JP6768815B2 - マルチプレックスpcrに供するプライマーの設計方法 - Google Patents
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Description
マルチプレックスPCRは少量のDNAから複数の領域を効率よく増幅することから、非侵襲的な出生前診断を行うために有用な技術である。
まず、増幅の対象となるDNAの塩基配列から1つめの増幅候補領域X1に対応するプライマー候補を選び出す。このとき、プライマー候補は、プライマーの融解温度、GC含量、塩基配列の長さ、塩基配列の特異性、ヘアピン構造およびプライマー・ダイマーの形成のしにくさをあらわすスコアから選び出されるものとする。Tm(融解温度;Melting Temperature)、GC含量、および塩基配列の長さが、あらかじめ定めた範囲内に収まっている、増幅候補領域X1に対応するn個のプライマー候補のうち、塩基配列の特異性、ヘアピン構造及びプライマー・ダイマーの形成のしにくさから算出した、プライマー候補の優位性を示すスコアが最も高いものをP11、2番目に高い候補をP12、そしてn番目の候補をP1nと呼ぶことにする。2つめの増幅候補領域X2に対応するn’個のプライマー候補P21,P22,・・・,P2n’も、上記と同様に選び出す。すべての増幅候補領域について同様の操作を繰り返し、m番目の増幅候補領域Xmに対応するk個のプライマー候補Pm1,Pm2,・・・,Pmkを選び出す。
次に、選び出されたプライマー候補の中から反応に最適なプライマーの組み合わせを選び出すために、異なる増幅候補領域のプライマー同士が意図しない場所で相補的な塩基配列を持っていないか調べる。異なる増幅候補領域のプライマー同士でプライマー・ダイマーを形成する可能性が低いプライマーが、マルチプレックスPCRで使用可能なプライマーとなる。
ひとつ目は、マルチプレックスPCRによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないという問題である。
ふたつ目は、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができても、高い精度を達成できないという問題である。
[1] 同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をPCR増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法であって、
上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法:
同一染色体DNA上のn箇所の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程;
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位1位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第1の優先順位設定工程;
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位2位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第2の優先順位設定工程;ならびに、
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がi位であり座標値がriであり識別名がRiである増幅候補領域および優先順位がj位であり座標値がrjであり識別名がRjである増幅候補領域であって、上記増幅候補領域Riおよび上記増幅候補領域Rjの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも1箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Riおよび増幅候補領域Rjを検索し、次いで、上記増幅候補領域Riおよび上記増幅候補領域Rjの中点の座標値ri−jをri−j=(ri+rj)/2により算出し、さらに、上記中点の座標値ri−jに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位k位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する工程検索されたに優先順位k位を付け、記憶手段に記憶する、第kの優先順位設定工程;
上記優先順位k位を付ける工程を、k=3からnまで繰り返す。
ただし、nは3≦nを満たす整数であり、kは3≦k≦nを満たす整数であり、iおよびjは、1≦i≦k−1、1≦j≦k−1、かつ、i≠jであり、riおよびrjはrmin≦ri≦rmax、rmin≦rj≦rmax、かつ、ri≠rjであり、rminおよびrmaxは、それぞれ、上記n個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
[2] 同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をPCR増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法であって、
上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法:
同一染色体DNA上のn個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程;
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位1位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第1の優先順位設定工程;
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位2位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第2の優先順位設定工程;ならびに、
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がi位であり座標値がriであり識別名がRiである増幅候補領域および優先順位がj位であり座標値がrjであり識別名がRjである増幅候補領域であって、上記増幅候補領域Riおよび上記増幅候補領域Rjの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも1箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Riおよび増幅候補領域Rjを検索し、次いで、上記増幅候補領域Riおよび上記増幅候補領域Rjの中点の座標値ri−jをri−j=(ri+rj)/2により算出し、さらに、上記中点の座標値ri−jに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位k位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する工程検索されたに優先順位k位を付け、記憶手段に記憶する、第kの優先順位設定工程;
上記第kの優先順位設定工程を、k=3からnまで繰り返す。
ただし、nは3≦nを満たす整数であり、kは3≦k≦nを満たす整数であり、iおよびjは、1≦i≦k−1、1≦j≦k−1、かつ、i≠jであり、riおよびrjはrmin≦ri≦rmax、rmin≦rj≦rmax、かつ、ri≠rjであり、rminおよびrmaxは、それぞれ、上記n個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
[3] 同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をPCR増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法であって、
上記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法:
同一染色体DNA上のn個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程;
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位1位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第1の優先順位設定工程;ならびに、
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がk−1位である増幅候補領域の識別名Rk−1および座標値rk−1を検索して、T=rk−1+tを算出し、
T=rk−1+t≦rmaxであるとき、rk−1+t以上rmax以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がrk−1+t以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶し、
T=rk−1+t≦rmaxであるとき、rk−1+t以上rmax以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がrmin以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶し、
T=rk−1+t>rmaxであるとき、座標値がrmin以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶する、第kの優先順位設定工程;
上記第kの優先順位設定工程を、k=2からnまで繰り返す。
ただし、nは3≦nを満たす整数であり、kは2≦k≦nを満たす整数であり、tはt>0を満たす実数であり、rk−1≠rkであり、rminおよびrmaxは、それぞれ、上記n個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
[4] 同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をPCR増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法であって、
上記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法:
同一染色体DNA上のn個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程;
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位1位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第1の優先順位設定工程;ならびに、
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がk−1位である増幅候補領域の識別名Rk−1および座標値rk−1を検索し、T=rk−1+tを算出し、
T=rk−1+t≦rmaxであるとき、rk−1+t以上rmax以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がrk−1+t以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶し、
T=rk−1+t≦rmaxであるとき、rk−1+t以上rmax以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がrmin以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶し、
T=rk−1+t>rmaxであるとき、座標値がrmin以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶する、第kの優先順位設定工程;
上記第kの優先順位設定工程を、k=2からnまで繰り返す。
ただし、nは3≦nを満たす整数であり、kは2≦k≦nを満たす整数であり、tはt>0を満たす実数であり、rk−1≠rkであり、rminおよびrmaxは、それぞれ、上記n個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
また、本発明によれば、染色体欠損またはDNA断片化等の影響を受けてPCR増幅に失敗する増幅対象領域の数を減らすことができ、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができる。
また、本発明によれば、プライマー候補の少ない増幅候補領域に対して、より多くのマルチプレックスPCRで使用可能なプライマーを採用してPCR増幅に失敗する増幅対象領域の数を減らすことができ、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができる。
さらに、本発明によれば、含まれる変異の変異頻度が0.5に近い領域の増幅対象領域に占める割合を高めることにより、より少ない領域数で高い精度を達成することができる。
また、本発明において、増幅候補領域は、ゲノムDNA上の領域であって、ジェノタイピングまたは染色体数定量などの目的のためにPCR増幅する候補の領域をいうものとする。
DNA・・・デオキシリボ核酸(Deoxyribonucleic acid)
PCR・・・ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction)
SNP・・・一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism)
SNPs・・・SNPの複数形
SNV・・・一塩基変異(Single Nucleotide Variant)、SNPの上位概念
V.F.・・・変異頻度(Variant Frequency)
ΔV.F.・・・変異頻度差(変異頻度0.5との差の絶対値)
in silico・・・「コンピュータを用いて」という意味(バイオインフォマティクス)
in vitro・・・in silicoに対して、「ウェットな実験によって」という意味(バイオインフォマティクス)
本発明における優先順位の設定方法を実行する装置(「ハードウェア」または「実行装置」ともいう。)について、図1を参照しながら説明する。
本発明において、優先順位の設定は、演算手段(CPU;Central Processing Unit,中央演算処理装置)11、記憶手段(メモリ)12、補助記憶手段(ストレージ)13、入力手段(キーボード)14、および表示手段(モニタ)16を備えるハードウェア(装置)によって行われる。この装置は、さらに、補助入力手段(マウス)15、および出力手段(プリンタ)17等を備えていてもよい。
それぞれの手段について説明する。
入力手段(キーボード)14は、装置に指示およびデータ等を入力する手段である。補助入力手段(マウス)15は、入力手段(キーボード)14に代えて、またはそれとともに、用いられる。
演算手段(CPU)11は、演算処理を行う手段である。
記憶手段(メモリ)12は、演算手段(CPU)11の演算処理の結果を記憶したり、入力手段(キーボード)14からの入力を記憶したりする手段である。
補助記憶手段(ストレージ)13は、オペレーティングシステム、必要ローカス数を決定するためのプログラムなどを保存するストレージである。補助記憶手段(ストレージ)13は、その一部を記憶手段(メモリ)12を拡張するために用いることもできる(仮想メモリ)。
本発明の第一の態様は、マルチプレックスPCRによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないというひとつ目の問題に対する解決手段を提供するものである。以下では、図1、図2および図3を適宜参照しながら説明する。
上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。
演算手段11が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位1位の優先順位情報を付け、記憶手段12に記憶する、第1の優先順位設定工程(図2のS12)。
増幅候補領域選択工程は、同一染色体DNA上のn個の増幅候補領域を選択する工程である。増幅候補領域n個の識別情報および座標情報を入力する(図2および図3のS11)。
ここで、nはn≧3を満たす整数である。
nは、好ましくは5以上であり、より好ましくは10以上であり、さらに好ましくは50以上であり、いっそう好ましく100以上であり、よりいっそう好ましくは500以上である。より多くの増幅候補領域に対してマルチプレックスPCRに供するプライマーを設計することができれば、必要領域数を満たすことがより容易となる。
なお、n個の増幅候補領域の全てに対して優先順位を付けたとしても、n箇所全ての増幅候補領域に対してマルチプレックスPCRに供するプライマーを設計できるとは限らないことは、既に記載したとおりである。
上記n個の増幅候補領域において、最小の座標rminを持つ増幅候補領域をRminとし、最大の座標rmaxを持つ増幅候補領域をRmaxとする。
第1の優先順位設定工程は、上記増幅候補領域Rminおよび上記増幅候補領域Rmaxの2つの増幅候補領域のうち、一方に優先順位1位を付ける工程である(図2のS12;図3のS12’)。
すなわち、増幅候補領域Rminに優先順位1位をつけるか、または、増幅候補領域Rmaxに優先順位1位を付けることとなる。
第2の優先順位設定工程は、上記増幅候補領域Rminおよび上記増幅候補領域Rmaxの2つの増幅候補領域のうち、上記優先順位1位を付けた一方を除く他方に優先順位2位を付ける工程である(図2のS13;図3のS13’)。
すなわち、上記第1の優先順位設定工程において、増幅候補領域Rminに優先順位1位をつけたときは、増幅候補領域Rmaxに優先順位2位を付けることとなり、上記第1の優先順位設定工程において、増幅候補領域Rmaxに優先順位1位を付けたときは、増幅候補領域Rminに優先順位2位を付けることとなる。
第kの優先順位設定工程では、既に1位から(k−1)位までの優先順位が付けられた場合において、優先順位i位が付けられた増幅候補領域Riおよび優先順位j位が付けられた増幅候補領域Rjの中点の座標(ri+rj)/2に最も近い座標値を持つ増幅候補領域に優先順位k位を付ける(図2および図3のS14〜S16)。ここで、riおよびrjは、それぞれ、増幅候補領域Riおよび増幅候補領域Rjの座標である。
iおよびjは、1≦i≦k−1、1≦j≦k−1、かつ、i≠jである。
riおよびrjはrmin≦ri≦rmax、rmin≦rj≦rmax、かつ、ri≠rjである。
優先順位を付けることができる増幅候補領域が無くなったところで、優先順位の設定を終了する。
さらに、増幅候補領域の識別情報および優先順位情報を出力する(図2および図3のS17)。
図7を参照しながら具体的に説明する。
図7は、簡単のため、同一染色体DNA上の増幅候補領域R01〜R09の9箇所の増幅候補領域が、左から右に座標が大きくなる順で等間隔に並べられている。
(1)座標が最も小さいR01に優先順位1位を付けた。
(2)座標が最も大きいR09に優先順位2位を付けた。
(3)R01とR09の中点に該当するR05に優先順位3位を付けた。
(4)R01とR05の中点に該当するR03に優先順位4位を付けた。
(5)R05とR09の中点に該当するR07に優先順位5位を付けた。
(6)R01とR03の中点に該当するR02に優先順位6位を付けた。
(7)R05とR07の中点に該当するR06に優先順位7位を付けた。
(8)R03とR05の中点に該当するR04に優先順位8位を付けた。
(9)まだ順位を付けていない増幅候補領域がなくなったため、順位付けを終了した。
図6および図7を対比しながら説明する。
図6および図7では、R01〜R09の増幅候補領域に1位から9位までの優先順位を付ける。
優先順位を付けた増幅候補領域のうち、優先順位に従って5箇所の増幅候補領域を増幅するためのプライマーを作製する。
実際の染色体DNAでは、R02、R03、およびR04が欠損している。
そのため、図6では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、3箇所(R02、R03、およびR04)の増幅に失敗する。増幅できる増幅候補領域は必要領域数に満たない可能性が大きい。
しかし、図7では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、1箇所(R03)の増幅に失敗するだけである。増幅できる増幅候補領域は必要領域数を満たす可能性が大きい。
本発明の第二の態様は、マルチプレックスPCRによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないというひとつ目の問題に対する別の解決手段を提供するものである。以下では、図1、図4および図5を適宜参照しながら説明する。
上記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。
T=rk−1+t≦rmaxであるとき、rk−1+t以上rmax以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がrk−1+t以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け(図4のS25およびS26)、記憶手段12に記憶し、
T=rk−1+t≦rmaxであるとき、rk−1+t以上rmax以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がrmin以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け(図4のS25およびS27)、記憶手段12に記憶し、
T=rk−1+t>rmaxであるとき、座標値がrmin以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け(図4のS25およびS27)、記憶手段12に記憶する、第kの優先順位設定工程。
増幅候補領域選択工程は、同一染色体DNA上のn個の増幅候補領域を選択する工程である。
ここで、nはn≧3を満たす整数である。
nは、好ましくは5以上であり、より好ましくは10以上であり、さらに好ましくは50以上であり、いっそう好ましく100以上であり、よりいっそう好ましくは500以上である。より多くの増幅候補領域に対してマルチプレックスPCRに供するプライマーを設計することができれば、必要領域数を満たすことがより容易となる。
なお、n個の増幅候補領域の全てに対して優先順位を付けたとしても、n箇所全ての増幅候補領域に対してマルチプレックスPCRに供するプライマーを設計できるとは限らないことは、既に記載したとおりである。
上記n個の増幅候補領域において、最小の座標rminを持つ増幅候補領域をRminとし、最大の座標rmaxを持つ増幅候補領域をRmaxとする。増幅候補領域n個の識別情報および座標情報を入力する(図4および図5のS21)。
すなわち、増幅候補領域Rminに優先順位1位をつけてもよいし、増幅候補領域Rmaxに優先順位1位を付けてもよいし、増幅候補領域Rminおよび増幅候補領域Rmaxのいずれとも異なる増幅候補領域に優先順位1位を付けてもよい。
R1の座標r1は、rmin≦r1≦rmaxを満たす限り、特に限定されないが、好ましくはr1=rminまたはr1=rmaxであり、より好ましくはr1=rminである。
第kの優先順位設定工程では、既に1位から(k−1)位までの優先順位が付けられた場合において、所定の条件を満たす増幅候補領域に優先順位k位を付ける(図4および図5のS23〜S28)。
上記所定の条件を満たす増幅候補領域は、以下のようにして決定される。
優先順位(k−1)位が付けられた増幅候補領域Rk−1の座標をrk−1とし、それに閾値tを足した値「T=rk−1+t」を考える。ここで、tはt>0を満たす実数であり、本発明において「閾値」という場合がある。
増幅候補領域の座標の最大値はrmaxであることから、次の(1)および(2)の2つの場合に分けられる。
(1)T=rk−1+t≦rmaxである場合
(2)T=rk−1+t>rmaxである場合
(1)−1 まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在する場合
(1)−2 まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在しない場合
この場合においては、tは優先順位(k−1)位の増幅候補領域Rk−1と優先順位k位の増幅候補領域Rkとの間の距離を表す。tが大きいほど、Rk−1とRkとの間の距離も大きくなり、通常、互いに及ぼす影響は小さくなる。
tはt>0を満たす実数であり、染色体DNAサイズ、または増幅候補領域の座標などに応じて適宜設定することができるが、好ましくは100,000以上、より好ましくは1,000,000以上、さらに好ましくは5,000,000以上である。
優先順位を付けることができる増幅候補領域が無くなったところで、優先順位の設定を終了する。
図8を参照しながら具体的に説明する。
図8は、簡単のため、同一染色体DNA上の増幅候補領域R01〜R09の9箇所の増幅候補領域が、左から右に座標が大きくなる順で等間隔に並べられている。この間隔を1,000,000(塩基対)とし、閾値tを4,000,000とする。
(1)座標が最も小さいR01に優先順位1位を付けた。
(2)R01の座標に4,000,000をプラスした座標に該当するR05に優先順位2位を付けた。
(3)R05の座標に4,000,000をプラスした座標に該当するR09に優先順位3位を付けた。
(4)R09の座標に4,000,000をプラスした座標に該当する増幅候補領域は存在しないため、R01の座標以上で最も小さい座標を持ち、まだ優先順位を付けていない増幅候補領域であるR02に優先順位4位を付けた。
(5)R02の座標に4,000,000をプラスした座標に該当するR06に優先順位5位を付けた。
(6)R06の座標に4,000,000をプラスした座標に該当する増幅候補領域は存在しないため、R01の座標以上で最も小さい座標を持ち、まだ優先順位を付けていない増幅候補領域であるR03に優先順位6位を付けた。
(7)R03の座標に4,000,000をプラスした座標に該当するR07に優先順位7位を付けた。
(8)R07の座標に4,000,000をプラスした座標に該当する増幅候補領域は存在しないため、R01の座標以上で最も小さい座標を持ち、まだ優先順位を付けていない増幅候補領域であるR04に優先順位8位を付けた。
(9)R04の座標に4,000,000をプラスした座標に該当するR08に優先順位9位を付けた。
(10)まだ順位を付けていない増幅候補領域がなくなったため、順位付けを終了した。
図6および図8を対比しながら説明する。
図6および図8では、R01〜R09の増幅候補領域に1位から9位までの優先順位を付ける。
優先順位を付けた増幅候補領域のうち、優先順位に従って5箇所の増幅候補領域を増幅するためのプライマーを作製する。
実際の染色体DNAでは、R02、R03、およびR04が欠損している。
そのため、図6では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、3箇所(R02、R03、およびR04)の増幅に失敗する。増幅できる増幅候補領域は必要領域数に満たない可能性が大きい。
しかし、図8では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、1箇所(R02)の増幅に失敗するだけである。増幅できる増幅候補領域は必要領域数を満たす可能性が大きい。
本発明の第三の態様は、マルチプレックスPCRによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないというひとつ目の問題に対するさらに別の解決手段を提供するものである。以下では、図1を適宜参照しながら説明する。
上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。
R01からR09までの各増幅候補領域について、プライマー候補数は図9または図10に示すとおりである。なおプライマー候補は、後述するプライマー等の設計をする方法の「プライマー候補塩基配列作成」において作成されたプライマー候補の塩基配列である。一般に、1つの増幅候補領域に対しては、その増幅候補領域を増幅するためのプライマーペアは、複数ペア作成される。
図9は、従来どおり、座標が小さい方から順に増幅候補領域に優先順位を付けたものである。座標順に優先順位を付けた場合、増幅候補領域数が増加するにつれて相補性の条件が厳しくなるため、もともと候補数の少ないR07およびR08では、他の増幅候補領域を増幅するためのプライマーとのプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、マルチプレックスPCRに使用可能なプライマーとして採用されるプライマーペアが少なくなり過ぎてしまい、その結果、増幅失敗の可能性が高くなる。
図10は、本発明の第三態様に従って、プライマー候補数が少ない順に増幅候補領域に優先順位を付けたものである。プライマー候補数の少ない順に優先順位を付けた場合、領域数が増加するにつれて相補性の条件が厳しくなるが、もともとの候補数が多いため、他の増幅候補領域を増幅するためのプライマーとのプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、マルチプレックスPCRに使用可能なプライマーとして採用されるプライマーペアが少なくなり過ぎず、その結果、従来よりも増幅成功の可能性が高くなる。
本発明の第四の態様は、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができても、高い精度を達成できないという問題に対する解決手段を提供するものである。以下では、図1を適宜参照しながら説明する。
上記優先順位は、以下の工程を含む染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。
R01からR09までの各増幅候補領域について、SNP(Single Nucleotide Polymorphism;一塩基多型)のV.F.(Variant Frequency;変異頻度)およびΔV.F.(変異頻度0.5との差の絶対値)は図11および図12に示すとおりである。
R01からR09までの増幅候補領域に優先順位を1位から9位まで付け、上位5箇所の増幅候補領域に対してプライマーを作製し、マルチプレックスPCRによる増幅、SNPタイピング、および母子判定を行い、母子判定の確度を算出すると、図11に示される例の方が図12に示される例よりも、確度が大きく、精度が悪い。図11に示される例で確度を小さくし、精度を改善するためには、SNP座位数、すなわち増幅候補領域数を増やす必要がある。特に、単一細胞から抽出した、微量で冗長性が無いゲノムDNAなどでは、マルチプレックスPCRによって同時に増幅する領域数または座位数を増やすことが難しい場合があることから、より少ない領域数または座位数でより高い精度を達成することが求められている。
増幅候補領域にプライマーを設計する順序である優先順位を設定した後は、以下に説明するマルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法によって、所望の増幅候補領域をPCR増幅するためのプライマーを設計する。
本発明のマルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法(1)(以下、単に「設計方法(1)」という場合がある。)では、増幅候補領域に優先順位を設定した後、以下の工程を行う。
(b)上記対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムDNA上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程。
(c)上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。
(d)上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程。
(e)上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
(f)上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程。
(g)上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をPCR増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程。
(e’)上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
(c’)上記第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。
(e’)上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
本発明のマルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法(2)(以下、単に「設計方法(2)」という場合がある。)では、増幅候補領域に優先順位を設定した後、以下の工程を行う。
(b1)上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムDNA上における上記第1の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第1工程。
(c1)上記プライマー候補塩基配列作成第1工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第1工程。
(d1)上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第1工程。
(e1)上記第一段階選抜第1工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第1工程。
(f1)上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第1工程。
(g1)上記第一段階選抜第1工程および上記第二段階選抜第1工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第1工程。
(b2)上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムDNA上における上記第2の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第2工程。
(c2)上記プライマー候補塩基配列作成第2工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第2工程。
(d2)上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第2工程。
(e2)上記第一段階選抜第2工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第2工程。
(f2)上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第2工程。
(g2)上記第一段階選抜第2工程および上記第二段階選抜第2工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第2工程。
(e1’)上記プライマー候補塩基配列作成第1工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第1工程。
(c1’)上記第二段階選抜第1工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第1工程。
(e1’)上記プライマー候補塩基配列作成第1工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第1工程。
(e2’)上記プライマー候補塩基配列作成第2工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第2工程。
(c2’)上記第二段階選抜第2工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第2工程。
(e2’)上記プライマー候補塩基配列作成第2工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第2工程。
本発明のマルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法(3)(以下、単に「設計方法(3)」という場合がある。)では、増幅候補領域に優先順位を設定した後、以下の工程を行い、その変形例では、(b−0)プライマー候補塩基配列複数作成工程の後、かつ、(c−1)第1のローカルアラインメント工程の前に、増幅候補領域に優先順位を設定し、(c−1)第1のローカルアラインメント工程以降の工程を行う。
(b−0)上記複数の対象領域のそれぞれをPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムDNA上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程。
なお、(b−0)プライマー候補塩基配列複数作成工程の後に代えて、(a−0)対象領域複数選択工程の前に、優先順位を設定してもよい。
(d−1)上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第1の第一段階選抜工程。
(e−1)上記第1の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程。
(f−1)上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第1の第二段階選抜工程。
(g−1)上記第1の第一段階選抜工程および上記第1の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程。
(d−2)上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第2の第一段階選抜工程。
(e−2)上記第2の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第2のグローバルアラインメント工程。
(f−2)上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第2の第二段階選抜工程。
(g−2)上記第2の第一段階選抜工程および上記第2の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第2のプライマー採用工程。
(e’−1)上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程。
(c’−1)上記第1の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第1のローカルアラインメント工程。
(e’−1)上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程。
(e’−2)上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位2位の第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第2のグローバルアラインメント工程。
(c’−2)上記第2の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第2のローカルアラインメント工程。
(e’−2)上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位2位の第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第2のグローバルアラインメント工程。
本発明のマルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法(1)〜(3)について、各工程を説明する。
(設計方法(1): 優先順位の設定工程S100)
図13において「優先順位の設定」として示す。
本発明の優先順位の設定方法に従って、増幅候補領域の優先順位を設定する。
図14において「優先順位の設定」として示す。
本発明の優先順位の設定方法に従って、増幅候補領域の優先順位を設定する。
図15および図16において「優先順位の設定」として示す。
本発明の優先順位の設定方法に従って、増幅候補領域の優先順位を設定する。
本明細書において、対象領域選択工程S101(図13)、対象領域選択第1工程S201および対象領域選択第2工程S211(図14)、ならびに複数対象領域選択工程S301(図15および図16)を総称して、単に「対象領域選択工程」という場合がある。
図13において「対象領域選択」として示す。
設計方法(1)において、(a)対象領域選択工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位の順に対象領域を選択する工程である。
図14において、「対象領域選択第1」および「対象領域選択第2」として示す。
設計方法(2)において、(a1)対象領域選択第1工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第1の対象領域として選択する工程であり、(a2)対象領域選択第2工程は、優先順位が設定された増幅候補領域のうちまだ選択されていない増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第2の対象領域として選択する工程である。
設計方法(2)では、増幅候補領域を優先順位の順に1つずつ選択する。
図15および図16において、「対象領域複数選択」として示す。
設計方法(3)およびその変形例において、(a−0)対象領域複数選択工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が高い順に複数の対象領域を選択する工程である。
設計方法(3)およびその変形例では、増幅候補領域を優先順位の順に複数個選択する。好ましくは、優先順位が設定された全ての増幅候補領域を選択する。
本明細書において、プライマー候補塩基配列作成工程S102(図13)、プライマー候補塩基配列作成第1工程S202およびプライマー候補塩基配列作成第2工程S212(図14)、ならびにプライマー候補塩基配列複数作成工程S302(図15および図16)を総称して、単に「プライマー候補塩基配列作成」という場合がある。
図13において「プライマー候補塩基配列作成」として示す。
設計方法(1)において、(b)プライマー候補塩基配列作成工程は、対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムDNA上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する工程である。
図14において「プライマー候補塩基配列作成第1」および「プライマー候補塩基配列作成第2」として示す。
設計方法(2)において、(b1)プライマー候補塩基配列作成第1工程は、第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムDNA上における上記第1の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する工程であり、(b2)プライマー候補塩基配列作成第2工程は、第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムDNA上における上記第2の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する工程である。
設計方法(2)では1つの対象領域について、プライマー候補の塩基配列の作成、プライマー候補の選抜、およびプライマーの採用を行い、次の1つの対象領域について、同様の工程を繰り返す。
図15および図16において「プライマー候補塩基配列複数作成」として示す。
設計方法(3)およびその変形例において、(b−0)プライマー候補塩基配列複数作成工程は、複数の対象領域のそれぞれをPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムDNA上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する。
設計方法(3)およびその変形例では、複数の対象領域のすべてについて、プライマー候補の塩基配列を作成し、以降の工程で選抜および採用を繰り返す。
対象領域の両端のそれぞれの近傍領域とは、対象領域の5’端から外側の領域、および対象領域の3’端から外側の領域を総称していう。対象領域の内側は近傍領域には含まない。
近傍領域の長さは特に限定されないが、PCRによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するDNAフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および/またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。PCRにおいて用いる酵素(DNAポリメラーゼ)の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは20〜500塩基程度、より好ましくは20〜300塩基程度、さらに好ましくは20〜200塩基程度、いっそう好ましくは50〜200塩基程度である。
また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの長さ、GC含量(全核酸塩基中のグアニン(G)およびシトシン(C)の合計モル百分率をいう。)、融解温度(2本鎖DNAの50%が解離して1本鎖DNAになる温度をいう。また、Melting Temperatureに由来し、「Tm値」という場合もある。単位は「℃」である。)、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。
プライマーの長さ(ヌクレオチド数)は、特に限定されないが、好ましくは15mer〜45mer、より好ましくは20mer〜45mer、さらに好ましくは20mer〜30merである。プライマーの長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。
プライマーのGC含量は、特に限定されないが、好ましくは40モル%〜60モル%、より好ましくは45モル%〜55モル%である。GC含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。
プライマーのTm値は、特に限定されないが、好ましくは50℃〜65℃の範囲内、より好ましくは55℃〜65℃の範囲内である。
プライマーのTm値の差は、プライマーペアおよびプライマーセットにおいて、好ましくは5℃以下、より好ましくは3℃以下とする。
Tm値は、OLIGO Primer Analysis Software(Molecular Biology Insights社製)、または、Primer3(http://www−genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のA、T、GおよびCの数(それぞれ、nA、nT、nGおよびnCとする)から、下記式によって計算により求めることもできる。
Tm値(℃)=2(nA+nT)+4(nC+nG)
Tm値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってTm値を算出することができる。
プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にGCリッチな配列および部分的にATリッチな配列を避けることが望ましい。
また、Tおよび/またはCの連続(ポリピリミジン)、ならびにAおよび/またはGの連続(ポリプリン)も避けることが望ましい。
さらに、3’末端塩基配列が、GCリッチな配列またはATリッチな配列を避けることが好ましい。3’末端塩基はGまたはCが好ましいが、これらに限定はされない。
「プライマー候補塩基配列作成」において作成した各プライマー候補の塩基配列の染色体DNAに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい(図示せず)。
特異性のチェックは、染色体DNAの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメント・スコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムDNAに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、染色体DNAの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが1本鎖DNAであるのに対して、染色体DNAは2本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。
例えば、スコアとして、マッチ(相補塩基)=+1、ミスマッチ(非相補塩基)=−1、インデル(挿入および/または欠失)=−3を採用し、閾値を+15に設定すること等が考えられる。
本明細書において、ローカルアラインメント工程S103(図1)、ローカルアラインメント第1工程S203およびローカルアラインメント第2工程S213(図14)、ならびに第1のローカルアラインメント工程S303および第2のローカルアラインメント工程S313(図15および図16)を総称して、単に「ローカルアラインメント工程」という場合がある。
図13において「ローカルアラインメント」として示す。
設計方法(1)において、(c)ローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
図14において「ローカルアラインメント第1」および「ローカルアラインメント第2」として示す。
設計方法(2)において、(c1)ローカルアラインメント第1工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第1工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、(c2)ローカルアラインメント第2工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第2工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
図15および図16において「第1のローカルアラインメント」および「第2のローカルアラインメント」として示す。
設計方法(3)およびその変形例において、(c−1)第1のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、(c−2)第2のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位2位の第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記2つの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める工程である。
ローカルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、ローカルアラインメントを行う塩基配列の総数をx個として、重複を許して選択した場合は、「xH2=x+1C2=(x+1)!/2(x−1)!」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「xC2=x(x−1)/2」通りである。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の3’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の3’末端を含むようにした。
さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の3’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の3’末端から始まり他方の配列の3’末端で終わるアラインメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の3’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および/または欠失(インデル)を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致(マッチ)とし、相補的でない場合を不一致(ミスマッチ)とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表1のようにスコアを設定してもよい。なお、表1中「−」はギャップ(挿入および/または欠失(インデル))を表す。
したがって、この(ペアワイズ)アラインメントに基づくローカルアラインメント・スコアは、(+1)×9+(−1)×8+(−1)×0=+1となる。
なお、アラインメント(ペアワイズアラインメント)は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
本明細書において、第一段階選抜工程S104(図13)、第一段階選抜第1工程S204および第一段階選抜第2工程S214(図14)、ならびn第1の第一段階選抜工程S304および第2の第一段階選抜工程S314(図15および図16)を総称して、単に「第一段階選抜工程」という場合がある。
図13において「第一段階選抜」として示す。
設計方法(1)において、(d)第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
図14において「第一段階選抜第1」および「第一段階選抜第2」として示す。
設計方法(2)において、(d1)第一段階選抜第1工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、(d2)第一段階選抜第2工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
図15および図16において「第1の第一段階選抜」および「第2の第一段階選抜」として示す。
設計方法(3)およびその変形例において、(d−1)第1の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、(d−2)第2の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。
ローカルアラインメント・スコアの閾値(「第1の閾値」ともいう。)を予め設定しておく。
ローカルアラインメント・スコアが第1の閾値未満であれば、これらの2つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
一方、ローカルアラインメント・スコアが第1の閾値以上であれば、これらの2つの塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
第1の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムDNAの量などのPCR条件によって、第1の閾値を設定してもよい。
上の例では、ローカルアラインメント・スコアは「+1」であり、第1の閾値である「+3」未満であったから、配列番号1および2の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。
本明細書において、グローバルアラインメント工程S105(図13)、グローバルアラインメント第1工程S205およびグローバルアラインメント第2工程S215(図14)、ならびに第1のグローバルアラインメント工程S305および第2のグローバルアラインメント工程S315(図15および図16)を総称して、単に「グローバルアラインメント工程」という場合がある。
図13において「グローバルアラインメント」として示す。
設計方法(1)において、(e)グローバルアラインメント工程は、上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
図14において「グローバルアラインメント第1」および「グローバルアラインメント第2」として示す。
設計方法(2)において、(e1)グローバルアラインメント第1工程は、上記第一段階選抜第1工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、(e2)グローバルアラインメント第2工程は、上記第一段階選抜第2工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
図15および図16において「第1のグローバルアラインメント」および「第2のグローバルアラインメント」として示す。
設計方法(3)およびその変形例において、(e−1)第1のグローバルアラインメント工程は、上記第1の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、(e−2)第2のグローバルアラインメント工程は、上記第2の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から2つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび1つのプライマー候補の塩基配列および1つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる2つの塩基配列の3’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める工程である。
グローバルアラインメント・スコアは、「プライマー候補塩基配列作成」で作成したプライマー候補の全部(「ローカルアラインメント工程」および「第1段階選抜工程」を先に行った場合において、ローカルアラインメント・スコアが第1の閾値未満であるプライマー候補の組合せがあるときは、その組合せに含まれるプライマー候補の全部。)および既に採用したプライマーの全部(既に採用したプライマーが存在する場合に限る。)からなる群から2つのプライマーを取り出して、3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、求める。
組合せの総数は、グローバルアラインメントを行う塩基配列の総数をx個として、重複を許して選択した場合は、「xH2=x+1C2=(x+1)!/2(x−1)!」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「xC2=x(x−1)/2」通りである。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および/または欠失(インデル)を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致(マッチ)とし、相補的でない場合を不一致(ミスマッチ)とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表1のようにスコアを設定してもよい。なお、表1中「−」はギャップ(挿入および/または欠失(インデル))を表す。
したがって、この(ペアワイズ)アラインメントに基づくグローバルアラインメント・スコアは、(+1)×0+(−1)×3+(−1)×0=−3となる。
なお、アラインメント(ペアワイズアラインメント)は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
本明細書において、第二段階選抜工程S106(図13)、第二段階選抜第1工程S206および第二段階選抜第2工程S216(図14)、ならびに第1の第二段階選抜工程S306および第2の第二段階選抜工程S316(図15および図16)を総称して、単に「第二段階選抜工程」という場合がある。
図13において「第二段階選抜」として示す。
設計方法(1)において、(f)第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
図14において「第二段階選抜第1」および「第二段階選抜第2」として示す。
設計方法(2)において、(f1)第二段階選抜第1工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、(f2)第二段階選抜第2工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
図15および図16において「第1の第二段階選抜」および「第2の第二段階選抜」として示す。
設計方法(3)およびその変形例において、(f−1)第1の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、(f−2)第2の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。
グローバルアラインメント・スコアの閾値(「第2の閾値」ともいう。)を予め設定しておく。
グローバルアラインメント・スコアが第2の閾値未満であれば、これらの2つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
一方、グローバルアラインメント・スコアが第2の閾値以上であれば、これらの2つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
第2の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムDNAの量などのPCR条件によって、第2の閾値を設定してもよい。
上の例では、グローバルアラインメント・スコアは「−3」であり、第2の閾値である「+3」未満であったから、配列番号1および2の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。
「第1段階選抜工程」および「第2段階選抜工程」においてプライマー・ダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列の組合せに対して、染色体DNA上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい(図示せず)。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列の組合せは、対象領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素(DNAポリメラーゼ)の種類等のPCR条件によって、適宜設定することができる。例えば、100〜200塩基(対)の範囲内、120〜180塩基(対)の範囲内、140〜180塩基(対)の範囲内、140〜160塩基(対)の範囲内、160〜180塩基(対)の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
本明細書において、プライマー採用工程S107(図13)、プライマー採用第1工程S207およびプライマー採用第2工程S217(図14)、ならびに第1のプライマー採用工程S307および第2のプライマー採用工程S317(図15および図16)を総称して、単に「プライマー採用工程」という場合がある。
図13において「プライマー採用」として示す。
設計方法(1)において、(g)プライマー採用工程は、上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をPCR増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
図14において「プライマー採用第1」および「プライマー採用第2」として示す。
設計方法(2)において、(g1)プライマー採用第1工程は、上記第一段階選抜第1工程および上記第二段階選抜第1工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、(g2)プライマー採用第2工程は、上記第一段階選抜第2工程および上記第二段階選抜第2工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
図15および図16において「第1のプライマー採用」および「第2のプライマー採用」として示す。
設計方法(3)およびその変形例において、(g−1)第1のプライマー採用工程は、上記第1の第一段階選抜工程および上記第1の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の対象領域をPCR増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、(g−2)第2のプライマー採用工程は、上記第2の第一段階選抜工程および上記第2の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第2の対象領域をPCR増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
プライマー採用工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメント・スコアが第1の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の3’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアが第2の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
したがって、配列番号1で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号2で示されるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
1つの増幅候補領域に対してプライマーを採用した後、さらに次の優先順位の増幅候補領域に対してプライマーを設計してもよい。
設計方法(1)においては、プライマー候補塩基配列作成工程S102において、次の優先順位の増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていれば、ローカルアラインメント工程S103から行う。次の優先順位の増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていなければ、対象領域選択工程S101において次の優先順位の増幅候補領域が選択されていなかったので、対象領域選択工程S101において次の優先順位の増幅候補領域を選択し、プライマー候補塩基配列作成工程S102において、その増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列を作成した後、ローカルアラインメント工程S103以降を行う。
設計方法(2)においては、対象領域選択第2工程S211から繰り返す。
設計方法(3)およびその変形例において、既に対象領域複数選択工程S301において選択した増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列がプライマー候補塩基配列複数作成工程S302において作成されているため、第2のローカルアラインメント工程S313から繰り返す。
増幅候補領域に優先順位を付けた後のプライマー等の設計における特徴点は、概していえば、複数の特定の対象領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、対象領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得ることにある。
プライマーの塩基配列の相補性の確認における特徴点は、ローカルアラインメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマーの塩基配列の端部に対して、グローバルアラインメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点にある。
〈増幅候補領域の選択〉
増幅候補領域として、ヒト13番染色体上の領域からSNV(Single Nucleotide Variant;一塩基変異)を含む17個所の領域X01〜X17を選択した。
以下の表8に、増幅候補領域の存在する染色体およびSNV座標と、比較例1、実施例1、および実施例2において付けた各増幅候補領域の優先順位を示す。ここで、SNV座標はGRCh37.p13(Genome Resource Consortium, human genome assembly data, Release 37, Patch 13; GenBank Accession no. CM000675.1)に基づく座標である。なお、各増幅候補領域の優先順位の付け方については、後述する。
《優先順位の設定》
X01〜X17の各増幅候補領域に対して、SNV座標が小さい順に、それぞれ、優先順位1位〜17位を付けた。
表8の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスPCRによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
その結果、優先順位1番目から10番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスPCRに供するプライマーを設計することができた。
表9の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
また、図17に、染色体DNA上の増幅候補領域の物理的配置および各増幅候補領域の優先順位を示す。ただし、図中の各領域間の距離は実際の染色体DNA上の距離を反映していない。
《優先順位の設定》
X01〜X17の増幅候補領域に対して、以下のとおり優先順位を付けた。
表8の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
SNV座標が最小のX01(SNV座標:20,763,642)に優先順位1位を付けた。
SNV座標が最大のX17(SNV座標:111,098,226)に優先順位2位を付けた。
X01とX17の中点(座標:65,930,934)に最も近いX12(SNV座標:67,800,935)に優先順位3位を付けた。
X01とX12の中点(座標:44,282,288.5)に最も近いX09(SNV座標:46,946,157)に優先順位4位を付けた。
X12とX17の中点(座標:89,449,580.5)に最も近いX13(SNV座標:95,858,978)に優先順位5位を付けた。
X09とX12の中点(座標:57,373,546)に最も近いX11(SNV座標:53,608,479)に優先順位6位を付けた。
X13とX17の中点(座標:103,478,602)に最も近いX16(SNV座標:103,397,937)に優先順位7位を付けた。
X09とX11の中点(座標:50,277,318)に最も近いX10(SNV座標:52,544,805)に優先順位8位を付けた。
X13とX16の中点(座標:99,628,457.5)に最も近いX14(SNV座標:102,366,825)に優先順位9位を付けた。
X14とX16の中点(座標:102,882,381)に最も近いX15(SNV座標:103,396,716)に優先順位10位を付けた。
X01とX09の中点(座標:33,854,899.5)に最も近いX05(SNV座標:36,385,031)に優先順位11位を付けた。
X01とX05の中点(座標:28,574,336.5)に最も近いX04(SNV座標:27,845,654)に優先順位12位を付けた。
X05とX09の中点(座標:41,665,594)に最も近いX08(SNV座標:36,886,469)に優先順位13位を付けた。
X01とX04の中点(座標:44,282,288.5)に最も近いX02(SNV座標:24,798,120)に優先順位14位を付けた。
X05とX08の中点(座標:36,635,750)に最も近いX06(SNV座標:36,743,177)に優先順位15位を付けた。
X02とX04の中点(座標:26,321,887)に最も近いX03(SNV座標:25,265,103)に優先順位16位を付けた。
X06とX08の中点(座標:36,814,823)に最も近いX07(SNV座標:36,801,415)に優先順位17位を付けた。
優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスPCRによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
その結果、優先順位1番目から10番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスPCRに供するプライマーを設計することができた。
表10の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
また、図18に、染色体DNA上の増幅候補領域の物理的配置および各増幅候補領域の優先順位を示す。ただし、図中の各領域間の距離は実際の染色体DNA上の距離を反映していない。
《優先順位の設定》
X01〜X17の増幅候補領域に対して、以下のとおり優先順位を付けた。
表10の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
X01(SNV座標:20,763,642)に優先順位1位を付けた。
X01のSNV座標に5,000,000をプラスした25,763,642以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX04(SNV座標:27,845,654)に優先順位2位を付けた。
X04のSNV座標に5,000,000をプラスした32,845,654以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX05(SNV座標:36,385,031)に優先順位3位を付けた。
X05のSNV座標に5,000,000をプラスした41,385,031以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX09(SNV座標:46,946,157)に優先順位4位を付けた。
X09のSNV座標に5,000,000をプラスした51,946,157以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX10(SNV座標:52,544,805)に優先順位5位を付けた。
X10のSNV座標に5,000,000をプラスした57,544,805以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX12(SNV座標:67,800,935)に優先順位6位を付けた。
X12のSNV座標に5,000,000をプラスした72,800,935以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX13(SNV座標:95,858,978)に優先順位7位を付けた。
X13のSNV座標に5,000,000をプラスした100,858,978以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX14(SNV座標:102,366,825)に優先順位8位を付けた。
X14のSNV座標に5,000,000をプラスした107,366,825以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX17(SNV座標:111,098,226)に優先順位9位を付けた。
X17のSNV座標に5,000,000をプラスした116,098,226以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域が存在しないため、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX02(SNV座標:24,798,120)に優先順位10位を付けた。
X02のSNV座標に5,000,000をプラスした29,798,120以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX06(SNV座標:36,743,177)に優先順位11位を付けた。
X06のSNV座標に5,000,000をプラスした41,743,177以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX11(SNV座標:53,608,479)に優先順位12位を付けた。
X11のSNV座標に5,000,000をプラスした58,608,479以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX15(SNV座標:103,396,716)に優先順位13位を付けた。
X15のSNV座標に5,000,000をプラスした108,396,716以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域が存在しないため、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX03(SNV座標:25,265,103)に優先順位14位を付けた。
X03のSNV座標に5,000,000をプラスした30,265,103以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX07(SNV座標:36,801,415)に優先順位15位を付けた。
X07のSNV座標に5,000,000をプラスした41,801,415以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX16(SNV座標:103,397,937)に優先順位16位を付けた。
X16のSNV座標に5,000,000をプラスした108,397,937以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域が存在しないため、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つX08(SNV座標:36,886,469)に優先順位17位を付けた。
優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスPCRによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
その結果、優先順位1番目から10番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスPCRに供するプライマーを設計することができた。
表11の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
また、図19に、染色体DNA上の増幅候補領域の物理的配置および各増幅候補領域の優先順位を示す。ただし、図中の各領域間の距離は実際の染色体DNA上の距離を反映していない。
比較例1では、17個所の増幅候補領域のすべてに対してマルチプレックスPCRに供するプライマーおよびプライマーペアを設計することを目的としたが、プライマーの特異性およびプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、10箇所の増幅候補領域に対してプライマーおよびプライマーペアを設計できるにとどまった。
実施例1および実施例2でも、17個所の増幅候補領域のすべてに対してマルチプレックスPCRに供するプライマーおよびプライマーペアを設計することを目的としたが、プライマーの特異性およびプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、10箇所の増幅候補領域に対してプライマーおよびプライマーペアを設計できるにとどまった。
鋳型DNAが増幅候補領域X06〜X08を欠損している場合には、これらの領域を増幅することができないことから、比較例1では、SNVの塩基配列情報を得られる領域数が、プライマーおよびプライマーセットを設計することができた10箇所から7箇所へと、さらに減ってしまうのに対し、実施例1および実施例2では、X06〜X08が欠損したことによる影響を受けない。
その結果、比較例1では、X06〜X08が欠損していることによって、解析に必要な領域数を確保できない可能性が生じるに対し、実施例1および実施例2では、X06〜X08が欠損していることによっては、解析に必要な領域数を確保できない可能性が生じない。
増幅候補領域として、ヒト13番染色体上の領域からSNP(Single Nucleotide Polymorphism;一塩基多型)を含む99個所の領域Y01〜Y99を選択した。
以下の表12、表13、および表14に、増幅候補領域の存在する染色体、SNP座標、変異頻度(V.F.;Variant Frequency)、および変異頻度差(ΔV.F:変異頻度0.5との差の絶対値)と、比較例2および実施例3において付けた各増幅候補領域の優先順位を示す。ここで、SNP座標はGRCh37.p13(Genome Resource Consortium, human genome assembly data, Release 37, Patch 13; GenBank Accession no. CM000675.1)に基づく座標である。なお、各増幅候補領域の優先順位の付け方については、後述する。
《優先順位の設定》
Y01〜Y99の各増幅候補領域に対して、SNP座標が小さい順に、それぞれ、優先順位1位〜99位を付けた。
表12、表13、および表14の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスPCRによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
その結果、優先順位1番目から60番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスPCRに供するプライマーを設計することができた。
設計したプライマーおよびプライマーペアのうち、10対のプライマーペアについて、表14の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
《優先順位の設定》
Y01〜Y99の各増幅候補領域に対して、各SNPのΔV.F.が小さい順、すなわち、変異頻度V.F.が0.5に近い順に、それぞれ、優先順位1位〜99位を付けた。
表12、表13、および表14の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスPCRによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
その結果、優先順位1番目から60番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスPCRに供するプライマーを設計することができた。
設計したプライマーおよびプライマーペアのうち、10対のプライマーペアについて、表16の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
妊婦(母親)口腔から採取した妊婦(母親)由来の細胞と、妊婦(母親)の血液から採取した胎児(子)由来の有核赤血球細胞を用いて、表12〜14に示す第13番染色体上の99箇所のSNP座位のうち、マルチプレックスPCRに供するプライマーを設計することができた60箇所のSNP座位を対象にジェノタイピングを行い、母子判定を行い、その確度を求めた。
比較例2の方法に従ってプライマーおよびプライマーセットを設計した場合、および実施例3の方法に従ってプライマーおよびプライマーセットを設計した場合のいずれも、母子関係が肯定されたが、比較例2の場合の母子判定の確度は約13.2%であり、誤差が大きく、精度が悪かったが、実施例3の場合の母子判定の確度は約4.5%であり、誤差が小さく、精度が良かった。
|M−F|>|M−G| であれば、子由来が疑われる単離した細胞は子に由来すると判定し、
|M−F|<|M−G| であれば、子由来が疑われる単離した細胞はコンタミした他人に由来すると判定する。
12 記憶手段(メモリ)
13 補助記憶手段(ストレージ)
14 入力手段(キーボード)
15 補助入力手段(マウス)
16 表示手段(モニタ)
17 出力手段(プリンタ)
Claims (4)
- 同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をPCR増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法であって、
前記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法:
同一染色体DNA上のn箇所の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程;
演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位1位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第1の優先順位設定工程;
演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位2位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第2の優先順位設定工程;ならびに、
演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がi位であり座標値がriであり識別名がRiである増幅候補領域および優先順位がj位であり座標値がrjであり識別名がRjである増幅候補領域であって、前記増幅候補領域Riおよび前記増幅候補領域Rjの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも1箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Riおよび増幅候補領域Rjを検索し、次いで、前記増幅候補領域Riおよび前記増幅候補領域Rjの中点の座標値ri−jをri−j=(ri+rj)/2により算出し、さらに、前記中点の座標値ri−jに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位k位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第kの優先順位設定工程;
を含み、
前記第kの優先順位設定工程を、k=3からnまで繰り返す。
ただし、nは3≦nを満たす整数であり、kは3≦k≦nを満たす整数であり、iおよびjは、1≦i≦k−1、1≦j≦k−1、かつ、i≠jであり、riおよびrjはrmin≦ri≦rmax、rmin≦rj≦rmax、かつ、ri≠rjであり、rminおよびrmaxは、それぞれ、前記n個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。 - 同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をPCR増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法であって、
前記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法:
同一染色体DNA上のn個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程;
演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位1位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第1の優先順位設定工程;
演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位2位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第2の優先順位設定工程;ならびに、
演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がi位であり座標値がriであり識別名がRiである増幅候補領域および優先順位がj位であり座標値がrjであり識別名がRjである増幅候補領域であって、前記増幅候補領域Riおよび前記増幅候補領域Rjの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも1箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Riおよび増幅候補領域Rjを検索し、次いで、前記増幅候補領域Riおよび前記増幅候補領域Rjの中点の座標値ri−jをri−j=(ri+rj)/2により算出し、さらに、前記中点の座標値ri−jに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位k位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第kの優先順位設定工程;
前記第kの優先順位設定工程を、k=3からnまで繰り返す。
ただし、nは3≦nを満たす整数であり、kは3≦k≦nを満たす整数であり、iおよびjは、1≦i≦k−1、1≦j≦k−1、かつ、i≠jであり、riおよびrjはrmin≦ri≦rmax、rmin≦rj≦rmax、かつ、ri≠rjであり、rminおよびrmaxは、それぞれ、前記n個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。 - 同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をPCR増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法であって、
前記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法:
同一染色体DNA上のn個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程;
演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位1位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第1の優先順位設定工程;ならびに、
演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がk−1位である増幅候補領域の識別名Rk−1および座標値rk−1を検索し、T=rk−1+tを算出し、
T=rk−1+t≦rmaxであるとき、rk−1+t以上rmax以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がrk−1+t以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶し、
T=rk−1+t≦rmaxであるとき、rk−1+t以上rmax以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がrmin以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶し、
T=rk−1+t>rmaxであるとき、座標値がrmin以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶する、第kの優先順位設定工程;
前記第kの優先順位設定工程を、k=2からnまで繰り返す。
ただし、nは3≦nを満たす整数であり、kは2≦k≦nを満たす整数であり、tはt>0を満たす実数であり、rk−1≠rkであり、rminおよびrmaxは、それぞれ、前記n個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。 - 同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をPCR増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法であって、
前記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体DNA上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスPCRに供するプライマーの設計方法:
同一染色体DNA上のn個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程;
演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位1位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第1の優先順位設定工程;ならびに、
演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がk−1位である増幅候補領域の識別名Rk−1および座標値rk−1を検索して、T=rk−1+tを算出し、
T=rk−1+t≦rmaxであるとき、rk−1+t以上rmax以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がrk−1+t以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶し、
T=rk−1+t≦rmaxであるとき、rk−1+t以上rmax以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がrmin以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶し、
T=rk−1+t>rmaxであるとき、座標値がrmin以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位k位を付け、記憶手段に記憶する、第kの優先順位設定工程;
前記第kの優先順位設定工程を、k=2からnまで繰り返す。
ただし、nは3≦nを満たす整数であり、kは2≦k≦nを満たす整数であり、tはt>0を満たす実数であり、rk−1≠rkであり、rminおよびrmaxは、それぞれ、前記n個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
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