ｒ０１～Ｒ０９の９箇所のうち、Ｒ０７およびＲ０８の２箇所を増幅することができない。 図１０は、本発明の第三の態様の優先順位の設定方法を解説するための概念図である。増幅候補領域に対して、プライマー候補の数が少ない方から順に優先順位を付けている。同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域Ｒ０１～Ｒ０９の９箇所を増幅することができる。 図１１は、従来の優先順位の設定方法を表す概念図である。増幅候補領域に対して、座標が小さい方から順に優先順位を付けている。９箇所中５箇所の増幅候補領域を増幅し、ジェノタイピング解析を行うと、高い解析精度が得られない。 図１２は、本発明の第四の態様の優先順位の設定方法を解説するための概念図である。増幅候補領域に対して、ＳＮＰの変異頻度が０．５に近い方から順に優先順位を付けている。９箇所中５箇所の増幅候補領域を増幅し、ジェノタイピング解析を行うと、高い解析精度が得られる。 図１３は、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（１）を説明するフロー図である。増幅候補領域の優先順位を設定した後、優先順位の順に対象領域を選択し、プライマーを設計する。 図１４は、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（２）を説明するフロー図である。増幅候補領域の優先順位を設定した後、優先順位の順に対象領域を選択し、プライマーを設計する。 図１５は、本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（３）を説明するフロー図である。増幅候補領域の優先順位を設定した後、対象領域を選択し、プライマー候補の塩基配列を設計した後、各工程を優先順位の順に行い、プライマーを設計する。 図１６は、本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（３）の変形例を説明するフロー図である。対象領域を選択し、プライマー候補の塩基配列を設計した後、増幅候補領域の優先順位を設定し、それ以降の工程を優先順位の順に行い、プライマーを設計する。 図１７は比較例１における増幅候補領域に対する優先順位の付け方を示す図である。増幅候補領域に対して、座標が小さい方から順に優先順位を付けた。プライマーを設計した１０箇所の増幅候補領域中、Ｘ０６、Ｘ０７、およびＸ０８については、染色体ＤＮＡの欠損のため、増幅しない。そのため、解析に必要な領域数に達しない可能性がある。 図１８は実施例１における増幅候補領域に対する優先順位の付け方を示す図である。増幅候補領域に対して、二分法的に優先順位を付けた。染色体ＤＮＡ上のＸ０６、Ｘ０７、およびＸ０８については、欠損しているが、プライマーを設計した１０箇所の増幅候補領域には含まれないため、影響がない。 図１９は実施例２における増幅候補領域に対する優先順位の付け方を示す図である。増幅候補領域に対して、距離閾値に基づいて優先順位を付けた。染色体ＤＮＡ上のＸ０６、Ｘ０７、およびＸ０８については、欠損しているが、プライマーを設計した１０箇所の増幅候補領域には含まれないため、影響がない。
　本発明において、「～」を用いて表される範囲は、その範囲に「～」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。例えば、ＡおよびＢについて「Ａ～Ｂ」はＡおよびＢを含む範囲を表す。
　また、本発明において、増幅候補領域は、ゲノムＤＮＡ上の領域であって、ジェノタイピングまたは染色体数定量などの目的のためにＰＣＲ増幅する候補の領域をいうものとする。
　本明細書において用いる主要な略語およびその意味は以下のとおりである。
　ＤＮＡ・・・デオキシリボ核酸（Deoxyribonucleic acid）
　ＰＣＲ・・・ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）
　ＳＮＰ・・・一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism）
　ＳＮＰｓ・・・ＳＮＰの複数形
　ＳＮＶ・・・一塩基変異（Single Nucleotide Variant）、ＳＮＰの上位概念
　Ｖ．Ｆ．・・・変異頻度（Variant Frequency）
　ΔＶ．Ｆ．・・・変異頻度差（変異頻度０．５との差の絶対値）
　ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ・・・「コンピュータを用いて」という意味（バイオインフォマティクス）
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ・・・ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏに対して、「ウェットな実験によって」という意味（バイオインフォマティクス）
［ハードウェア（実行装置）］
　本発明における優先順位の設定方法を実行する装置（「ハードウェア」または「実行装置」ともいう。）について、図１を参照しながら説明する。
　本発明において、優先順位の設定は、演算手段（ＣＰＵ；Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ，中央演算処理装置）１１、記憶手段（メモリ）１２、補助記憶手段（ストレージ）１３、入力手段（キーボード）１４、および表示手段（モニタ）１６を備えるハードウェア（装置）によって行われる。この装置は、さらに、補助入力手段（マウス）１５、および出力手段（プリンタ）１７等を備えていてもよい。
　それぞれの手段について説明する。
　入力手段（キーボード）１４は、装置に指示およびデータ等を入力する手段である。補助入力手段（マウス）１５は、入力手段（キーボード）１４に代えて、またはそれとともに、用いられる。
　演算手段（ＣＰＵ）１１は、演算処理を行う手段である。
　記憶手段（メモリ）１２は、演算手段（ＣＰＵ）１１の演算処理の結果を記憶したり、入力手段（キーボード）１４からの入力を記憶したりする手段である。
　補助記憶手段（ストレージ）１３は、オペレーティングシステム、必要ローカス数を決定するためのプログラムなどを保存するストレージである。補助記憶手段（ストレージ）１３は、その一部を記憶手段（メモリ）１２を拡張するために用いることもできる（仮想メモリ）。
［１．本発明の第一の態様］
　本発明の第一の態様は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないというひとつ目の問題に対する解決手段を提供するものである。以下では、図１、図２および図３を適宜参照しながら説明する。
　本発明の第一の態様は、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法である。
　上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。
　同一染色体ＤＮＡ上のｎ箇所の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段１４を介して入力され、記憶手段１２に記憶される工程（図２のＳ１１）。
　演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第１の優先順位設定工程（図２のＳ１２）。
　演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第２の優先順位設定工程（図２のＳ１３）。
　演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｉ位であり座標値がｒｉであり識別名がＲｉである増幅候補領域および優先順位がｊ位であり座標値がｒｊであり識別名がＲｊである増幅候補領域であって、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊを検索し、次いで、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの中点の座標値ｒｉ－ｊをｒｉ－ｊ＝（ｒｉ＋ｒｊ）／２により算出し、さらに、上記中点の座標値ｒｉ－ｊに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する工程検索されたに優先順位ｋ位を付け、記憶手段１２に記憶する、第ｋの優先順位設定工程（図２のＳ１５）。
　上記優先順位ｋ位を付ける工程を、ｋ＝３からｎまで繰り返す（図２のＳ１４およびＳ１６）。
　ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ－１、１≦ｊ≦ｋ－１、かつ、ｉ≠ｊであり、ｒｉおよびｒｊはｒｍｉｎ≦ｒｉ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｊ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｉ≠ｒｊであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
　または、図３に示すように、優先順位１位および２位の付け方は次のようにしてもよい。
　演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第１の優先順位設定工程（図３のＳ１２’）。
　演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第２の優先順位設定工程（図３のＳ１３’）。
　本発明の第一の態様は、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法において、増幅候補領域選択工程と、第１の優先順位設定工程と、第２の優先順位設定工程と、第ｋの優先順位設定工程とを備え、第ｋの優先順位設定工程はｋ＝３からｋ＝ｎまで逐次繰り返される優先順位を付ける方法によって、上記優先順位を付けることを特徴とする。
〈増幅候補領域選択工程〉
　増幅候補領域選択工程は、同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域を選択する工程である。増幅候補領域ｎ個の識別情報および座標情報を入力する（図２および図３のＳ１１）。
　ここで、ｎはｎ≧３を満たす整数である。
　ｎは、好ましくは５以上であり、より好ましくは１０以上であり、さらに好ましくは５０以上であり、いっそう好ましく１００以上であり、よりいっそう好ましくは５００以上である。より多くの増幅候補領域に対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができれば、必要領域数を満たすことがより容易となる。
　なお、ｎ個の増幅候補領域の全てに対して優先順位を付けたとしても、ｎ箇所全ての増幅候補領域に対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計できるとは限らないことは、既に記載したとおりである。
〈第１の優先順位設定工程／第２の優先順位設定工程〉
　上記ｎ個の増幅候補領域において、最小の座標ｒｍｉｎを持つ増幅候補領域をＲｍｉｎとし、最大の座標ｒｍａｘを持つ増幅候補領域をＲｍａｘとする。
《第１の優先順位設定工程》
　第１の優先順位設定工程は、上記増幅候補領域Ｒｍｉｎおよび上記増幅候補領域Ｒｍａｘの２つの増幅候補領域のうち、一方に優先順位１位を付ける工程である（図２のＳ１２；図３のＳ１２’）。
　すなわち、増幅候補領域Ｒｍｉｎに優先順位１位をつけるか、または、増幅候補領域Ｒｍａｘに優先順位１位を付けることとなる。
《第２の優先順位設定工程》
　第２の優先順位設定工程は、上記増幅候補領域Ｒｍｉｎおよび上記増幅候補領域Ｒｍａｘの２つの増幅候補領域のうち、上記優先順位１位を付けた一方を除く他方に優先順位２位を付ける工程である（図２のＳ１３；図３のＳ１３’）。
　すなわち、上記第１の優先順位設定工程において、増幅候補領域Ｒｍｉｎに優先順位１位をつけたときは、増幅候補領域Ｒｍａｘに優先順位２位を付けることとなり、上記第１の優先順位設定工程において、増幅候補領域Ｒｍａｘに優先順位１位を付けたときは、増幅候補領域Ｒｍｉｎに優先順位２位を付けることとなる。
〈第ｋの優先順位設定工程〉
　第ｋの優先順位設定工程では、既に１位から（ｋ－１）位までの優先順位が付けられた場合において、優先順位ｉ位が付けられた増幅候補領域Ｒｉおよび優先順位ｊ位が付けられた増幅候補領域Ｒｊの中点の座標（ｒｉ＋ｒｊ）／２に最も近い座標値を持つ増幅候補領域に優先順位ｋ位を付ける（図２および図３のＳ１４～Ｓ１６）。ここで、ｒｉおよびｒｊは、それぞれ、増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊの座標である。
　増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊの組合せが２組以上存在する場合は、無作為に１組を選択してもよいが、座標が小さい方を優先する、または座標が大きい方を優先する等のポリシーを採用してもよい。
　座標（ｒｉ＋ｒｊ）／２に最も近い座標値を持つ増幅候補領域が２箇所存在する場合は、無作為に１箇所を選択してもよいが、座標が小さい方を優先する、または座標が大きい方を優先する等のポリシーを採用してもよい。
　なお、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在する。また、Ｒ１は上記第１の優先順位設定工程において優先順位１位が付けられたＲｍｉｎまたはＲｍａｘであり、Ｒ２は上記第２の優先順位設定工程において優先順位２位が付けられたＲｍｉｎまたはＲｍａｘである。
　ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数である。
　ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ－１、１≦ｊ≦ｋ－１、かつ、ｉ≠ｊである。
　ｒｉおよびｒｊはｒｍｉｎ≦ｒｉ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｊ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｉ≠ｒｊである。
　第ｋの優先順位設定工程は、ｋ＝３からｋ＝ｎまで逐次繰り返す（図２および図３のＳ１４～Ｓ１６）。
　優先順位を付けることができる増幅候補領域が無くなったところで、優先順位の設定を終了する。
　さらに、増幅候補領域の識別情報および優先順位情報を出力する（図２および図３のＳ１７）。
　なお、増幅候補領域に対する優先順位の設定は、優先順位に重複が生じないように行う。
〈図７に基づく説明〉
　図７を参照しながら具体的に説明する。
　図７は、簡単のため、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域Ｒ０１～Ｒ０９の９箇所の増幅候補領域が、左から右に座標が大きくなる順で等間隔に並べられている。
（１）座標が最も小さいＲ０１に優先順位１位を付けた。
（２）座標が最も大きいＲ０９に優先順位２位を付けた。
（３）Ｒ０１とＲ０９の中点に該当するＲ０５に優先順位３位を付けた。
（４）Ｒ０１とＲ０５の中点に該当するＲ０３に優先順位４位を付けた。
（５）Ｒ０５とＲ０９の中点に該当するＲ０７に優先順位５位を付けた。
（６）Ｒ０１とＲ０３の中点に該当するＲ０２に優先順位６位を付けた。
（７）Ｒ０５とＲ０７の中点に該当するＲ０６に優先順位７位を付けた。
（８）Ｒ０３とＲ０５の中点に該当するＲ０４に優先順位８位を付けた。
（９）まだ順位を付けていない増幅候補領域がなくなったため、順位付けを終了した。
〈本発明の第一態様の有利な効果〉
　図６および図７を対比しながら説明する。
　図６および図７では、Ｒ０１～Ｒ０９の増幅候補領域に１位から９位までの優先順位を付ける。
　優先順位を付けた増幅候補領域のうち、優先順位に従って５箇所の増幅候補領域を増幅するためのプライマーを作製する。
　実際の染色体ＤＮＡでは、Ｒ０２、Ｒ０３、およびＲ０４が欠損している。
　そのため、図６では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、３箇所（Ｒ０２、Ｒ０３、およびＲ０４）の増幅に失敗する。増幅できる増幅候補領域は必要領域数に満たない可能性が大きい。
　しかし、図７では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、１箇所（Ｒ０３）の増幅に失敗するだけである。増幅できる増幅候補領域は必要領域数を満たす可能性が大きい。
［２．本発明の第二の態様］
　本発明の第二の態様は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないというひとつ目の問題に対する別の解決手段を提供するものである。以下では、図１、図４および図５を適宜参照しながら説明する。
　本発明の第二の態様は、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法である。
　上記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。
　同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段１４を介して入力され、記憶手段１２に記憶される工程（図４のＳ２１）。
　演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第１の優先順位設定工程（図４のＳ２２）。
　演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｋ－１位である増幅候補領域の識別名Ｒｋ－１および座標値ｒｋ－１を検索し、Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔを算出し（図４のＳ２４）、
　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ－１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がｒｋ－１＋ｔ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け（図４のＳ２５およびＳ２６）、記憶手段１２に記憶し、
　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ－１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け（図４のＳ２５およびＳ２７）、記憶手段１２に記憶し、
　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ＞ｒｍａｘであるとき、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け（図４のＳ２５およびＳ２７）、記憶手段１２に記憶する、第ｋの優先順位設定工程。
　上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝２からｎまで繰り返す（図４のＳ２３～Ｓ２８）。
　ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、ｒｋ－１≠ｒｋであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
　または、図５に示すように、優先順位１位の付け方は次のようにしてもよい。
　演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第１の優先順位設定工程（図５のＳ２２’）。
　本発明の第二の態様は、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法において、増幅候補領域選択工程と、第１の優先順位設定工程と、第ｋの優先順位設定工程とを備え、第ｋの優先順位設定工程はｋ＝２からｋ＝ｎまで逐次繰り返される優先順位を付ける方法によって、上記優先順位を付けることを特徴とする。
〈増幅候補領域選択工程〉
　増幅候補領域選択工程は、同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域を選択する工程である。
　ここで、ｎはｎ≧３を満たす整数である。
　ｎは、好ましくは５以上であり、より好ましくは１０以上であり、さらに好ましくは５０以上であり、いっそう好ましく１００以上であり、よりいっそう好ましくは５００以上である。より多くの増幅候補領域に対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができれば、必要領域数を満たすことがより容易となる。
　なお、ｎ個の増幅候補領域の全てに対して優先順位を付けたとしても、ｎ箇所全ての増幅候補領域に対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計できるとは限らないことは、既に記載したとおりである。
〈第１の優先順位設定工程〉
　上記ｎ個の増幅候補領域において、最小の座標ｒｍｉｎを持つ増幅候補領域をＲｍｉｎとし、最大の座標ｒｍａｘを持つ増幅候補領域をＲｍａｘとする。増幅候補領域ｎ個の識別情報および座標情報を入力する（図４および図５のＳ２１）。
　第１の優先順位設定工程は、上記増幅候補領域Ｒｍｉｎおよび上記増幅候補領域Ｒｍａｘの２つの増幅候補領域の間に存在し、ｒｍｉｎ≦ｒ１≦ｒｍａｘを満たす座標ｒ１を持つ増幅候補領域Ｒ１に優先順位１位を付ける工程である（図４のＳ２２；図５のＳ２２’）。
　すなわち、増幅候補領域Ｒｍｉｎに優先順位１位をつけてもよいし、増幅候補領域Ｒｍａｘに優先順位１位を付けてもよいし、増幅候補領域Ｒｍｉｎおよび増幅候補領域Ｒｍａｘのいずれとも異なる増幅候補領域に優先順位１位を付けてもよい。
　Ｒ１の座標ｒ１は、ｒｍｉｎ≦ｒ１≦ｒｍａｘを満たす限り、特に限定されないが、好ましくはｒ１＝ｒｍｉｎまたはｒ１＝ｒｍａｘであり、より好ましくはｒ１＝ｒｍｉｎである。
〈第ｋの優先順位設定工程〉
　第ｋの優先順位設定工程では、既に１位から（ｋ－１）位までの優先順位が付けられた場合において、所定の条件を満たす増幅候補領域に優先順位ｋ位を付ける（図４および図５のＳ２３～Ｓ２８）。
　上記所定の条件を満たす増幅候補領域は、以下のようにして決定される。
　優先順位（ｋ－１）位が付けられた増幅候補領域Ｒｋ－１の座標をｒｋ－１とし、それに閾値ｔを足した値「Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ」を考える。ここで、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、本発明において「閾値」という場合がある。
　増幅候補領域の座標の最大値はｒｍａｘであることから、次の（１）および（２）の２つの場合に分けられる。
（１）Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ≦ｒｍａｘである場合
（２）Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ＞ｒｍａｘである場合
　さらに、上記（１）の場合は、座標ｒｋ－１＋ｔとｒｍａｘの間にまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するか否かにより、次の（１）－１および（１）－２の２つの場合に分けられる。
（１）－１　まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在する場合
（１）－２　まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在しない場合
　上記（１）－１に該当する場合は、座標が（ｒｋ－１＋ｔ）以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付ける。
　この場合においては、ｔは優先順位（ｋ－１）位の増幅候補領域Ｒｋ－１と優先順位ｋ位の増幅候補領域Ｒｋとの間の距離を表す。ｔが大きいほど、Ｒｋ－１とＲｋとの間の距離も大きくなり、通常、互いに及ぼす影響は小さくなる。
　上記（１）－２または上記（２）に該当する場合は、座標がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付ける。
　ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数である。
　ｔはｔ＞０を満たす実数であり、染色体ＤＮＡサイズ、または増幅候補領域の座標などに応じて適宜設定することができるが、好ましくは１００，０００以上、より好ましくは１，０００，０００以上、さらに好ましくは５，０００，０００以上である。
　第ｋの優先順位設定工程は、ｋ＝２からｋ＝ｎまで逐次繰り返す。
　優先順位を付けることができる増幅候補領域が無くなったところで、優先順位の設定を終了する。
　なお、増幅候補領域に対する優先順位の設定は、優先順位に重複が生じないように行う。
〈図８に基づく説明〉
　図８を参照しながら具体的に説明する。
　図８は、簡単のため、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域Ｒ０１～Ｒ０９の９箇所の増幅候補領域が、左から右に座標が大きくなる順で等間隔に並べられている。この間隔を１，０００，０００（塩基対）とし、閾値ｔを４，０００，０００とする。
（１）座標が最も小さいＲ０１に優先順位１位を付けた。
（２）Ｒ０１の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当するＲ０５に優先順位２位を付けた。
（３）Ｒ０５の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当するＲ０９に優先順位３位を付けた。
（４）Ｒ０９の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当する増幅候補領域は存在しないため、Ｒ０１の座標以上で最も小さい座標を持ち、まだ優先順位を付けていない増幅候補領域であるＲ０２に優先順位４位を付けた。
（５）Ｒ０２の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当するＲ０６に優先順位５位を付けた。
（６）Ｒ０６の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当する増幅候補領域は存在しないため、Ｒ０１の座標以上で最も小さい座標を持ち、まだ優先順位を付けていない増幅候補領域であるＲ０３に優先順位６位を付けた。
（７）Ｒ０３の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当するＲ０７に優先順位７位を付けた。
（８）Ｒ０７の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当する増幅候補領域は存在しないため、Ｒ０１の座標以上で最も小さい座標を持ち、まだ優先順位を付けていない増幅候補領域であるＲ０４に優先順位８位を付けた。
（９）Ｒ０４の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当するＲ０８に優先順位９位を付けた。
（１０）まだ順位を付けていない増幅候補領域がなくなったため、順位付けを終了した。
〈本発明の第二態様の有利な効果〉
　図６および図８を対比しながら説明する。
　図６および図８では、Ｒ０１～Ｒ０９の増幅候補領域に１位から９位までの優先順位を付ける。
　優先順位を付けた増幅候補領域のうち、優先順位に従って５箇所の増幅候補領域を増幅するためのプライマーを作製する。
　実際の染色体ＤＮＡでは、Ｒ０２、Ｒ０３、およびＲ０４が欠損している。
　そのため、図６では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、３箇所（Ｒ０２、Ｒ０３、およびＲ０４）の増幅に失敗する。増幅できる増幅候補領域は必要領域数に満たない可能性が大きい。
　しかし、図８では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、１箇所（Ｒ０２）の増幅に失敗するだけである。増幅できる増幅候補領域は必要領域数を満たす可能性が大きい。
［３．本発明の第三の態様］
　本発明の第三の態様は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないというひとつ目の問題に対するさらに別の解決手段を提供するものである。以下では、図１を適宜参照しながら説明する。
　本発明の第三の態様は、同一染色体上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法である。
　上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。
　同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報およびプライマー候補数情報が入力手段１４を介して入力され、記憶手段１２に記憶される工程。
　演算手段１１が記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報およびプライマー候補数情報から、プライマー候補数の数がｋ番目に少ない増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第ｋの優先順位設定工程。
　上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝１からｎまで繰り返す。ただし、ｎはｎ≧２を満たす整数であり、ｋは１≦ｋ≦ｎを満たす整数である。
　これにより、上記増幅候補領域において設計することができるプライマー候補の数が少ないほど上記優先順位が高くなるように付けられる。
　本発明の第三の態様は、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法において、上記増幅候補領域において設計することができるプライマー候補の数が少ないほど上記優先順位が高くなるように、優先順位を付けることを特徴とする。
　図９および図１０を参照しながら説明する。
　Ｒ０１からＲ０９までの各増幅候補領域について、プライマー候補数は図９または図１０に示すとおりである。なおプライマー候補は、後述するプライマー等の設計をする方法の「プライマー候補塩基配列作成」において作成されたプライマー候補の塩基配列である。一般に、１つの増幅候補領域に対しては、その増幅候補領域を増幅するためのプライマーペアは、複数ペア作成される。
　図９は、従来どおり、座標が小さい方から順に増幅候補領域に優先順位を付けたものである。座標順に優先順位を付けた場合、増幅候補領域数が増加するにつれて相補性の条件が厳しくなるため、もともと候補数の少ないＲ０７およびＲ０８では、他の増幅候補領域を増幅するためのプライマーとのプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、マルチプレックスＰＣＲに使用可能なプライマーとして採用されるプライマーペアが少なくなり過ぎてしまい、その結果、増幅失敗の可能性が高くなる。
　図１０は、本発明の第三態様に従って、プライマー候補数が少ない順に増幅候補領域に優先順位を付けたものである。プライマー候補数の少ない順に優先順位を付けた場合、領域数が増加するにつれて相補性の条件が厳しくなるが、もともとの候補数が多いため、他の増幅候補領域を増幅するためのプライマーとのプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、マルチプレックスＰＣＲに使用可能なプライマーとして採用されるプライマーペアが少なくなり過ぎず、その結果、従来よりも増幅成功の可能性が高くなる。
［４］本発明の第四の態様
　本発明の第四の態様は、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができても、高い精度を達成できないという問題に対する解決手段を提供するものである。以下では、図１を適宜参照しながら説明する。
　本発明の第四の態様は、増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法である。
　上記優先順位は、以下の工程を含む染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。
　染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および変異頻度情報が入力手段１４を介して入力され、記憶手段１２に記憶される工程。
　演算手段１１が記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および変異頻度情報から、識別名Ｒｉおよび変異頻度ＶＦｉを持つ増幅候補領域の変異頻度差＝｜０．５－ＶＦｉ｜を算出し、変異頻度差がｋ番目に小さい増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第ｋの優先順位設定工程。
　上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝１からｎまで繰り返す。ただし、ｎはｎ≧２を満たす整数であり、ｋは１≦ｋ≦ｎを満たす整数である。
　これにより、上記増幅候補領域に含まれる変異の変異頻度が０．５に近いほど上記優先順位が高くなるように付けられる。
　本発明の第四の態様は、増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法において、上記増幅候補領域に含まれる変異の変異頻度が０．５に近いほど上記優先順位が高くなるように、上記優先順位を付けることを特徴とする。
　図１１および図１２を参照しながら説明する。
　Ｒ０１からＲ０９までの各増幅候補領域について、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；一塩基多型）のＶ．Ｆ．（Ｖａｒｉａｎｔ　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ；変異頻度）およびΔＶ．Ｆ．（変異頻度０．５との差の絶対値）は図１１および図１２に示すとおりである。
　Ｒ０１からＲ０９までの増幅候補領域に優先順位を１位から９位まで付け、上位５箇所の増幅候補領域に対してプライマーを作製し、マルチプレックスＰＣＲによる増幅、ＳＮＰタイピング、および母子判定を行い、母子判定の確度を算出すると、図１１に示される例の方が図１２に示される例よりも、確度が大きく、精度が悪い。図１１に示される例で確度を小さくし、精度を改善するためには、ＳＮＰ座位数、すなわち増幅候補領域数を増やす必要がある。特に、単一細胞から抽出した、微量で冗長性が無いゲノムＤＮＡなどでは、マルチプレックスＰＣＲによって同時に増幅する領域数または座位数を増やすことが難しい場合があることから、より少ない領域数または座位数でより高い精度を達成することが求められている。
［マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法］
　増幅候補領域にプライマーを設計する順序である優先順位を設定した後は、以下に説明するマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法によって、所望の増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する。
〈マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（１）〉
　本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（１）（以下、単に「設計方法（１）」という場合がある。）では、増幅候補領域に優先順位を設定した後、以下の工程を行う。
（ａ）優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位の順に対象領域を選択する、対象領域選択工程。
（ｂ）上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程。
（ｃ）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。
（ｄ）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程。
（ｅ）上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
（ｆ）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程。
（ｇ）上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程。
　ただし、上記（ａ）工程～上記（ｇ）工程のうち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程の両工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行った後、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行ってもよいし、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行ってもよいし、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行ってもよい。
　上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行う場合には、上記（ｅ）工程および上記（ｃ）工程は、それぞれ、下記（ｅ’）工程および下記（ｃ’）工程とすることが好ましい。
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
（ｃ’）上記第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。
　また、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ）工程は、下記（ｅ’）工程とすることが好ましい。
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
〈マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（２）〉
　本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（２）（以下、単に「設計方法（２）」という場合がある。）では、増幅候補領域に優先順位を設定した後、以下の工程を行う。
（ａ１）優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第１の対象領域として選択する、対象領域選択第１工程。
（ｂ１）上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第１工程。
（ｃ１）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程。
（ｄ１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第１工程。
（ｅ１）上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
（ｆ１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第１工程。
（ｇ１）上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第１工程。
（ａ２）優先順位が設定された増幅候補領域のうちまだ選択されていない増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第２の対象領域として選択する、対象領域選択第２工程。
（ｂ２）上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第２工程。
（ｃ２）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程。
（ｄ２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第２工程。
（ｅ２）上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
（ｆ２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第２工程。
（ｇ２）上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第２工程。
　ただし、上記（ａ１）工程～上記（ｇ１）工程のうち、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程の両工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行った後、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行った後、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程とを、並行して行ってもよい。
　上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程を行った後、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程を行う場合には、上記（ｅ１）工程および上記（ｃ１）工程は、それぞれ、下記（ｅ１’）工程および下記（ｃ１’）工程とすることが好ましい。
（ｅ１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
（ｃ１’）上記第二段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程。
　また、上記（ｃ１）工程および上記（ｄ１）工程と、上記（ｅ１）工程および上記（ｆ１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ１）工程は、下記（ｅ１’）工程とすることが好ましい。
（ｅ１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
　ただし、上記（ａ２）工程～上記（ｇ２）工程のうち、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程の両工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行った後、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行った後、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程とを、並行して行ってもよい。
　上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程を行った後、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程を行う場合には、上記（ｅ２）工程および上記（ｃ２）工程は、それぞれ、下記（ｅ２’）工程および下記（ｃ２’）工程とすることが好ましい。
（ｅ２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
（ｃ２’）上記第二段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程。
　また、上記（ｃ２）工程および上記（ｄ２）工程と、上記（ｅ２）工程および上記（ｆ２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ２）工程は、下記（ｅ２’）工程とすることが好ましい。
（ｅ２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
　さらに、上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含む場合であって、上記３つ以上の目的領域からまだ選択されていない第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記（ａ２）工程～上記（ｇ２）工程までの各工程を繰り返す。
〈マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（３）〉
　本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（３）（以下、単に「設計方法（３）」という場合がある。）では、増幅候補領域に優先順位を設定した後、以下の工程を行い、その変形例では、（ｂ－０）プライマー候補塩基配列複数作成工程の後、かつ、（ｃ－１）第１のローカルアラインメント工程の前に、増幅候補領域に優先順位を設定し、（ｃ－１）第１のローカルアラインメント工程以降の工程を行う。
（ａ－０）優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が高い順に複数の対象領域を選択する、対象領域複数選択工程。
（ｂ－０）上記複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程。
　（ｂ－０）プライマー候補塩基配列複数作成工程の後、増幅候補領域にプライマーを設計する順序である優先順位を設定する。設定後、（ｃ－１）第１のローカルアラインメント工程以降を行う。
　なお、（ｂ－０）プライマー候補塩基配列複数作成工程の後に代えて、（ａ－０）対象領域複数選択工程の前に、優先順位を設定してもよい。
（ｃ－１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程。
（ｄ－１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第１の第一段階選抜工程。
（ｅ－１）上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
（ｆ－１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第１の第二段階選抜工程。
（ｇ－１）上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程。
（ｃ－２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程。
（ｄ－２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第２の第一段階選抜工程。
（ｅ－２）上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
（ｆ－２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第２の第二段階選抜工程。
（ｇ－２）上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程。
　ただし、上記（ｃ－１）工程～上記（ｇ－１）工程のうち、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程の両工程と、上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程を行った後、上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程を行った後、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程と、上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程とを、並行して行ってもよい。
　上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程を行った後、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程を行う場合には、上記（ｅ－１）工程および上記（ｃ－１）工程は、それぞれ、下記（ｅ’－１）工程および下記（ｃ’－１）工程とすることが好ましい。
（ｅ’－１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
（ｃ’－１）上記第１の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程。
　また、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程と、上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ－１）工程は、下記（ｅ’－１）工程とすることが好ましい。
（ｅ’－１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
　ただし、上記（ｃ－２）工程～上記（ｇ－２）工程のうち、上記（ｃ－２）工程および上記（ｄ－２）工程の両工程と、上記（ｅ－２）工程および上記（ｆ－２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ－２）工程および上記（ｄ－２）工程を行った後、上記（ｅ－２）工程および上記（ｆ－２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ－２）工程および上記（ｆ－２）工程を行った後、上記（ｃ－２）工程および上記（ｄ－２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程と、上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程とを、並行して行ってもよい。
　上記（ｅ－２）工程および上記（ｆ－２）工程を行った後、上記（ｃ－２）工程および上記（ｄ－２）工程を行う場合には、上記（ｅ－２）工程および上記（ｃ－２）工程は、それぞれ、下記（ｅ’－２）工程および下記（ｃ’－２）工程とすることが好ましい。
（ｅ’－２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
（ｃ’－２）上記第２の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程。
　また、上記（ｃ－２）工程および上記（ｄ－２）工程と、上記（ｅ－２）工程および上記（ｆ－２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ－２）工程は、下記（ｅ’－２）工程とすることが好ましい。
（ｅ’－２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
　さらに、上記少なくとも１つの増幅候補領域が３つ以上の増幅候補領域を含み、上記対象領域複数選択工程において３つ以上の対象領域を選択し、かつ、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において上記３つ以上の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成した場合であって、優先順位３位以降の第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記第２のローカルアラインメント工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す。
〈各工程の説明〉
　本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（１）～（３）について、各工程を説明する。
《優先順位の設定工程》
（設計方法（１）：　優先順位の設定工程Ｓ１００）
　図１３において「優先順位の設定」として示す。
　本発明の優先順位の設定方法に従って、増幅候補領域の優先順位を設定する。
（設計方法（２）：　優先順位の設定工程Ｓ２００）
　図１４において「優先順位の設定」として示す。
　本発明の優先順位の設定方法に従って、増幅候補領域の優先順位を設定する。
（設計方法（３）：　優先順位の設定工程Ｓ３００）
　図１５および図１６において「優先順位の設定」として示す。
　本発明の優先順位の設定方法に従って、増幅候補領域の優先順位を設定する。
《対象領域選択工程》
　本明細書において、対象領域選択工程Ｓ１０１（図１３）、対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１（図１４）、ならびに複数対象領域選択工程Ｓ３０１（図１５および図１６）を総称して、単に「対象領域選択工程」という場合がある。
（設計方法（１）：　対象領域選択工程Ｓ１０１）
　図１３において「対象領域選択」として示す。
　設計方法（１）において、（ａ）対象領域選択工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位の順に対象領域を選択する工程である。
（設計方法（２）：　対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１）
　図１４において、「対象領域選択第１」および「対象領域選択第２」として示す。
　設計方法（２）において、（ａ１）対象領域選択第１工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第１の対象領域として選択する工程であり、（ａ２）対象領域選択第２工程は、優先順位が設定された増幅候補領域のうちまだ選択されていない増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第２の対象領域として選択する工程である。
　設計方法（２）では、増幅候補領域を優先順位の順に１つずつ選択する。
（設計方法（３）：　対象領域複数選択工程Ｓ３０１）
　図１５および図１６において、「対象領域複数選択」として示す。
　設計方法（３）およびその変形例において、（ａ－０）対象領域複数選択工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が高い順に複数の対象領域を選択する工程である。
　設計方法（３）およびその変形例では、増幅候補領域を優先順位の順に複数個選択する。好ましくは、優先順位が設定された全ての増幅候補領域を選択する。
《プライマー候補塩基配列作成工程》
　本明細書において、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２（図１３）、プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２（図１４）、ならびにプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２（図１５および図１６）を総称して、単に「プライマー候補塩基配列作成」という場合がある。
（設計方法（１）：　プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２）
　図１３において「プライマー候補塩基配列作成」として示す。
　設計方法（１）において、（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程は、対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
（設計方法（２）：　プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２）
　図１４において「プライマー候補塩基配列作成第１」および「プライマー候補塩基配列作成第２」として示す。
　設計方法（２）において、（ｂ１）プライマー候補塩基配列作成第１工程は、第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程であり、（ｂ２）プライマー候補塩基配列作成第２工程は、第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
　設計方法（２）では１つの対象領域について、プライマー候補の塩基配列の作成、プライマー候補の選抜、およびプライマーの採用を行い、次の１つの対象領域について、同様の工程を繰り返す。
（設計方法（３）：　プライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２）
　図１５および図１６において「プライマー候補塩基配列複数作成」として示す。
　設計方法（３）およびその変形例において、（ｂ－０）プライマー候補塩基配列複数作成工程は、複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する。
　設計方法（３）およびその変形例では、複数の対象領域のすべてについて、プライマー候補の塩基配列を作成し、以降の工程で選抜および採用を繰り返す。
（近傍領域）
　対象領域の両端のそれぞれの近傍領域とは、対象領域の５’端から外側の領域、および対象領域の３’端から外側の領域を総称していう。対象領域の内側は近傍領域には含まない。
　近傍領域の長さは特に限定されないが、ＰＣＲによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するＤＮＡフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および／またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。ＰＣＲにおいて用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは２０～５００塩基程度、より好ましくは２０～３００塩基程度、さらに好ましくは２０～２００塩基程度、いっそう好ましくは５０～２００塩基程度である。
（プライマーの設計パラメータ）
　また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの長さ、ＧＣ含量（全核酸塩基中のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の合計モル百分率をいう。）、融解温度（２本鎖ＤＮＡの５０％が解離して１本鎖ＤＮＡになる温度をいう。また、Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅに由来し、「Ｔｍ値」という場合もある。単位は「℃」である。）、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。
・プライマーの長さ
　プライマーの長さ（ヌクレオチド数）は、特に限定されないが、好ましくは１５ｍｅｒ～４５ｍｅｒ、より好ましくは２０ｍｅｒ～４５ｍｅｒ、さらに好ましくは２０ｍｅｒ～３０ｍｅｒである。プライマーの長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。
・プライマーのＧＣ含量
　プライマーのＧＣ含量は、特に限定されないが、好ましくは４０モル％～６０モル％、より好ましくは４５モル％～５５モル％である。ＧＣ含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。
・プライマーのＴｍ値
　プライマーのＴｍ値は、特に限定されないが、好ましくは５０℃～６５℃の範囲内、より好ましくは５５℃～６５℃の範囲内である。
　プライマーのＴｍ値の差は、プライマーペアおよびプライマーセットにおいて、好ましくは５℃以下、より好ましくは３℃以下とする。
　Ｔｍ値は、ＯＬＩＧＯ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）、または、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ－ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）等のソフトウエアを用いて計算することができる。
　また、プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの数（それぞれ、ｎＡ、ｎＴ、ｎＧおよびｎＣとする）から、下記式によって計算により求めることもできる。
　Ｔｍ値（℃）＝２（ｎＡ＋ｎＴ）＋４（ｎＣ＋ｎＧ）
　Ｔｍ値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってＴｍ値を算出することができる。
・プライマーの塩基の偏り
　プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にＧＣリッチな配列および部分的にＡＴリッチな配列を避けることが望ましい。
　また、Ｔおよび／またはＣの連続（ポリピリミジン）、ならびにＡおよび／またはＧの連続（ポリプリン）も避けることが望ましい。
・プライマーの３’末端
　さらに、３’末端塩基配列が、ＧＣリッチな配列またはＡＴリッチな配列を避けることが好ましい。３’末端塩基はＧまたはＣが好ましいが、これらに限定はされない。
《特異性チェック工程》
　「プライマー候補塩基配列作成」において作成した各プライマー候補の塩基配列の染色体ＤＮＡに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい（図示せず）。
　特異性のチェックは、染色体ＤＮＡの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメント・スコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムＤＮＡに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、染色体ＤＮＡの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが１本鎖ＤＮＡであるのに対して、染色体ＤＮＡは２本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。
　また、プライマー候補の塩基配列をクエリー配列として、ゲノムＤＮＡ塩基配列データベースに対して相同性検索をしてもよい。相同性検索ツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool：ブラスト）（Altschul, S. A.、外4名、“Basic Local Alignment Search Tool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215巻、ｐ．403-410）およびＦＡＳＴＡ（ファストエー）（Pearson, W. R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1988年、4月、第85巻、ｐ．2444-2448）等が挙げられる。相同性検索を行った結果として、ローカルアラインメントを得ることができる。
　スコア、およびローカルアラインメント・スコアの閾値は、いずれも、特に限定されず、プライマー候補の塩基配列の長さ、および／またはＰＣＲ条件等によって、適宜設定することができる。相同性検索ツールを使用する場合には、その相同性検索ツールの既定値を使ってもよい。
　例えば、スコアとして、マッチ（相補塩基）＝＋１、ミスマッチ（非相補塩基）＝－１、インデル（挿入および／または欠失）＝－３を採用し、閾値を＋１５に設定すること等が考えられる。
　プライマー候補の塩基配列が染色体ＤＮＡ上の想定外の位置の塩基配列と相補性を有し、特異性が低い場合には、その塩基配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った際に、対象領域ではなくアーティファクトを増幅する場合があるため、除外する。
《ローカルアラインメント工程》
　本明細書において、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３（図１）、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３（図１４）、ならびに第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３（図１５および図１６）を総称して、単に「ローカルアラインメント工程」という場合がある。
（設計方法（１）：　ローカルアラインメント工程Ｓ１０３）
　図１３において「ローカルアラインメント」として示す。
　設計方法（１）において、（ｃ）ローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
（設計方法（２）：　ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３）
　図１４において「ローカルアラインメント第１」および「ローカルアラインメント第２」として示す。
　設計方法（２）において、（ｃ１）ローカルアラインメント第１工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ２）ローカルアラインメント第２工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
（設計方法（３）：　第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３）
　図１５および図１６において「第１のローカルアラインメント」および「第２のローカルアラインメント」として示す。
　設計方法（３）およびその変形例において、（ｃ－１）第１のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ－２）第２のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
（ローカルアラインメントの方法）
　ローカルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
　組合せの総数は、ローカルアラインメントを行う塩基配列の総数をｘ個として、重複を許して選択した場合は、「ｘＨ２＝ｘ＋１Ｃ２＝（ｘ＋１）！／２（ｘ－１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｘＣ２＝ｘ（ｘ－１）／２」通りである。
　ローカルアラインメントは、部分配列に対して行うアラインメントであり、相補性の高い部分を局所的に調べることができる。
　ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の３’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにした。
　さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の３’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の３’末端から始まり他方の配列の３’末端で終わるアラインメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにする態様が好ましい。
　なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
　また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
　アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「－」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　例えば、以下の表２に示す配列番号１および２の塩基配列について、ローカルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　配列番号１および２の塩基配列から、表３に示すドット行列（ドットマトリクス）を作成する。具体的には、配列番号１の塩基配列を左から右へ、５’から３’の向きで並べ、配列番号２の塩基配列を下から上へ、５’から３’の向きで並べ、塩基が相補的であるグリッドに「・」を記入して、表３に示すドットマトリクスを得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すドットマトリクスから、以下の表４に示す、部分配列のアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得る（表３の斜線部分参照）。なお、表４中、マッチを「｜」で、ミスマッチを「：」で、それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　この（ペアワイズ）アラインメントには、マッチが９か所あり、ミスマッチが８か所あり、インデル（ギャップ）はない。
　したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくローカルアラインメント・スコアは、（＋１）×９＋（－１）×８＋（－１）×０＝＋１となる。
　なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
《第一段階選抜工程》
　本明細書において、第一段階選抜工程Ｓ１０４（図１３）、第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４（図１４）、ならびｎ第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４（図１５および図１６）を総称して、単に「第一段階選抜工程」という場合がある。
（設計方法（１）：　第一段階選抜工程Ｓ１０４）
　図１３において「第一段階選抜」として示す。
　設計方法（１）において、（ｄ）第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
（設計方法（２）：　第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４）
　図１４において「第一段階選抜第１」および「第一段階選抜第２」として示す。
　設計方法（２）において、（ｄ１）第一段階選抜第１工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ２）第一段階選抜第２工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
（設計方法（３）：　第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４）
　図１５および図１６において「第１の第一段階選抜」および「第２の第一段階選抜」として示す。
　設計方法（３）およびその変形例において、（ｄ－１）第１の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ－２）第２の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
（第１段階選抜の方法）
　ローカルアラインメント・スコアの閾値（「第１の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
　ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
　一方、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
　第１の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第１の閾値を設定してもよい。
　ここで、上記「ローカルアラインメント工程」に示した例において、第１の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
　上の例では、ローカルアラインメント・スコアは「＋１」であり、第１の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。
　なお、本工程は、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３、ローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３、第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３、または第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３においてローカルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。
《グローバルアラインメント工程》
　本明細書において、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５（図１３）、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５（図１４）、ならびに第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５（図１５および図１６）を総称して、単に「グローバルアラインメント工程」という場合がある。
（設計方法（１）：　グローバルアラインメント工程Ｓ１０５）
　図１３において「グローバルアラインメント」として示す。
　設計方法（１）において、（ｅ）グローバルアラインメント工程は、上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
（設計方法（２）：　グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５）
　図１４において「グローバルアラインメント第１」および「グローバルアラインメント第２」として示す。
　設計方法（２）において、（ｅ１）グローバルアラインメント第１工程は、上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ２）グローバルアラインメント第２工程は、上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
（設計方法（３）：　第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５）
　図１５および図１６において「第１のグローバルアラインメント」および「第２のグローバルアラインメント」として示す。
　設計方法（３）およびその変形例において、（ｅ－１）第１のグローバルアラインメント工程は、上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ－２）第２のグローバルアラインメント工程は、上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
（グローバルアラインメントの方法）
　グローバルアラインメント・スコアは、「プライマー候補塩基配列作成」で作成したプライマー候補の全部（「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」を先に行った場合において、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であるプライマー候補の組合せがあるときは、その組合せに含まれるプライマー候補の全部。）および既に採用したプライマーの全部（既に採用したプライマーが存在する場合に限る。）からなる群から２つのプライマーを取り出して、３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、求める。
　グローバルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
　組合せの総数は、グローバルアラインメントを行う塩基配列の総数をｘ個として、重複を許して選択した場合は、「ｘＨ２＝ｘ＋１Ｃ２＝（ｘ＋１）！／２（ｘ－１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｘＣ２＝ｘ（ｘ－１）／２」通りである。
　グローバルアラインメントは、「配列全体」に対して行うアラインメントであり、配列全体の相補性を調べることができる。
　ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
　なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
　また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
　アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「－」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
　例えば、以下の表５に示す配列番号１および２の塩基配列について、それぞれの３’末端の３塩基（大文字箇所）についてグローバルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　スコアが最大となるように、配列番号１の塩基配列の３’末端の３塩基（大文字箇所）および配列番号２の３’末端の３塩基（大文字箇所）の塩基配列についてグローバルアラインメントを行うと、以下の表６に示すアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得ることができる。なお、表６中、ミスマッチを「：」で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　この（ペアワイズ）アラインメントには、ミスマッチが３か所あり、マッチおよびインデル（ギャップ）はいずれもない。
　したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくグローバルアラインメント・スコアは、（＋１）×０＋（－１）×３＋（－１）×０＝－３となる。
　なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
《第二段階選抜工程》
　本明細書において、第二段階選抜工程Ｓ１０６（図１３）、第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６（図１４）、ならびに第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６（図１５および図１６）を総称して、単に「第二段階選抜工程」という場合がある。
（設計方法（１）：　第二段階選抜工程Ｓ１０６）
　図１３において「第二段階選抜」として示す。
　設計方法（１）において、（ｆ）第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
（設計方法（２）：　第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６）
　図１４において「第二段階選抜第１」および「第二段階選抜第２」として示す。
　設計方法（２）において、（ｆ１）第二段階選抜第１工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ２）第二段階選抜第２工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
（設計方法（３）：　第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６）
　図１５および図１６において「第１の第二段階選抜」および「第２の第二段階選抜」として示す。
　設計方法（３）およびその変形例において、（ｆ－１）第１の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ－２）第２の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
（第二段階選抜の方法）
　グローバルアラインメント・スコアの閾値（「第２の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
　グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
　一方、グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
　第２の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第２の閾値を設定してもよい。
　なお、プライマーの３’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることによって、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアを第２の閾値未満とすることができる。
　ここで、上記「グローバルアラインメント工程」に示した例において、第２の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
　上の例では、グローバルアラインメント・スコアは「－３」であり、第２の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。
　なお、本工程は、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５、グローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５、第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５、または第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５においてグローバルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。
　また、計算量を低減させるため、「グローバルアラインメント工程」および「第２段階選抜工程」の両工程を先に実施して、「第２段階選抜工程」を通過したプライマーの塩基配列の組合せに対して、「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」の両工程を実施することが好ましい。特に、対象領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
　これは、「グローバルアラインメント工程」では「予め設定した配列長」という短い長さの塩基配列についてグローバルアラインメントを行うので、３’末端を含むという条件下で塩基配列全体から相補性が高い部分配列を見つけるローカルアラインメント・スコアよりも計算量が少なく、高速に処理できるからである。なお、通常知られているアルゴリズムでは、同じ長さの配列に対するアラインメントであれば、ローカルアラインメントよりもグローバルアラインメントの方が高速であることが知られている。
《増幅配列長チェック工程》
　「第１段階選抜工程」および「第２段階選抜工程」においてプライマー・ダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列の組合せに対して、染色体ＤＮＡ上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい（図示せず）。
　塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列の組合せは、対象領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等のＰＣＲ条件によって、適宜設定することができる。例えば、１００～２００塩基（対）の範囲内、１２０～１８０塩基（対）の範囲内、１４０～１８０塩基（対）の範囲内、１４０～１６０塩基（対）の範囲内、１６０～１８０塩基（対）の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
《プライマー採用工程》
　本明細書において、プライマー採用工程Ｓ１０７（図１３）、プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７（図１４）、ならびに第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７（図１５および図１６）を総称して、単に「プライマー採用工程」という場合がある。
（設計方法（１）：　プライマー採用工程Ｓ１０７）
　図１３において「プライマー採用」として示す。
　設計方法（１）において、（ｇ）プライマー採用工程は、上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
（設計方法（２）：　プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７）
　図１４において「プライマー採用第１」および「プライマー採用第２」として示す。
　設計方法（２）において、（ｇ１）プライマー採用第１工程は、上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ２）プライマー採用第２工程は、上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
（設計方法（３）：　第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７）
　図１５および図１６において「第１のプライマー採用」および「第２のプライマー採用」として示す。
　設計方法（３）およびその変形例において、（ｇ－１）第１のプライマー採用工程は、上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ－２）第２のプライマー採用工程は、上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
（プライマー採用の方法）
　プライマー採用工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
　例えば、表７に示す配列番号１および２の塩基配列について、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することを考える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　既に記載したように、ローカルアラインメント・スコアは「＋１」であるから、第１の閾値である「＋３」未満であり、また、グローバルアラインメント・スコアは「－３」であるから、第２の閾値である「＋３」未満である。
　したがって、配列番号１で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号２で示されるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
《他の増幅候補領域のプライマー設計》
　１つの増幅候補領域に対してプライマーを採用した後、さらに次の優先順位の増幅候補領域に対してプライマーを設計してもよい。
　設計方法（１）においては、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、次の優先順位の増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていれば、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３から行う。次の優先順位の増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていなければ、対象領域選択工程Ｓ１０１において次の優先順位の増幅候補領域が選択されていなかったので、対象領域選択工程Ｓ１０１において次の優先順位の増幅候補領域を選択し、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、その増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列を作成した後、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３以降を行う。
　設計方法（２）においては、対象領域選択第２工程Ｓ２１１から繰り返す。
　設計方法（３）およびその変形例において、既に対象領域複数選択工程Ｓ３０１において選択した増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列がプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２において作成されているため、第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３から繰り返す。
《プライマー等の設計における特徴点》
　増幅候補領域に優先順位を付けた後のプライマー等の設計における特徴点は、概していえば、複数の特定の対象領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、対象領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得ることにある。
　プライマーの塩基配列の相補性の確認における特徴点は、ローカルアラインメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマーの塩基配列の端部に対して、グローバルアラインメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点にある。
　以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［比較例１／実施例１／実施例２］
〈増幅候補領域の選択〉
　増幅候補領域として、ヒト１３番染色体上の領域からＳＮＶ（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｖａｒｉａｎｔ；一塩基変異）を含む１７個所の領域Ｘ０１～Ｘ１７を選択した。
　以下の表８に、増幅候補領域の存在する染色体およびＳＮＶ座標と、比較例１、実施例１、および実施例２において付けた各増幅候補領域の優先順位を示す。ここで、ＳＮＶ座標はＧＲＣｈ３７．ｐ１３（Genome Resource Consortium, human genome assembly data, Release 37, Patch 13; GenBank Accession no. CM000675.1）に基づく座標である。なお、各増幅候補領域の優先順位の付け方については、後述する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
〈比較例１〉
《優先順位の設定》
　Ｘ０１～Ｘ１７の各増幅候補領域に対して、ＳＮＶ座標が小さい順に、それぞれ、優先順位１位～１７位を付けた。
　表８の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
《プライマーおよびプライマーペアの設計》
　優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
　その結果、優先順位１番目から１０番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた。
　表９の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
　また、図１７に、染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域の物理的配置および各増幅候補領域の優先順位を示す。ただし、図中の各領域間の距離は実際の染色体ＤＮＡ上の距離を反映していない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
〈実施例１〉
《優先順位の設定》
　Ｘ０１～Ｘ１７の増幅候補領域に対して、以下のとおり優先順位を付けた。
　表８の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
　ＳＮＶ座標が最小のＸ０１（ＳＮＶ座標：２０，７６３，６４２）に優先順位１位を付けた。
　ＳＮＶ座標が最大のＸ１７（ＳＮＶ座標：１１１，０９８，２２６）に優先順位２位を付けた。
　Ｘ０１とＸ１７の中点（座標：６５，９３０，９３４）に最も近いＸ１２（ＳＮＶ座標：６７，８００，９３５）に優先順位３位を付けた。
　Ｘ０１とＸ１２の中点（座標：４４，２８２，２８８．５）に最も近いＸ０９（ＳＮＶ座標：４６，９４６，１５７）に優先順位４位を付けた。
　Ｘ１２とＸ１７の中点（座標：８９，４４９，５８０．５）に最も近いＸ１３（ＳＮＶ座標：９５，８５８，９７８）に優先順位５位を付けた。
　Ｘ０９とＸ１２の中点（座標：５７，３７３，５４６）に最も近いＸ１１（ＳＮＶ座標：５３，６０８，４７９）に優先順位６位を付けた。
　Ｘ１３とＸ１７の中点（座標：１０３，４７８，６０２）に最も近いＸ１６（ＳＮＶ座標：１０３，３９７，９３７）に優先順位７位を付けた。
　Ｘ０９とＸ１１の中点（座標：５０，２７７，３１８）に最も近いＸ１０（ＳＮＶ座標：５２，５４４，８０５）に優先順位８位を付けた。
　Ｘ１３とＸ１６の中点（座標：９９，６２８，４５７．５）に最も近いＸ１４（ＳＮＶ座標：１０２，３６６，８２５）に優先順位９位を付けた。
　Ｘ１４とＸ１６の中点（座標：１０２，８８２，３８１）に最も近いＸ１５（ＳＮＶ座標：１０３，３９６，７１６）に優先順位１０位を付けた。
　Ｘ０１とＸ０９の中点（座標：３３，８５４，８９９．５）に最も近いＸ０５（ＳＮＶ座標：３６，３８５，０３１）に優先順位１１位を付けた。
　Ｘ０１とＸ０５の中点（座標：２８，５７４，３３６．５）に最も近いＸ０４（ＳＮＶ座標：２７，８４５，６５４）に優先順位１２位を付けた。
　Ｘ０５とＸ０９の中点（座標：４１，６６５，５９４）に最も近いＸ０８（ＳＮＶ座標：３６，８８６，４６９）に優先順位１３位を付けた。
　Ｘ０１とＸ０４の中点（座標：４４，２８２，２８８．５）に最も近いＸ０２（ＳＮＶ座標：２４，７９８，１２０）に優先順位１４位を付けた。
　Ｘ０５とＸ０８の中点（座標：３６，６３５，７５０）に最も近いＸ０６（ＳＮＶ座標：３６，７４３，１７７）に優先順位１５位を付けた。
　Ｘ０２とＸ０４の中点（座標：２６，３２１，８８７）に最も近いＸ０３（ＳＮＶ座標：２５，２６５，１０３）に優先順位１６位を付けた。
　Ｘ０６とＸ０８の中点（座標：３６，８１４，８２３）に最も近いＸ０７（ＳＮＶ座標：３６，８０１，４１５）に優先順位１７位を付けた。
《プライマーおよびプライマーセットの設計》
　優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
　その結果、優先順位１番目から１０番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた。
　表１０の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
　また、図１８に、染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域の物理的配置および各増幅候補領域の優先順位を示す。ただし、図中の各領域間の距離は実際の染色体ＤＮＡ上の距離を反映していない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
〈実施例２〉
《優先順位の設定》
　Ｘ０１～Ｘ１７の増幅候補領域に対して、以下のとおり優先順位を付けた。
　表１０の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
　Ｘ０１（ＳＮＶ座標：２０，７６３，６４２）に優先順位１位を付けた。
　Ｘ０１のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした２５，７６３，６４２以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０４（ＳＮＶ座標：２７，８４５，６５４）に優先順位２位を付けた。
　Ｘ０４のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした３２，８４５，６５４以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０５（ＳＮＶ座標：３６，３８５，０３１）に優先順位３位を付けた。
　Ｘ０５のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした４１，３８５，０３１以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０９（ＳＮＶ座標：４６，９４６，１５７）に優先順位４位を付けた。
　Ｘ０９のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした５１，９４６，１５７以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１０（ＳＮＶ座標：５２，５４４，８０５）に優先順位５位を付けた。
　Ｘ１０のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした５７，５４４，８０５以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１２（ＳＮＶ座標：６７，８００，９３５）に優先順位６位を付けた。
　Ｘ１２のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした７２，８００，９３５以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１３（ＳＮＶ座標：９５，８５８，９７８）に優先順位７位を付けた。
　Ｘ１３のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした１００，８５８，９７８以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１４（ＳＮＶ座標：１０２，３６６，８２５）に優先順位８位を付けた。
　Ｘ１４のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした１０７，３６６，８２５以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１７（ＳＮＶ座標：１１１，０９８，２２６）に優先順位９位を付けた。
　Ｘ１７のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした１１６，０９８，２２６以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域が存在しないため、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０２（ＳＮＶ座標：２４，７９８，１２０）に優先順位１０位を付けた。
　Ｘ０２のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした２９，７９８，１２０以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０６（ＳＮＶ座標：３６，７４３，１７７）に優先順位１１位を付けた。
　Ｘ０６のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした４１，７４３，１７７以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１１（ＳＮＶ座標：５３，６０８，４７９）に優先順位１２位を付けた。
　Ｘ１１のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした５８，６０８，４７９以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１５（ＳＮＶ座標：１０３，３９６，７１６）に優先順位１３位を付けた。
　Ｘ１５のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした１０８，３９６，７１６以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域が存在しないため、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０３（ＳＮＶ座標：２５，２６５，１０３）に優先順位１４位を付けた。
　Ｘ０３のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした３０，２６５，１０３以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０７（ＳＮＶ座標：３６，８０１，４１５）に優先順位１５位を付けた。
　Ｘ０７のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした４１，８０１，４１５以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１６（ＳＮＶ座標：１０３，３９７，９３７）に優先順位１６位を付けた。
　Ｘ１６のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした１０８，３９７，９３７以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域が存在しないため、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０８（ＳＮＶ座標：３６，８８６，４６９）に優先順位１７位を付けた。
《プライマーおよびプライマーセットの設計》
　優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
　その結果、優先順位１番目から１０番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた。
　表１１の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
　また、図１９に、染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域の物理的配置および各増幅候補領域の優先順位を示す。ただし、図中の各領域間の距離は実際の染色体ＤＮＡ上の距離を反映していない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
〈実施例１、２の効果〉
　比較例１では、１７個所の増幅候補領域のすべてに対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーおよびプライマーペアを設計することを目的としたが、プライマーの特異性およびプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、１０箇所の増幅候補領域に対してプライマーおよびプライマーペアを設計できるにとどまった。
　実施例１および実施例２でも、１７個所の増幅候補領域のすべてに対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーおよびプライマーペアを設計することを目的としたが、プライマーの特異性およびプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、１０箇所の増幅候補領域に対してプライマーおよびプライマーペアを設計できるにとどまった。
　鋳型ＤＮＡが増幅候補領域Ｘ０６～Ｘ０８を欠損している場合には、これらの領域を増幅することができないことから、比較例１では、ＳＮＶの塩基配列情報を得られる領域数が、プライマーおよびプライマーセットを設計することができた１０箇所から７箇所へと、さらに減ってしまうのに対し、実施例１および実施例２では、Ｘ０６～Ｘ０８が欠損したことによる影響を受けない。
　その結果、比較例１では、Ｘ０６～Ｘ０８が欠損していることによって、解析に必要な領域数を確保できない可能性が生じるに対し、実施例１および実施例２では、Ｘ０６～Ｘ０８が欠損していることによっては、解析に必要な領域数を確保できない可能性が生じない。
［比較例２／実施例３］
　増幅候補領域として、ヒト１３番染色体上の領域からＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；一塩基多型）を含む９９個所の領域Ｙ０１～Ｙ９９を選択した。
　以下の表１２、表１３、および表１４に、増幅候補領域の存在する染色体、ＳＮＰ座標、変異頻度（Ｖ．Ｆ．；Ｖａｒｉａｎｔ　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、および変異頻度差（ΔＶ．Ｆ：変異頻度０．５との差の絶対値）と、比較例２および実施例３において付けた各増幅候補領域の優先順位を示す。ここで、ＳＮＰ座標はＧＲＣｈ３７．ｐ１３（Genome Resource Consortium, human genome assembly data, Release 37, Patch 13; GenBank Accession no. CM000675.1）に基づく座標である。なお、各増幅候補領域の優先順位の付け方については、後述する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
〈比較例２〉
《優先順位の設定》
　Ｙ０１～Ｙ９９の各増幅候補領域に対して、ＳＮＰ座標が小さい順に、それぞれ、優先順位１位～９９位を付けた。
　表１２、表１３、および表１４の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
《プライマーおよびプライマーペアの設計》
　優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
　その結果、優先順位１番目から６０番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた。
　設計したプライマーおよびプライマーペアのうち、１０対のプライマーペアについて、表１４の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
〈実施例３〉
《優先順位の設定》
　Ｙ０１～Ｙ９９の各増幅候補領域に対して、各ＳＮＰのΔＶ．Ｆ．が小さい順、すなわち、変異頻度Ｖ．Ｆ．が０．５に近い順に、それぞれ、優先順位１位～９９位を付けた。
　表１２、表１３、および表１４の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
《プライマーおよびプライマーペアの設計》
　優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
　その結果、優先順位１番目から６０番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた。
　設計したプライマーおよびプライマーペアのうち、１０対のプライマーペアについて、表１６の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
〈実施例３の効果〉
　妊婦（母親）口腔から採取した妊婦（母親）由来の細胞と、妊婦（母親）の血液から採取した胎児（子）由来の有核赤血球細胞を用いて、表１２～１４に示す第１３番染色体上の９９箇所のＳＮＰ座位のうち、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた６０箇所のＳＮＰ座位を対象にジェノタイピングを行い、母子判定を行い、その確度を求めた。
　比較例２の方法に従ってプライマーおよびプライマーセットを設計した場合、および実施例３の方法に従ってプライマーおよびプライマーセットを設計した場合のいずれも、母子関係が肯定されたが、比較例２の場合の母子判定の確度は約１３．２％であり、誤差が大きく、精度が悪かったが、実施例３の場合の母子判定の確度は約４．５％であり、誤差が小さく、精度が良かった。
　なお、母子判定は、母親由来が確実な細胞と子由来が疑われる単離した細胞を用いて、変異頻度ｐ１，ｐ２，ｐ３，・・・，ｐｎであるｎ個のＳＮＰ座位を用いてＳＮＰ解析を行った場合の、ジェノタイプが異なるＳＮＰ座位の数をＭ、他人同士でのジェノタイプが異なるＳＮＰ座位の平均的な数をＦ、および母子でのジェノタイプが異なるＳＮＰ座位の平均的な数をＧとして、
　｜Ｍ－Ｆ｜＞｜Ｍ－Ｇ｜　であれば、子由来が疑われる単離した細胞は子に由来すると判定し、
　｜Ｍ－Ｆ｜＜｜Ｍ－Ｇ｜　であれば、子由来が疑われる単離した細胞はコンタミした他人に由来すると判定する。
　ここで、ＦおよびＧは、下記式により与えられる。ただし、アレル・ドロップアウトおよびアレル・ドロップインの影響を無視する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
　ここで、変異頻度ｐ（０≦ｐ≦１）であるＳＮＰ座位について、他人同士で異なるジェノタイプを有する確率ｆ（ｐ）および母子で異なるジェノタイプを有する確率ｇ（ｐ）は下記式で表されるものとする。ただし、ｑ＝１－ｐである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000020
　１１　演算手段（ＣＰＵ）
　１２　記憶手段（メモリ）
　１３　補助記憶手段（ストレージ）
　１４　入力手段（キーボード）
　１５　補助入力手段（マウス）
　１６　表示手段（モニタ）
　１７　出力手段（プリンタ）

Claims (6)

  1. 　同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
    　前記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
    　同一染色体ＤＮＡ上のｎ箇所の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
    　演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；
    　演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第２の優先順位設定工程；ならびに、
    　演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｉ位であり座標値がｒｉであり識別名がＲｉである増幅候補領域および優先順位がｊ位であり座標値がｒｊであり識別名がＲｊである増幅候補領域であって、前記増幅候補領域Ｒｉおよび前記増幅候補領域Ｒｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊを検索し、次いで、前記増幅候補領域Ｒｉおよび前記増幅候補領域Ｒｊの中点の座標値ｒｉ－ｊをｒｉ－ｊ＝（ｒｉ＋ｒｊ）／２により算出し、さらに、前記中点の座標値ｒｉ－ｊに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する工程検索されたに優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
    を含み、
    　前記優先順位ｋ位を付ける工程を、ｋ＝３からｎまで繰り返す。
    　ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ－１、１≦ｊ≦ｋ－１、かつ、ｉ≠ｊであり、ｒｉおよびｒｊはｒｍｉｎ≦ｒｉ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｊ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｉ≠ｒｊであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、前記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
  2. 　同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
    　前記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
    　同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
    　演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；
    　演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第２の優先順位設定工程；ならびに、
    　演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｉ位であり座標値がｒｉであり識別名がＲｉである増幅候補領域および優先順位がｊ位であり座標値がｒｊであり識別名がＲｊである増幅候補領域であって、前記増幅候補領域Ｒｉおよび前記増幅候補領域Ｒｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊを検索し、次いで、前記増幅候補領域Ｒｉおよび前記増幅候補領域Ｒｊの中点の座標値ｒｉ－ｊをｒｉ－ｊ＝（ｒｉ＋ｒｊ）／２により算出し、さらに、前記中点の座標値ｒｉ－ｊに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する工程検索されたに優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
    　前記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝３からｎまで繰り返す。
    　ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ－１、１≦ｊ≦ｋ－１、かつ、ｉ≠ｊであり、ｒｉおよびｒｊはｒｍｉｎ≦ｒｉ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｊ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｉ≠ｒｊであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、前記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
  3. 　同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
    　前記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
    　同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
    　演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；ならびに、
    　演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｋ－１位である増幅候補領域の識別名Ｒｋ－１および座標値ｒｋ－１を検索し、Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔを算出し、
    　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ－１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がｒｋ－１＋ｔ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
    　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ－１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
    　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ＞ｒｍａｘであるとき、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
    　前記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝２からｎまで繰り返す。
    　ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、ｒｋ－１≠ｒｋであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、前記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
  4. 　同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
    　前記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
    　同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
    　演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；ならびに、
    　演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｋ－１位である増幅候補領域の識別名Ｒｋ－１および座標値ｒｋ－１を検索して、Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔを算出し、
    　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ－１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がｒｋ－１＋ｔ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
    　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ－１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
    　Ｔ＝ｒｋ－１＋ｔ＞ｒｍａｘであるとき、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
    　前記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝２からｎまで繰り返す。
    　ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、ｒｋ－１≠ｒｋであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、前記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
  5. 　同一染色体上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
    　前記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
    　同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報およびプライマー候補数情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；および、
    　演算手段が記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報およびプライマー候補数情報から、プライマー候補数の数がｋ番目に少ない増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
    　前記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝１からｎまで繰り返す。
    　ただし、ｎはｎ≧２を満たす整数であり、ｋは１≦ｋ≦ｎを満たす整数である。
  6. 　増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
    　前記優先順位は、以下の工程を備える増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
    　染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および変異頻度情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；ならびに、
    　演算手段が記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および変異頻度情報から、識別名Ｒｉおよび変異頻度ＶＦｉを持つ増幅候補領域の変異頻度差＝｜０．５－ＶＦｉ｜を算出し、変異頻度差がｋ番目に小さい増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
    　前記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝１からｎまで繰り返す。
    　ただし、ｎはｎ≧２を満たす整数であり、ｋは１≦ｋ≦ｎを満たす整数である。
PCT/JP2017/032262 2016-09-29 2017-09-07 マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法 WO2018061695A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018542323A JP6768815B2 (ja) 2016-09-29 2017-09-07 マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
EP17855653.6A EP3521424A4 (en) 2016-09-29 2017-09-07 PROCESS FOR DESIGNING PRIMERS FOR MULTIPLEX PCR
CN201780060228.1A CN109790537A (zh) 2016-09-29 2017-09-07 供多重pcr的引物的设计方法
US16/368,488 US20190221292A1 (en) 2016-09-29 2019-03-28 Method for designing primers for multiplex pcr

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-192241 2016-09-29
JP2016192241 2016-09-29

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/368,488 Continuation US20190221292A1 (en) 2016-09-29 2019-03-28 Method for designing primers for multiplex pcr

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018061695A1 true WO2018061695A1 (ja) 2018-04-05

Family

ID=61763405

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/032262 WO2018061695A1 (ja) 2016-09-29 2017-09-07 マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20190221292A1 (ja)
EP (1) EP3521424A4 (ja)
JP (1) JP6768815B2 (ja)
CN (1) CN109790537A (ja)
WO (1) WO2018061695A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2018061699A1 (ja) * 2016-09-29 2019-06-24 富士フイルム株式会社 マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
WO2020013919A1 (en) * 2018-07-13 2020-01-16 Illumina, Inc. Systems and methods for multiplex pcr primer selection
KR20200030166A (ko) * 2018-09-12 2020-03-20 한국과학기술정보연구원 표적 서열 증폭용 올리고 뉴클레오타이드 및 이를 이용한 표적 서열의 증폭 방법
EP3421608B1 (en) * 2016-02-24 2022-03-09 FUJIFILM Corporation Chromosome number quantification method
WO2024047992A1 (ja) * 2022-08-31 2024-03-07 富士フイルム株式会社 アンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーの設計方法、製造方法、設計装置、設計プログラムおよび記録媒体

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
EP2820158B1 (en) 2012-02-27 2018-01-10 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
GB2546833B (en) 2013-08-28 2018-04-18 Cellular Res Inc Microwell for single cell analysis comprising single cell and single bead oligonucleotide capture labels
CN107208158B (zh) 2015-02-27 2022-01-28 贝克顿迪金森公司 空间上可寻址的分子条形编码
JP7508191B2 (ja) 2015-03-30 2024-07-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー コンビナトリアルバーコーディングのための方法および組成物
WO2016172373A1 (en) * 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
EP3347465B1 (en) 2015-09-11 2019-06-26 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
CA3034924A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
WO2018144240A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Cellular Research, Inc. Selective amplification using blocking oligonucleotides
US20180237853A1 (en) * 2017-02-19 2018-08-23 Yan Wang Methods, Compositions and Kits for Detection of Mutant Variants of Target Genes
US10676779B2 (en) 2017-06-05 2020-06-09 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CN112272710A (zh) 2018-05-03 2021-01-26 贝克顿迪金森公司 高通量多组学样品分析
EP3861134B1 (en) 2018-10-01 2024-09-04 Becton, Dickinson and Company Determining 5' transcript sequences
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
EP3894552A1 (en) 2018-12-13 2021-10-20 Becton, Dickinson and Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11661631B2 (en) 2019-01-23 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides associated with antibodies
CN113454234A (zh) 2019-02-14 2021-09-28 贝克顿迪金森公司 杂合体靶向和全转录物组扩增
WO2021016239A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
US11773436B2 (en) 2019-11-08 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length V(D)J information for immune repertoire sequencing
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
CN115605614A (zh) 2020-05-14 2023-01-13 贝克顿迪金森公司（Us） 用于免疫组库谱分析的引物
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
CN116635533A (zh) 2020-11-20 2023-08-22 贝克顿迪金森公司 高表达的蛋白和低表达的蛋白的谱分析

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008004691A1 (fr) * 2006-07-04 2008-01-10 Shimadzu Corporation appareil pour concevoir des amorces d'amplification d'acides nucléiques, programme pour concevoir des amorces et appareil de serveur pour concevoir des amorces
WO2016159132A1 (ja) * 2015-03-31 2016-10-06 富士フイルム株式会社 ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法およびプライマーセット
WO2016159111A1 (ja) * 2015-03-31 2016-10-06 富士フイルム株式会社 胎児の遺伝子状態を判定する方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101613698B (zh) * 2009-04-13 2011-06-15 厦门艾德生物医药科技有限公司 一种扩增低含量基因突变dna的引物设计方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008004691A1 (fr) * 2006-07-04 2008-01-10 Shimadzu Corporation appareil pour concevoir des amorces d'amplification d'acides nucléiques, programme pour concevoir des amorces et appareil de serveur pour concevoir des amorces
WO2016159132A1 (ja) * 2015-03-31 2016-10-06 富士フイルム株式会社 ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法およびプライマーセット
WO2016159111A1 (ja) * 2015-03-31 2016-10-06 富士フイルム株式会社 胎児の遺伝子状態を判定する方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KADERALI L. ET AL.: "Primer-design for multiplexed genotyping", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 31, 2003, pages 1796 - 1802, XP002996256, DOI: doi:10.1093/nar/gkg267 *
See also references of EP3521424A4 *
SHEN Z . ET AL.: "MPprimer: aprogram for reliable multiplex PCR primer design", BMC BIOINFORMATICS, vol. 11, 2010, XP021071487, DOI: doi:10.1186/1471-2105-11-143 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3421608B1 (en) * 2016-02-24 2022-03-09 FUJIFILM Corporation Chromosome number quantification method
JPWO2018061699A1 (ja) * 2016-09-29 2019-06-24 富士フイルム株式会社 マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
WO2020013919A1 (en) * 2018-07-13 2020-01-16 Illumina, Inc. Systems and methods for multiplex pcr primer selection
US11495325B2 (en) 2018-07-13 2022-11-08 Illumina, Inc. Systems and methods for multiplex PCR primer selection
KR20200030166A (ko) * 2018-09-12 2020-03-20 한국과학기술정보연구원 표적 서열 증폭용 올리고 뉴클레오타이드 및 이를 이용한 표적 서열의 증폭 방법
KR102200109B1 (ko) 2018-09-12 2021-01-08 한국과학기술정보연구원 표적 서열 증폭용 올리고 뉴클레오타이드 및 이를 이용한 표적 서열의 증폭 방법
WO2024047992A1 (ja) * 2022-08-31 2024-03-07 富士フイルム株式会社 アンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーの設計方法、製造方法、設計装置、設計プログラムおよび記録媒体

Also Published As

Publication number Publication date
JP6768815B2 (ja) 2020-10-14
EP3521424A4 (en) 2019-10-23
US20190221292A1 (en) 2019-07-18
CN109790537A (zh) 2019-05-21
EP3521424A1 (en) 2019-08-07
JPWO2018061695A1 (ja) 2019-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018061695A1 (ja) マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
WO2018061699A1 (ja) マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
US11462298B2 (en) Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP3092317B1 (en) Systems and methods for use of known alleles in read mapping
AU2016311444B2 (en) Systems and methods for high-accuracy variant calling
Nielsen et al. Genotype and SNP calling from next-generation sequencing data
US9165109B2 (en) Sequence assembly and consensus sequence determination
US20140163900A1 (en) Analyzing short tandem repeats from high throughput sequencing data for genetic applications
BR112016007401B1 (pt) Método para determinar a presença ou ausência de uma aneuploidia cromossômica em uma amostra
WO2018061693A1 (ja) マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
Creer Choosing and using introns in molecular phylogenetics
US20220254444A1 (en) Systems and methods for detecting recombination
Ruark et al. The ICR1000 UK exome series: a resource of gene variation in an outbred population
US20170132361A1 (en) Sequence assembly method
Alqaisi et al. Forensic evaluation of mitochondrial DNA heteroplasmy in Gujarat population, India
US20160055293A1 (en) Systems, Algorithms, and Software for Molecular Inversion Probe (MIP) Design
Mukamel et al. Repeat polymorphisms in non-coding DNA underlie top genetic risk loci for glaucoma and colorectal cancer
WO2018066317A1 (ja) 必要なローカス数を決定する方法および必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法
Eskin et al. Optimally phasing long genomic regions using local haplotype predictions
Eskin et al. A note on phasing long genomic regions using local haplotype predictions
Söylev Algorithms for Structural Variation Discovery Using Multiple Sequence Signatures
Sood Bioinformatic analysis of human Next Generation Sequencing data; extracting additional information, optimising mapping and variant calling, and application in a rare disease
Gusev et al. Low-pass Genomewide Sequencing and Variant Imputation Using Identity-by-descent in an Isolated Human Population
Zhao Creating pipeline for linkage analysis using whole genome sequencing data in rare diseases
Hoogendoorn Computational methods for the detection of structural variation in the human genome

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17855653

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018542323

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017855653

Country of ref document: EP

Effective date: 20190429