WO2024047992A1

WO2024047992A1 - アンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーの設計方法、製造方法、設計装置、設計プログラムおよび記録媒体

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Publication number: WO2024047992A1
Application number: PCT/JP2023/021016
Authority: WO
Inventors: 奈央子山口; 由奈村尾; 雅也長瀬
Original assignee: 富士フイルム株式会社
Priority date: 2022-08-31
Filing date: 2023-06-06
Publication date: 2024-03-07

Abstract

本発明は、プライマー・ダイマーの形成率を極めて低く抑えつつ、プライマーの設計成功率を向上させることができる、アンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマーの設計方法、製造方法、設計装置、設計プログラムおよび記録媒体を提供することを目的とする。　本発明は、１以上のプライマー候補配列から所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを選択し、所定のプライマー配列間のローカルアライメント・スコアを算出し、そのスコアが所定の閾値以下のプライマー候補配列ペアを、所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定するプライマー配列決定工程を含むアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計方法である。

Description

アンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーの設計方法、製造方法、設計装置、設計プログラムおよび記録媒体

　本発明は、アンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーの設計方法、製造方法、設計装置、設計プログラムおよび記録媒体に関する。特に、バイサルファイト処理が施された又は酵素処理をしたＤＮＡ（deoxyribonucleic acid：デオキシリボ核酸）中の複数の標的部位をそれぞれ含む複数の増幅対象領域をマルチプレックスＰＣＲ（polymerase chain reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）によって同時に増幅するためのプライマーを設計するためのプライマーの設計方法、製造方法、設計装置、設計プログラムおよび記録媒体に関する。

　ＤＮＡ塩基配列の変化を伴わない遺伝子発現制御機構であるエピジェネティクス機構の１つとして、ＤＮＡメチル化が知られている。哺乳類のＤＮＡメチル化は、主に、ＤＮＡ上のＣＧ配列のシトシン（Ｃ）の５位炭素原子で生じる。
　ＣＧ配列が高頻度に出現するCpG アイランドと呼ばれる領域は、遺伝子プロモーター領域に多く存在し、初めは、その領域のＣＧ配列の多くはメチル化されていないが、疾患、発生、分化、炎症、又は加齢等に伴ってメチル化を受け、遺伝子発現が抑制されることが知られている。例えば、がん細胞では、遺伝子プロモーター領域におけるCpGアイランドのメチル化の亢進が起きることによって、がんを抑制する遺伝子群の多くが不活性化されることが知られている。

　このように、ＤＮＡのメチル化は遺伝子発現制御に大きく関与するため、その情報は、がん等の疾患のメカニズムの解明や、各種細胞の分化の状態の評価等に有用であるとして、診断、治療、創薬及び再生医療等、様々な分野で着目され、盛んに研究開発が行われている。例えば、特定領域のＤＮＡメチル化の状態を測定解析することで、薬剤を開発する際、細胞の種類ごとに薬剤抵抗性の有無を調べる試みや、正常細胞と異常細胞との割合から、がん細胞の有無や悪性度（進行度）を評価する試み、幹細胞の分化状態を評価して、その品質管理に利用する試みが行われている。

　ＤＮＡメチル化の状態の解析方法の１つとして、バイサルファイト（bisulfite：亜硫酸水素塩）反応を利用した方法がある。
　例えば、ある疾患に関係のあるＣＧ配列のシトシン（Ｃ）をピックアップし、標的部位（計測サイト）とする。図１３Ａでは、［１］～［４］がメチル化サイトであり、その中から、［２］及び［４］を標的部位Ａ及びＢとして設定する（図１３Ａは片鎖のみを示す）。

　続いて、テンプレートＤＮＡをバイサルファイト（亜硫酸水素塩）で処理する。テンプレートＤＮＡ上でＣＧ配列のシトシン（Ｃ）がメチル化されている場合は、この処理後、そのままシトシン（Ｃ）として残存する（図１３Ａのメチル化サイト［３］及び［４］参照）。一方、テンプレートＤＮＡ上でＣＧ配列のシトシン（Ｃ）がメチル化されていない場合は、脱アミノ化されてウラシル（Ｕ）へ変換される（図１３Ａのメチル化サイト［１］及び［２］参照）。
　なお、最近では、バイサルファイト処理に代わり、例えば、New England Biolabs 社製、NEB Next Enzymatic Methyl-seq Kit 等の酵素を使用して、上述の反応と同様の塩基変換を行う方法も利用されている。

　続いて、バイサルファイト処理後のＤＮＡは、シーケンス解析を行うために、ＰＣＲ（polymerase chain reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて増幅される。増幅されたＤＮＡ、即ち、ＰＣＲ増幅産物は、キャピラリーシーケンサーや、ＮＧＳ（Next Generation Sequencer：次世代シーケンサー）を用いてシーケンス解析が行われる。
　バイサルファイト処理後のＤＮＡを、ＰＣＲを用いて増幅すると、シトシン（Ｃ）はそのままであるが（図１３Ａのメチル化サイト［３］及び［４］参照）、ウラシル（Ｕ）はチミン（Ｔ）に置き換わって増幅される（図１３Ａのメチル化サイト［１］及び［２］参照）。
　このＰＣＲ増幅産物の配列中に生じるシトシン（Ｃ）とチミン（Ｔ）の違いを利用すれば、例えば、バイサルファイト処理前のＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ）において、所定の標的部位のメチル化状態、即ち、１つの細胞から選択された所定の標的部位のＤＮＡがメチル化されているか否かを検出することができる。より具体的に説明すれば、ＰＣＲ増幅産物の所定の標的部位における塩基がシトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）であるかにより、テンプレートＤＮＡの所定の標的部位のシトシン（Ｃ）がメチル化されていたのか、それとも、メチル化されていなかったのかを把握することができる。図１３Ａで説明すれば、ＰＣＲ増幅産物の標的部位Ａにおける塩基は、チミン（Ｔ）であるから、テンプレートＤＮＡの標的部位Ａにおけるシトシン（Ｃ）は、メチル化されていなかったことがわかる。一方、標的部位ＢのＰＣＲ増幅産物の塩基は、シトシン（Ｃ）であるから、テンプレートＤＮＡの標的部位Ｂにおけるシトシン（Ｃ）は、メチル化されていたことがわかる。

　また、このＰＣＲ増幅産物の配列中に生じるシトシン（Ｃ）とチミン（Ｔ）の違いを利用すれば、バイサルファイト処理前のＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ）において、複数の細胞由来の特定の標的部位のＤＮＡのメチル化状態（頻度）、即ち、複数の細胞に由来する特定の標的部位のＤＮＡがメチル化されているか否かを検出し、且つ、その検出結果に基づいて、特定の標的部位のＤＮＡがメチル化されている細胞の割合を把握することもできる。特定の標的部位が複数ある場合は、特定の標的部位ごとに、その部位のＤＮＡがメチル化されているか否かを検出し、且つ、その検出結果に基づいて、ＤＮＡがメチル化されている細胞の割合を特定の標的部位ごとに検出することもできる。より具体的に説明すれば、ＰＣＲ増幅産物の配列中に生じる、特定の標的部位における塩基がシトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）であるかにより、複数の細胞由来の特定の標的部位のＤＮＡのメチル化状態（頻度）を把握することができる。特定の標的部位のＤＮＡのメチル化状態（頻度）は、各標的部位（計測サイト）で生じるシトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）の個数から、メチル化度＝Ｃ／（Ｃ＋Ｔ）を計測することにより取得することができ、特定の標的部位が複数ある場合は、ＤＮＡがメチル化された細胞の割合を特定の標的部位ごとに把握することができる。

　例えば、図１３Ｂに示すように、複数の細胞（図中では、細胞Ｃ１～Ｃ３）を用いて、複数の細胞由来の標的部位（計測サイト）Ａ及びＢのメチル化状態（頻度）を評価した場合、標的部位Ａで生じるシトシン（Ｃ）の数は２個であり、チミン（Ｔ）の数は１個であるから、メチル化度を算出すると、２／（２＋１）＝０．６７となる。よって、図１３Ｂの標的部位ＡにおけるＤＮＡのメチル化状態（頻度）は、３細胞由来のメチル化度０．６７として、ＤＮＡがメチル化された細胞の割合を把握することができる。一方、標的部位Ｂで生じるシトシン（Ｃ）の数は３個であり、チミン（Ｔ）の数は０個であるから、メチル化度を算出すると、３／（３＋０）＝１となる。よって、図１３Ｂの標的部位ＢにおけるＤＮＡのメチル化状態（頻度）は、３細胞由来のメチル化度１として、ＤＮＡがメチル化された細胞の割合を把握することができる。
　なお、同様に、図１３Ａに示す標的部位Ａのメチル化状態（頻度）は、１細胞由来のメチル化度０として検出することができ、標的部位Ｂのメチル化状態（頻度）は、１細胞由来のメチル化度１として検出することができる。

　バイサルファイト処理後のＤＮＡの増幅には、同一反応において、ＤＮＡ上の２以上の増幅対象領域を一度に増幅することができるマルチプレックスＰＣＲが用いられることがある。
　マルチプレックスＰＣＲを用いて、所定の標的部位のＤＮＡメチル化の状態や複数の細胞由来の特定の標的部位のＤＮＡメチル化の状態（頻度）を把握するためには、図１３Ｃに示すように（図１３Ｃは、片鎖のみ示す）、２以上の標的部位をそれぞれ含む１以上の増幅対象領域をそれぞれ増幅するプライマー対（フォーワードプライマー及びリバースプライマー）が必要となる。図１３Ａで説明すれば、標的部位Ａを含む増幅対象領域（増幅領域）を増幅するためのプライマー対と、標的部位Ｂを含む増幅対象領域（増幅領域）を増幅するためのプライマー対が必要となる。

　バイサルファイト処理を施したＤＮＡを対象とするプライマーの設計は、通常のプライマーの設計（即ち、バイサルファイト処理が施されていないＤＮＡを対象とするプライマーの設計）で検討する条件に加え、さらに、以下のような条件も検討しなければならない。
　まず、前提として、ＤＮＡのメチル化の有無は、塩基配列と異なり、事前に知ることが出来ない。つまり、バイサルファイト処理を施した後にチミン（Ｔ）であるのかシトシン（Ｃ）であるのか定まらない塩基が存在する。そのため、ＤＮＡのメチル化状態を解析することを目的とするプライマー設計では、標的部位周辺のメチル化状態に依存してプライマーの増幅効率が変化することが無いよう、プライマーが接合する部位にＣＧ配列をなるべく含まない、または含む場合もプライマー中のＣＧ配列の位置を限定してその影響を小さくする必要がある。

　また、ＤＮＡ二本鎖は、バイサルファイト処理が施されることでＤＮＡ上の多くのシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変換されるため、各鎖のＤＮＡ配列は、バイサルファイト処理後、シトシン（Ｃ）以外の３塩基で構成される領域が増加する。従って、３塩基で構成される領域に特異的に接合することができるプライマーを設計しなければならないことも考慮する必要がある。
　また、ＤＮＡ上の多くのシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変換され、二本鎖ＤＮＡはその相補性を失ってしまうため、ＤＮＡ二本鎖のどちらも増幅し解析する必要がある場合は、それぞれの鎖の標的部位をそれぞれ含む１以上の増幅対象領域をそれぞれ増幅するプライマー対（フォーワードプライマー及びリバースプライマー）、つまり、二組のプライマー対の設計が必要となる。

　従って、このような特有の事情を有するバイサルファイト処理を施したＤＮＡを対象とするプライマーの設計は、通常のプライマーの設計に比べ、設計の条件が異なり、難度が高い。
　プライマー設計ソフトウェアは多く存在するが、その多くは、Primer-BLASTのような通常のプライマーを設計するためのものであるから、バイサルファイト処理により塩基が変換されるシトシンを考慮した条件を設定することができない。つまり、通常のプライマー設計ソフトウェアでは、上述したようなバイサルファイト処理を施したＤＮＡを対象とするプライマーの設計に係る特有の事情が全く考慮されていないため、それらのソフトウェアでは、バイサルファイト処理を施したＤＮＡを対象とするプライマーを設計することはできないという事情がある。

　また、さらに、バイサルファイト処理後のＤＮＡの増幅にマルチプレックスＰＣＲを用いる場合は、メチル化度の解析に係る標的部位をそれぞれ含む複数の増幅対象領域を同時に増幅するため、プライマー・ダイマーの形成を抑制するプライマーを設計することも考慮する必要がある。

　従って、所定の部位のＤＮＡのメチル化度の計測に、バイサルファイト反応及びマルチプレックスＰＣＲが利用される場合、その解析で用いられるマルチプレックスＰＣＲ用のプライマー（即ち、バイサルファイトアンプリコンシーケンス解析用のプライマー）を設計する作業は、バイサルファイト処理を施したＤＮＡを対象とするプライマーの設計よりもさらに煩雑であり、時間がかかるという問題がある。

　先述したように、プライマー設計ソフトウェアの多くは、通常のプライマー設計ソフトウェアに係るものであり、バイサルファイト処理を施したＤＮＡを対象とするプライマーの設計に係るソフトウェアは少ない。また、バイサルファイト処理を施したＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲで増幅するプライマー（即ち、バイサルファイトアンプリコンシーケンス解析用プライマー）の設計に対応したプライマー設計ソフトウェアとなると、さらに少ない。利用できる数少ないソフトウェアとしては、例えば、本発明者らが提案する特許文献１に記載のものが挙げられる。

国際公開第２０２２／１１３８３５号

　バイサルファイトアンプリコンシーケンス解析においては、一般的に、計測対象として５～１０００の標的部位が予め設定されるが、できるだけ多くの標的部位でプライマー配列を出力することが望ましい。つまり、高いプライマー設計成功率（プライマーを設計できた標的部位の数／全ての標的部位の数［％］）が求められる。

　特許文献１に記載のソフトウェアは、従来のバイサルファイト処理を施したＤＮＡを対象とするプライマーの設計ソフトウェアに比べ、プライマー設計成功率を向上させることが可能であるが、更なるプライマーの設計成功率の向上が求められている。また、プライマー設計成功率を向上させることができたとしても、プライマー・ダイマーが生じる確率が高くなり、プライマーの精度が劣るという問題が生じる可能性があった。

　また、プライマーを設計する際、ユーザは、個々のＤＮＡ試料の状況や研究の内容に応じて、設計成功率を選択するため、必ずしも設計成功率が高いものばかりを所望する訳ではない。しかし、設計成功率に応じて、複数のプライマー設計を行うには、時間も手間もコストもかかるという課題があった。

　本発明は、このような課題を解決するためになされたものであり、プライマーの設計成功率を更に向上させることができる、バイサルファイトアンプリコンシーケンス解析用プライマー（より詳細には、アンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー）の設計方法、製造方法、設計装置、設計プログラムおよび記録媒体を提供することを目的とする。
　また、ユーザが所望する設計成功率に応じたプライマー設計を容易に実現することを可能にするバイサルファイトアンプリコンシーケンス解析用プライマー（より詳細には、アンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー）の設計方法、製造方法、設計装置、設計プログラムおよび記録媒体を提供することを目的とする。

〔１〕　本発明に係るアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマーの設計方法は、
　少なくとも１本のゲノム二本鎖DNAのメチル化度の計測のために、バイサルファイト反応又は酵素反応、及びマルチプレックスＰＣＲを利用し、上記メチル化度を計測する２以上の標的部位をそれぞれ含む複数の領域を同時に増幅するために用いられるアンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーを設計するための方法であって、
　上記DNAの鋳型鎖に対し相補鎖を生成する相補鎖生成工程と、
　上記２以上の標的部位の中から１つ選択し、上記各鎖から、その選択された標的部位の５’末端側に位置する塩基配列の中から、所定の長さの部分配列を１以上切り出す部分配列切出工程と、
　上記切り出された１以上の部分配列を１以上のプライマー候補配列として選抜するプライマー候補配列選抜工程と、
　上記１以上のプライマー候補配列の中から、上記選択された所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列を採用し、決定するプライマー配列決定工程と、
　上記部分配列切出工程において、上記２以上の標的部位が全て選択されるまで、上記部分配列切出工程、上記プライマー候補配列選抜工程、及び上記プライマー配列決定工程を繰り返す、繰り返し工程と、
を有し、
（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合は、
　　上記プライマー配列決定工程は、
　　　［１］　上記１以上のプライマー候補配列から上記所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを選択し、
　　　［２］　上記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから１つのペアを選択し、上記選択したプライマー候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　　［３］上記所定の閾値よりも低いローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定し、
（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合は、
　　上記プライマー配列決定工程は、
　　　［１］上記１以上のプライマー候補配列から所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを選択し、
　　　［２］上記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから１つのペアを選択し、上記選択したプライマー候補配列ペアの各候補配列と、既に決定された異なる標的部位の各プライマー配列との間のローカルアライメント・スコア、及び、上記選択した候補配列ペアの配列間のローカルアライメント・スコアを算出し、
　　　［３］算出された全てのローカルアライメント・スコアの中から最大値を検出し、その値が所定の閾値以下となるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定するものであって、
　上記（Ｉ）及び上記（ＩＩ）の上記［３］の工程において、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用されない場合は、上記（I）及び上記（ＩＩ）の［１］で選択された上記１以上のプライマー候補配列ペアの中から、異なる１つのペアを選択し、少なくとも１つのプライマー候補配列ペアが採用されるまで、上記［２］及び［３］の工程を繰り返し、
　上記ローカルアライメント・スコアは、上記プライマー候補配列間における、〈１〉塩基が相補的なペアは１か所あたり「X」、〈２〉非相補的なペアは１か所あたり「Y」、及び、〈３〉挿入または欠失がある場合は１か所あたり「Z」とした場合、上記「X」は１、上記「Y」は－４～－２、及び上記「Z」は－６～－３で算出し、
　上記所定の閾値は、１～４である、方法である。

〔２〕　上記プライマー配列決定工程は、
　上記（Ｉ）標的部位が２以上であって、異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合は、
　　上記［２］の工程において、上記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから全てのペアを選択し、各ペアについて、選択されたプライマー候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　上記［３］の工程において、算出されたローカルアライメント・スコアが、上記所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出した１以上のプライマー候補配列ペアを選抜し、さらに、選抜された全ペアの中から、上記ローカルアライメント・スコアの最大値が最も小さい値を有するプライマー候補配列ペアを検出し、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定し、
　上記（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合は、
　　上記［２］の工程において、上記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから全てのペアを選択し、各ペアについて、上記選択したプライマー候補配列ペアの各候補配列と、既に決定された異なる標的部位の各プライマー配列との間のローカルアライメント・スコア、及び、上記選択した候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　上記［３］の工程において、各ペアについて、算出された全てのローカルアライメント・スコアの中から最大値を検出し、その値が所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを選抜し、さらに、上記選抜された全ペアの中から、上記ローカルアライメント・スコアの最大値が最も小さい値を有するプライマー候補配列ペアを検出し、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定する、
　上記〔１〕に記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計方法。

〔３〕　上記ゲノム二本鎖ＤＮＡの塩基配列データを取得する塩基配列データ取得工程と、
　上記２以上の標的部位及びその位置情報を取得する標的部位情報取得工程と、
　上記塩基配列データにおいて、上記ゲノム二本鎖ＤＮＡにおいて、メチル化され得る「Ｃ」を「Ｙ」へ変換し、その他の「Ｃ」は、「Ｔ」へ変換する塩基変換工程と、
をさらに有し、
　上記相補鎖生成工程は、上記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡの各鋳型鎖に対し相補鎖を生成し、
　上記部分配列切出工程は、上記２以上の標的部位の中から１つ選択し、その選択された標的部位の位置情報に基づいて、上記各鎖から、上記選択された標的部位が変換された上記「Ｙ」又はそれに相補的な「Ｒ」の５’末端側に位置する塩基配列の中から所定の長さの部分配列を１以上切り出し、
　上記プライマー候補配列選抜工程は、上記各鎖から切り出された１以上の部分配列の中から、所定の選抜条件を満たすものをプライマー候補配列として選抜し、
　上記メチル化され得る「Ｃ」とは、ＣＧ配列中の「Ｃ」であり、
　上記所定の選抜条件は、
（１）Ｔｍ値が所定の範囲内にあること、
（２）上記部分配列上に含まれるＹＧ配列またはＣＲ配列が所定の数以下であること、及び
（３）上記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡ上の関連領域外の配列との接合数の上限が１以上の所定の数以下であること
を含む、〔１〕または〔２〕に記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計方法。
　［但し、「Ｃ」、「Ｇ」、「Ｙ」及び「Ｒ」は、ＩＵＰＡＣが定める塩基標記であり、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す。］

〔４〕　上記メチル化され得る「Ｃ」は、さらに、ＣＨＧ配列中の「Ｃ」を含み、
　上記所定の選抜条件は、さらに、（４）上記部分配列上に含まれるＹＨＧ配列またはＣＤＲ配列が所定の数以下であることを含む、上記〔３〕に記載のプライマー設計方法。
［但し、「Ｃ」、「Ｇ」、「Ｙ」、「Ｈ」、「Ｒ」及び「Ｄ」は、ＩＵＰＡＣが定める塩基標記であり、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｈ」は、アデニン、シトシン、又はチミン、「Ｄ」は、チミン、グアニン、又はアデニン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す。］
〔５〕　上記メチル化され得る「Ｃ」は、さらに、ＣＨＨ配列中の「Ｃ」を含み、
上記所定の選抜条件は、さらに、（５）上記部分配列上に含まれるＹＨＨ配列またはＤＤＲ配列が所定の数以下であることを含む、上記〔３〕または〔４〕に記載のプライマー設計方法。
［ただし、「Ｙ」、「Ｈ」、「Ｒ」及び「Ｄ」は、IUPACが定める塩基表記であり、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｈ」は、アデニン、シトシン、又はチミン、「Ｄ」は、チミン、グアニン、又はアデニン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す。］

〔６〕　プライマー候補配列選抜工程は、
　上記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡを第１の鋳型鎖及び第２の鋳型鎖とし、上記第１の鋳型鎖の相補鎖を第１の相補鎖、上記第２の鋳型鎖の相補鎖を第２の相補鎖として、上記第１の鋳型鎖から切り出された１以上の部分配列が、所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列として選抜し、上記第１の相補鎖から切り出された１以上部分配列が、上記所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列として選抜し、上記第２の鋳型鎖から切り出された１以上の部分配列が、上記所定の選抜条件を満たすものは、第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列として選抜し、第２の相補鎖から切り出された１以上の部分配列が、上記所定の選抜条件を満たすものは、第２の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列として選抜する工程である、上記〔３〕～上記〔５〕のいずれかに記載のプライマー設計方法。
〔７〕　上記プライマー配列決定工程は、上記プライマー候補配列選抜工程において、上記選抜された１以上の第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列と上記選抜された１以上の第１の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列の全ての組み合わせについて、ＰＣＲによって増幅が予想されるＰＣＲ増幅産物の長さを算出し、上記算出されたＰＣＲ増幅産物の長さが所定の範囲内にあるプライマー候補配列の組み合わせを、上記部分配列切出工程において選択された上記標的部位を含む領域を増幅する上記第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、上記選抜された第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列と上記選抜された第２の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列の全ての組み合わせについて、ＰＣＲによって増幅が予想されるＰＣＲ増幅産物の長さを算出し、上記算出されたＰＣＲ増幅産物の長さが上記所定の範囲内にあるプライマー候補配列の組み合わせを、上記部分配列切出工程において選択された上記標的部位を含む領域を増幅する上記第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用して決定する工程である、上記〔３〕～上記〔６〕のいずれかに記載のプライマー設計方法。

〔８〕　予め、上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計方法を用いて、少なくとも、上記標的部位の数と、上記所定の閾値と、上記プライマー設計成功率との対応関係を計測し、上記対応関係を格納部に保存し、
　ユーザが入力部を介して、少なくとも、上記ユーザが所望するプライマー設計成功率、及び上記標的部位の数を設定し、プライマー設計を実行するよう指示すると、上記格納部に保存された上記対応関係の中から、上記プライマー設計成功率及び上記標的部位の数の設定値以上、且つ、差が小さい上記プライマー設計成功率及び上記標的部位の数に対応する上記所定の閾値を読み出し、読み出した上記所定の閾値に基づいて、上記１以上のプライマー候補配列の中から、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するプライマー配列を採用し、決定する、上記〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載のプライマー設計方法。

〔９〕　本発明におけるアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマーの製造方法は、上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載のプライマー設計工程と、上記プライマー設計工程で設計されたプライマー配列に基づきプライマーを合成する合成工程と、を備え、上記プライマー設計工程が、上述したアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマーの設計方法により実施されるものである。

〔１０〕　本発明におけるアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマーの設計装置は、
　少なくとも１本の二本鎖ＤＮＡのメチル化度の計測のために、バイサルファイト反応又は酵素反応、及びマルチプレックスＰＣＲを利用し、上記メチル化度を計測する２以上の標的部位をそれぞれ含む複数の領域を同時に増幅するために用いられるアンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーを設計するための装置であって、
　上記ＤＮＡの鋳型鎖に対し相補鎖を生成する相補鎖生成部と、
　上記２以上の標的部位の中から１つ選択し、上記各鎖から、その選択された標的部位の５’末端側に位置する塩基配列の中から、所定の長さの部分配列を１以上切り出す部分配列切出部と、
　上記切り出された１以上の部分配列を１以上のプライマー候補配列として選抜するプライマー候補配列選抜部と、
　上記１以上のプライマー候補配列の中から、上記選択された所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列を採用し、決定するプライマー配列決定部と、
　上記部分配列切出部において、上記２以上の標的部位が全て選択されるまで、上記部分配列切出部、上記プライマー候補配列選抜部、及び上記プライマー配列決定部の各処理を繰り返すよう制御する制御部と、
を有し、
（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合は、
　　上記プライマー配列決定工程は、
　　　［１］　上記１以上のプライマー候補配列から上記所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを選択し、
　　　［２］　上記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから１つのペアを選択し、上記選択したプライマー候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　　［３］上記所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定し、
（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合は、
　　上記プライマー配列決定工程は、
　　　［１］上記１以上のプライマー候補配列から所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを選択し、
　　　［２］上記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから１つのペアを選択し、各ペアについて、上記選択したプライマー候補配列ペアの各候補配列と、既に決定された異なる標的部位の各プライマー配列との間のローカルアライメント・スコア、及び、選択した候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　　［３］算出された全てのローカルアライメント・スコアの中から最大値を検出し、その値が所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定するものであって、
　上記（Ｉ）及び上記（ＩＩ）の上記［３］の工程において、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用されない場合は、上記（Ｉ）及び上記（ＩＩ）の［１］で選択された上記１以上のプライマー候補配列ペアの中から、異なる１つのペアを選択し、少なくとも１つのプライマー候補配列ペアが採用されるまで、上記［２］及び［３］の工程を繰り返し、
　上記ローカルアライメント・スコアは、上記プライマー候補配列間における、〈１〉塩基が相補的なペアは１か所あたり「X」、〈２〉非相補的なペアは１か所あたり「Y」、及び、〈３〉挿入または欠失がある場合は１か所あたり「Z」とした場合、上記「X」は１、上記「Y」は－４～－２、及び上記「Z」は－６～－３で算出し、
　上記所定の閾値は、１～４である、
　アンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計装置、である。

〔１１〕　上記プライマー配列決定部は、
　　上記（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合は、
　　上記［２］の工程において、上記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから全てのペアを選択し、各ペアについて、選択されたプライマー候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　上記［３］の工程において、算出されたローカルアライメント・スコアが、所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出した１以上のプライマー候補配列ペアを選抜し、さらに、選抜された全ペアの中から、上記ローカルアライメント・スコアの最大値が最も小さい値を有するプライマー候補配列ペアを検出し、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定し、
　上記（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合は、
　　上記［２］の工程において、上記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから全てのペアを選択し、各ペアについて、選択したプライマー候補配列ペアの各候補配列と、既に決定された異なる標的部位の各プライマー配列との間のローカルアライメント・スコア、及び、上記選択した候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　上記［３］の工程において、各ペアについて、算出された全てのローカルアライメント・スコアの中から最大値を検出し、その値が所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを選抜し、さらに、上記選抜された全ペアの中から、上記ローカルアライメント・スコアの最大値が最も小さい値を有するプライマー候補配列ペアを検出し、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定する、
　上記〔１０〕に記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計装置。

〔１２〕　上記ゲノム二本鎖ＤＮＡの塩基配列データを取得する塩基配列データ取得部と、
　上記２以上の標的部位及びその位置情報を取得する標的部位情報取得部と、
　上記塩基配列データにおいて、上記ゲノム二本鎖ＤＮＡにおいて、メチル化され得る「Ｃ」を「Ｙ」へ変換し、その他の「Ｃ」は、「Ｔ」へ変換する塩基変換部と、
を更に有し、
　上記相補鎖生成部は、上記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡの各鋳型鎖に対し相補鎖を生成し、
　上記部分配列切出部は、上記２以上の標的部位の中から１つ選択し、その選択された標的部位の位置情報に基づいて、上記各鎖から、上記選択された標的部位が変換された上記「Ｙ」又はそれに相補的な「Ｒ」の５’末端側に位置する塩基配列の中から所定の長さの部分配列を１以上切り出し、
　上記プライマー候補配列選抜部は、上記各鎖から切り出された１以上の部分配列の中から、所定の選抜条件を満たすものをプライマー候補配列として選抜し、
　上記メチル化され得る「Ｃ」とは、ＣＧ配列中の「Ｃ」であり、
　上記所定の選抜条件は、
（１）Ｔｍが所定の範囲内にあること、
（２）上記部分配列上に含まれるＹＧ配列またはＣＲ配列が所定の数以下であること、及び
（３）上記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡ上の関連領域外の配列との接合数の上限が１以上の所定の数以下であること
を含む、
　上記〔１０〕または〔１１〕に記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計装置。
　［但し、「Ｃ」、「Ｇ」、「Ｙ」及び「Ｒ」は、ＩＵＰＡＣが定める塩基標記であり、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す。］

〔１３〕　メチル化され得る「Ｃ」は、さらに、ＣＨＧ配列中の「Ｃ」を含み、所定の選抜条件は、さらに、（４）部分配列上に含まれるＹＨＧ配列またはＣＤＲ配列が所定の数以下であることを含む、上記〔１２〕に記載のプライマー設計装置［但し、「Ｃ」、「Ｇ」、「Ｙ」、「Ｈ」、「Ｒ」及び「Ｄ」は、ＩＵＰＡＣが定める塩基標記であり、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｈ」は、アデニン、シトシン、又はチミン、「Ｄ」は、チミン、グアニン、又はアデニン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す］。
〔１４〕　メチル化され得る「Ｃ」は、さらに、ＣＨＨ配列中の「Ｃ」を含み、所定の選抜条件は、さらに、（５）部分配列上に含まれるＹＨＨ配列またはＤＤＲ配列が所定の数以下であることを含む、上記〔１２〕または〔１３〕に記載のプライマー設計装置［但し、「Ｙ」、「Ｈ」、「Ｒ」及び「Ｄ」は、ＩＵＰＡＣが定める塩基標記であり、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｈ」は、アデニン、シトシン、又はチミン、「Ｄ」は、チミン、グアニン、又はアデニン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す］

〔１５〕　上記プライマー候補配列選抜部は、
　上記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡを第１の鋳型鎖及び第２の鋳型鎖とし、上記第１の鋳型鎖の相補鎖を第１の相補鎖、上記第２の鋳型鎖の相補鎖を第２の相補鎖として、
上記第１の鋳型鎖から切り出された１以上の部分配列が、所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列として選抜し、上記第１の相補鎖から切り出された１以上部分配列が、上記所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列として選抜し、上記第２の鋳型鎖から切り出された１以上の部分配列が、上記所定の選抜条件を満たすものは、第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列として選抜し、第２の相補鎖から切り出された１以上の部分配列が、上記所定の選抜条件を満たすものは、第２の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列として選抜するものである、上記〔１２〕～〔１４〕のいずれかに記載のプライマー設計装置。
〔１６〕　上記プライマー配列決定部は、上記プライマー候補配列選抜部において、上記選抜された１以上の第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列と上記選抜された１以上の第１の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列の全ての組み合わせについて、ＰＣＲによって増幅が予想されるＰＣＲ増幅産物の長さを算出し、上記算出されたＰＣＲ増幅産物の長さが所定の範囲内にあるプライマー候補配列の組み合わせを、上記部分配列切出部において選択された上記標的部位を含む領域を増幅する上記第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、上記選抜された第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列と上記選抜された第２の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列の全ての組み合わせについて、ＰＣＲによって増幅が予想されるＰＣＲ増幅産物の長さを算出し、上記算出されたＰＣＲ増幅産物の長さが上記所定の範囲内にあるプライマー候補配列の組み合わせを、上記部分配列切出部において選択された上記標的部位を含む領域を増幅する上記第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用して決定するものである、上記〔１５〕に記載のプライマー設計装置。

〔１７〕　予め、上記〔１０〕に記載のプライマー設計装置を用いて、少なくとも、上記標的部位の数と、上記所定の閾値と、上記プライマー設計成功率との対応関係を計測し、保存する格納部と、
　ユーザが指示を入力する入力部と、
を更に有し、
　上記プライマー配列決定部は、ユーザが入力部を介して、少なくとも、上記ユーザが所望するプライマー設計成功率、及び上記標的部位の数を設定し、プライマー設計を実行するよう指示すると、上記格納部に保存された上記対応関係の中から、上記プライマー設計成功率及び上記標的部位の数の設定値以上、且つ、差が小さい上記プライマー設計成功率及び上記標的部位の数に対応する上記所定の閾値を読み出し、上記読み出した所定の閾値に基づいて、上記１以上のプライマー候補配列の中から、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するプライマー配列を採用し、決定する、上記〔１０〕に記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計装置。

　上記〔１２〕～〔１７〕のいずれかに記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計装置は、さらに、通信インターフェースを備え、前記通信インターフェースにより、装置外の通信回線網を介してサーバに接続することができ、前記サーバ内のプログラムにより、前記塩基配列データ取得部、前記標的部位情報取得部、前記塩基変換部、前記相補鎖生成部、前記部分配列切出部、前記プライマー候補配列選抜部及び前記プライマー配列決定部からなる群の少なくとも１つを実行することができる。

　本発明における上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマーの設計プログラムは、上述したプライマー設計方法をコンピュータ上で実行することができるものである。
　本発明における上記〔１９〕に記載のコンピュータにおいて読取可能な記録媒体とは、上述したアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマーの設計プログラムが記録されているものである。

　本発明によれば、バイサルファイトアンプリコンシーケンス解析用のプライマー（より詳細には、アンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー）の設計成功率を、従来よりも更に向上させることができるだけでなく、プライマー・ダイマーが生じる確率も低く抑えることができる。また、本発明の設計に基づくプライマーを獲得することができる。その結果、多くの標的部位を増幅し、計測することができる。
　本発明によれば、さらに、容易に、且つ、短時間で、ユーザが所望する設計成功率に応じたバイサルファイトアンプリコンシーケンス解析用のプライマー（より詳細には、アンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー）を設計することができる。また、その設計に基づくプライマーを獲得することができる。

本発明の実施形態１に係るプライマーの設計装置の構成の一例を概念的に示すブロック図である。図１に示すプライマー設計装置で実施される実施形態１のプライマー設計方法の一例を示すフローチャート図である。図２に示すプライマー設計方法の塩基配列データ取得工程を説明するための模式図である。図２に示すプライマー設計方法の塩基変換工程を説明するための模式図である。図２に示すプライマー設計方法の相補鎖生成工程を説明するための模式図である。図２に示すプライマー設計方法の部分配列切出工程を説明するための模式図である。図４は、部分配列切出部２８、プライマー候補配列選抜部３０及びプライマー配列決定部３２の動作の一例を示すフローチャートである。図５Ａは、条件（３）「塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡ上の関連領域外の配列との接合数の上限が１以上の所定の数以下であることを説明するための図である。図５Ｂは、条件（３）「塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡ上の関連領域外の配列との接合数の上限が１以上の所定の数以下であることを説明するための図である。図６Ａは、ローカルアライメント・スコア算出に係る配列比較の組み合わせを説明するための図である。図６Ｂは、ローカルアライメント・スコア算出に係る配列比較の組み合わせを説明するための図である。図７Ａは、ローカルアライメント・スコア算出に係る配列比較の組み合わせを説明するための図である。図７Ｂは、ローカルアライメント・スコア算出に係る配列比較の組み合わせを説明するための図である。図８は、ローカルアライメント・スコアの算出方法及び閾値に基づく判定方法を説明するための図である。図９は、本発明の実施例１の変形例２に係るプライマー設計装置の格納部に保存される、標的部位の数と、閾値と、プライマー設計成功率との対応関係を示す図である。図１０は、本発明の実施形態２に係るプライマーの設計装置の構成の一例を概念的に示すブロック図である。図１１は、本発明の実施形態２に係るプライマーの設計装置と外部サーバとの接続の一例を概念的に示すブロック図である。実施例１～４及び比較例２～４のプライマー設計成功率を示す図である。実施例１～４及び比較例２～４のプライマー・ダイマー形成率を示す図である。図１３Ａは、バイサルファイト反応を利用したＤＮＡのメチル化状態の解析方法の一例を説明するための模式図である。図１３Ｂは、バイサルファイト反応を利用したＤＮＡのメチル化状態（頻度）の解析方法の一例を説明するための模式図である。図１３Ｃは、標的部位（計測サイト）、及び増幅対象領域を説明するための図である。

　以下に、添付の図面に示す公的な実施形態に基づいて、本発明のバイサルファイトアンプリコンシーケンス用のプライマー（アンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー）の設計方法、製造方法、設計装置、設計プログラムおよび記録媒体を詳細に説明する。

（用語の説明）
　本明細書において、「バイサルファイトアンプリコンシーケンス解析用プライマー」とは、バイサルファイト処理が施されたＤＮＡ中の複数の標的部位をそれぞれ含む複数の増幅対象領域をマルチプレックスＰＣＲによって同時に増幅するための解析用プライマーのことを意味する。
　「アンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー」とは、バイサルファイト処理が施された又は酵素処理をしたＤＮＡ中の複数の標的部位をそれぞれ含む複数の増幅対象領域をマルチプレックスＰＣＲによって同時に増幅するための解析用プライマーのことを意味する。
　「増幅対象領域」とは、プライマー対で増幅される領域を意味する。
　「メチル化サイト」とは、メチル化され得る部位を意味する。
　「標的部位」は、「メチル化サイト」であり、メチル化度を計測する部位（計測サイト）を意味する。
　「プライマー候補配列」とは、特に限定して記載する場合を除き、フォーワード候補プライマー配列及びリバース候補プライマー配列のいずれかを意味する。
　「プライマー候補配列対（ペア）」とは、フォーワード候補プライマー配列及びリバース候補プライマー配列の１つの組み合わせを意味する。
　「プライマー配列」とは、特に限定して記載する場合を除き、フォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列のいずれかを意味する。
　「プライマー配列対（ペア）」とは、フォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列の１つの組み合わせを意味する。
　「ＧＣ配列」「ＹＧ配列」等の塩基配列はいずれも５’末端側から読んだ配列を意味する。
　「～」を用いて表される範囲には「～」の両側を含むものとする。例えば、「Ａ～Ｂ」と表される範囲には、ＡおよびＢを含む。

［実施形態１］
　図１は本発明の実施形態１に係るプライマー設計装置の一例を概念的に示すブロック図である。また、図２に、図１に示すプライマー設計装置で実施されるプライマー設計方法の一例のフローチャートを概念的に示す。また、図３Ａ～Ｄに、プライマー設計方法の各工程を説明するための模式図を示す。

　図１に示すように、プライマー設計装置１０は、入力部１２と、格納部１４と、出力部１６と、プライマー設計処理部１８とを備える。入力部１２、格納部１４、出力部１６、及びプライマー設計処理部１８は、互いに接続されている。

　入力部１２は、ユーザによって入力された情報や、各種の設定指示、選択指示、入力指示、作成指示等を取得するものであり、例えば、キーボードおよびマウス等の入力デバイスによって構成される。
　格納部１４は、プライマー設計装置の動作プログラムを格納するものであり、また、プライマー設計処理を実行する上で必要な情報やデータを一時的に格納することができるものでもある。格納部１４としては、例えば、ＨＤＤ（Hard Disc Drive：ハードディスクドライブ）、ＳＳＤ（Solid State Drive：ソリッドステートドライブ）、ＦＤ（Flexible Disc：フレキシブルディスク）、ＭＯディスク（Magneto-Optical disc：光磁気ディスク）、ＭＴ（Magnetic Tape：磁気テープ）、ＲＡＭ（Random Access Memory：ランダムアクセスメモリ）、ＣＤ（Compact Disc：コンパクトディスク）、ＤＶＤ（Digital Versatile Disc：デジタルバーサタイルディスク）、ＳＤカード（Secure Digital card：セキュアデジタルカード）、ＵＳＢメモリ（Universal Serial Bus memory：ユニバーサルシリアルバスメモリ）等の記録メディア等を用いることができる。
　出力部１６は、入力部１２から入力されたＤＮＡ塩基配列情報、指示、設計条件、及びプライマー設計処理部１８で設計されたプライマー配列情報等を出力するものであり、例えば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）、フラットパネルディスプレイ、個体ディスプレイ、並びにブラウン管（ＣＲＴ）等のディスプレイユニット、及び種々の形態のプリンター等によって構成される。

　プライマー設計処理部１８は、プライマー設計のための一連の処理を行うものである。
　プライマー設計処理部１８は、塩基配列データ取得部２０と、標的部位情報取得部２２と、塩基変換部２４と、相補鎖生成部２６と、部分配列切出部２８と、プライマー候補配列選抜部３０と、プライマー配列決定部３２と、制御部３４と、を備える。
　プライマー設計処理部１８は、中央処理ユニット（ＣＰＵ）等を含むプロセッサ、及びコンピュータ等によって構成することができる。
　また、図２に示すように、プライマー設計方法は、塩基配列データ取得工程Ｓ１０と、標的部位情報取得工程Ｓ１２と、塩基変換工程Ｓ１４と、相補鎖生成工程Ｓ１６と、部分配列切出工程Ｓ１８と、プライマー候補配列選抜工程Ｓ２０と、プライマー配列決定工程Ｓ２２と、判定工程Ｓ２４によって全ての標的部位を選択したかを判定し、全ての標的部位が検出されるまで、部分配列切出工程Ｓ１８、プライマー候補配列選抜工程Ｓ２０、及びプライマー配列決定工程Ｓ２２を繰り返す繰り返し工程を含む。

（塩基配列データ取得部）
　図１に示す塩基配列データ取得部２０は、図２に示す塩基配列データ取得工程Ｓ１０を実施する部分であって、入力部１２を介して、プライマー設計を行う生物種のゲノムの二本鎖ＤＮＡ配列（リファレンス配列）のデータを取得するものである。予め、格納部１４にリファレンス配列のデータが格納されている場合には、格納部１４から取得してもよい。
　ここで、取得されるゲノム二本鎖ＤＮＡ配列のデータは、プライマー設計を行う生物種のゲノムの全配列のデータであることが好ましい。
　なお、本実施形態のプライマーの設計方法の説明のために、この工程で取得された二本鎖ＤＮＡ配列データの二本鎖ＤＮＡを、テンプレートＤＮＡと呼び、それぞれ、Ａ鎖、Ｂ鎖と呼ぶものとする（図３Ａ参照）。
　塩基配列データ取得部２０は、コンピュータによって構成され、上述のゲノムの二本鎖ＤＮＡ配列のデータを取得する機能を果たす。

（標的部位情報取得部）
　図１に示す標的部位情報取得部２２は、図２に示す標的部位情報取得工程Ｓ１２を実施する部分であって、入力部１２を介して、塩基配列データ取得部２０で取得されたゲノム二本鎖ＤＮＡに含まれる１以上の標的部位、及びその位置情報を取得することができる。予め、格納部１４に標的部位、及びその位置情報が格納されている場合には、格納部１４から取得してもよい。
　ここで、「標的部位」とは、所定の生命現象に関係する部位であり、メチル化され得るシトシン（Ｃ）であるＣＧ配列のシトシン（Ｃ）であり、メチル化度を計測するサイトである。
　標的部位の選択数は、２以上であれば、特に限定されないが、本発明の所望の効果を顕著に得る観点から、５～１０００の部位を選択することが好ましい。
　各標的部位の位置は、染色体、及びゲノム座標等で示すことができる。
　標的部位情報取得部２２は、コンピュータによって構成され、上述のゲノム二本鎖ＤＮＡに含まれる２以上の標的部位、及びその位置情報を取得する機能を果たす。

（塩基変換部）
　塩基変換部２４は、図２に示す塩基変換工程Ｓ１４を実施する部分であって、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、塩基配列データ取得部２０から取得したテンプレートＤＮＡ上のＣＧ配列のシトシン（Ｃ）を「Ｙ」へ変換し（図３Ａ及び図３Ｂの矢印の塩基参照）、その他の配列のシトシン（Ｃ）は、チミン（Ｔ）へ変換するものである。ＤＮＡのＣＧ配列のシトシン（Ｃ）は、メチル化されている可能性とメチル化されていない可能性があるため、チミン（Ｔ）に変換される可能性と、シトシン（Ｃ）として残存ずる可能性の両方を含む「Ｙ」へ変換する。
　なお、この変換処理は、コンピュータ上で疑似的に、バイサルファイト処理後、ＰＣＲを用いて増幅したＤＮＡの生成を再現するものである。
　塩基変換部２４は、コンピュータによって構成され、上述のテンプレートＤＮＡ上のＣＧ配列のシトシン（Ｃ）を「Ｙ」へ、その他の配列のシトシン（Ｃ）は、チミン（Ｔ）へ変換する機能を果たす。

　先述したように、バイサルファイト処理により、ＤＮＡ二本鎖は相補性を失ってしまう。これは、バイサルファイト処理により、相補性のあるＣＧ塩基対のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）へ変換されることで、塩基対の相補性が失われてしまうからである（図３Ａ及び図３Ｂの太字の塩基参照）。このように相補性が失われたバイサルファイト処理後のＤＮＡ上にある増幅対象領域は、１組のプライマーで両鎖を同じように増幅することができない。そのため、二本鎖ＤＮＡのメチル化状態の解析を行う場合には、各鎖の各標的部位をそれぞれ含む増幅対象領域を増幅するプライマー対（フォーワードプライマー及びリバースプライマー）を標的部位ごとに作製する必要がある。つまり、図３Ｂの塩基変換後のＡ鎖の標的部位を含む増幅対象領域に係るプライマー対、及び塩基配列後のＢ鎖の標的部位を含む増幅対象領域に係るプライマー対をそれぞれ設計する必要がある。
　但し、後述の変形例５で説明するが、Ａ鎖のみを解析したい場合やＢ鎖のみを解析したい場合、あるいはＡ鎖ないしはＢ鎖の一方を解析できれば良い場合は、必ずしも２組のプライマー対を設計する必要はない。

（相補鎖生成部）
　相補鎖生成部２６は、図２に示す相補鎖生成工程Ｓ１６を実施する部分であり、塩基変換処理後のＤＮＡ二本鎖それぞれに対し相補鎖を生成するものである。
　ここで、本実施形態のプライマーの設計方法の説明のために、塩基変換後Ａ鎖及び塩基変換後のＢ鎖を、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）及び第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）と呼び、第１の鋳型鎖の相補鎖を第１の相補鎖（Ａ－鎖）、第２の鋳型鎖の相補鎖を第２の相補鎖（Ｂ－鎖）と呼ぶものとする（図３Ｃ参照）。
　図３Ｃに示すように、Ａ＋鎖の塩基配列に対し相補的な配列を生成することにより相補鎖Ａ－を作製し、Ｂ＋鎖の塩基配列に対し相補的な配列を生成することにより相補鎖Ｂ－を作製する。なお、「Ｙ」と相補性のある塩基を、アデニン（Ａ）の可能性とグアニン（Ｇ）の可能性の両方を含む「Ｒ」とする。
　相補鎖生成部２６は、コンピュータによって構成され、塩基変換処理後のＤＮＡ二本鎖それぞれに対し上述の相補鎖を生成する機能を果たす。

　これにより、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）は、「Ｙ」（即ち、メチル化サイト）を除き、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）の３塩基で構成され、第１の相補鎖（Ａ－鎖）は、「Ｒ」（メチル化サイト）を除き、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）及びシトシン（Ｃ）の３塩基で構成されるが、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）と第１の相補鎖（Ａ－鎖）は相補性を持つことができる。
　また、同様に、第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）も、「Ｙ」（メチル化サイト）を除き、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）の３塩基で構成され、第２の相補鎖（Ｂ－鎖）は、「Ｒ」（メチル化サイト）を除き、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）及びシトシン（Ｃ）の３塩基で構成されるが、第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）と第２の相補鎖（Ｂ－鎖）は相補性を持つことができる。

（部分配列切出部）
　部分配列切出部２８は、図２に示す部分配列切出工程Ｓ１８を実施する部分であり、図４のフローチャートに示すように、標的部位情報取得部２２で取得した２以上の標的部位の中から、標的部位を１つ選択し（ステップＳ２８０）、その選択された標的部位の位置情報に基づいて、各鎖のＤＮＡ配列から、選択された標的部位の「Ｙ」又はそれに相補的な「Ｒ」（即ち、標的部位にあり、メチル化サイトにある塩基）を検出し、検出された「Ｙ」及び「Ｒ」の５’末端側に位置する塩基配列（図３Ｄの（１）～（４））から所定の長さの部分配列の中から切り出せるだけ切り出し（ステップＳ２８２）、１以上の部分配列を取得するものである。
　なお、図４は、部分配列切出部２８、プライマー候補配列選抜部３０及びプライマー配列決定部３２の動作の一例を示すフローチャートである。
　部分配列切出部２８は、コンピュータによって構成され、上述の選択された標的部位の位置情報に基づいて、各鎖のＤＮＡ配列から、選択された標的部位の「Ｙ」又はそれに相補的な「Ｒ」から所定の長さの部分配列の中から切り出せるだけ切り出し、１以上の部分配列を取得する機能を果たす。

　ここで、切り出される１以上の部分配列の長さは、特に限定されないが、処理の効率性や、本発明の所望の効果を顕著に得る観点から、ユーザが所望するＰＣＲ増幅産物の最大の長さとプライマーの最小の長さの差の長さから、標的部位の長さ（１塩基分）を除いた長さであることが好ましい。
　ＰＣＲ増幅産物の長さは、公知の範囲、即ち、７０～数キロｂｐであれば特に限定されない。ＰＣＲの成功率、及びＤＮＡシーケンサーの配列解読能力等を考慮することが好ましい。
　プライマーの長さは、公知の範囲、即ち、１５～４５塩基であれば特に限定されない。プライマーの特異性、及びプライマー・ダイマーの形成性を考慮することが好ましい。

　例えば、ユーザが設定したＰＣＲ産物の最大の長さが３００塩基であり、プライマーの最小の長さが２０塩基である場合、切り出される所定の長さｘ＝３００－２０－１（標的部位の長さ）＝２７９と算出され、まず、各標的部位の５’末端側にある２７９塩基が切り出される。図３Ｄに示されるように、各鎖の標的部位、即ち、Ａ＋鎖の「Ｙ」、Ａ－鎖の「Ｒ」、Ｂ＋鎖の「Ｙ」及びＢ－鎖の「Ｒ」の５’末端側にある２７９塩基（図３Ｄの（１）～（４））が、各鎖からそれぞれ切り出される。
　続いて、２７９塩基の中から、プライマーの長さ（２０塩基以上所定の長さ以下）で切り出せるだけ部分配列を切り出すことにより、１以上の部分配列を取得することができる。

　なお、ＰＣＲ増幅産物の長さ、及びプライマーの長さの数値、又は数値範囲は、入力部１２を介して、ユーザにより設定される。これらの条件が、予め、格納部１４に格納されている場合には、格納部１４から取得し、設定することもできる。

（プライマー候補配列選抜部）
　プライマー候補配列選抜部３０は、図２に示すプライマー候補配列選抜工程Ｓ２０を実施する部分であり、部分配列切出部２８で切り出された各鎖の１以上の部分配列から、所定の選抜条件（１）～（３）を全て満たすものをプライマー候補配列として選抜するものである。
　具体的には、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）から切り出された１以上の部分配列（即ち、図３Ｄの（１）から切り出された１以上の部分配列）が、所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）のフォーワードプライマー候補配列として選抜し、第１の相補鎖（Ａ－鎖）から切り出された１以上部分配列（即ち、図３Ｄの（２）から切り出された１以上の部分配列）が、所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）のリバースプライマー候補配列として選抜し、第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）から切り出された１以上の部分配列（即ち、図３Ｄの（３）から切り出された１以上の部分配列）が、所定の選抜条件を満たすものは、第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）のフォーワードプライマー候補配列として選抜し、第２の相補鎖（Ｂ－鎖）から切り出された１以上の部分配列（即ち、図３Ｄの（４）から切り出された１以上の部分配列）が、所定の選抜条件を満たすものは、第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）のリバースプライマー候補配列として選抜する。
　プライマー候補配列選抜部３０は、コンピュータによって構成され、上述の各鎖の１以上の部分配列から、所定の選抜条件（１）～（３）を全て満たすものをプライマー候補配列として選抜する機能を果たす。

　プライマー候補配列の「所定の選抜条件」とは、以下の項目（１）～（３）である。所定の選抜条件の数値及び数値範囲は、ユーザが入力部１２を介して、予め設定しておくことができる。
（１）Ｔｍ値が所定の範囲内にあること、
（２）部分配列上に含まれるＹＧ配列またはＣＲ配列が所定の数以下であること
（３）塩基変換後の鋳型鎖ＤＮＡ（ゲノム二本鎖ＤＮＡ）上の関連領域外の塩基配列との接合数の上限が１以上の所定の数以下であること

　上記（１）の条件にかかる、「Ｔｍ値」の範囲は、公知の数値範囲、即ち、４５～７０℃であれば特に限定されない。ＰＣＲのサーマルサイクル条件、ＰＣＲ増幅のかかり易さ（使用するＰＣＲ酵素によって増幅を進めやすい温度帯）、及びＰＣＲ増幅の特異性を考慮することが好ましい。Ｔｍ値は、例えば、最近接塩基対法で算出することができる。

　上記（２）の条件にかかる、「部分配列上に含まれるＹＧ配列またはＣＲ配列」の数は、特に限定されないが、本発明の所望の効果を顕著に得る観点から、好ましくは２以下であり、より好ましくは１以下であり、特に好ましくは０である。
　この条件を満たすことにより、プライマーと、プライマー接合部位におけるＣＧ配列のシトシン（Ｃ）との接合による影響を小さくすることができる。

　上記（３）の条件にかかる、「塩基変換後の鋳型鎖ＤＮＡ（ゲノム二本鎖ＤＮＡ）上の関連領域外の配列」とは、部分配列の位置に対応する、塩基変換後の鋳型鎖ＤＮＡ上の位置における配列を除く塩基配列のこと、部分配列を除く配列（塩基変換後の鋳型鎖ＤＮＡ配列）と相補的な塩基配列をいう。
　「塩基変換後の鋳型鎖ＤＮＡ上の関連領域外の配列との接合数の上限」は、特に限定されないが、本発明の所望の効果を顕著に得る観点から、好ましくは５以下であり、特に好ましくは２以下である。
　この条件満たすことにより、プライマーがバイサルファイト処理後のＤＮＡ上の関連領域外と接合する影響を小さくすることができる。

　ＰＣＲにおける加熱のサイクル数をｎとして、図５Ａに示すように、ＤＮＡにプライマー対（フォーワードプライマー及びリバースプライマー）が接合した場合、２^ｎのオーダーでＰＣＲ増幅産物が生成されるが、図５Ｂに示すように、フォーワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか１つがＤＮＡに接合した場合は、２ｎのオーダーでＰＣＲ増幅産物が生成される（図５Ｂは、フォーワードプライマーが接合した場合を示す）。
　従って、一般的な加熱サイクル数（ｎが２０～４０程度）でＰＣＲが行われた場合に、ＤＮＡにプライマー対が増幅対象領域外のＤＮＡ配列に接合した場合は、非特異産物が大量に生成されてしまうため問題となるが、フォーワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか１つが関連領域外のＤＮＡ配列に接合した場合は、非特異産物がそれほど多く生成されることがなく、特に問題とされない。そのため、従来は、フォーワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか１つが関連領域外のＤＮＡ配列に接合した場合に、非特異産物が生成される問題については特に考慮されてこなかった。なお、図５Ａの（１）は、増幅対象領域のＤＮＡ配列を示し、（２）は、増幅対象領域外のＤＮＡ配列を示す。また、図５Ｂの（３）は、部分配列の関連領域のＤＮＡ配列を示し、（４）は、関連領域外のＤＮＡ配列を示す。
　このように、プライマーの設計において判定される従来の条件に、各プライマーと、対象領域外のＤＮＡとの接合とを所定の範囲内で許容した、上記（３）の条件を加えた判定を行うことにより、プライマー設計成功率を高めることができる。

　ここで、各鎖から切り出された１以上の部分配列の中から、所定の選抜条件を満たすものをプライマー候補配列として選抜する処理について、図４のフローチャートを用いて説明する。

　プライマー候補配列選抜部３０は、まず、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）から切り出された１以上の部分配列の中から、１つ取得し（ステップＳ３００）、その部分配列のＴｍ値が所定の範囲内にあるか否かを判定する（ステップＳ３０２）。
　Ｔｍ値が所定の範囲内でなければ、別の部分配列を取得し（ステップＳ３００）、Ｔｍ値が所定の範囲内であれば、部分配列上に含まれるＹＧ配列またはＣＲ配列が所定の数以下であるか否かを判定する（ステップＳ３０４）。
　部分配列上に含まれるＹＧ配列またはＣＲ配列が所定の数以下でなければ、別の部分配列を取得し（ステップＳ３００）、部分配列上に含まれるＹＧ配列またはＣＲ配列が所定の数以下であれば、塩基変換後の鋳型鎖ＤＮＡ上の関連領域外の塩基配列との接合数の上限が１以上の所定の数以下であるか否かを判定する（ステップＳ３０６）。
　塩基変換後の鋳型鎖ＤＮＡ上の関連領域外の塩基配列と、部分配列との接合数の上限が「１以上の所定の数」以下でなければ、別の部分配列を取得し（ステップＳ３００）、塩基変換後の鋳型鎖ＤＮＡ上の関連領域外の配列との接合数の上限が１以上の所定の数以下であれば、プライマー候補配列として選抜し（ステップＳ３０８）、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）から切り出された全ての部分配列の判定が終了したか否かを判定する（ステップＳ３１０）。
　第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）から切り出された全ての部分配列の判定が終了していなければ、別の部分配列を取得し（ステップＳ３００）、全ての部分配列の判定が終了していれば、選抜された１以上のプライマー候補配列を、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）のフォーワードプライマー候補配列として決定する（ステップＳ３１２）。

　第１の相補鎖（Ａ－鎖）から切り出された１以上の部分配列、第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）から切り出された１以上の部分配列、及び第２の相補鎖（Ｂ－鎖）から切り出された１以上の部分配列についても同様の判定を行い（ステップＳ３００～Ｓ３１０）、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）のリバースプライマー候補配列、第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）のフォーワードプライマー候補配列、及び第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）のリバースプライマー候補配列を決定する（ステップＳ３１２）。

（プライマー配列決定部）
　プライマー配列決定部３２は、図２に示すプライマー配列決定工程Ｓ２２を実施する部分であり、プライマー候補配列選抜部３０で決定された１以上のプライマー候補配列、即ち、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）の１以上のフォーワードプライマー候補配列、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）の１以上のリバースプライマー候補配列、第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）の１以上のフォーワードプライマー候補配列、及び第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）の１以上のリバースプライマー候補配列の中から、（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合と、（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合に分けて、所定の配列の組み合わせ（ペア）を作り、その各組み合わせの配列間でローカルアライメント・スコアを算出し、その値が所定の閾値を超えているか否かに基づいて、各鎖（Ａ＋鎖またはＢ＋鎖）における部分配列切出部２８で選択された所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列を採用し、決定するものである。以下に、各鎖において実行されるプライマー配列決定方法を説明する。

　（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合、
［１］　第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）の１以上のプライマー候補配列から所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを選択し、
［２］　前記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから１つのペア選択し、前記選択したプライマー候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
［３］　前記所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）における所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定する。

　ここで、上記［２］で選択したプライマー候補配列ペアのスコアが閾値より高く、プライマー配列ペア（フォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列）を決定することができない場合は、上記［１］で選択したプライマー候補配列ペアの中から異なるペアを１つ選択し、［２］及び［３］の工程を実施し、プライマー配列ペアが少なくとも１つ決定するまで、このような工程を繰り返す。少なくとも１つのプライマー配列ペアを決定することができれば、上記［１］で選択した全てのプライマー候補配列ペアのスコア算出等の工程を必ずしも実行する必要はなく、部分配列切出工程Ｓ１８に戻って、別の標的部位の選択を行い（図４のステップＳ２８０）、別の標的部位のプライマー配列の決定を行ってもよい。計算コストの削減や、手間や時間を省くことができるという効果を有する。
　また、上記［１］で選択した全てのプライマー候補配列のペアのスコアが閾値より高く、プライマー配列ペアとして採用及び決定することができない場合は、部分配列切出工程Ｓ１８に戻って、別の標的部位の選択を行い（図４のステップＳ２８０）、別の標的部位のプライマー配列の決定を行う。

　（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合は、
［１］第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）の前記１以上のプライマー候補配列から所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを選択し、
［２］前記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから１つのペアを選択し、前記選択したプライマー候補配列ペアの各候補配列と、既に決定された異なる標的部位の各プライマー配列との間のローカルアライメント・スコア、及び、前記選択した候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
［３］算出された全てのローカルアライメント・スコアの中から最大値（即ち、最もプライマー・ダイマーを形成しやすいペアのスコア）を検出し、その値が所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）における所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定する。

　ここで、上記［２］で選択したプライマー候補配列ペアが算出したスコアの最大値が閾値よりも高く、プライマー配列ペア（フォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列）を決定することができない場合は、上記［１］で選択したプライマー候補配列ペアの中から異なるペアを１つ選択し、［２］及び［３］の工程を実施し、プライマー配列ペアが少なくとも１つ決定するまで、このような工程を繰り返す。少なくとも１つのプライマー配列ペアを決定することができれば、上記［１］で選択した全てのプライマー候補配列ペアのスコア算出等の工程を必ずしも実行する必要はなく、部分配列切出工程Ｓ１８に戻って、別の標的部位の選択を行い（図４のステップＳ２８０）、別の標的部位のプライマー配列の決定を行ってもよい。計算コストの削減や、手間や時間を省くことができるという効果を有する。
　また、上記［１］で選択した全てのプライマー候補配列のペアが算出したスコアの最大値が閾値より高く、プライマー配列ペアとして採用及び決定することができない場合は、部分配列切出工程Ｓ１８に戻って、別の標的部位の選択を行い（図４のステップＳ２８０）、別の標的部位のプライマー配列の決定を行う。

　ここで、上記ローカルアライメント・スコアは、プライマー候補配列間、又は、プライマー候補配列と、既に決定されたプライマー配列間において、〈１〉塩基が相補的なペアは１か所あたり「X」、〈２〉非相補的なペアは１か所あたり「Y」、及び、〈３〉挿入または欠失がある場合は１か所あたり「Z」とした場合、前記「X」は１、前記「Y」は－４～－２、及び前記「Z」は－６～－３で算出する。また、所定の閾値は、１～４である。

　本願発明者らは、従来、一般的なスコア算出に使用するパラメータ（例えば、相補スコア１、非相補スコア－１、ギャップ／欠失スコア－２）、閾値（０）、配列比較の方法（例えば、候補配列の総当たり）が使用されてきたことに着目し、特に検討されることのない、ローカルアライメント・スコアの算出方法、スコア算出に係る配列比較の組み合わせや順序、プライマー配列の決定を選抜する所定の閾値等について鋭意検討し、上記方法によれば、少ない計算コストで、プライマー・ダイマーの形成率を極めて低く抑制しつつ、高いプライマー設計成功率を獲得することができることを知見した。特に、標的部位の数が多ければ多いほど、具体的には、標的部位の数が５０以上のプライマー設計を実施する場合において、本発明の所望の効果を顕著に獲得することができる。
　上記効果を従来の方法で獲得する場合、化学的なエネルギー計算や深層学習といった計算コストの高い方法を用いてスコア算出を改良する必要があり、標的部位が多い場合、現実的な時間で計算ができないという課題があった。しかし、本願方法は、「単純な足し算によるスコア算出の範囲内」で上記効果を獲得することができるため、少ない計算コストで、標的部位の数が数千程度であれば現実的な時間で（一般的なコンピュータであれば数日程度）設計を行うことができるという効果を有する。

　プライマー配列決定部３２は、コンピュータによって構成され、上述の１以上のプライマー候補配列の中からフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列を採用し、決定する機能を果たす。

　ここで、図６及び７を参照して、上記ローカルアライメント・スコアの算出にかかる配列比較（配列の組み合わせ）方法及びその順序について、より具体的に説明する。

　まず、上記（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合のプライマー配列決定方法について説明する。
　上記［１］の工程において、まず、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）の１以上のフォーワードプライマー候補配列及び第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）の１以上のリバースプライマー候補配列から作製が可能な全てのプライマー対（フォーワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせ）を取得し、各プライマー対について、ＰＣＲによって増幅が予想されるＰＣＲ増幅産物の長さを算出する。次いで、算出されたＰＣＲ増幅産物の長さが、所定の数値範囲内にあるか否かを判定し、算出されたＰＣＲ増幅産物の長さが所定の数値範囲内にあれば、そのＰＣＲ増幅産物の長さが算出されたプライマー対（即ち、第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列及び第１の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列の組み合わせ）を、部分配列切出部２８（部分配列切出工程）で選択された標的部位を含む領域を増幅する１以上のプライマー候補配列ペア、即ち、１以上の第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列及びリバースプライマー候補配列ペアとして採用する（図４のステップＳ３２０）。
　ここで、算出されたＰＣＲ増幅産物の長さを判定する「所定の数値範囲」とは、ユーザが所望するＰＣＲ増幅産物の長さを含む範囲であり、先述したように、公知の範囲、即ち、７０～数キロｂｐであれば特に限定されない。ＰＣＲの成功率、及びＤＮＡシーケンサーの配列解読能力等を考慮することが好ましい。
　図６Ａは、プライマー候補配列選抜部３０（プライマー候補配列選抜工程）で選抜されたプライマー候補配列（３つのフォーワードプライマー候補配列及び２つのリバースプライマー候補配列）を示す。図６Ｂは、上記［１］の工程で選択された所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを示す（即ち、本ケースでは、３つのフォーワードプライマー候補配列及び２つのリバースプライマー候補配列の全てのペアのＰＣＲによって増幅が予想されるＰＣＲ増幅産物の長さが所定の範囲内にあると判定された）。

　次いで、上記［２］の工程において、図６Ｂに示すプライマー候補配列ペア（６ペア）の中から、「フォーワード候補配列ＦＣ１」及び「リバース候補配列ＲＣ１」を１つのペアとして選択し、そのペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出する。
　次いで、上記［３］の工程において、算出されたローカルアライメント・スコアの値が、所定の閾値以下である場合は、上記［２］で選択した「フォーワード候補配列ＦＣ１」及び「リバース候補配列ＲＣ１」ペアを前記選択された所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定する（図４のステップＳ３２４、ステップＳ３２２）。

　次に、上記（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合のプライマー配列決定方法について説明する。
　上記［１］の工程において、まず、上記（Ｉ）－［１］の工程と同様に、部分配列切出部２８（部分配列切出工程）で選択された標的部位を含む領域を増幅する１以上の第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列及びリバースプライマー候補配列ペアとして採用する（図４のステップＳ３２０）。図６Ａは、プライマー候補選抜工程で選抜されたプライマー候補配列（３つのフォーワードプライマー候補配列及び２つのリバースプライマー候補配列）を示す。図６Ｂは、上記［１］で選択された６つの所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを示す（即ち、本ケースでは、３つのフォーワードプライマー候補配列及び２つのリバースプライマー候補配列の全てのペアのＰＣＲによって増幅が予想されるＰＣＲ増幅産物の長さが所定の範囲内にあると判定された）。図７Ａは、既に決定された異なる標的部位Ｐ１及びＰ２にかかるプライマー配列ペアを示す。

　次いで、上記［２］の工程において、図６Ｂに示すプライマー候補配列ペアの中から、「フォーワード候補配列ＦＣ１」及び「リバース候補配列ＲＣ１」を１つのペアとして選択し、各候補配列と、既に決定された異なる標的部位の各プライマー配列との間のローカルアライメント・スコア、及び、選択した候補配列の対となるプライマー候補配列との間のローカルアライメント・スコアを算出する。即ち、図７Ｂに示すように、「フォーワード候補配列ＦＣ１」と、「標的部位Ｐ１のフォーワード配列」、「標的部位Ｐ１のリバース配列」、「標的部位Ｐ２のフォーワード配列」または「標的部位Ｐ２のリバース配列」との間のローカルアライメント・スコア、「リバース候補配列ＲＣ１」と、「標的部位Ｐ１のフォーワード配列」、「標的部位Ｐ１のリバース配列」、「標的部位Ｐ２のフォーワード配列」または「標的部位Ｐ２のリバース配列」との間のローカルアライメント・スコア、及び、「フォーワード候補配列ＦＣ１」及び「リバース候補配列ＲＣ１」のペア間におけるローカルアライメント・スコアを算出する。つまり、９つのローカルアライメント・スコアを算出する。
　次いで、上記［３］の工程において、算出された９つのローカルアライメント・スコアの中から最大値を検出し、その値が所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを、上記選択された所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定する（図４のステップＳ３２４、ステップＳ３２２）。

　ここで、図８に示すローカルアライメントの例を参照して、より具体的に、ローカルアライメント・スコアの算出方法及び閾値に基づく判定方法について説明する。図８は、上から、プライマー候補配列をプライマー配列として採用するか否かの判定にかかる、（１）配列［Ｉ］と配列［ＩＩ］、（２）配列［Ｉ］と配列［ＩＩＩ］、（３）配列［Ｉ］と配列［ＩＶ］のローカルアライメントを示す。図中、配列間の塩基が相補的なペアを形成する場合には、「|」を付し、非相補的なペアを形成している場合には「：」付し、ギャップには「－」を付し、欠失には、何も付さないこととした。
　ローカルアライメント・スコアの算出にあたり、配列間において、〈１〉塩基が相補的なペアは１か所あたり「X」＝１、〈２〉非相補的なペアは１か所あたり「Y」＝－３、及び、〈３〉挿入または欠失がある場合は１か所あたり「Z」＝－６とし、閾値は、４と設定した。

　上記（１）の配列［Ｉ］と配列［ＩＩ］の間では、相補的なペアが５か所あるため、スコアは、１×５－３×０－６×０＝５となる（図８の上図）。しかし、このスコアは、閾値４を超えているので、プライマー候補配列［Ｉ］は、不採用となる。
　上記（２）の配列［Ｉ］と配列［ＩＩＩ］の間では、相補的なペアが４か所、非相補的なペアが１か所あるため、スコアは、１×４－３×１－６×０＝１となる。このスコアは、閾値４以下であるため、プライマー候補配列［Ｉ］は、採用することができる。
　上記（３）の配列［Ｉ］と配列［ＩＶ］の間では、相補的なペアが９か所、欠失が１か所あるため、スコアは、１×９－３×０－６×１＝３なる。このスコアは、閾値４以下であるため、プライマー候補配列［Ｉ］は、採用することができる。

　上記［２］の工程において、図６Ｂに示すプライマー候補配列ペアの中から、全てのペア（６ペア）を選択し、各ペアが算出したローカルアライメント・スコアの最大値が仮に表１に示すとおりであったとする。ここで、所定の閾値を３と設定した場合、所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用及び決定される候補配列プライマーペアは、全６ペアのうち、最大値が３以下の４ペアだけである。つまり、この４つのプライマー候補配列ペアが、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）のフォーワード配列及びリバース配列がプライマー配列として採用され、決定される。

　同様に、まず、第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）の１以上のフォーワードプライマー候補配列及び第２の鋳型鎖（Ｂ＋鎖）の１以上のリバースプライマー候補配列の中から、（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合と、（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合に分けて、所定の配列の組み合わせ（ペア）を作り、その各組み合わせの配列間でローカルアライメント・スコアを算出し、その値が所定の閾値を超えているか否かに基づいて、Ｂ＋鎖における部分配列切出部２８で選択された所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列を採用し、決定する（ステップＳ３２２）。

　全てのプライマー対について、ＰＣＲ増幅産物の長さが所定の範囲内にあるか否かの判定が終了すれば、部分配列切出部２８（部分配列切出工程）において、全ての標的部位を選択したか否か判定する（ステップＳ２４）。
　全ての標的部位が選択されていなければ、部分配列切出工程Ｓ１８に戻って、別の標的部位の選択を行い（ステップＳ２８０）、全ての標的部位が選択されていれば、終了する。

（制御部）
　制御部３４は、プライマー設計処理部１８内の各部だけでなく、入力部１２、格納部１４、及び出力部１６にも直接的または間接的に接続し、入力部１２からのユーザの指示に基づいて、または、格納部１４に格納された所定の動作プログラム等に基づいて、プライマー設計装置１０の各部を制御して、プライマーを設計するものであり、例えば、コンピュータ等のＣＰＵ（Central Processing Unit：中央処理装置）等で構成される。
　制御部３４は、プライマー候補配列選抜部３０において、全ての部分配列が所定の選抜基準を全て満たすか否かの判定が終了するまで（ステップＳ３１０）、判定作業（ステップＳ３００～Ｓ３０８）を繰り返すように制御する。

　制御部３４は、プライマー配列決定部３２において、作製された全てのプライマー対について、ＰＣＲ増幅産物の長さが所定の範囲内にあるか否かの判定が終了するまで、判定作業（ステップ３２０）を繰り返すように制御する。
　制御部３４は、プライマー配列決定部３２において、所定の標的部位に係るプライマー配列ペアが少なくとも１つ決定するまで、（Ｉ）及び（ＩＩ）の［１］で選択したプライマー候補配列ペアの中から異なるペアを１つ選択し、（Ｉ）及び（ＩＩ）の［２］及び［３］の工程の実施を繰り返し、所定の標的部位に係るプライマー配列ペアが決定されない場合は、部分配列切出工程（ステップＳ１８、Ｓ２８０～Ｓ２８２）において、異なる標的部位を１つ選択し、プライマー候補配列選抜工程（ステップＳ２０、Ｓ３００～Ｓ３１２）及びプライマー配列決定工程（ステップＳ２２、Ｓ３２０～Ｓ３２２）を行うよう制御する。

　制御部３４は、部分配列切出部２８において、標的部位情報取得部２２で取得した全ての標的部位が検出されるまで（ステップＳ２４）、部分配列切出工程（ステップＳ１８、Ｓ２８０～Ｓ２８２）、プライマー候補配列選抜工程（ステップＳ２０、Ｓ３００～Ｓ３１２）、及びプライマー配列決定工程（ステップＳ２２、Ｓ３２０～Ｓ３２２）を繰り返す、繰り返し工程が実施されるように、部分配列切出部２８、プライマー候補配列選抜部３０及びプライマー配列決定部３２を制御する。

　本発明の実施形態１のプライマー設計装置１０によれば、優れた設計成功率でアンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーを設計できる。また、その設計に基づくプライマーを獲得することができる。その結果、より多くの標的部位にプライマーを設計しメチル化度の計測を行うことができる。

［変形例１］
　次に、本発明の実施形態１の変形例１に係るプライマー設計装置について説明する。なお、この変形例１に係るプライマー設計装置において、実施形態１と同様の処理については、その説明を省略する。
　実施形態１では、プライマー配列決定において、ローカルアライメント・スコアを算出するプライマー候補配列ペアの数、及び、所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列の数を特に限定していないが、これに限定されず、全てのペアについてスコアを算出し、各標的部位を含む領域を増幅するプライマー配列ペアを１つのみ選択することもできる。

　この変形例１において、プライマー配列決定部３２は、以下に示す工程を実施することもできる。
　（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合は、
　上記［２］の工程において、上記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから全てのペアを選択し、各ペアについて、選択されたプライマー候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　上記［３］の工程において、算出されたローカルアライメント・スコアが、所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出した１以上のプライマー候補配列ペアを選抜し、さらに、選抜された全ペアの中から、上記ローカルアライメント・スコアの最大値が最も小さい値を有するプライマー候補配列ペアを検出し、上記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定する。

　（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合は、
　上記［２］の工程において、上記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから全てのペアを選択し、各ペアについて、選択したプライマー候補配列ペアの各候補配列と、既に決定された異なる標的部位の各プライマー配列との間のローカルアライメント・スコア、及び、上記選択した候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　上記［３］の工程において、各ペアについて、算出された全てのローカルアライメント・スコアの中から最大値を検出し、その値が所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを選抜し、さらに、上記選抜された全ペアの中から、上記ローカルアライメント・スコアの最大値が最も小さい値を有するプライマー候補配列ペアを検出し、所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定する。

　このような工程を実施することにより、所定の標的部位を含む領域を増幅することが可能な１以上のプライマー配列ペアの中から、プライマー・ダイマー形成率が最も低く、且つ、プライマー設計成功率が最も高いペアをプライマー配列として決定することができるという効果を有する。

　例えば、上記［２］の工程において、図６Ｂに示すプライマー候補配列ペアの中から全てのペアを選択し、各ペアが算出したローカルアライメント・スコアの最大値が表１に示すとおりであったとする。所定の閾値を３と設定した場合、所定の閾値以下のスコアの最大値を有するペアは、最大値が３以下の４ペア選抜され、さらに、前記選抜された全ペアの中から、前記ローカルアライメント・スコアの最大値が最も小さい値を有するプライマー候補配列ペアは、「フォーワード候補配列ＦＣ２」と「リバース候補配列ＲＣ２」のプライマー候補配列ペアであるため、このペアが、所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用及び決定される。

［変形例２］
　次に、本発明の実施形態１の変形例２に係るプライマー設計装置について説明する。なお、この変形例２に係るプライマー設計装置において、実施形態１と同様の処理については、その説明を省略する。
　実施形態１においては、ユーザがプライマー設計率を設定することなく、プライマーを設計したが、これに限定されず、事前に設定された、ユーザが所望するプライマー設計成功率に基づいて、プライマー設計を行うこともできる。

　予め、実施形態１及び各変形例に記載のプライマー設計装置（方法）を用いて、少なくとも、所定の閾値と、標的部位（計測サイト）の数、プライマー設計成功率との対応関係を計測しておき、その対応関係を格納部１４に保存する。ここで、「所定の閾値」は、１～４であれば特に限定されない。
　Ｘ、Ｙ、Ｚが全て整数の場合、標的部位が１０００個未満であれば、閾値１、２、３、４全てについて対応関係を作成しておくことが好ましい。標的部位が１０００個以上であれば、少なくとも２個以上の閾値について対応関係を作成しておくことが好ましい。Ｘ、Ｙ、Ｚに非整数を含む場合、標的部位が１０００個未満であれば、少なくとも５個以上の対応関係を作成しておくことが好ましい。標的部位が１０００個以上であれば、少なくとも２個以上の閾値について対応関係を作成しておくことが好ましい。

　ユーザが入力部１２を介して、少なくとも、ユーザが所望するプライマー設計成功率と、標的部位の数を設定し、プライマー設計を実行するよう指示を入力すると、プライマー配列決定部３２は、格納部１４に保存された対応関係の中から、上記プライマー設計成功率及び上記標的部位の数の設定値以上、且つ、その差が小さい上記プライマー設計成功率及び上記標的部位の数に対応する上記所定の閾値を読み出し、その所定の閾値に基づいて、プライマー配列を決定する。

　このような変形例２のプライマー設計装置により、ユーザは、試料が少ない場合や、所望するプライマー設計成功率又は複数のプライマー設計成功率におけるプライマー設計を試みたい場合等、プライマー設計時の背景や事情に応じて、容易且つコスト負担が少なくプライマー配列を設計することができる。また、その設計に基づくプライマーを獲得することができる。

　図９を参照して、プライマー配列決定の際に使用される閾値の選択方法を具体的に説明する。図９は、事前に、実施形態１及び各変形例に記載のプライマー設計装置（方法）を用いて、１００個の標的部位に係るプライマーを設計し、各ペアのローカルアライメント・スコアを判定する閾値を１～４の整数として計測されたプライマー設計成功率、即ち、所定の閾値と、標的部位（計測サイト）の数、プライマー設計成功率との対応関係を示す。この対応関係は、格納部１７に保存されている。

　例えば、ユーザが３０％以上のプライマー設計成功率を望む場合、ユーザは入力部１２を介して、少なくとも、プライマー設計成功率を３０％、標的部位の数を１００と設定し、プライマー設計を実行するよう指示を入力する。格納部１４にある対応関係の中から条件を満たす標的部位の数１００、及びユーザが所望するプライマー設計成功率である３０％より大きく、且つ、最も近い３１％のプライマー設計成功率に対応する閾値２がプライマー配列決定部３２に読み出され、その対応関係における閾値２に基づいて、プライマー配列決定工程を実行し、３１部位分のプライマー配列ペアを獲得する。

［変形例３］
　次に、本発明の実施形態１の変形例３に係るプライマー設計装置について説明する。なお、この変形例３に係るプライマー設計装置において、実施形態１と同様の処理については、その説明を省略する。
　実施形態１においては、メチル化され得るシトシン（Ｃ）をＣＧ配列中のシトシン（Ｃ）のみとし、その中からピックアップされたシトシン（Ｃ）を標的部位としたが、これに限定されず、さらに、メチル化され得るシトシン（Ｃ）にＣＨＧ配列中のシトシン（Ｃ）を含んでもよく、また、その中からピックアップされたシトシン（Ｃ）を標的部位としてもよい。

　この変形例３において、標的部位情報取得部２２は、さらに、入力部１２を介して、塩基配列データ取得部２０で取得されたゲノム二本鎖ＤＮＡに含まれる２以上の標的部位、及びその位置情報を取得する。
　塩基変換部２４は、さらに、塩基配列データ取得部２０から取得したテンプレートＤＮＡ上のＣＨＧ配列のシトシン（Ｃ）も「Ｙ」へ変換し、その他の配列（即ち、ＣＧ配列及びＣＨＧ配列以外の配列）のシトシン（Ｃ）は、チミン（Ｔ）へ変換する。

　プライマー候補配列選抜部３０は、部分配列切出部２８で切り出された各鎖の１以上の部分配列から、さらに、以下の項目（４）を含む所定の選抜条件（１）～（４）を全て満たすものをプライマー候補配列として選抜する。
（４）部分配列上に含まれるＹＨＧ配列またはＣＤＲ配列が所定の数以下であること
　ここで、上記（４）の条件にかかる、「部分配列上に含まれるＹＨＧ配列またはＣＤＲ配列」の数は、特に限定されないが、本発明の所望の効果を顕著に得る観点から、好ましくは２以下であり、より好ましくは１以下であり、特に好ましくは０である。
　この条件を満たすことにより、プライマーと、プライマー接合部位におけるＣＨＧ配列のシトシン（Ｃ）との接合による影響を少なくすることができる。

　この本発明の実施形態１の変形例３のプライマー設計装置により、容易に、且つ、短時間で、ＣＨＧ配列にも対応したアンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーを設計することができる。また、その設計に基づくプライマーを獲得することができる。その結果、これら配列に係る解析も可能になるため、ＤＮＡのメチル化の状態（メチル化度）をより詳細に解析することができる。
　なお、変形例３は、既出の変形例１または２とも組み合わせ可能である。

［変形例４］
　次に、本発明の実施形態１の変形例４に係るプライマー設計装置について説明する。なお、この変形例４に係るプライマー設計装置において、実施形態１と同様の処理については、その説明を省略する。
　実施形態１においては、メチル化され得るシトシン（Ｃ）をＣＧ配列中のシトシン（Ｃ）のみとし、その中からピックアップされたシトシン（Ｃ）を標的部位としたが、これに限定されず、さらに、メチル化され得るシトシン（Ｃ）にＣＨＨ配列中のシトシン（Ｃ）を含んでもよく、また、その中からピックアップされたシトシン（Ｃ）を標的部位としてもよい。

　この変形例４において、標的部位情報取得部２２は、さらに、入力部１２を介して、塩基配列データ取得部２０で取得されたゲノム二本鎖ＤＮＡに含まれる２以上の標的部位、及びその位置情報を取得する。
　塩基変換部２４は、さらに、塩基配列データ取得部２０から取得したテンプレートＤＮＡ上のＣＨＨ配列のシトシン（Ｃ）も「Ｙ」へ変換し、その他の配列（即ち、ＣＧ配列及びＣＨＨ配列以外の配列）のシトシン（Ｃ）は、チミン（Ｔ）へ変換する。

　プライマー候補配列選抜部３０は、部分配列切出部２８で切り出された各鎖の１以上の部分配列から、さらに、以下の項目（５）を含む所定の選抜条件（１）～（３）及び（５）を全て満たすものをプライマー候補配列として選抜する。
（５）部分配列上に含まれるＹＨＨ配列またはＤＤＲ配列が所定の数以下であること
　ここで、上記（５）の条件にかかる、「部分配列上に含まれるＹＨＨ配列またはＤＤＲ配列」の数は、特に限定されないが、本発明の所望の効果を顕著に得る観点から、好ましくは２以下であり、より好ましくは１以下であり、特に好ましくは０である。
　この条件を満たすことにより、プライマーと、プライマー接合部位におけるＣＨＨ配列のシトシン（Ｃ）との接合による影響を少なくすることができる。

　この本発明の実施形態１の変形例４のプライマー設計装置により、容易に、且つ、短時間で、ＣＨＨ配列にも対応したアンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーを設計することができる。また、その設計に基づくプライマーを獲得することができる。その結果、これら配列に係る解析も可能になるため、ＤＮＡのメチル化の状態（メチル化度）をより詳細に解析することができる。

　なお、変形例４は、既出の変形例１または２とも組み合わせ可能である。また、変形例４は、既出の変形例３と組み合わせ可能である。つまり、メチル化され得るシトシン（Ｃ）にＣＨＧ配列及びＣＨＨ配列中のシトシン（Ｃ）の両方を含んでもよく、また、その中からピックアップされたシトシン（Ｃ）を標的部位としてもよい。
　このような場合、プライマー候補配列選抜部３０は、部分配列切出部２８で切り出された各鎖の１以上の部分配列から、さらに、選抜条件（１）～（５）を全て満たすものをプライマー候補配列として選抜する。

［変形例５］
　次に、本発明の実施形態１の変形例５に係るプライマー設計装置について説明する。なお、この変形例４に係るプライマー設計装置において、実施形態１と同様の構成については、同一の符号を付し、実施形態１と同様の処理については、その説明を省略する。
　実施形態１においては、ＤＮＡ二本鎖のどちらも増幅し解析するために、二組のプライマーを設計する装置及び方法を示したが、これに限定されず、ＤＮＡ二本鎖のいずれかの鎖のみを解析する場合は、一組のプライマーを設計するだけでよい。つまり、図３Ｂにおいて、Ａ鎖とＢ鎖に基づいてプライマーを設計したが、Ａ鎖のみに基づいてプライマーを設計すればよい。
　また、ＤＮＡの維持メチル化機構が働いていると考えられる場合は、一組のプライマーのみを設計すれば良い。ＤＮＡの一方の鎖のＣＧ配列中のＣがメチル化されている場合は、他方の鎖のＣＧ配列中のＣもメチル化されている可能性が、一方の鎖のＣＧ配列中のＣがメチル化されていない場合は他方の鎖のＣＧ配列中のＣもメチル化されていない可能性が、非常に高いからである。なお、このような場合において、片方の鎖に基づいて一組のプライマーが設計できない時は、もう片方の鎖に基づいてプライマー設計を行えばよい。

　このように、一組のプライマーのみを設計する場合、相補鎖生成部２６において、図３Ｃに示すＡ＋鎖の塩基配列に対し相補的な塩基配列を持つ相補鎖Ａ－のみを作製する。
　次いで、部分配列切出部２８は、標的部位情報取得部２２で取得した２以上の標的部位の中から、標的部位を１つ選択し（ステップＳ２８０）、その選択された標的部位の位置情報に基づいて、Ａ＋鎖及びＡ－鎖のＤＮＡ配列から、選択された標的部位の「Ｙ」又はそれに相補的な「Ｒ」（即ち、標的部位にあり、メチル化サイトにある塩基）を検出し、検出された「Ｙ」及び「Ｒ」の５’末端側に位置する塩基配列（図３Ｄの（１）及び（２））から所定の長さの部分配列の中から切り出せるだけ切り出し（ステップＳ２８２）、１以上の部分配列を取得する。

　プライマー候補配列選抜部３０は、図２に示すプライマー候補配列選抜工程Ｓ２０を実施する部分であり、部分配列切出部２８で切り出された各鎖の１以上の部分配列から、所定の選抜条件（１）～（３）を全て満たすものをプライマー候補配列として選抜する。
　第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）から切り出された１以上の部分配列（即ち、図３Ｄの（１）から切り出された１以上の部分配列）が、所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）のフォーワードプライマー候補配列として選抜し、第１の相補鎖（Ａ－鎖）から切り出された１以上部分配列（即ち、図３Ｄの（２）から切り出された１以上の部分配列）が、所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）のリバースプライマー候補配列として選抜する。

　プライマー配列決定部３２は、選抜された第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）の１以上のフォーワードプライマー候補配列及び第１の鋳型鎖（Ａ＋鎖）の１以上のリバースプライマー候補配列の中から、（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合と、（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合に分けて、所定の配列の組み合わせ（ペア）を作り、その各組み合わせの配列間でローカルアライメント・スコアを算出し、その値が所定の閾値を超えているか否かに基づいて、Ａ＋鎖における部分配列切出部２８で選択された所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定する。
　なお、変形例５は、既出の変形例１～４の少なくとも１つと組み合わせ可能である。

［実施形態２］
　図１０は、本発明の実施形態２に係るプライマー設計装置の一例を概念的に示すブロック図である。実施形態１のプライマー設計装置１０は、通信インターフェース（通信装置）を備えることもできる。
　図１０に示す実施形態２のプライマー設計装置１０Ａは、図１に示す実施形態１のプライマー設計装置１０と、通信インターフェース３６を有する以外は、同様の構成を有するものであるので、同一の構成要素には、同一の参照符号を付し、その説明は省略する。
　図１１に示すように、プライマー設計装置１０Ａは、インターネット等の通信回線網３８を介して、装置外に設置された公共データベースを備える検索サーバ４２に接続可能である。
　本実施形態の装置１０Ａは、通信インターフェース３６を介して、塩基配列データ取得部２０、標的部位情報取得部２２、塩基変換部２４、相補鎖生成部２６、部分配列切出部２８、プライマー候補配列選抜部３０、及びプライマー配列決定部３２の少なくとも１つを、外部のサーバ４０のサイトにあるプログラムで実行することができる。なお、このような場合は、本実施形態のプライマー設計装置１０Ａは、外部のサーバのプログラムで実行する各手段については含まなくてもよい。

　例えば、通信インターフェース３６は、制御部３４の指示に基づき、通信回線網３８を介して、公共データベースから遺伝子及びゲノムを含むＤＮＡ塩基配列を取得し、格納部１４に格納することができる。ここで、公共データベースの例としては、米国ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information：米国・国立生物工学情報センター）のＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ（European Molecular Biology Laboratory：欧州分子生物学研究所）のＥＮＡ、国立遺伝学研究所のＤＤＢＪ等が挙げられる。
　公共データベースから取得する塩基配列は、プライマーを設計する生物種のゲノムＤＮＡの塩基配列の部分配列であってもよいが、全配列であることが好ましい。

　例えば、通信インターフェース３６は、制御部３４の指示に基づき、通信回線網３８を介して、公共の検索サーバ４２を用いて、配列の相同性検索を行い、プライマー配列決定部３２のローカルアライメント検索等を行うことができる。ここで、公共の検索サーバ４２としては、米国ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information：米国・国立生物工学情報センター）のＢＬＡＳＴ等が挙げられる。

［実施形態３］
　実施形態３は、実施形態１及び２に係るプライマー設計装置及び設計方法により設計されたプライマー配列に基づきプライマーを合成して、プライマーを製造する方法である。
　プライマーの設計方法は、実施形態１及び２に示すとおりである。
　プライマーの合成方法は、公知の方法を使用することができ、例えば、ＤＮＡ合成装置やＲＮＡ合成装置により、ｄＮＴＰ（Deoxyribonucleoside triphosphate：デオキシリボヌクレオシド三リン酸）等を材料として、末端塩基から化学合成する方法等があげられる。合成装置としては、市販品を使用することができる。

　本発明の装置は、装置が備える各々の構成要素を専用のハードウェアで構成してもよいし、各々の構成要素をプログラムされたコンピュータで構成してもよい。
　本発明の方法は、例えば、その各々のステップをコンピュータに実行させるためのプログラムにより実施することができる。また、このプログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供することもできる。

　以上、本発明について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。

［実施例１、比較例１］
　本実施形態１のプライマー設計装置を用いて、リファレンスゲノムＧＲＣｈ３７（GenBank assembly accession: GCA_000001405.1、RefSeq assembly accession: GCF_000001405.13）の塩基配列データ、表１に示すランダムに選択した１００箇所の計測サイト（標的部位）及びその位置情報に基づく、７０ｂｐ～１２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物の長さのマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーを設計した。なお、プライマーの長さは、２０～３５塩基（ｍｅｒ）、メチル化され得るＣは、ＣＧ配列中のＣのみとしてプライマーを設計した。また、部分配列を判定する条件は以下のように設定した。
条件（１）：Ｔｍ値が５５℃～６５℃にあること
条件（２）：部分配列上に含まれるＹＧ配列またはＣＲ配列が０であること
条件（３）：関連領域外の配列との接合数の上限が２であること

　ローカルアライメント・スコアの算出にあたり、実施例１は、配列間において、〈１〉塩基が相補的なペアは１か所あたり「X」＝１、〈２〉非相補的なペアは１か所あたり「Y」＝－３、及び、〈３〉挿入または欠失がある場合は１か所あたり「Z」＝－６とし、閾値は、１と設定した。
　一方、比較例１は、配列間において、〈１〉塩基が相補的なペアは１か所あたり「X」＝１、〈２〉非相補的なペアは１か所あたり「Y」＝－１、及び、〈３〉挿入または欠失がある場合は１か所あたり「Z」＝－２とし、閾値は、０と設定した。

　表３に、実施例１及び比較例１の各計測サイトのプライマー設計の成否、及びプライマー設計の成否の結果から算出されたプライマー設計成功率を示す。また、表４に、実施例１において設計できたプライマーを示し、表５に、比較例１において設計できたプライマーを示す。各プライマーペアは、ローカルアライメント・スコアの最大値が閾値以下となった最初のペアを採用した。

　表３に示すように、各プライマー設計成功率は、実施例１で６２％、比較例１で４％であった。この結果より、プライマー配列決定工程においてローカルアライメント・スコアの最大値に対する閾値を所定の範囲に設定することで、プライマー設計成功率が高まることが確認された。

［実施例１～４、比較例２～４］
　本実施形態１のプライマー設計装置を用いて、リファレンスゲノムＧＲＣｈ３７（GenBank assembly accession: GCA_000001405.1、RefSeq assembly accession: GCF_000001405.13）の塩基配列データ、ランダムに選択した表１に示す１００箇所の計測サイト（標的部位）及びその位置情報に基づく、７０ｂｐ～１２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物の長さのマルチプレックスＰＣＲ用のプライマー配列を設計した。なお、プライマーの長さは、２０～３５塩基（ｍｅｒ）、メチル化され得るＣは、ＣＧ配列中のＣのみとしてプライマーを設計した。また、部分配列を選定する条件は以下のように設定した。
条件（１）：Ｔｍ値が５５℃～６５℃にあること
条件（２）：部分配列上に含まれるＹＧ配列またはＣＲ配列が０であること
条件（３）：関連領域外の配列との接合数の上限が２であること

　ローカルアライメント・スコアの算出にあたり、配列間において、〈１〉塩基が相補的なペアは１か所あたり「X」＝１、〈２〉非相補的なペアは１か所あたり「Y」＝－３、及び、〈３〉挿入または欠失がある場合は１か所あたり「Z」＝－６とした。
　実施例１～４及び比較例２～４の閾値は、それぞれ、表６に示すように設定された。

　また、各実施例及び比較例で使用されたローカルアラインメント・スコアに関する条件（スコア算出に使用するパラメータ、及び閾値）と同じプライマーのダイマー形成率も算出した。別途選択した９１の標的部位を増幅する、２本のプライマーの間のローカルアライメント・スコアが０～６に分布する１組のプライマーセットを用意し（即ち、各標的部位について１ペアずつ設計され、合計１８２本のプライマーを用意する）、バイサルファイト処理を施した標品ＤＮＡ（Zymo Research社 Human WGA Methylated DNA) をマルチプレックスＰＣＲにて増幅した。得られた増幅産物の配列を次世代シーケンサー（illumina社 MiSeq）により取得した。ここで、取得された配列は、標的部位を含む目的の増幅産物、プライマー・ダイマー、その他の非特異増幅産物からなる。コンピュータ内で、用意したプライマー配列から生じ得る全てのプライマー・ダイマー配列を生成し、次世代シーケンサーにより取得した配列と照合および集計することによって、実際に生成されたプライマー・ダイマー配列及びその本数を検出した。用意したプライマー配列から選ばれる全ての２配列の組み合わせを、ローカルアライメント・スコアに従って、０～６の７群に振り分けた。各群に所属する２配列の数のうち、実際にプライマー・ダイマーが生成された（次世代シーケンサーで１０本以上の配列が取得された）割合を計算し、ダイマー形成率とした。

　表７に、実施例１～４及び比較例２～４の各計測サイトのプライマー設計の成否、及びプライマー設計の成否の結果から算出されたプライマー設計成功率を示す。また、実施例２～４において設計できたプライマーを表８～１０に示し、比較例２～４において設計できたプライマーを表１１～１３に示す。　図１２Ａに、各実施例及び比較例に基づく、プライマー配列決定の際に設定された各閾値に対するプライマー設計成功率、図１２Ｂに、各実施例及び比較例で設計された各閾値に対するダイマー形成率を示す。

　表７、図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるように、ローカルアライメント・スコアの最大値が閾値１～４の整数で判定され、採用されたプライマー配列ペア（実施例１～４）は、高いプライマー設計成功率を獲得しつつ、ダイマーの形成も２％以下と極めて低く抑えられることがわかる。一方、ローカルアライメント・スコアの最大値が閾値０、５及び６で判定され、採用されたプライマー配列ペア（比較例２～４）は、低いダイマー形成率であっても、プライマー設計成功率が低い結果、または、高い設計成功率を獲得していても、ダイマー形成率が高い結果が生じていることがわかる。

　なお、比較例３のプライマー設計成功率（８４％）が実施例４のプライマー設計成功率（８２％）を僅かに上回っている。しかし、実施例４、即ち、本願発明に係る設計及び製造したプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行った場合では、ダイマー形成率が２％以下に抑えられるのに対し、比較例３、即ち、ローカルアライメント・スコアの最大値が本願発明に係る数値範囲を外れた閾値５で判定された場合では、採用されたプライマー配列ペアのうち２０％程度でダイマーが形成されている。そのため、比較例３で設計、製造されたプライマー配列ペアをマルチプレックスＰＣＲに使用した場合、所望の標的部位を増幅できない、多量のプライマー・ダイマーが生成されて増幅した別の標的部位のシーケンスを阻害する等の問題が生じ、破綻する可能性が高い。

　１０、１０Ａ　プライマー設計装置
　１２　入力部
　１４　格納部
　１６　出力部
　１８　プライマー設計処理部
　２０　塩基配列データ取得部
　２２　標的部位情報取得部
　２４　塩基変換部
　２６　相補鎖生成部
　２８　部分配列切出部
　３０　プライマー候補配列選抜部
　３２　プライマー配列決定部
　３４　制御部
　３６　通信インターフェース
　３８　通信回線網
　４０　サーバ
　４２　検索サーバ

　本発明で設計されたプライマーは、創薬・診断・その他バイオ産業分野において、生体試料のＤＮＡメチル化度計測に利用可能である。

Claims

　少なくとも１本のゲノム二本鎖DNAのメチル化度の計測のために、バイサルファイト反応又は酵素反応、及びマルチプレックスＰＣＲを利用し、前記メチル化度を計測する２以上の標的部位をそれぞれ含む複数の領域を同時に増幅するために用いられるアンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーを設計するための方法であって、
　前記DNAの鋳型鎖に対し相補鎖を生成する相補鎖生成工程と、
　前記２以上の標的部位の中から１つ選択し、前記各鎖から、その選択された標的部位の５’末端側に位置する塩基配列の中から、所定の長さの部分配列を１以上切り出す部分配列切出工程と、
　前記切り出された１以上の部分配列を１以上のプライマー候補配列として選抜するプライマー候補配列選抜工程と、
　前記１以上のプライマー候補配列の中から、前記選択された所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列を採用し、決定するプライマー配列決定工程と、
　前記部分配列切出工程において、前記２以上の標的部位が全て選択されるまで、前記部分配列切出工程、前記プライマー候補配列選抜工程、及び前記プライマー配列決定工程を繰り返す、繰り返し工程と、
を有し、
（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合は、
　　前記プライマー配列決定工程は、
　　　［１］　前記１以上のプライマー候補配列から前記所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを選択し、
　　　［２］　前記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから１つのペアを選択し、前記選択したプライマー候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　　［３］前記所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定し、
（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合は、
　　前記プライマー配列決定工程は、
　　　［１］前記１以上のプライマー候補配列から所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを選択し、
　　　［２］前記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから１つのペアを選択し、前記選択したプライマー候補配列ペアの各候補配列と、既に決定された異なる標的部位の各プライマー配列との間のローカルアライメント・スコア、及び、前記選択した候補配列ペアの配列間のローカルアライメント・スコアを算出し、
　　　［３］算出された全てのローカルアライメント・スコアの中から最大値を検出し、その値が所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定するものであって、
　前記（Ｉ）及び前記（ＩＩ）の前記［３］の工程において、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用されない場合は、前記（Ｉ）及び前記（ＩＩ）の［１］で選択された前記１以上のプライマー候補配列ペアの中から、異なる１つのペアを選択し、少なくとも１つのプライマー候補配列ペアが採用されるまで、前記［２］及び［３］の工程を繰り返し、
　前記ローカルアライメント・スコアは、前記プライマー候補配列間における、〈１〉塩基が相補的なペアは１か所あたり「X」、〈２〉非相補的なペアは１か所あたり「Y」、及び、〈３〉挿入または欠失がある場合は１か所あたり「Z」とした場合、前記「X」は１、前記「Y」は－４～－２、及び前記「Z」は－６～－３で算出し、
　前記所定の閾値は、１～４である、
　アンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計方法。
　前記プライマー配列決定工程は、
　前記（Ｉ）標的部位が２以上であって、異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合は、
　　前記［２］の工程において、前記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから全てのペアを選択し、各ペアについて、選択されたプライマー候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　前記［３］の工程において、算出されたローカルアライメント・スコアが、前記所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出した１以上のプライマー候補配列ペアを選抜し、さらに、選抜された全ペアの中から、前記ローカルアライメント・スコアの最大値が最も小さい値を有するプライマー候補配列ペアを検出し、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定し、
　前記（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合は、
　　前記［２］の工程において、前記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから全てのペアを選択し、各ペアについて、前記選択したプライマー候補配列ペアの各候補配列と、既に決定された異なる標的部位の各プライマー配列との間のローカルアライメント・スコア、及び、前記選択した候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　前記［３］の工程において、各ペアについて、算出された全てのローカルアライメント・スコアの中から最大値を検出し、その値が所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを選抜し、さらに、前記選抜された全ペアの中から、前記ローカルアライメント・スコアの最大値が最も小さい値を有するプライマー候補配列ペアを検出し、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定する、
　請求項１に記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計方法。
　前記ゲノム二本鎖ＤＮＡの塩基配列データを取得する塩基配列データ取得工程と、
　前記２以上の標的部位及びその位置情報を取得する標的部位情報取得工程と、
　前記塩基配列データにおいて、前記ゲノム二本鎖ＤＮＡにおいて、メチル化され得る「Ｃ」を「Ｙ」へ変換し、その他の「Ｃ」は、「Ｔ」へ変換する塩基変換工程と、
をさらに有し、
　前記相補鎖生成工程は、前記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡの各鋳型鎖に対し相補鎖を生成し、
　前記部分配列切出工程は、前記２以上の標的部位の中から１つ選択し、その選択された標的部位の位置情報に基づいて、前記各鎖から、前記選択された標的部位が変換された前記「Ｙ」又はそれに相補的な「Ｒ」の５’末端側に位置する塩基配列の中から所定の長さの部分配列を１以上切り出し、
　前記プライマー候補配列選抜工程は、前記各鎖から切り出された１以上の部分配列の中から、所定の選抜条件を満たすものをプライマー候補配列として選抜し、
　前記メチル化され得る「Ｃ」とは、ＣＧ配列中の「Ｃ」であり、
　前記所定の選抜条件は、
（１）Ｔｍ値が所定の範囲内にあること、
（２）前記部分配列上に含まれるＹＧ配列またはＣＲ配列が所定の数以下であること、及び
（３）前記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡ上の関連領域外の配列との接合数の上限が１以上の所定の数以下であること
を含む、請求項１に記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計方法。
　［但し、「Ｃ」、「Ｇ」、「Ｙ」及び「Ｒ」は、ＩＵＰＡＣが定める塩基標記であり、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す。］
　前記メチル化され得る「Ｃ」は、さらに、ＣＨＧ配列中の「Ｃ」を含み、
　前記所定の選抜条件は、さらに、（４）前記部分配列上に含まれるＹＨＧ配列またはＣＤＲ配列が所定の数以下であることを含む、請求項３に記載のプライマー設計方法。
［但し、「Ｃ」、「Ｇ」、「Ｙ」、「Ｈ」、「Ｒ」及び「Ｄ」は、ＩＵＰＡＣが定める塩基標記であり、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｈ」は、アデニン、シトシン、又はチミン、「Ｄ」は、チミン、グアニン、又はアデニン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す。］
　前記メチル化され得る「Ｃ」は、さらに、ＣＨＨ配列中の「Ｃ」を含み、
前記所定の選抜条件は、さらに、（５）前記部分配列上に含まれるＹＨＨ配列またはＤＤＲ配列が所定の数以下であることを含む、請求項３に記載のプライマー設計方法。
［但し、「Ｙ」、「Ｈ」、「Ｒ」及び「Ｄ」は、ＩＵＰＡＣが定める塩基標記であり、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｈ」は、アデニン、シトシン、又はチミン、「Ｄ」は、チミン、グアニン、又はアデニン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す。］
　プライマー候補配列選抜工程は、
　前記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡを第１の鋳型鎖及び第２の鋳型鎖とし、前記第１の鋳型鎖の相補鎖を第１の相補鎖、前記第２の鋳型鎖の相補鎖を第２の相補鎖として、
　前記第１の鋳型鎖から切り出された１以上の部分配列が、所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列として選抜し、前記第１の相補鎖から切り出された１以上部分配列が、前記所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列として選抜し、前記第２の鋳型鎖から切り出された１以上の部分配列が、前記所定の選抜条件を満たすものは、第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列として選抜し、第２の相補鎖から切り出された１以上の部分配列が、前記所定の選抜条件を満たすものは、第２の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列として選抜する工程である、請求項３に記載のプライマー設計方法。
　前記プライマー配列決定工程は、前記プライマー候補配列選抜工程において、前記選抜された１以上の第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列と前記選抜された１以上の第１の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列の全ての組み合わせについて、ＰＣＲによって増幅が予想されるＰＣＲ増幅産物の長さを算出し、前記算出されたＰＣＲ増幅産物の長さが所定の範囲内にあるプライマー候補配列の組み合わせを、前記部分配列切出工程において選択された前記標的部位を含む領域を増幅する前記第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、前記選抜された第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列と前記選抜された第２の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列の全ての組み合わせについて、ＰＣＲによって増幅が予想されるＰＣＲ増幅産物の長さを算出し、前記算出されたＰＣＲ増幅産物の長さが前記所定の範囲内にあるプライマー候補配列の組み合わせを、前記部分配列切出工程において選択された前記標的部位を含む領域を増幅する前記第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用して決定する工程である、請求項３に記載のプライマー設計方法。
　予め、請求項１に記載のプライマー設計方法を用いて、少なくとも、前記標的部位の数と、前記所定の閾値と、前記プライマー設計成功率との対応関係を計測し、前記対応関係を格納部に保存し、
　ユーザが入力部を介して、少なくとも、前記ユーザが所望するプライマー設計成功率、及び前記標的部位の数を設定し、プライマー設計を実行するよう指示すると、前記格納部に保存された上記対応関係の中から、前記プライマー設計成功率及び前記標的部位の数の設定値以上、且つ、差が小さい前記プライマー設計成功率及び前記標的部位の数に対応する前記所定の閾値を読み出し、
　読み出された前記所定の閾値に基づいて、前記１以上のプライマー候補配列の中から、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するプライマー配列を採用し、決定する、請求項１に記載のプライマー設計方法。
　プライマー設計工程と、
　前記プライマー設計工程で設計されたプライマー配列に基づきプライマーを合成する合成工程と、
を備え、
　前記プライマー設計工程が、請求項１に記載のプライマー設計方法により実施されることを特徴とする、プライマーの製造方法。
　少なくとも１本の二本鎖ＤＮＡのメチル化度の計測のために、バイサルファイト反応又は酵素反応、及びマルチプレックスＰＣＲを利用し、前記メチル化度を計測する２以上の標的部位をそれぞれ含む複数の領域を同時に増幅するために用いられるアンプリコンメチル化シーケンス解析用のプライマーを設計するための装置であって、
　前記ＤＮＡの鋳型鎖に対し相補鎖を生成する相補鎖生成部と、
　前記２以上の標的部位の中から１つ選択し、前記各鎖から、その選択された標的部位の５’末端側に位置する塩基配列の中から、所定の長さの部分配列を１以上切り出す部分配列切出部と、
　前記切り出された１以上の部分配列を１以上のプライマー候補配列として選抜するプライマー候補配列選抜部と、
　前記１以上のプライマー候補配列の中から、前記選択された所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列を採用し、決定するプライマー配列決定部と、
　前記部分配列切出部において、前記２以上の標的部位が全て選択されるまで、前記部分配列切出部、前記プライマー候補配列選抜部、及び前記プライマー配列決定部の各処理を繰り返すよう制御する制御部と、
を有し、
（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合は、
　　前記プライマー配列決定工程は、
　　　［１］　前記１以上のプライマー候補配列から前記所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを選択し、
　　　［２］　前記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから１つのペアを選択し、前記選択したプライマー候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　　［３］前記所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定し、
（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合は、
　　前記プライマー配列決定工程は、
　　　［１］前記１以上のプライマー候補配列から所定の標的部位にかかる１以上のプライマー候補配列ペアを選択し、
　　　［２］前記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから１つのペアを選択し、各ペアについて、前記選択したプライマー候補配列ペアの各候補配列と、既に決定された異なる標的部位の各プライマー配列との間のローカルアライメント・スコア、及び、選択した候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　　［３］算出された全てのローカルアライメント・スコアの中から最大値を検出し、その値が所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定するものであって、
　前記（Ｉ）及び前記（ＩＩ）の前記［３］の工程において、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用されない場合は、前記（Ｉ）及び前記（ＩＩ）の［１］で選択された前記１以上のプライマー候補配列ペアの中から、異なる１つのペアを選択し、少なくとも１つのプライマー候補配列ペアが採用されるまで、前記［２］及び［３］の工程を繰り返し、
　前記ローカルアライメント・スコアは、前記プライマー候補配列間における、〈１〉塩基が相補的なペアは１か所あたり「X」、〈２〉非相補的なペアは１か所あたり「Y」、及び、〈３〉挿入または欠失がある場合は１か所あたり「Z」とした場合、前記「X」は１、前記「Y」は－４～－２、及び前記「Z」は－６～－３で算出し、
　前記所定の閾値は、１～４である、
　アンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計装置。
　　前記プライマー配列決定部は、
　　前記（Ｉ）異なる標的部位のプライマー配列が未だ１以上決定されていない場合は、
　　前記［２］の工程において、前記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから全てのペアを選択し、各ペアについて、選択されたプライマー候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　前記［３］の工程において、算出されたローカルアライメント・スコアが、所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出した１以上のプライマー候補配列ペアを選抜し、さらに、選抜された全ペアの中から、前記ローカルアライメント・スコアの最大値が最も小さい値を有するプライマー候補配列ペアを検出し、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定し、
　前記（ＩＩ）異なる標的部位のプライマー配列が既に１以上決定されている場合は、
　　前記［２］の工程において、前記所定の標的部位の１以上のプライマー候補配列ペアから全てのペアを選択し、各ペアについて、選択したプライマー候補配列ペアの各候補配列と、既に決定された異なる標的部位の各プライマー配列との間のローカルアライメント・スコア、及び、前記選択した候補配列ペアの配列間におけるローカルアライメント・スコアを算出し、
　　前記［３］の工程において、各ペアについて、算出された全てのローカルアライメント・スコアの中から最大値を検出し、その値が所定の閾値以下であるローカルアライメント・スコアを算出したプライマー候補配列ペアを選抜し、さらに、前記選抜された全ペアの中から、前記ローカルアライメント・スコアの最大値が最も小さい値を有するプライマー候補配列ペアを検出し、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、決定する、
　請求項１０に記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計装置。
　前記ゲノム二本鎖ＤＮＡの塩基配列データを取得する塩基配列データ取得部と、
　前記２以上の標的部位及びその位置情報を取得する標的部位情報取得部と、
　前記塩基配列データにおいて、前記ゲノム二本鎖ＤＮＡにおいて、メチル化され得る「Ｃ」を「Ｙ」へ変換し、その他の「Ｃ」は、「Ｔ」へ変換する塩基変換部と、
を更に有し、
　前記相補鎖生成部は、前記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡの各鋳型鎖に対し相補鎖を生成し、
　前記部分配列切出部は、前記２以上の標的部位の中から１つ選択し、その選択された標的部位の位置情報に基づいて、前記各鎖から、前記選択された標的部位が変換された前記「Ｙ」又はそれに相補的な「Ｒ」の５’末端側に位置する塩基配列の中から所定の長さの部分配列を１以上切り出し、
　前記プライマー候補配列選抜部は、前記各鎖から切り出された１以上の部分配列の中から、所定の選抜条件を満たすものをプライマー候補配列として選抜し、
　前記メチル化され得る「Ｃ」とは、ＣＧ配列中の「Ｃ」であり、
　前記所定の選抜条件は、
（１）Ｔｍが所定の範囲内にあること、
（２）前記部分配列上に含まれるＹＧ配列またはＣＲ配列が所定の数以下であること、及び
（３）前記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡ上の関連領域外の配列との接合数の上限が１以上の所定の数以下であること
を含む、
請求項１０に記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計装置。
　［但し、「Ｃ」、「Ｇ」、「Ｙ」及び「Ｒ」は、ＩＵＰＡＣが定める塩基標記であり、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す。］
　前記メチル化され得る「Ｃ」は、さらに、ＣＨＧ配列中の「Ｃ」を含み、
　前記所定の選抜条件は、さらに、（４）前記部分配列上に含まれるＹＨＧ配列またはＣＤＲ配列が所定の数以下であることを含む、請求項１２に記載のプライマー設計装置。
［但し、「Ｃ」、「Ｇ」、「Ｙ」、「Ｈ」、「Ｒ」及び「Ｄ」は、ＩＵＰＡＣが定める塩基標記であり、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｈ」は、アデニン、シトシン、又はチミン、「Ｄ」は、チミン、グアニン、又はアデニン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す。］
　前記メチル化され得る「Ｃ」は、さらに、ＣＨＨ配列中の「Ｃ」を含み、
前記所定の選抜条件は、さらに、（５）前記部分配列上に含まれるＹＨＨ配列またはＤＤＲ配列が所定の数以下であることを含む、請求項１２に記載のプライマー設計装置。
［但し、「Ｙ」、「Ｈ」、「Ｒ」及び「Ｄ」は、ＩＵＰＡＣが定める塩基標記であり、「Ｙ」はチミン又はシトシン、「Ｈ」は、アデニン、シトシン、又はチミン、「Ｄ」は、チミン、グアニン、又はアデニン、「Ｒ」はアデニン又はグアニンを表す。］
　プライマー候補配列選抜部は、
　前記塩基変換後のゲノム二本鎖ＤＮＡを第１の鋳型鎖及び第２の鋳型鎖とし、前記第１の鋳型鎖の相補鎖を第１の相補鎖、前記第２の鋳型鎖の相補鎖を第２の相補鎖として、
　前記第１の鋳型鎖から切り出された１以上の部分配列が、所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列として選抜し、前記第１の相補鎖から切り出された１以上部分配列が、前記所定の選抜条件を満たすものは、第１の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列として選抜し、前記第２の鋳型鎖から切り出された１以上の部分配列が、前記所定の選抜条件を満たすものは、第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列として選抜し、第２の相補鎖から切り出された１以上の部分配列が、前記所定の選抜条件を満たすものは、第２の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列として選抜するものである、請求項１２に記載のプライマー設計装置。
　前記プライマー配列決定部は、前記プライマー候補配列選抜部において、前記選抜された１以上の第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列と前記選抜された１以上の第１の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列の全ての組み合わせについて、ＰＣＲによって増幅が予想されるＰＣＲ増幅産物の長さを算出し、前記算出されたＰＣＲ増幅産物の長さが所定の範囲内にあるプライマー候補配列の組み合わせを、前記部分配列切出部において選択された前記標的部位を含む領域を増幅する前記第１の鋳型鎖のフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用し、前記選抜された第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー候補配列と前記選抜された第２の鋳型鎖のリバースプライマー候補配列の全ての組み合わせについて、ＰＣＲによって増幅が予想されるＰＣＲ増幅産物の長さを算出し、前記算出されたＰＣＲ増幅産物の長さが前記所定の範囲内にあるプライマー候補配列の組み合わせを、前記部分配列切出部において選択された前記標的部位を含む領域を増幅する前記第２の鋳型鎖のフォーワードプライマー配列及びリバースプライマー配列として採用して決定するものである、請求項１５に記載のプライマー設計装置。
　予め、請求項１０に記載のプライマー設計装置を用いて、少なくとも、前記標的部位の数と、前記所定の閾値と、前記プライマー設計成功率との対応関係を計測し、保存する格納部と、
　ユーザが指示を入力する入力部と、
を更に有し、
　前記プライマー配列決定部は、ユーザが入力部を介して、少なくとも、前記ユーザが所望するプライマー設計成功率、及び前記標的部位の数を設定し、プライマー設計を実行するよう指示すると、前記格納部に保存された上記対応関係の中から、前記プライマー設計成功率及び前記標的部位の数の設定値以上、且つ、差が小さい上記プライマー設計成功率及び前記標的部位の数に対応する前記所定の閾値を読み出し、前記読み出した所定の閾値に基づいて、前記１以上のプライマー候補配列の中から、前記所定の標的部位を含む領域を増幅するプライマー配列を採用し、決定する、請求項１０に記載のアンプリコンメチル化シーケンス解析用プライマー設計装置。
　さらに、通信インターフェースを備え、
　前記通信インターフェースにより、装置外の通信回線網を介してサーバに接続することができ、前記サーバ内のプログラムにより、前記塩基配列データ取得部、前記標的部位情報取得部、前記塩基変換部、前記相補鎖生成部、前記部分配列切出部、前記プライマー候補配列選抜部及び前記プライマー配列決定部からなる群の少なくとも１つを実行することができる、請求項１２に記載のプライマー設計装置。
　請求項１に記載のプライマー設計方法をコンピュータ上で実行することを特徴とする、プライマーの設計用プログラム。
　請求項１９に記載のプライマーの設計用プログラムが記録されていることを特徴とする、コンピュータにおいて読み取り可能な記録媒体。