JP6768815B2 - マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法 - Google Patents

Description

本発明は、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法に関する。

近年発達してきたＤＮＡシーケンサ等により遺伝子解析が手軽に行えるようになっている。しかし、ゲノムの総塩基長は一般に膨大であり、一方でシーケンサのリード能力には制約がある。そこで、必要な特定の遺伝子領域のみを増幅し、その塩基配列に限定してリードを行うことで、効率的かつ精度よく遺伝子解析を行う技術としてＰＣＲ法が普及している。特に、ある１つのＰＣＲ反応系に複数種類のプライマーを同時に供給することで、複数の遺伝子領域を選択的に増幅する手法をマルチプレックスＰＣＲと称する。
マルチプレックスＰＣＲは少量のＤＮＡから複数の領域を効率よく増幅することから、非侵襲的な出生前診断を行うために有用な技術である。

特許文献１には、同一染色体上に座標順に配置されたｍ個の増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲにおいて使用するプライマーの設計方法が記載されている。ここで、ｍは１以上の整数である。
まず、増幅の対象となるＤＮＡの塩基配列から１つめの増幅候補領域Ｘ_１に対応するプライマー候補を選び出す。このとき、プライマー候補は、プライマーの融解温度、ＧＣ含量、塩基配列の長さ、塩基配列の特異性、ヘアピン構造およびプライマー・ダイマーの形成のしにくさをあらわすスコアから選び出されるものとする。Ｔｍ（融解温度；Melting Temperature）、ＧＣ含量、および塩基配列の長さが、あらかじめ定めた範囲内に収まっている、増幅候補領域Ｘ_１に対応するｎ個のプライマー候補のうち、塩基配列の特異性、ヘアピン構造及びプライマー・ダイマーの形成のしにくさから算出した、プライマー候補の優位性を示すスコアが最も高いものをＰ_１１、２番目に高い候補をＰ_１２、そしてｎ番目の候補をＰ_１ｎと呼ぶことにする。２つめの増幅候補領域Ｘ_２に対応するｎ’個のプライマー候補Ｐ_２１，Ｐ_２２，・・・，Ｐ_２ｎ’も、上記と同様に選び出す。すべての増幅候補領域について同様の操作を繰り返し、ｍ番目の増幅候補領域Ｘ_ｍに対応するｋ個のプライマー候補Ｐ_ｍ１，Ｐ_ｍ２，・・・，Ｐ_ｍｋを選び出す。
次に、選び出されたプライマー候補の中から反応に最適なプライマーの組み合わせを選び出すために、異なる増幅候補領域のプライマー同士が意図しない場所で相補的な塩基配列を持っていないか調べる。異なる増幅候補領域のプライマー同士でプライマー・ダイマーを形成する可能性が低いプライマーが、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーとなる。

特許第５０７９６９４号公報

ところが、単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡのような冗長性が低い少量ＤＮＡサンプルに対する直接的なマルチプレックスＰＣＲを行う際には、相補性／特異性などのプライマー設計の条件が非常に厳しいため、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計しようとする増幅候補領域の全てに対して、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーを採用することができない場合がある。

その結果、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーを採用することができた増幅候補領域（以下「増幅対象領域」という場合がある。）の数が少なくなり、以下のような問題が生じている。
ひとつ目は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないという問題である。
ふたつ目は、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができても、高い精度を達成できないという問題である。

そこで、本発明は、単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡのような冗長性が低い少量ＤＮＡサンプルに対する直接的なマルチプレックスＰＣＲを行った場合であっても、必要な領域数を確保することができる、または、高い精度を達成することができる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法を提供することを課題とする。

本発明者は、考察の末に、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じる原因として、染色体欠損またはＤＮＡ断片化などにより、増幅しようとする領域の少なくとも一部が存在しなくなっている場合があること、また、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーとしてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで採用されたプライマーであっても、ｉｎ ｖｉｔｒｏのマルチプレックスＰＣＲ実験系ではプライマー不適合が顕在化する場合があること、さらに、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができても、高い精度を達成できない原因として、増幅対象領域に含まれる変異の変異頻度が０．５に近くないと、所望の精度を達成するためにより多くの領域数を必要とすることを知見した。

本発明者は、上記課題を解決すべくさらに検討を重ねた結果、増幅候補領域に対して優先順位を付け、優先順位に従って増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法において、有線順位が前後する増幅候補領域の間の距離を大きく確保することにより、染色体の一部欠損またはＤＮＡ断片化等の影響が及ぶ範囲を限定し、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域の数を減らせること、また、優先順位を、増幅候補領域において設計することができるプライマー候補の数が少ないほど優先順位が高くなるように付けることにより、マルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーとして採用されるプライマーの数を増やし、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域の数を減らせること、さらに、優先順位を、増幅候補領域に含まれる変異の変異頻度が０．５に近いほど優先順位が高くなるように付けることにより、より少ない領域数で所望の精度を達成することができることを知得し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の［１］〜［４］を提供する。
［１］ 同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
同一染色体ＤＮＡ上のｎ箇所の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第２の優先順位設定工程；ならびに、
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｉ位であり座標値がｒｉであり識別名がＲｉである増幅候補領域および優先順位がｊ位であり座標値がｒｊであり識別名がＲｊである増幅候補領域であって、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊを検索し、次いで、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの中点の座標値ｒｉ−ｊをｒｉ−ｊ＝（ｒｉ＋ｒｊ）／２により算出し、さらに、上記中点の座標値ｒｉ−ｊに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する工程検索されたに優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
上記優先順位ｋ位を付ける工程を、ｋ＝３からｎまで繰り返す。
ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ−１、１≦ｊ≦ｋ−１、かつ、ｉ≠ｊであり、ｒｉおよびｒｊはｒｍｉｎ≦ｒｉ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｊ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｉ≠ｒｊであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
［２］ 同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第２の優先順位設定工程；ならびに、
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｉ位であり座標値がｒｉであり識別名がＲｉである増幅候補領域および優先順位がｊ位であり座標値がｒｊであり識別名がＲｊである増幅候補領域であって、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊを検索し、次いで、上記増幅候補領域Ｒｉおよび上記増幅候補領域Ｒｊの中点の座標値ｒｉ−ｊをｒｉ−ｊ＝（ｒｉ＋ｒｊ）／２により算出し、さらに、上記中点の座標値ｒｉ−ｊに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する工程検索されたに優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝３からｎまで繰り返す。
ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ−１、１≦ｊ≦ｋ−１、かつ、ｉ≠ｊであり、ｒｉおよびｒｊはｒｍｉｎ≦ｒｉ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｊ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｉ≠ｒｊであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
［３］ 同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
上記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；ならびに、
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｋ−１位である増幅候補領域の識別名Ｒｋ−１および座標値ｒｋ−１を検索して、Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔを算出し、
Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ−１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がｒｋ−１＋ｔ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ−１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ＞ｒｍａｘであるとき、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝２からｎまで繰り返す。
ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、ｒｋ−１≠ｒｋであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
［４］ 同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
上記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；ならびに、
演算手段が、記億手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｋ−１位である増幅候補領域の識別名Ｒｋ−１および座標値ｒｋ−１を検索し、Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔを算出し、
Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ−１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がｒｋ−１＋ｔ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ−１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ＞ｒｍａｘであるとき、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝２からｎまで繰り返す。
ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、ｒｋ−１≠ｒｋであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。

本発明によれば、単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡのような冗長性が低い少量ＤＮＡサンプルに対する直接的なマルチプレックスＰＣＲを行った場合であっても、必要な領域数を確保することができる、または、高い精度を達成することができる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法を提供することができる。
また、本発明によれば、染色体欠損またはＤＮＡ断片化等の影響を受けてＰＣＲ増幅に失敗する増幅対象領域の数を減らすことができ、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができる。
また、本発明によれば、プライマー候補の少ない増幅候補領域に対して、より多くのマルチプレックスＰＣＲで使用可能なプライマーを採用してＰＣＲ増幅に失敗する増幅対象領域の数を減らすことができ、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができる。
さらに、本発明によれば、含まれる変異の変異頻度が０．５に近い領域の増幅対象領域に占める割合を高めることにより、より少ない領域数で高い精度を達成することができる。

図１は、本発明における優先順位の設定において用いるハードウェアを表す概念図である。 図２は、本発明の本発明の第一の態様の優先順位の設定方法を表すフロー図である。 図３は、本発明の本発明の第一の態様の優先順位の設定方法の別の実施形態を表すフロー図である。 図４は、本発明の本発明の第二の態様の優先順位の設定方法を表すフロー図である。 図５は、本発明の本発明の第二の態様の優先順位の設定方法の別の実施形態を表すフロー図である。 図６は、従来の優先順位の設定方法を示す概念図である。増幅候補領域に対して、座標が小さい方から順に優先順位を付けている。同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域９箇所のうち５箇所を増幅しようとして、Ｒ０１、Ｒ０２、Ｒ０３、Ｒ０４、およびＲ０５についてプライマーを設計し、増幅を試みると、染色体ＤＮＡの増幅候補領域Ｒ０２、Ｒ０３およびＲ０４に該当する３箇所が欠損しているため、Ｒ０１およびＲ０５の高々２箇所しか増幅できない。 図７は、本発明の第一の態様の優先順位の設定方法を示す概念図である。増幅候補領域に対して、二分法的に優先順位を付けている。同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域９箇所のうち５箇所を増幅しようとして、Ｒ０１、Ｒ０３、Ｒ０５、Ｒ０７、およびＲ０９についてプライマーを設計し、増幅を試みると、染色体ＤＮＡの増幅候補領域Ｒ０２、Ｒ０３およびＲ０４に該当する３箇所が欠損しているため、Ｒ０１、Ｒ０５、Ｒ０７、およびＲ０９の４箇所を増幅することができる。 図８は、本発明の第二の態様の優先順位の設定方法を示す概念図である。増幅候補領域に対して、距離閾値に基づいて優先順位を付けている。同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域９箇所のうち５箇所を増幅しようとして、Ｒ０１、Ｒ０２、Ｒ０５、Ｒ０６、およびＲ０９についてプライマーを設計し、増幅を試みると、染色体ＤＮＡの増幅候補領域Ｒ０２、Ｒ０３およびＲ０４に該当する３箇所が欠損しているため、Ｒ０１、Ｒ０５、Ｒ０６、およびＲ０９の４箇所を増幅することができる。 図９は、従来の優先順位の設定方法を表す概念図である。増幅候補領域に対して、座標が小さい方から順に優先順位を付けている。同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域Ｒ０１〜Ｒ０９の９箇所のうち、Ｒ０７およびＲ０８の２箇所を増幅することができない。 図１０は、本発明の第三の態様の優先順位の設定方法を解説するための概念図である。増幅候補領域に対して、プライマー候補の数が少ない方から順に優先順位を付けている。同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域Ｒ０１〜Ｒ０９の９箇所を増幅することができる。 図１１は、従来の優先順位の設定方法を表す概念図である。増幅候補領域に対して、座標が小さい方から順に優先順位を付けている。９箇所中５箇所の増幅候補領域を増幅し、ジェノタイピング解析を行うと、高い解析精度が得られない。 図１２は、本発明の第四の態様の優先順位の設定方法を解説するための概念図である。増幅候補領域に対して、ＳＮＰの変異頻度が０．５に近い方から順に優先順位を付けている。９箇所中５箇所の増幅候補領域を増幅し、ジェノタイピング解析を行うと、高い解析精度が得られる。 図１３は、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（１）を説明するフロー図である。増幅候補領域の優先順位を設定した後、優先順位の順に対象領域を選択し、プライマーを設計する。 図１４は、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（２）を説明するフロー図である。増幅候補領域の優先順位を設定した後、優先順位の順に対象領域を選択し、プライマーを設計する。 図１５は、本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（３）を説明するフロー図である。増幅候補領域の優先順位を設定した後、対象領域を選択し、プライマー候補の塩基配列を設計した後、各工程を優先順位の順に行い、プライマーを設計する。 図１６は、本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（３）の変形例を説明するフロー図である。対象領域を選択し、プライマー候補の塩基配列を設計した後、増幅候補領域の優先順位を設定し、それ以降の工程を優先順位の順に行い、プライマーを設計する。 図１７は比較例１における増幅候補領域に対する優先順位の付け方を示す図である。増幅候補領域に対して、座標が小さい方から順に優先順位を付けた。プライマーを設計した１０箇所の増幅候補領域中、Ｘ０６、Ｘ０７、およびＸ０８については、染色体ＤＮＡの欠損のため、増幅しない。そのため、解析に必要な領域数に達しない可能性がある。 図１８は実施例１における増幅候補領域に対する優先順位の付け方を示す図である。増幅候補領域に対して、二分法的に優先順位を付けた。染色体ＤＮＡ上のＸ０６、Ｘ０７、およびＸ０８については、欠損しているが、プライマーを設計した１０箇所の増幅候補領域には含まれないため、影響がない。 図１９は実施例２における増幅候補領域に対する優先順位の付け方を示す図である。増幅候補領域に対して、距離閾値に基づいて優先順位を付けた。染色体ＤＮＡ上のＸ０６、Ｘ０７、およびＸ０８については、欠損しているが、プライマーを設計した１０箇所の増幅候補領域には含まれないため、影響がない。

本発明において、「〜」を用いて表される範囲は、その範囲に「〜」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。例えば、ＡおよびＢについて「Ａ〜Ｂ」はＡおよびＢを含む範囲を表す。
また、本発明において、増幅候補領域は、ゲノムＤＮＡ上の領域であって、ジェノタイピングまたは染色体数定量などの目的のためにＰＣＲ増幅する候補の領域をいうものとする。

本明細書において用いる主要な略語およびその意味は以下のとおりである。
ＤＮＡ・・・デオキシリボ核酸（Deoxyribonucleic acid）
ＰＣＲ・・・ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）
ＳＮＰ・・・一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism）
ＳＮＰｓ・・・ＳＮＰの複数形
ＳＮＶ・・・一塩基変異（Single Nucleotide Variant）、ＳＮＰの上位概念
Ｖ．Ｆ．・・・変異頻度（Variant Frequency）
ΔＶ．Ｆ．・・・変異頻度差（変異頻度０．５との差の絶対値）
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ・・・「コンピュータを用いて」という意味（バイオインフォマティクス）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ・・・ｉｎ ｓｉｌｉｃｏに対して、「ウェットな実験によって」という意味（バイオインフォマティクス）

［ハードウェア（実行装置）］
本発明における優先順位の設定方法を実行する装置（「ハードウェア」または「実行装置」ともいう。）について、図１を参照しながら説明する。
本発明において、優先順位の設定は、演算手段（ＣＰＵ；Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ，中央演算処理装置）１１、記憶手段（メモリ）１２、補助記憶手段（ストレージ）１３、入力手段（キーボード）１４、および表示手段（モニタ）１６を備えるハードウェア（装置）によって行われる。この装置は、さらに、補助入力手段（マウス）１５、および出力手段（プリンタ）１７等を備えていてもよい。
それぞれの手段について説明する。
入力手段（キーボード）１４は、装置に指示およびデータ等を入力する手段である。補助入力手段（マウス）１５は、入力手段（キーボード）１４に代えて、またはそれとともに、用いられる。
演算手段（ＣＰＵ）１１は、演算処理を行う手段である。
記憶手段（メモリ）１２は、演算手段（ＣＰＵ）１１の演算処理の結果を記憶したり、入力手段（キーボード）１４からの入力を記憶したりする手段である。
補助記憶手段（ストレージ）１３は、オペレーティングシステム、必要ローカス数を決定するためのプログラムなどを保存するストレージである。補助記憶手段（ストレージ）１３は、その一部を記憶手段（メモリ）１２を拡張するために用いることもできる（仮想メモリ）。

［１．本発明の第一の態様］
本発明の第一の態様は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないというひとつ目の問題に対する解決手段を提供するものである。以下では、図１、図２および図３を適宜参照しながら説明する。

本発明の第一の態様は、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法である。
上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。

同一染色体ＤＮＡ上のｎ箇所の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段１４を介して入力され、記憶手段１２に記憶される工程（図２のＳ１１）。
演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第１の優先順位設定工程（図２のＳ１２）。

演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第２の優先順位設定工程（図２のＳ１３）。

演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｉ位であり座標値がｒ_ｉであり識別名がＲ_ｉである増幅候補領域および優先順位がｊ位であり座標値がｒ_ｊであり識別名がＲ_ｊである増幅候補領域であって、上記増幅候補領域Ｒ_ｉおよび上記増幅候補領域Ｒ_ｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Ｒ_ｉおよび増幅候補領域Ｒ_ｊを検索し、次いで、上記増幅候補領域Ｒ_ｉおよび上記増幅候補領域Ｒ_ｊの中点の座標値ｒ_ｉ−ｊをｒ_ｉ−ｊ＝（ｒ_ｉ＋ｒ_ｊ）／２により算出し、さらに、上記中点の座標値ｒ_ｉ−ｊに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する工程検索されたに優先順位ｋ位を付け、記憶手段１２に記憶する、第ｋの優先順位設定工程（図２のＳ１５）。

上記優先順位ｋ位を付ける工程を、ｋ＝３からｎまで繰り返す（図２のＳ１４およびＳ１６）。

ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ−１、１≦ｊ≦ｋ−１、かつ、ｉ≠ｊであり、ｒ_ｉおよびｒ_ｊはｒ_ｍｉｎ≦ｒ_ｉ≦ｒ_ｍａｘ、ｒ_ｍｉｎ≦ｒ_ｊ≦ｒ_ｍａｘ、かつ、ｒ_ｉ≠ｒ_ｊであり、ｒ_ｍｉｎおよびｒ_ｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。

または、図３に示すように、優先順位１位および２位の付け方は次のようにしてもよい。

演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第１の優先順位設定工程（図３のＳ１２’）。

演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第２の優先順位設定工程（図３のＳ１３’）。

本発明の第一の態様は、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法において、増幅候補領域選択工程と、第１の優先順位設定工程と、第２の優先順位設定工程と、第ｋの優先順位設定工程とを備え、第ｋの優先順位設定工程はｋ＝３からｋ＝ｎまで逐次繰り返される優先順位を付ける方法によって、上記優先順位を付けることを特徴とする。

〈増幅候補領域選択工程〉
増幅候補領域選択工程は、同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域を選択する工程である。増幅候補領域ｎ個の識別情報および座標情報を入力する（図２および図３のＳ１１）。
ここで、ｎはｎ≧３を満たす整数である。
ｎは、好ましくは５以上であり、より好ましくは１０以上であり、さらに好ましくは５０以上であり、いっそう好ましく１００以上であり、よりいっそう好ましくは５００以上である。より多くの増幅候補領域に対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができれば、必要領域数を満たすことがより容易となる。
なお、ｎ個の増幅候補領域の全てに対して優先順位を付けたとしても、ｎ箇所全ての増幅候補領域に対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計できるとは限らないことは、既に記載したとおりである。

〈第１の優先順位設定工程／第２の優先順位設定工程〉
上記ｎ個の増幅候補領域において、最小の座標ｒ_ｍｉｎを持つ増幅候補領域をＲ_ｍｉｎとし、最大の座標ｒ_ｍａｘを持つ増幅候補領域をＲ_ｍａｘとする。

《第１の優先順位設定工程》
第１の優先順位設定工程は、上記増幅候補領域Ｒ_ｍｉｎおよび上記増幅候補領域Ｒ_ｍａｘの２つの増幅候補領域のうち、一方に優先順位１位を付ける工程である（図２のＳ１２；図３のＳ１２’）。
すなわち、増幅候補領域Ｒ_ｍｉｎに優先順位１位をつけるか、または、増幅候補領域Ｒ_ｍａｘに優先順位１位を付けることとなる。

《第２の優先順位設定工程》
第２の優先順位設定工程は、上記増幅候補領域Ｒ_ｍｉｎおよび上記増幅候補領域Ｒ_ｍａｘの２つの増幅候補領域のうち、上記優先順位１位を付けた一方を除く他方に優先順位２位を付ける工程である（図２のＳ１３；図３のＳ１３’）。
すなわち、上記第１の優先順位設定工程において、増幅候補領域Ｒ_ｍｉｎに優先順位１位をつけたときは、増幅候補領域Ｒ_ｍａｘに優先順位２位を付けることとなり、上記第１の優先順位設定工程において、増幅候補領域Ｒ_ｍａｘに優先順位１位を付けたときは、増幅候補領域Ｒ_ｍｉｎに優先順位２位を付けることとなる。

〈第ｋの優先順位設定工程〉
第ｋの優先順位設定工程では、既に１位から（ｋ−１）位までの優先順位が付けられた場合において、優先順位ｉ位が付けられた増幅候補領域Ｒ_ｉおよび優先順位ｊ位が付けられた増幅候補領域Ｒ_ｊの中点の座標（ｒ_ｉ＋ｒ_ｊ）／２に最も近い座標値を持つ増幅候補領域に優先順位ｋ位を付ける（図２および図３のＳ１４〜Ｓ１６）。ここで、ｒ_ｉおよびｒ_ｊは、それぞれ、増幅候補領域Ｒ_ｉおよび増幅候補領域Ｒ_ｊの座標である。

増幅候補領域Ｒ_ｉおよび増幅候補領域Ｒ_ｊの組合せが２組以上存在する場合は、無作為に１組を選択してもよいが、座標が小さい方を優先する、または座標が大きい方を優先する等のポリシーを採用してもよい。

座標（ｒ_ｉ＋ｒ_ｊ）／２に最も近い座標値を持つ増幅候補領域が２箇所存在する場合は、無作為に１箇所を選択してもよいが、座標が小さい方を優先する、または座標が大きい方を優先する等のポリシーを採用してもよい。

なお、上記増幅候補領域Ｒ_ｉおよび上記増幅候補領域Ｒ_ｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在する。また、Ｒ_１は上記第１の優先順位設定工程において優先順位１位が付けられたＲ_ｍｉｎまたはＲ_ｍａｘであり、Ｒ_２は上記第２の優先順位設定工程において優先順位２位が付けられたＲ_ｍｉｎまたはＲ_ｍａｘである。

ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数である。
ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ−１、１≦ｊ≦ｋ−１、かつ、ｉ≠ｊである。
ｒ_ｉおよびｒ_ｊはｒ_ｍｉｎ≦ｒ_ｉ≦ｒ_ｍａｘ、ｒ_ｍｉｎ≦ｒ_ｊ≦ｒ_ｍａｘ、かつ、ｒ_ｉ≠ｒ_ｊである。

第ｋの優先順位設定工程は、ｋ＝３からｋ＝ｎまで逐次繰り返す（図２および図３のＳ１４〜Ｓ１６）。
優先順位を付けることができる増幅候補領域が無くなったところで、優先順位の設定を終了する。
さらに、増幅候補領域の識別情報および優先順位情報を出力する（図２および図３のＳ１７）。

なお、増幅候補領域に対する優先順位の設定は、優先順位に重複が生じないように行う。

〈図７に基づく説明〉
図７を参照しながら具体的に説明する。
図７は、簡単のため、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域Ｒ０１〜Ｒ０９の９箇所の増幅候補領域が、左から右に座標が大きくなる順で等間隔に並べられている。
（１）座標が最も小さいＲ０１に優先順位１位を付けた。
（２）座標が最も大きいＲ０９に優先順位２位を付けた。
（３）Ｒ０１とＲ０９の中点に該当するＲ０５に優先順位３位を付けた。
（４）Ｒ０１とＲ０５の中点に該当するＲ０３に優先順位４位を付けた。
（５）Ｒ０５とＲ０９の中点に該当するＲ０７に優先順位５位を付けた。
（６）Ｒ０１とＲ０３の中点に該当するＲ０２に優先順位６位を付けた。
（７）Ｒ０５とＲ０７の中点に該当するＲ０６に優先順位７位を付けた。
（８）Ｒ０３とＲ０５の中点に該当するＲ０４に優先順位８位を付けた。
（９）まだ順位を付けていない増幅候補領域がなくなったため、順位付けを終了した。

〈本発明の第一態様の有利な効果〉
図６および図７を対比しながら説明する。
図６および図７では、Ｒ０１〜Ｒ０９の増幅候補領域に１位から９位までの優先順位を付ける。
優先順位を付けた増幅候補領域のうち、優先順位に従って５箇所の増幅候補領域を増幅するためのプライマーを作製する。
実際の染色体ＤＮＡでは、Ｒ０２、Ｒ０３、およびＲ０４が欠損している。
そのため、図６では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、３箇所（Ｒ０２、Ｒ０３、およびＲ０４）の増幅に失敗する。増幅できる増幅候補領域は必要領域数に満たない可能性が大きい。
しかし、図７では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、１箇所（Ｒ０３）の増幅に失敗するだけである。増幅できる増幅候補領域は必要領域数を満たす可能性が大きい。

［２．本発明の第二の態様］
本発明の第二の態様は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないというひとつ目の問題に対する別の解決手段を提供するものである。以下では、図１、図４および図５を適宜参照しながら説明する。

本発明の第二の態様は、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法である。
上記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。

同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段１４を介して入力され、記憶手段１２に記憶される工程（図４のＳ２１）。

演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第１の優先順位設定工程（図４のＳ２２）。

演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｋ−１位である増幅候補領域の識別名Ｒ_ｋ−１および座標値ｒ_ｋ−１を検索し、Ｔ＝ｒ_ｋ−１＋ｔを算出し（図４のＳ２４）、
Ｔ＝ｒ_ｋ−１＋ｔ≦ｒ_ｍａｘであるとき、ｒ_ｋ−１＋ｔ以上ｒ_ｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がｒ_ｋ−１＋ｔ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け（図４のＳ２５およびＳ２６）、記憶手段１２に記憶し、
Ｔ＝ｒ_ｋ−１＋ｔ≦ｒ_ｍａｘであるとき、ｒ_ｋ−１＋ｔ以上ｒ_ｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がｒ_ｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け（図４のＳ２５およびＳ２７）、記憶手段１２に記憶し、
Ｔ＝ｒ_ｋ−１＋ｔ＞ｒ_ｍａｘであるとき、座標値がｒ_ｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け（図４のＳ２５およびＳ２７）、記憶手段１２に記憶する、第ｋの優先順位設定工程。

上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝２からｎまで繰り返す（図４のＳ２３〜Ｓ２８）。

ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、ｒ_ｋ−１≠ｒ_ｋであり、ｒ_ｍｉｎおよびｒ_ｍａｘは、それぞれ、上記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。

または、図５に示すように、優先順位１位の付け方は次のようにしてもよい。

演算手段１１が、記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第１の優先順位設定工程（図５のＳ２２’）。

本発明の第二の態様は、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法において、増幅候補領域選択工程と、第１の優先順位設定工程と、第ｋの優先順位設定工程とを備え、第ｋの優先順位設定工程はｋ＝２からｋ＝ｎまで逐次繰り返される優先順位を付ける方法によって、上記優先順位を付けることを特徴とする。

〈増幅候補領域選択工程〉
増幅候補領域選択工程は、同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域を選択する工程である。
ここで、ｎはｎ≧３を満たす整数である。
ｎは、好ましくは５以上であり、より好ましくは１０以上であり、さらに好ましくは５０以上であり、いっそう好ましく１００以上であり、よりいっそう好ましくは５００以上である。より多くの増幅候補領域に対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができれば、必要領域数を満たすことがより容易となる。
なお、ｎ個の増幅候補領域の全てに対して優先順位を付けたとしても、ｎ箇所全ての増幅候補領域に対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計できるとは限らないことは、既に記載したとおりである。

〈第１の優先順位設定工程〉
上記ｎ個の増幅候補領域において、最小の座標ｒ_ｍｉｎを持つ増幅候補領域をＲ_ｍｉｎとし、最大の座標ｒ_ｍａｘを持つ増幅候補領域をＲ_ｍａｘとする。増幅候補領域ｎ個の識別情報および座標情報を入力する（図４および図５のＳ２１）。

第１の優先順位設定工程は、上記増幅候補領域Ｒ_ｍｉｎおよび上記増幅候補領域Ｒ_ｍａｘの２つの増幅候補領域の間に存在し、ｒ_ｍｉｎ≦ｒ_１≦ｒ_ｍａｘを満たす座標ｒ_１を持つ増幅候補領域Ｒ_１に優先順位１位を付ける工程である（図４のＳ２２；図５のＳ２２’）。
すなわち、増幅候補領域Ｒ_ｍｉｎに優先順位１位をつけてもよいし、増幅候補領域Ｒ_ｍａｘに優先順位１位を付けてもよいし、増幅候補領域Ｒ_ｍｉｎおよび増幅候補領域Ｒ_ｍａｘのいずれとも異なる増幅候補領域に優先順位１位を付けてもよい。
Ｒ１の座標ｒ_１は、ｒ_ｍｉｎ≦ｒ_１≦ｒ_ｍａｘを満たす限り、特に限定されないが、好ましくはｒ_１＝ｒ_ｍｉｎまたはｒ_１＝ｒ_ｍａｘであり、より好ましくはｒ_１＝ｒ_ｍｉｎである。

〈第ｋの優先順位設定工程〉
第ｋの優先順位設定工程では、既に１位から（ｋ−１）位までの優先順位が付けられた場合において、所定の条件を満たす増幅候補領域に優先順位ｋ位を付ける（図４および図５のＳ２３〜Ｓ２８）。
上記所定の条件を満たす増幅候補領域は、以下のようにして決定される。
優先順位（ｋ−１）位が付けられた増幅候補領域Ｒ_ｋ−１の座標をｒ_ｋ−１とし、それに閾値ｔを足した値「Ｔ＝ｒ_ｋ−１＋ｔ」を考える。ここで、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、本発明において「閾値」という場合がある。
増幅候補領域の座標の最大値はｒ_ｍａｘであることから、次の（１）および（２）の２つの場合に分けられる。
（１）Ｔ＝ｒ_ｋ−１＋ｔ≦ｒ_ｍａｘである場合
（２）Ｔ＝ｒ_ｋ−１＋ｔ＞ｒ_ｍａｘである場合

さらに、上記（１）の場合は、座標ｒ_ｋ−１＋ｔとｒ_ｍａｘの間にまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するか否かにより、次の（１）−１および（１）−２の２つの場合に分けられる。
（１）−１ まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在する場合
（１）−２ まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在しない場合

上記（１）−１に該当する場合は、座標が（ｒ_ｋ−１＋ｔ）以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付ける。
この場合においては、ｔは優先順位（ｋ−１）位の増幅候補領域Ｒ_ｋ−１と優先順位ｋ位の増幅候補領域Ｒ_ｋとの間の距離を表す。ｔが大きいほど、Ｒ_ｋ−１とＲ_ｋとの間の距離も大きくなり、通常、互いに及ぼす影響は小さくなる。

上記（１）−２または上記（２）に該当する場合は、座標がｒ_ｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付ける。

ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数である。
ｔはｔ＞０を満たす実数であり、染色体ＤＮＡサイズ、または増幅候補領域の座標などに応じて適宜設定することができるが、好ましくは１００，０００以上、より好ましくは１，０００，０００以上、さらに好ましくは５，０００，０００以上である。

第ｋの優先順位設定工程は、ｋ＝２からｋ＝ｎまで逐次繰り返す。
優先順位を付けることができる増幅候補領域が無くなったところで、優先順位の設定を終了する。

なお、増幅候補領域に対する優先順位の設定は、優先順位に重複が生じないように行う。

〈図８に基づく説明〉
図８を参照しながら具体的に説明する。
図８は、簡単のため、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域Ｒ０１〜Ｒ０９の９箇所の増幅候補領域が、左から右に座標が大きくなる順で等間隔に並べられている。この間隔を１，０００，０００（塩基対）とし、閾値ｔを４，０００，０００とする。
（１）座標が最も小さいＲ０１に優先順位１位を付けた。
（２）Ｒ０１の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当するＲ０５に優先順位２位を付けた。
（３）Ｒ０５の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当するＲ０９に優先順位３位を付けた。
（４）Ｒ０９の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当する増幅候補領域は存在しないため、Ｒ０１の座標以上で最も小さい座標を持ち、まだ優先順位を付けていない増幅候補領域であるＲ０２に優先順位４位を付けた。
（５）Ｒ０２の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当するＲ０６に優先順位５位を付けた。
（６）Ｒ０６の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当する増幅候補領域は存在しないため、Ｒ０１の座標以上で最も小さい座標を持ち、まだ優先順位を付けていない増幅候補領域であるＲ０３に優先順位６位を付けた。
（７）Ｒ０３の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当するＲ０７に優先順位７位を付けた。
（８）Ｒ０７の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当する増幅候補領域は存在しないため、Ｒ０１の座標以上で最も小さい座標を持ち、まだ優先順位を付けていない増幅候補領域であるＲ０４に優先順位８位を付けた。
（９）Ｒ０４の座標に４，０００，０００をプラスした座標に該当するＲ０８に優先順位９位を付けた。
（１０）まだ順位を付けていない増幅候補領域がなくなったため、順位付けを終了した。

〈本発明の第二態様の有利な効果〉
図６および図８を対比しながら説明する。
図６および図８では、Ｒ０１〜Ｒ０９の増幅候補領域に１位から９位までの優先順位を付ける。
優先順位を付けた増幅候補領域のうち、優先順位に従って５箇所の増幅候補領域を増幅するためのプライマーを作製する。
実際の染色体ＤＮＡでは、Ｒ０２、Ｒ０３、およびＲ０４が欠損している。
そのため、図６では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、３箇所（Ｒ０２、Ｒ０３、およびＲ０４）の増幅に失敗する。増幅できる増幅候補領域は必要領域数に満たない可能性が大きい。
しかし、図８では、プライマーを作製し、増幅しようとしていた増幅候補領域のうち、１箇所（Ｒ０２）の増幅に失敗するだけである。増幅できる増幅候補領域は必要領域数を満たす可能性が大きい。

［３．本発明の第三の態様］
本発明の第三の態様は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅に失敗する増幅対象領域が生じてしまい、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができないというひとつ目の問題に対するさらに別の解決手段を提供するものである。以下では、図１を適宜参照しながら説明する。

本発明の第三の態様は、同一染色体上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法である。
上記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。

同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報およびプライマー候補数情報が入力手段１４を介して入力され、記憶手段１２に記憶される工程。

演算手段１１が記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報およびプライマー候補数情報から、プライマー候補数の数がｋ番目に少ない増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第ｋの優先順位設定工程。

上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝１からｎまで繰り返す。ただし、ｎはｎ≧２を満たす整数であり、ｋは１≦ｋ≦ｎを満たす整数である。

これにより、上記増幅候補領域において設計することができるプライマー候補の数が少ないほど上記優先順位が高くなるように付けられる。

本発明の第三の態様は、同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法において、上記増幅候補領域において設計することができるプライマー候補の数が少ないほど上記優先順位が高くなるように、優先順位を付けることを特徴とする。

図９および図１０を参照しながら説明する。
Ｒ０１からＲ０９までの各増幅候補領域について、プライマー候補数は図９または図１０に示すとおりである。なおプライマー候補は、後述するプライマー等の設計をする方法の「プライマー候補塩基配列作成」において作成されたプライマー候補の塩基配列である。一般に、１つの増幅候補領域に対しては、その増幅候補領域を増幅するためのプライマーペアは、複数ペア作成される。
図９は、従来どおり、座標が小さい方から順に増幅候補領域に優先順位を付けたものである。座標順に優先順位を付けた場合、増幅候補領域数が増加するにつれて相補性の条件が厳しくなるため、もともと候補数の少ないＲ０７およびＲ０８では、他の増幅候補領域を増幅するためのプライマーとのプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、マルチプレックスＰＣＲに使用可能なプライマーとして採用されるプライマーペアが少なくなり過ぎてしまい、その結果、増幅失敗の可能性が高くなる。
図１０は、本発明の第三態様に従って、プライマー候補数が少ない順に増幅候補領域に優先順位を付けたものである。プライマー候補数の少ない順に優先順位を付けた場合、領域数が増加するにつれて相補性の条件が厳しくなるが、もともとの候補数が多いため、他の増幅候補領域を増幅するためのプライマーとのプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、マルチプレックスＰＣＲに使用可能なプライマーとして採用されるプライマーペアが少なくなり過ぎず、その結果、従来よりも増幅成功の可能性が高くなる。

［４］本発明の第四の態様
本発明の第四の態様は、ジェノタイピング等の解析に必要な領域数を確保することができても、高い精度を達成できないという問題に対する解決手段を提供するものである。以下では、図１を適宜参照しながら説明する。

本発明の第四の態様は、増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法である。
上記優先順位は、以下の工程を含む染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる。

染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および変異頻度情報が入力手段１４を介して入力され、記憶手段１２に記憶される工程。

演算手段１１が記憶手段に記憶された上記増幅候補領域の識別情報および変異頻度情報から、識別名Ｒ_ｉおよび変異頻度ＶＦ_ｉを持つ増幅候補領域の変異頻度差＝｜０．５−ＶＦ_ｉ｜を算出し、変異頻度差がｋ番目に小さい増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段１２に記憶する、第ｋの優先順位設定工程。

上記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝１からｎまで繰り返す。ただし、ｎはｎ≧２を満たす整数であり、ｋは１≦ｋ≦ｎを満たす整数である。

これにより、上記増幅候補領域に含まれる変異の変異頻度が０．５に近いほど上記優先順位が高くなるように付けられる。

本発明の第四の態様は、増幅候補領域に対して優先順位を付け、上記優先順位に従って上記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法において、上記増幅候補領域に含まれる変異の変異頻度が０．５に近いほど上記優先順位が高くなるように、上記優先順位を付けることを特徴とする。

図１１および図１２を参照しながら説明する。
Ｒ０１からＲ０９までの各増幅候補領域について、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；一塩基多型）のＶ．Ｆ．（Ｖａｒｉａｎｔ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ；変異頻度）およびΔＶ．Ｆ．（変異頻度０．５との差の絶対値）は図１１および図１２に示すとおりである。
Ｒ０１からＲ０９までの増幅候補領域に優先順位を１位から９位まで付け、上位５箇所の増幅候補領域に対してプライマーを作製し、マルチプレックスＰＣＲによる増幅、ＳＮＰタイピング、および母子判定を行い、母子判定の確度を算出すると、図１１に示される例の方が図１２に示される例よりも、確度が大きく、精度が悪い。図１１に示される例で確度を小さくし、精度を改善するためには、ＳＮＰ座位数、すなわち増幅候補領域数を増やす必要がある。特に、単一細胞から抽出した、微量で冗長性が無いゲノムＤＮＡなどでは、マルチプレックスＰＣＲによって同時に増幅する領域数または座位数を増やすことが難しい場合があることから、より少ない領域数または座位数でより高い精度を達成することが求められている。

［マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法］
増幅候補領域にプライマーを設計する順序である優先順位を設定した後は、以下に説明するマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法によって、所望の増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する。

〈マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（１）〉
本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（１）（以下、単に「設計方法（１）」という場合がある。）では、増幅候補領域に優先順位を設定した後、以下の工程を行う。

（ａ）優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位の順に対象領域を選択する、対象領域選択工程。
（ｂ）上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程。
（ｃ）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。
（ｄ）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程。
（ｅ）上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
（ｆ）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程。
（ｇ）上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程。

ただし、上記（ａ）工程〜上記（ｇ）工程のうち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程の両工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行った後、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行ってもよいし、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行ってもよいし、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行ってもよい。

上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行う場合には、上記（ｅ）工程および上記（ｃ）工程は、それぞれ、下記（ｅ’）工程および下記（ｃ’）工程とすることが好ましい。
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。
（ｃ’）上記第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。

また、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ）工程は、下記（ｅ’）工程とすることが好ましい。
（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。

〈マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（２）〉
本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（２）（以下、単に「設計方法（２）」という場合がある。）では、増幅候補領域に優先順位を設定した後、以下の工程を行う。

（ａ_１）優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第１の対象領域として選択する、対象領域選択第１工程。
（ｂ_１）上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第１工程。
（ｃ_１）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程。
（ｄ_１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第１工程。
（ｅ_１）上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
（ｆ_１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第１工程。
（ｇ_１）上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第１工程。

（ａ_２）優先順位が設定された増幅候補領域のうちまだ選択されていない増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第２の対象領域として選択する、対象領域選択第２工程。
（ｂ_２）上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第２工程。
（ｃ_２）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程。
（ｄ_２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第２工程。
（ｅ_２）上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
（ｆ_２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第２工程。
（ｇ_２）上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第２工程。

ただし、上記（ａ_１）工程〜上記（ｇ_１）工程のうち、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程の両工程と、上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程を行った後、上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程を行った後、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程と、上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程とを、並行して行ってもよい。

上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程を行った後、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程を行う場合には、上記（ｅ_１）工程および上記（ｃ_１）工程は、それぞれ、下記（ｅ_１’）工程および下記（ｃ_１’）工程とすることが好ましい。
（ｅ_１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。
（ｃ_１’）上記第二段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程。

また、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程と、上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ_１）工程は、下記（ｅ_１’）工程とすることが好ましい。
（ｅ_１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。

ただし、上記（ａ_２）工程〜上記（ｇ_２）工程のうち、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程の両工程と、上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程を行った後、上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程を行った後、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程と、上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程とを、並行して行ってもよい。

上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程を行った後、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程を行う場合には、上記（ｅ_２）工程および上記（ｃ_２）工程は、それぞれ、下記（ｅ_２’）工程および下記（ｃ_２’）工程とすることが好ましい。
（ｅ_２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。
（ｃ_２’）上記第二段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程。

また、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程と、上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ_２）工程は、下記（ｅ_２’）工程とすることが好ましい。
（ｅ_２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。

さらに、上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含む場合であって、上記３つ以上の目的領域からまだ選択されていない第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記（ａ_２）工程〜上記（ｇ_２）工程までの各工程を繰り返す。

〈マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（３）〉
本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（３）（以下、単に「設計方法（３）」という場合がある。）では、増幅候補領域に優先順位を設定した後、以下の工程を行い、その変形例では、（ｂ−０）プライマー候補塩基配列複数作成工程の後、かつ、（ｃ−１）第１のローカルアラインメント工程の前に、増幅候補領域に優先順位を設定し、（ｃ−１）第１のローカルアラインメント工程以降の工程を行う。

（ａ−０）優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が高い順に複数の対象領域を選択する、対象領域複数選択工程。
（ｂ−０）上記複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程。

（ｂ−０）プライマー候補塩基配列複数作成工程の後、増幅候補領域にプライマーを設計する順序である優先順位を設定する。設定後、（ｃ−１）第１のローカルアラインメント工程以降を行う。
なお、（ｂ−０）プライマー候補塩基配列複数作成工程の後に代えて、（ａ−０）対象領域複数選択工程の前に、優先順位を設定してもよい。

（ｃ−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程。
（ｄ−１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第１の第一段階選抜工程。
（ｅ−１）上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
（ｆ−１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第１の第二段階選抜工程。
（ｇ−１）上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程。

（ｃ−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程。
（ｄ−２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第２の第一段階選抜工程。
（ｅ−２）上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
（ｆ−２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第２の第二段階選抜工程。
（ｇ−２）上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程。

ただし、上記（ｃ−１）工程〜上記（ｇ−１）工程のうち、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程の両工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行った後、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行った後、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行ってもよい。

上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程を行った後、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程を行う場合には、上記（ｅ−１）工程および上記（ｃ−１）工程は、それぞれ、下記（ｅ’−１）工程および下記（ｃ’−１）工程とすることが好ましい。
（ｅ’−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。
（ｃ’−１）上記第１の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程。

また、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ−１）工程は、下記（ｅ’−１）工程とすることが好ましい。
（ｅ’−１）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。

ただし、上記（ｃ−２）工程〜上記（ｇ−２）工程のうち、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程の両工程と、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行った後、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行った後、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ−１）工程および上記（ｄ−１）工程と、上記（ｅ−１）工程および上記（ｆ−１）工程とを、並行して行ってもよい。

上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程を行った後、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程を行う場合には、上記（ｅ−２）工程および上記（ｃ−２）工程は、それぞれ、下記（ｅ’−２）工程および下記（ｃ’−２）工程とすることが好ましい。
（ｅ’−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。
（ｃ’−２）上記第２の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程。

また、上記（ｃ−２）工程および上記（ｄ−２）工程と、上記（ｅ−２）工程および上記（ｆ−２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ−２）工程は、下記（ｅ’−２）工程とすることが好ましい。
（ｅ’−２）上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。

さらに、上記少なくとも１つの増幅候補領域が３つ以上の増幅候補領域を含み、上記対象領域複数選択工程において３つ以上の対象領域を選択し、かつ、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において上記３つ以上の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成した場合であって、優先順位３位以降の第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記第２のローカルアラインメント工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す。

〈各工程の説明〉
本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法（１）〜（３）について、各工程を説明する。

《優先順位の設定工程》
（設計方法（１）： 優先順位の設定工程Ｓ１００）
図１３において「優先順位の設定」として示す。
本発明の優先順位の設定方法に従って、増幅候補領域の優先順位を設定する。

（設計方法（２）： 優先順位の設定工程Ｓ２００）
図１４において「優先順位の設定」として示す。
本発明の優先順位の設定方法に従って、増幅候補領域の優先順位を設定する。

（設計方法（３）： 優先順位の設定工程Ｓ３００）
図１５および図１６において「優先順位の設定」として示す。
本発明の優先順位の設定方法に従って、増幅候補領域の優先順位を設定する。

《対象領域選択工程》
本明細書において、対象領域選択工程Ｓ１０１（図１３）、対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１（図１４）、ならびに複数対象領域選択工程Ｓ３０１（図１５および図１６）を総称して、単に「対象領域選択工程」という場合がある。

（設計方法（１）： 対象領域選択工程Ｓ１０１）
図１３において「対象領域選択」として示す。
設計方法（１）において、（ａ）対象領域選択工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位の順に対象領域を選択する工程である。

（設計方法（２）： 対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１）
図１４において、「対象領域選択第１」および「対象領域選択第２」として示す。
設計方法（２）において、（ａ_１）対象領域選択第１工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第１の対象領域として選択する工程であり、（ａ_２）対象領域選択第２工程は、優先順位が設定された増幅候補領域のうちまだ選択されていない増幅候補領域から優先順位が最も高い増幅候補領域を第２の対象領域として選択する工程である。
設計方法（２）では、増幅候補領域を優先順位の順に１つずつ選択する。

（設計方法（３）： 対象領域複数選択工程Ｓ３０１）
図１５および図１６において、「対象領域複数選択」として示す。
設計方法（３）およびその変形例において、（ａ−０）対象領域複数選択工程は、優先順位が設定された増幅候補領域から優先順位が高い順に複数の対象領域を選択する工程である。
設計方法（３）およびその変形例では、増幅候補領域を優先順位の順に複数個選択する。好ましくは、優先順位が設定された全ての増幅候補領域を選択する。

《プライマー候補塩基配列作成工程》
本明細書において、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２（図１３）、プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２（図１４）、ならびにプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２（図１５および図１６）を総称して、単に「プライマー候補塩基配列作成」という場合がある。

（設計方法（１）： プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２）
図１３において「プライマー候補塩基配列作成」として示す。
設計方法（１）において、（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程は、対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。

（設計方法（２）： プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２）
図１４において「プライマー候補塩基配列作成第１」および「プライマー候補塩基配列作成第２」として示す。
設計方法（２）において、（ｂ_１）プライマー候補塩基配列作成第１工程は、第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程であり、（ｂ_２）プライマー候補塩基配列作成第２工程は、第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
設計方法（２）では１つの対象領域について、プライマー候補の塩基配列の作成、プライマー候補の選抜、およびプライマーの採用を行い、次の１つの対象領域について、同様の工程を繰り返す。

（設計方法（３）： プライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２）
図１５および図１６において「プライマー候補塩基配列複数作成」として示す。
設計方法（３）およびその変形例において、（ｂ−０）プライマー候補塩基配列複数作成工程は、複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する。
設計方法（３）およびその変形例では、複数の対象領域のすべてについて、プライマー候補の塩基配列を作成し、以降の工程で選抜および採用を繰り返す。

（近傍領域）
対象領域の両端のそれぞれの近傍領域とは、対象領域の５’端から外側の領域、および対象領域の３’端から外側の領域を総称していう。対象領域の内側は近傍領域には含まない。
近傍領域の長さは特に限定されないが、ＰＣＲによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するＤＮＡフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および／またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。ＰＣＲにおいて用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは２０〜５００塩基程度、より好ましくは２０〜３００塩基程度、さらに好ましくは２０〜２００塩基程度、いっそう好ましくは５０〜２００塩基程度である。

（プライマーの設計パラメータ）
また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの長さ、ＧＣ含量（全核酸塩基中のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の合計モル百分率をいう。）、融解温度（２本鎖ＤＮＡの５０％が解離して１本鎖ＤＮＡになる温度をいう。また、Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅに由来し、「Ｔｍ値」という場合もある。単位は「℃」である。）、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。

・プライマーの長さ
プライマーの長さ（ヌクレオチド数）は、特に限定されないが、好ましくは１５ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、より好ましくは２０ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、さらに好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。プライマーの長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。

・プライマーのＧＣ含量
プライマーのＧＣ含量は、特に限定されないが、好ましくは４０モル％〜６０モル％、より好ましくは４５モル％〜５５モル％である。ＧＣ含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。

・プライマーのＴｍ値
プライマーのＴｍ値は、特に限定されないが、好ましくは５０℃〜６５℃の範囲内、より好ましくは５５℃〜６５℃の範囲内である。
プライマーのＴｍ値の差は、プライマーペアおよびプライマーセットにおいて、好ましくは５℃以下、より好ましくは３℃以下とする。
Ｔｍ値は、ＯＬＩＧＯ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）、または、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの数（それぞれ、ｎＡ、ｎＴ、ｎＧおよびｎＣとする）から、下記式によって計算により求めることもできる。
Ｔｍ値（℃）＝２（ｎＡ＋ｎＴ）＋４（ｎＣ＋ｎＧ）
Ｔｍ値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってＴｍ値を算出することができる。

・プライマーの塩基の偏り
プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にＧＣリッチな配列および部分的にＡＴリッチな配列を避けることが望ましい。
また、Ｔおよび／またはＣの連続（ポリピリミジン）、ならびにＡおよび／またはＧの連続（ポリプリン）も避けることが望ましい。

・プライマーの３’末端
さらに、３’末端塩基配列が、ＧＣリッチな配列またはＡＴリッチな配列を避けることが好ましい。３’末端塩基はＧまたはＣが好ましいが、これらに限定はされない。

《特異性チェック工程》
「プライマー候補塩基配列作成」において作成した各プライマー候補の塩基配列の染色体ＤＮＡに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい（図示せず）。
特異性のチェックは、染色体ＤＮＡの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメント・スコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムＤＮＡに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、染色体ＤＮＡの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが１本鎖ＤＮＡであるのに対して、染色体ＤＮＡは２本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。

また、プライマー候補の塩基配列をクエリー配列として、ゲノムＤＮＡ塩基配列データベースに対して相同性検索をしてもよい。相同性検索ツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool：ブラスト）（Altschul, S. A.、外4名、“Basic Local Alignment Search Tool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215巻、ｐ．403-410）およびＦＡＳＴＡ（ファストエー）（Pearson, W. R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1988年、4月、第85巻、ｐ．2444-2448）等が挙げられる。相同性検索を行った結果として、ローカルアラインメントを得ることができる。

スコア、およびローカルアラインメント・スコアの閾値は、いずれも、特に限定されず、プライマー候補の塩基配列の長さ、および／またはＰＣＲ条件等によって、適宜設定することができる。相同性検索ツールを使用する場合には、その相同性検索ツールの既定値を使ってもよい。
例えば、スコアとして、マッチ（相補塩基）＝＋１、ミスマッチ（非相補塩基）＝−１、インデル（挿入および／または欠失）＝−３を採用し、閾値を＋１５に設定すること等が考えられる。

プライマー候補の塩基配列が染色体ＤＮＡ上の想定外の位置の塩基配列と相補性を有し、特異性が低い場合には、その塩基配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った際に、対象領域ではなくアーティファクトを増幅する場合があるため、除外する。

《ローカルアラインメント工程》
本明細書において、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３（図１）、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３（図１４）、ならびに第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３（図１５および図１６）を総称して、単に「ローカルアラインメント工程」という場合がある。

（設計方法（１）： ローカルアラインメント工程Ｓ１０３）
図１３において「ローカルアラインメント」として示す。
設計方法（１）において、（ｃ）ローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。

（設計方法（２）： ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３）
図１４において「ローカルアラインメント第１」および「ローカルアラインメント第２」として示す。
設計方法（２）において、（ｃ_１）ローカルアラインメント第１工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ_２）ローカルアラインメント第２工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。

（設計方法（３）： 第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３）
図１５および図１６において「第１のローカルアラインメント」および「第２のローカルアラインメント」として示す。
設計方法（３）およびその変形例において、（ｃ−１）第１のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位が最も高い第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ−２）第２のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち優先順位２位の第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める工程である。

（ローカルアラインメントの方法）
ローカルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、ローカルアラインメントを行う塩基配列の総数をｘ個として、重複を許して選択した場合は、「_ｘＨ_２＝_ｘ＋１Ｃ_２＝（ｘ＋１）！／２（ｘ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「_ｘＣ_２＝ｘ（ｘ−１）／２」通りである。

ローカルアラインメントは、部分配列に対して行うアラインメントであり、相補性の高い部分を局所的に調べることができる。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の３’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにした。
さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の３’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の３’末端から始まり他方の配列の３’末端で終わるアラインメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。

例えば、以下の表２に示す配列番号１および２の塩基配列について、ローカルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。

配列番号１および２の塩基配列から、表３に示すドット行列（ドットマトリクス）を作成する。具体的には、配列番号１の塩基配列を左から右へ、５’から３’の向きで並べ、配列番号２の塩基配列を下から上へ、５’から３’の向きで並べ、塩基が相補的であるグリッドに「・」を記入して、表３に示すドットマトリクスを得る。

表３に示すドットマトリクスから、以下の表４に示す、部分配列のアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得る（表３の斜線部分参照）。なお、表４中、マッチを「｜」で、ミスマッチを「：」で、それぞれ示す。

この（ペアワイズ）アラインメントには、マッチが９か所あり、ミスマッチが８か所あり、インデル（ギャップ）はない。
したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくローカルアラインメント・スコアは、（＋１）×９＋（−１）×８＋（−１）×０＝＋１となる。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。

《第一段階選抜工程》
本明細書において、第一段階選抜工程Ｓ１０４（図１３）、第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４（図１４）、ならびｎ第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４（図１５および図１６）を総称して、単に「第一段階選抜工程」という場合がある。

（設計方法（１）： 第一段階選抜工程Ｓ１０４）
図１３において「第一段階選抜」として示す。
設計方法（１）において、（ｄ）第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。

（設計方法（２）： 第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４）
図１４において「第一段階選抜第１」および「第一段階選抜第２」として示す。
設計方法（２）において、（ｄ_１）第一段階選抜第１工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ_２）第一段階選抜第２工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。

（設計方法（３）： 第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４）
図１５および図１６において「第１の第一段階選抜」および「第２の第一段階選抜」として示す。
設計方法（３）およびその変形例において、（ｄ−１）第１の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ−２）第２の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。

（第１段階選抜の方法）
ローカルアラインメント・スコアの閾値（「第１の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
一方、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
第１の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第１の閾値を設定してもよい。

ここで、上記「ローカルアラインメント工程」に示した例において、第１の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
上の例では、ローカルアラインメント・スコアは「＋１」であり、第１の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。

なお、本工程は、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３、ローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３、第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３、または第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３においてローカルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。

《グローバルアラインメント工程》
本明細書において、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５（図１３）、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５（図１４）、ならびに第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５（図１５および図１６）を総称して、単に「グローバルアラインメント工程」という場合がある。

（設計方法（１）： グローバルアラインメント工程Ｓ１０５）
図１３において「グローバルアラインメント」として示す。
設計方法（１）において、（ｅ）グローバルアラインメント工程は、上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。

（設計方法（２）： グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５）
図１４において「グローバルアラインメント第１」および「グローバルアラインメント第２」として示す。
設計方法（２）において、（ｅ_１）グローバルアラインメント第１工程は、上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ_２）グローバルアラインメント第２工程は、上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。

（設計方法（３）： 第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５）
図１５および図１６において「第１のグローバルアラインメント」および「第２のグローバルアラインメント」として示す。
設計方法（３）およびその変形例において、（ｅ−１）第１のグローバルアラインメント工程は、上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ−２）第２のグローバルアラインメント工程は、上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める工程である。

（グローバルアラインメントの方法）
グローバルアラインメント・スコアは、「プライマー候補塩基配列作成」で作成したプライマー候補の全部（「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」を先に行った場合において、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であるプライマー候補の組合せがあるときは、その組合せに含まれるプライマー候補の全部。）および既に採用したプライマーの全部（既に採用したプライマーが存在する場合に限る。）からなる群から２つのプライマーを取り出して、３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、求める。

グローバルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、グローバルアラインメントを行う塩基配列の総数をｘ個として、重複を許して選択した場合は、「_ｘＨ_２＝_ｘ＋１Ｃ_２＝（ｘ＋１）！／２（ｘ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「_ｘＣ_２＝ｘ（ｘ−１）／２」通りである。

グローバルアラインメントは、「配列全体」に対して行うアラインメントであり、配列全体の相補性を調べることができる。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。

例えば、以下の表５に示す配列番号１および２の塩基配列について、それぞれの３’末端の３塩基（大文字箇所）についてグローバルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。

スコアが最大となるように、配列番号１の塩基配列の３’末端の３塩基（大文字箇所）および配列番号２の３’末端の３塩基（大文字箇所）の塩基配列についてグローバルアラインメントを行うと、以下の表６に示すアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得ることができる。なお、表６中、ミスマッチを「：」で示す。

この（ペアワイズ）アラインメントには、ミスマッチが３か所あり、マッチおよびインデル（ギャップ）はいずれもない。
したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくグローバルアラインメント・スコアは、（＋１）×０＋（−１）×３＋（−１）×０＝−３となる。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。

《第二段階選抜工程》
本明細書において、第二段階選抜工程Ｓ１０６（図１３）、第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６（図１４）、ならびに第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６（図１５および図１６）を総称して、単に「第二段階選抜工程」という場合がある。

（設計方法（１）： 第二段階選抜工程Ｓ１０６）
図１３において「第二段階選抜」として示す。
設計方法（１）において、（ｆ）第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。

（設計方法（２）： 第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６）
図１４において「第二段階選抜第１」および「第二段階選抜第２」として示す。
設計方法（２）において、（ｆ_１）第二段階選抜第１工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ_２）第二段階選抜第２工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。

（設計方法（３）： 第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６）
図１５および図１６において「第１の第二段階選抜」および「第２の第二段階選抜」として示す。
設計方法（３）およびその変形例において、（ｆ−１）第１の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ−２）第２の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。

（第二段階選抜の方法）
グローバルアラインメント・スコアの閾値（「第２の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
一方、グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
第２の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第２の閾値を設定してもよい。

なお、プライマーの３’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることによって、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアを第２の閾値未満とすることができる。

ここで、上記「グローバルアラインメント工程」に示した例において、第２の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
上の例では、グローバルアラインメント・スコアは「−３」であり、第２の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。

なお、本工程は、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５、グローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５、第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５、または第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５においてグローバルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。

また、計算量を低減させるため、「グローバルアラインメント工程」および「第２段階選抜工程」の両工程を先に実施して、「第２段階選抜工程」を通過したプライマーの塩基配列の組合せに対して、「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」の両工程を実施することが好ましい。特に、対象領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。

これは、「グローバルアラインメント工程」では「予め設定した配列長」という短い長さの塩基配列についてグローバルアラインメントを行うので、３’末端を含むという条件下で塩基配列全体から相補性が高い部分配列を見つけるローカルアラインメント・スコアよりも計算量が少なく、高速に処理できるからである。なお、通常知られているアルゴリズムでは、同じ長さの配列に対するアラインメントであれば、ローカルアラインメントよりもグローバルアラインメントの方が高速であることが知られている。

《増幅配列長チェック工程》
「第１段階選抜工程」および「第２段階選抜工程」においてプライマー・ダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列の組合せに対して、染色体ＤＮＡ上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい（図示せず）。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列の組合せは、対象領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等のＰＣＲ条件によって、適宜設定することができる。例えば、１００〜２００塩基（対）の範囲内、１２０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１６０塩基（対）の範囲内、１６０〜１８０塩基（対）の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。

《プライマー採用工程》
本明細書において、プライマー採用工程Ｓ１０７（図１３）、プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７（図１４）、ならびに第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７（図１５および図１６）を総称して、単に「プライマー採用工程」という場合がある。

（設計方法（１）： プライマー採用工程Ｓ１０７）
図１３において「プライマー採用」として示す。
設計方法（１）において、（ｇ）プライマー採用工程は、上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。

（設計方法（２）： プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７）
図１４において「プライマー採用第１」および「プライマー採用第２」として示す。
設計方法（２）において、（ｇ_１）プライマー採用第１工程は、上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ_２）プライマー採用第２工程は、上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。

（設計方法（３）： 第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７）
図１５および図１６において「第１のプライマー採用」および「第２のプライマー採用」として示す。
設計方法（３）およびその変形例において、（ｇ−１）第１のプライマー採用工程は、上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ−２）第２のプライマー採用工程は、上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。

（プライマー採用の方法）
プライマー採用工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。

例えば、表７に示す配列番号１および２の塩基配列について、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することを考える。

既に記載したように、ローカルアラインメント・スコアは「＋１」であるから、第１の閾値である「＋３」未満であり、また、グローバルアラインメント・スコアは「−３」であるから、第２の閾値である「＋３」未満である。
したがって、配列番号１で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号２で示されるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。

《他の増幅候補領域のプライマー設計》
１つの増幅候補領域に対してプライマーを採用した後、さらに次の優先順位の増幅候補領域に対してプライマーを設計してもよい。
設計方法（１）においては、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、次の優先順位の増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていれば、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３から行う。次の優先順位の増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていなければ、対象領域選択工程Ｓ１０１において次の優先順位の増幅候補領域が選択されていなかったので、対象領域選択工程Ｓ１０１において次の優先順位の増幅候補領域を選択し、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、その増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列を作成した後、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３以降を行う。
設計方法（２）においては、対象領域選択第２工程Ｓ２１１から繰り返す。
設計方法（３）およびその変形例において、既に対象領域複数選択工程Ｓ３０１において選択した増幅候補領域に対するプライマー候補の塩基配列がプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２において作成されているため、第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３から繰り返す。

《プライマー等の設計における特徴点》
増幅候補領域に優先順位を付けた後のプライマー等の設計における特徴点は、概していえば、複数の特定の対象領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、対象領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得ることにある。
プライマーの塩基配列の相補性の確認における特徴点は、ローカルアラインメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマーの塩基配列の端部に対して、グローバルアラインメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点にある。

以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［比較例１／実施例１／実施例２］
〈増幅候補領域の選択〉
増幅候補領域として、ヒト１３番染色体上の領域からＳＮＶ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｎｔ；一塩基変異）を含む１７個所の領域Ｘ０１〜Ｘ１７を選択した。
以下の表８に、増幅候補領域の存在する染色体およびＳＮＶ座標と、比較例１、実施例１、および実施例２において付けた各増幅候補領域の優先順位を示す。ここで、ＳＮＶ座標はＧＲＣｈ３７．ｐ１３（Genome Resource Consortium, human genome assembly data, Release 37, Patch 13; GenBank Accession no. CM000675.1）に基づく座標である。なお、各増幅候補領域の優先順位の付け方については、後述する。

〈比較例１〉
《優先順位の設定》
Ｘ０１〜Ｘ１７の各増幅候補領域に対して、ＳＮＶ座標が小さい順に、それぞれ、優先順位１位〜１７位を付けた。
表８の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。

《プライマーおよびプライマーペアの設計》
優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
その結果、優先順位１番目から１０番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた。
表９の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
また、図１７に、染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域の物理的配置および各増幅候補領域の優先順位を示す。ただし、図中の各領域間の距離は実際の染色体ＤＮＡ上の距離を反映していない。

〈実施例１〉
《優先順位の設定》
Ｘ０１〜Ｘ１７の増幅候補領域に対して、以下のとおり優先順位を付けた。
表８の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
ＳＮＶ座標が最小のＸ０１（ＳＮＶ座標：２０，７６３，６４２）に優先順位１位を付けた。
ＳＮＶ座標が最大のＸ１７（ＳＮＶ座標：１１１，０９８，２２６）に優先順位２位を付けた。
Ｘ０１とＸ１７の中点（座標：６５，９３０，９３４）に最も近いＸ１２（ＳＮＶ座標：６７，８００，９３５）に優先順位３位を付けた。
Ｘ０１とＸ１２の中点（座標：４４，２８２，２８８．５）に最も近いＸ０９（ＳＮＶ座標：４６，９４６，１５７）に優先順位４位を付けた。
Ｘ１２とＸ１７の中点（座標：８９，４４９，５８０．５）に最も近いＸ１３（ＳＮＶ座標：９５，８５８，９７８）に優先順位５位を付けた。
Ｘ０９とＸ１２の中点（座標：５７，３７３，５４６）に最も近いＸ１１（ＳＮＶ座標：５３，６０８，４７９）に優先順位６位を付けた。
Ｘ１３とＸ１７の中点（座標：１０３，４７８，６０２）に最も近いＸ１６（ＳＮＶ座標：１０３，３９７，９３７）に優先順位７位を付けた。
Ｘ０９とＸ１１の中点（座標：５０，２７７，３１８）に最も近いＸ１０（ＳＮＶ座標：５２，５４４，８０５）に優先順位８位を付けた。
Ｘ１３とＸ１６の中点（座標：９９，６２８，４５７．５）に最も近いＸ１４（ＳＮＶ座標：１０２，３６６，８２５）に優先順位９位を付けた。
Ｘ１４とＸ１６の中点（座標：１０２，８８２，３８１）に最も近いＸ１５（ＳＮＶ座標：１０３，３９６，７１６）に優先順位１０位を付けた。
Ｘ０１とＸ０９の中点（座標：３３，８５４，８９９．５）に最も近いＸ０５（ＳＮＶ座標：３６，３８５，０３１）に優先順位１１位を付けた。
Ｘ０１とＸ０５の中点（座標：２８，５７４，３３６．５）に最も近いＸ０４（ＳＮＶ座標：２７，８４５，６５４）に優先順位１２位を付けた。
Ｘ０５とＸ０９の中点（座標：４１，６６５，５９４）に最も近いＸ０８（ＳＮＶ座標：３６，８８６，４６９）に優先順位１３位を付けた。
Ｘ０１とＸ０４の中点（座標：４４，２８２，２８８．５）に最も近いＸ０２（ＳＮＶ座標：２４，７９８，１２０）に優先順位１４位を付けた。
Ｘ０５とＸ０８の中点（座標：３６，６３５，７５０）に最も近いＸ０６（ＳＮＶ座標：３６，７４３，１７７）に優先順位１５位を付けた。
Ｘ０２とＸ０４の中点（座標：２６，３２１，８８７）に最も近いＸ０３（ＳＮＶ座標：２５，２６５，１０３）に優先順位１６位を付けた。
Ｘ０６とＸ０８の中点（座標：３６，８１４，８２３）に最も近いＸ０７（ＳＮＶ座標：３６，８０１，４１５）に優先順位１７位を付けた。

《プライマーおよびプライマーセットの設計》
優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
その結果、優先順位１番目から１０番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた。
表１０の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
また、図１８に、染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域の物理的配置および各増幅候補領域の優先順位を示す。ただし、図中の各領域間の距離は実際の染色体ＤＮＡ上の距離を反映していない。

〈実施例２〉
《優先順位の設定》
Ｘ０１〜Ｘ１７の増幅候補領域に対して、以下のとおり優先順位を付けた。
表１０の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。
Ｘ０１（ＳＮＶ座標：２０，７６３，６４２）に優先順位１位を付けた。
Ｘ０１のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした２５，７６３，６４２以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０４（ＳＮＶ座標：２７，８４５，６５４）に優先順位２位を付けた。
Ｘ０４のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした３２，８４５，６５４以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０５（ＳＮＶ座標：３６，３８５，０３１）に優先順位３位を付けた。
Ｘ０５のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした４１，３８５，０３１以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０９（ＳＮＶ座標：４６，９４６，１５７）に優先順位４位を付けた。
Ｘ０９のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした５１，９４６，１５７以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１０（ＳＮＶ座標：５２，５４４，８０５）に優先順位５位を付けた。
Ｘ１０のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした５７，５４４，８０５以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１２（ＳＮＶ座標：６７，８００，９３５）に優先順位６位を付けた。
Ｘ１２のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした７２，８００，９３５以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１３（ＳＮＶ座標：９５，８５８，９７８）に優先順位７位を付けた。
Ｘ１３のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした１００，８５８，９７８以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１４（ＳＮＶ座標：１０２，３６６，８２５）に優先順位８位を付けた。
Ｘ１４のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした１０７，３６６，８２５以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１７（ＳＮＶ座標：１１１，０９８，２２６）に優先順位９位を付けた。
Ｘ１７のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした１１６，０９８，２２６以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域が存在しないため、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０２（ＳＮＶ座標：２４，７９８，１２０）に優先順位１０位を付けた。
Ｘ０２のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした２９，７９８，１２０以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０６（ＳＮＶ座標：３６，７４３，１７７）に優先順位１１位を付けた。
Ｘ０６のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした４１，７４３，１７７以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１１（ＳＮＶ座標：５３，６０８，４７９）に優先順位１２位を付けた。
Ｘ１１のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした５８，６０８，４７９以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１５（ＳＮＶ座標：１０３，３９６，７１６）に優先順位１３位を付けた。
Ｘ１５のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした１０８，３９６，７１６以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域が存在しないため、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０３（ＳＮＶ座標：２５，２６５，１０３）に優先順位１４位を付けた。
Ｘ０３のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした３０，２６５，１０３以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０７（ＳＮＶ座標：３６，８０１，４１５）に優先順位１５位を付けた。
Ｘ０７のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした４１，８０１，４１５以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ１６（ＳＮＶ座標：１０３，３９７，９３７）に優先順位１６位を付けた。
Ｘ１６のＳＮＶ座標に５，０００，０００をプラスした１０８，３９７，９３７以上の座標を持ち、かつ、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域が存在しないため、まだ優先順位がつけられていない増幅候補領域のうち最も小さい座標値を持つＸ０８（ＳＮＶ座標：３６，８８６，４６９）に優先順位１７位を付けた。

《プライマーおよびプライマーセットの設計》
優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
その結果、優先順位１番目から１０番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた。
表１１の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。
また、図１９に、染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域の物理的配置および各増幅候補領域の優先順位を示す。ただし、図中の各領域間の距離は実際の染色体ＤＮＡ上の距離を反映していない。

〈実施例１、２の効果〉
比較例１では、１７個所の増幅候補領域のすべてに対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーおよびプライマーペアを設計することを目的としたが、プライマーの特異性およびプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、１０箇所の増幅候補領域に対してプライマーおよびプライマーペアを設計できるにとどまった。
実施例１および実施例２でも、１７個所の増幅候補領域のすべてに対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーおよびプライマーペアを設計することを目的としたが、プライマーの特異性およびプライマー・ダイマー形成性などを検討した結果、１０箇所の増幅候補領域に対してプライマーおよびプライマーペアを設計できるにとどまった。
鋳型ＤＮＡが増幅候補領域Ｘ０６〜Ｘ０８を欠損している場合には、これらの領域を増幅することができないことから、比較例１では、ＳＮＶの塩基配列情報を得られる領域数が、プライマーおよびプライマーセットを設計することができた１０箇所から７箇所へと、さらに減ってしまうのに対し、実施例１および実施例２では、Ｘ０６〜Ｘ０８が欠損したことによる影響を受けない。
その結果、比較例１では、Ｘ０６〜Ｘ０８が欠損していることによって、解析に必要な領域数を確保できない可能性が生じるに対し、実施例１および実施例２では、Ｘ０６〜Ｘ０８が欠損していることによっては、解析に必要な領域数を確保できない可能性が生じない。

［比較例２／実施例３］
増幅候補領域として、ヒト１３番染色体上の領域からＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；一塩基多型）を含む９９個所の領域Ｙ０１〜Ｙ９９を選択した。
以下の表１２、表１３、および表１４に、増幅候補領域の存在する染色体、ＳＮＰ座標、変異頻度（Ｖ．Ｆ．；Ｖａｒｉａｎｔ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、および変異頻度差（ΔＶ．Ｆ：変異頻度０．５との差の絶対値）と、比較例２および実施例３において付けた各増幅候補領域の優先順位を示す。ここで、ＳＮＰ座標はＧＲＣｈ３７．ｐ１３（Genome Resource Consortium, human genome assembly data, Release 37, Patch 13; GenBank Accession no. CM000675.1）に基づく座標である。なお、各増幅候補領域の優先順位の付け方については、後述する。

〈比較例２〉
《優先順位の設定》
Ｙ０１〜Ｙ９９の各増幅候補領域に対して、ＳＮＰ座標が小さい順に、それぞれ、優先順位１位〜９９位を付けた。
表１２、表１３、および表１４の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。

《プライマーおよびプライマーペアの設計》
優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
その結果、優先順位１番目から６０番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた。
設計したプライマーおよびプライマーペアのうち、１０対のプライマーペアについて、表１４の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。

〈実施例３〉
《優先順位の設定》
Ｙ０１〜Ｙ９９の各増幅候補領域に対して、各ＳＮＰのΔＶ．Ｆ．が小さい順、すなわち、変異頻度Ｖ．Ｆ．が０．５に近い順に、それぞれ、優先順位１位〜９９位を付けた。
表１２、表１３、および表１４の「優先順位」欄に各増幅候補領域の優先順位を示す。

《プライマーおよびプライマーペアの設計》
優先順位が高い増幅候補領域から順に、その増幅候補領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅するためのプライマーおよびプライマーペアを設計した。
その結果、優先順位１番目から６０番目までの増幅候補領域に対して、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた。
設計したプライマーおよびプライマーペアのうち、１０対のプライマーペアについて、表１６の「プライマー」欄に各プライマーペアを構成するプライマーの名称、塩基配列および配列番号を示す。

〈実施例３の効果〉
妊婦（母親）口腔から採取した妊婦（母親）由来の細胞と、妊婦（母親）の血液から採取した胎児（子）由来の有核赤血球細胞を用いて、表１２〜１４に示す第１３番染色体上の９９箇所のＳＮＰ座位のうち、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計することができた６０箇所のＳＮＰ座位を対象にジェノタイピングを行い、母子判定を行い、その確度を求めた。
比較例２の方法に従ってプライマーおよびプライマーセットを設計した場合、および実施例３の方法に従ってプライマーおよびプライマーセットを設計した場合のいずれも、母子関係が肯定されたが、比較例２の場合の母子判定の確度は約１３．２％であり、誤差が大きく、精度が悪かったが、実施例３の場合の母子判定の確度は約４．５％であり、誤差が小さく、精度が良かった。

なお、母子判定は、母親由来が確実な細胞と子由来が疑われる単離した細胞を用いて、変異頻度ｐ_１，ｐ_２，ｐ_３，・・・，ｐ_ｎであるｎ個のＳＮＰ座位を用いてＳＮＰ解析を行った場合の、ジェノタイプが異なるＳＮＰ座位の数をＭ、他人同士でのジェノタイプが異なるＳＮＰ座位の平均的な数をＦ、および母子でのジェノタイプが異なるＳＮＰ座位の平均的な数をＧとして、
｜Ｍ−Ｆ｜＞｜Ｍ−Ｇ｜ であれば、子由来が疑われる単離した細胞は子に由来すると判定し、
｜Ｍ−Ｆ｜＜｜Ｍ−Ｇ｜ であれば、子由来が疑われる単離した細胞はコンタミした他人に由来すると判定する。

ここで、ＦおよびＧは、下記式により与えられる。ただし、アレル・ドロップアウトおよびアレル・ドロップインの影響を無視する。

ここで、変異頻度ｐ（０≦ｐ≦１）であるＳＮＰ座位について、他人同士で異なるジェノタイプを有する確率ｆ（ｐ）および母子で異なるジェノタイプを有する確率ｇ（ｐ）は下記式で表されるものとする。ただし、ｑ＝１−ｐである。

１１ 演算手段（ＣＰＵ）
１２ 記憶手段（メモリ）
１３ 補助記憶手段（ストレージ）
１４ 入力手段（キーボード）
１５ 補助入力手段（マウス）
１６ 表示手段（モニタ）
１７ 出力手段（プリンタ）

Claims (4)

1. 同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
   前記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
   同一染色体ＤＮＡ上のｎ箇所の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
   演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；
   演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第２の優先順位設定工程；ならびに、
   演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｉ位であり座標値がｒｉであり識別名がＲｉである増幅候補領域および優先順位がｊ位であり座標値がｒｊであり識別名がＲｊである増幅候補領域であって、前記増幅候補領域Ｒｉおよび前記増幅候補領域Ｒｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊを検索し、次いで、前記増幅候補領域Ｒｉおよび前記増幅候補領域Ｒｊの中点の座標値ｒｉ−ｊをｒｉ−ｊ＝（ｒｉ＋ｒｊ）／２により算出し、さらに、前記中点の座標値ｒｉ−ｊに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
   を含み、
   前記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝３からｎまで繰り返す。
   ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ−１、１≦ｊ≦ｋ−１、かつ、ｉ≠ｊであり、ｒｉおよびｒｊはｒｍｉｎ≦ｒｉ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｊ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｉ≠ｒｊであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、前記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
2. 同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
   前記優先順位は、以下の工程を含む同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
   同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
   演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；
   演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位２位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第２の優先順位設定工程；ならびに、
   演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｉ位であり座標値がｒｉであり識別名がＲｉである増幅候補領域および優先順位がｊ位であり座標値がｒｊであり識別名がＲｊである増幅候補領域であって、前記増幅候補領域Ｒｉおよび前記増幅候補領域Ｒｊの間には、優先順位が付けられた増幅候補領域は存在しないが、少なくとも１箇所のまだ優先順位が付けられていない増幅候補領域が存在するという条件を満たす増幅候補領域Ｒｉおよび増幅候補領域Ｒｊを検索し、次いで、前記増幅候補領域Ｒｉおよび前記増幅候補領域Ｒｊの中点の座標値ｒｉ−ｊをｒｉ−ｊ＝（ｒｉ＋ｒｊ）／２により算出し、さらに、前記中点の座標値ｒｉ−ｊに最も近い座標値を持つ増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位ｋ位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
   前記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝３からｎまで繰り返す。
   ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは３≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ−１、１≦ｊ≦ｋ−１、かつ、ｉ≠ｊであり、ｒｉおよびｒｊはｒｍｉｎ≦ｒｉ≦ｒｍａｘ、ｒｍｉｎ≦ｒｊ≦ｒｍａｘ、かつ、ｒｉ≠ｒｊであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、前記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
3. 同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
   前記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
   同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
   演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最小の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；ならびに、
   演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｋ−１位である増幅候補領域の識別名Ｒｋ−１および座標値ｒｋ−１を検索し、Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔを算出し、
   Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ−１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がｒｋ−１＋ｔ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
   Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ−１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
   Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ＞ｒｍａｘであるとき、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
   前記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝２からｎまで繰り返す。
   ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、ｒｋ−１≠ｒｋであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、前記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。
4. 同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付け、前記優先順位に従って前記増幅候補領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計する、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法であって、
   前記優先順位は、以下の工程を備える同一染色体ＤＮＡ上の増幅候補領域に対して優先順位を付ける方法によって付けられる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法：
   同一染色体ＤＮＡ上のｎ個の増幅候補領域の識別情報および座標情報が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程；
   演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報および座標情報から、座標値が最大の増幅候補領域を検索し、その増幅候補領域に優先順位１位の優先順位情報を付け、記憶手段に記憶する、第１の優先順位設定工程；ならびに、
   演算手段が、記憶手段に記憶された前記増幅候補領域の識別情報、座標情報および優先順位情報から、優先順位がｋ−１位である増幅候補領域の識別名Ｒｋ−１および座標値ｒｋ−１を検索して、Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔを算出し、
   Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ−１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在すれば、座標値がｒｋ−１＋ｔ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
   Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ≦ｒｍａｘであるとき、ｒｋ−１＋ｔ以上ｒｍａｘ以下の座標値を持ち、優先順位情報が付けられていない増幅候補領域を検索し、その条件を満たす増幅候補領域が存在しなければ、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位情報が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶し、
   Ｔ＝ｒｋ−１＋ｔ＞ｒｍａｘであるとき、座標値がｒｍｉｎ以上で最も小さい座標値を持つ、まだ優先順位が付けられていない増幅候補領域に優先順位ｋ位を付け、記憶手段に記憶する、第ｋの優先順位設定工程；
   前記第ｋの優先順位設定工程を、ｋ＝２からｎまで繰り返す。
   ただし、ｎは３≦ｎを満たす整数であり、ｋは２≦ｋ≦ｎを満たす整数であり、ｔはｔ＞０を満たす実数であり、ｒｋ−１≠ｒｋであり、ｒｍｉｎおよびｒｍａｘは、それぞれ、前記ｎ個の増幅候補領域の座標値の最小値および最大値である。