WO2018066317A1

WO2018066317A1 - 必要なローカス数を決定する方法および必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法

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Publication number: WO2018066317A1
Application number: PCT/JP2017/032699
Authority: WO
Inventors: 尭之辻本
Original assignee: 富士フイルム株式会社
Priority date: 2016-10-05
Filing date: 2017-09-11
Publication date: 2018-04-12
Also published as: EP3524687A1; JPWO2018066317A1; EP3524687A4; US20190221285A1

Abstract

必要なローカス数を決定する方法および必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法が提供される。

Description

必要なローカス数を決定する方法および必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法

　本発明は、必要なローカス数を決定する方法および必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法に関する。

　近年発達してきたＤＮＡシーケンサ等により遺伝子解析が手軽に行えるようになっている。しかし、ゲノムの総塩基長は一般に膨大であり、一方でシーケンサのリード能力には制約がある。そこで、必要な特定の遺伝子領域のみを増幅し、その塩基配列に限定してリードを行うことで、効率的かつ精度よく遺伝子解析を行う技術としてＰＣＲ法が普及している。特に、ある１つのＰＣＲ反応系に複数種類のプライマーを同時に供給することで、複数の遺伝子領域を選択的に増幅する手法をマルチプレックスＰＣＲと称する。

　母体血中を循環する胎児有核赤血球細胞は、母体血中の細胞１０^６～１０^７個あたり１個程度しか含まれない希少な細胞であり、胎児有核赤血球細胞が疑われる有核赤血球細胞を複数個採取した場合、それらのすべてが胎児由来有核赤血球細胞である確率は極めて低い。

　従来、単一の有核赤血球細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＷＧＡ（全ゲノム増幅）を用いてゲノム全領域を増幅後に、マルチプレックスＰＣＲやハイブリダイズによって関心ローカスをエンリッチメントすることが一般的であった。

　しかし、ＷＧＡには、増幅バイアスが大きいため、染色体数の定量が困難になってしまうという問題があるため、最近では、単一の有核赤血球細胞から抽出したゲノムＤＮＡをエンリッチメントすることなく、マルチプレックスＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして用いて、複数のローカスをＰＣＲ増幅し、次世代シークエンサーを用いて塩基配列情報を取得し、染色体数定量、またはジェノタイピング等を行っている。

　その際、増幅対象のローカス数が増えるほど、１つのローカスが全体の性能に与える影響が小さくなり、精度などの目標性能を達成しやすくなる。
　そのため、増幅対象のローカス数は多いことが好ましいが、一方で、増幅対象のローカス数が増えるほど、すべての増幅対象のローカスに対してプライマーを設計することが困難になるうえ、プライマー・ダイマーを形成しやすくなることにより、ＰＣＲ増幅に失敗する可能性も高くなる。

　そのため、単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにより複数のローカスをＰＣＲ増幅して塩基配列情報を取得し、染色体数を定量する方法において、目標性能を達成するために必要なローカス数を決定する方法が求められている。

　そこで、本発明は、単一細胞からの染色体数定量のために必要なローカス数を決定する方法を提供することを課題とする。
　また、本発明は、妊婦から単離した胎児由来が疑われる単一細胞が胎児由来であるか、または妊婦である母親由来であるかを、ＳＮＰｓジェノタイピングを用いて判定する際に必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法を提供することを課題とする。

　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、実験結果と、目標性能とを入力し、これらを演算処理して必要なローカス数または必要なＳＮＰｓ座位数を決定することにより、必要なローカス数を決定する方法または必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法を提供することができることを知得し、本発明を完成させた。

　すなわち、本発明は、以下の［１］～［９］である。
　［１］　単一細胞からの染色体数定量のために必要なローカス数を決定する方法であって、
　複数回の反復試行により取得された実験結果である、対象染色体上のローカス数ｎおよび対象染色体の配列リード数の変動係数ｘが入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される実験結果入力工程と、
　目標性能である、対象染色体の配列リード数の変動係数ｙが入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される目標性能入力工程と、
　演算手段が、記憶手段から、ローカス数ｎ、変動係数ｘ、および変動係数ｙを読み出し、実験結果であるローカス数ｎおよび変動係数ｘならびに目標性能である変動係数ｙから、変動係数ｘがｙ以下となるために必要なローカス数Ｎを算出し、記憶手段に記憶する、必要ローカス数決定工程と、
　演算手段が、記憶手段から、染色体数定量のために必要なローカス数Ｎを読み出し、表示手段に表示する、結果表示工程と
を含む、必要なローカス数を決定する方法。
　［２］　上記実験結果入力工程において、上記対象染色体の配列リード数の変動係数ｘに代えて、上記対象染色体上のローカスあたりの配列リード数の変動係数ｘ’が入力され、記憶手段に記憶された場合において、
　上記実験結果入力工程の後、かつ、上記必要ローカス数決定工程の前に、さらに、
　演算手段が、記憶手段から、上記対象染色体上のローカス数ｎおよび上記対象染色体上のローカスあたりの配列リード数の変動係数ｘ’を読み出し、下記式
　ｘ＝ｘ’／ＳＱＲＴ（ｎ）
によって、対象染色体の配列リード数の変動係数ｘを算出し、記憶手段に記憶する、実験結果換算工程を含む、上記［１］に記載の方法。
　ただし、ＳＱＲＴ（ｎ）は、ｎの平方根を表す。
　［３］　上記目標性能入力工程において、変動係数ｙに代えて、感度Ｓｅ_Ｔ、特異度Ｓｐ_Ｔ、陽性適中率ＰＰＶ_Ｔ、または陰性適中率ＮＰＶ_Ｔが入力され、記憶手段に記憶された場合において、
　上記目標性能入力工程の後、かつ、上記必要ローカス数決定工程の前に、さらに、
　演算手段が、記憶手段から、感度Ｓｅ_Ｔ、特異度Ｓｐ_Ｔ、陽性適中率ＰＰＶ_Ｔ、または陰性適中率ＮＰＶ_Ｔを読み出し、目標とする、対象染色体の配列リード数の変動係数ｙに換算し、記憶手段に記憶する、目標性能換算工程
を含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
　［４］　上記目標性能換算工程において、
　感度Ｓｅ_Ｔが読み出された場合、正規分布に従う、染色体異数性がある細胞群を仮定すると、この細胞群において染色体異数性ありと判定される細胞の割合が感度であるから、これに目標とする感度Ｓｅ_Ｔを代入して、そのときの変動係数を目標とする変動係数ｙとする、
　特異度Ｓｐ_Ｔが読み出された場合、正規分布に従う、染色体異数性がない細胞群を仮定すると、この細胞群において染色体異数性なしと判定される細胞の割合が特異度であるから、これに目標とする特異度Ｓｐ_Ｔを代入して、そのときの変動係数を目標とする変動係数ｙとする、
　陽性適中率ＰＰＶ_Ｔが読み出された場合、予め与えられた有病率および下記式１を用いて、陽性適中率を感度および特異度に変換し、さらに、上記感度Ｓｅ_Ｔが読み出された場合および上記特異度Ｓｐ_Ｔが読み出された場合に従って、感度および特異度を、目標とする変動係数ｙに換算する、または、
　陰性適中率ＮＰＶ_Ｔが読み出された場合、予め与えられた有病率および下記式２を用いて、陰性適中率を特異度および感度に変換し、さらに、上記感度Ｓｅ_Ｔが読み出された場合および上記特異度Ｓｐ_Ｔが読み出された場合に従って、特異度および感度を、目標とする変動係数ｙに換算する、
上記［３］に記載の方法。
　式１：　陽性適中率＝感度×有病率／（感度×有病率＋（１－有病率）（１－特異度））
　式２：　陰性適中率＝特異度×（１－有病率）／（特異度×（１－有病率）＋有病率×（１－感度））
　［５］　上記必要ローカス数決定工程において、演算手段が、記憶手段から、ローカス数ｎ、変動係数ｘ、および変動係数ｙを読み出し、下記式
　Ｎ＝ｆ（ｎ，ｘ，ｙ）＝ｃｅｉｌｉｎｇ（ｚ）
　ｚ＝ｋ×ｎ×（ｘ／ｙ）^２
によって、必要なローカス数Ｎを算出する、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
　ただし、ｃｅｉｌｉｎｇ（ｚ）は実数ｚに対してｚ以上の最小の整数を表し、ｋは予め定められた１．０以上１．５以下の係数である。
　［６］　ｚ＝ｎ×（ｘ／ｙ）^２
である、上記［５］に記載の方法。
　［７］　妊婦から単離した胎児由来が疑われる単一細胞が胎児由来であるか、または妊婦である母親由来であるかを、ＳＮＰｓジェノタイピングを用いて判定する際に必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法であって、
　ｍを２以上の整数として、ｍ個のＳＮＰｓ座位を解析する先行実験により得られた、ｍ個のＳＮＰｓの平均の変異頻度νおよびアレルドロップアウト率Θ％が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される実験結果入力工程と、
　目標精度Ψ％が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される目標性能入力工程と、
　演算手段が記憶手段から、ＳＮＰｓ座位の個数ｍ、変異頻度ν、アレルドロップアウト率Θ％、および目標精度Ψ％を読み出し、
　アレルドロップアウト率Θ％である場合の、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプがホモ－ヘテロで不一致となるＳＮＰｓ座位の数がｍ個中０個である確率τを求め、
　アレルドロップアウト率Θ％である場合の、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプがホモ－ヘテロで不一致となるＳＮＰｓ座位の数がｍ個中０個である確率υ＝１を求め、
　Φ＝１００×（υ－τ）を計算し、
　ｍを１ずつ増加して行き、Φ≧Ψとなる最小の整数ｍを算出し、必要なＳＮＰｓ座位数Ｍとして記憶手段に記憶する、必要ＳＮＰｓ座位数決定工程と、
　演算手段が、記憶手段から、妊婦から単離した胎児由来が疑われる単一細胞が胎児由来であるか、または妊婦である母親由来であるかを、ＳＮＰｓジェノタイピングを用いて判定する際に必要なＳＮＰｓ座位数Ｍを読み出し、表示手段に表示する、結果表示工程と
を含む、必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法。
　［８］　上記必要ＳＮＰｓ座位数決定工程において、演算手段が記憶手段から変異頻度ν、アレルドロップアウト率Θ％、および目標精度Ψ％を読み出し、下記式
　Ｍ＝ｈ（ν，θ，ψ）＝ｃｅｉｌｉｎｇ（χ）
　χ＝κｌｏｇ（１－ψ）／ｌｏｇ（１－ξ）
　ξ＝ν（１－ν）（１－θ）
　ψ＝Ψ／１００
　θ＝Θ／１００
によって、必要なＳＮＰｓ座位数Ｍを算出する、上記［７］に記載の方法。
　ただし、ｃｅｉｌｉｎｇ（χ）は実数χに対してχ以上の最小の整数を表し、κは予め定められた１．０以上１．５以下の係数である。
　［９］　χ＝ｌｏｇ（１－ψ）／ｌｏｇ（１－ξ）
である、上記［８］に記載の方法。

　本発明によれば、単一細胞からの染色体数定量のために必要なローカス数を決定する方法を提供することができる。より具体的には、単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにより複数のローカスをＰＣＲ増幅して塩基配列情報を取得し、染色体数を定量する方法において、目標性能を達成するために必要なローカス数を決定する方法を提供することができる。
　また、本発明によれば、妊婦から単離した胎児由来が疑われる単一細胞が胎児由来であるか、または妊婦である母親由来であるかを、ＳＮＰｓジェノタイピングを用いて判定する際に必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法を提供することができる。
　さらに、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーが減少されることにより、コストの削減、およびプライマー設計の容易化を図ることができる。

図１は、本発明における単一細胞からの染色体数定量のために必要なローカス数を決定する方法において用いる必要なローカス数を決定する装置の構成を表す概念図である。図２は、本発明における単一細胞からの染色体数定量のために必要なローカス数を決定する方法を説明するフロー図である。図３は、感度、特異度、陽性適中率、および陰性適中率を説明する図である。図４は、本発明における妊婦から単離した胎児由来が疑われる単一細胞が胎児由来であるか、または妊婦である母親由来であるかを、ＳＮＰｓジェノタイピングを用いて判定する際に必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法を説明するフロー図である。図５は、真のジェノタイプがヘテロである場合に、アレルドロップアウトによって、みかけのジェノタイプがヘテロおよびホモとなることを説明する図である。図６は、増幅対象のローカスをＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第１の態様を説明する図である。図７は、増幅対象のローカスをＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第２の態様を説明する図である。図８は、増幅対象のローカス領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第３の態様を説明する図である。図９は、実施例２において、ＡＤＯ率が０％である場合に、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプを比較して得られた確率分布を表すグラフである。図１０は、実施例２において、ＡＤＯ率が０％である場合に、母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプを比較して得られた確率分布を表すグラフである。図１１は、実施例２において、ＡＤＯ率が５０％である場合に、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプを比較して得られた確率分布を表すグラフである。図１２は、実施例２において、ＡＤＯ率が５０％である場合に、母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプを比較して得られた確率分布を表すグラフである。図１３は、実施例２において、ＡＤＯ率が５０％である場合に、母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプまたは胎児細胞のジェノタイプが、２０個中Ｘ個のＳＮＰｓ座位で、ホモ－ヘテロで不一致となる確率を表すグラフである。母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプの比較について、２０個中０個のＳＮＰｓ座位がホモ－ヘテロで不一致となる確率は１であり、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプの比較について、２０個中０個のＳＮＰｓ座位がホモ－ヘテロで不一致となる確率は約０．０７である。したがって、母子判別の精度は約９３％である。図１４は、実施例２において、ＡＤＯ率が５０％である場合に、母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプまたは胎児細胞のジェノタイプが、３５個中Ｘ個のＳＮＰｓ座位で、ホモ－ヘテロで不一致となる確率を表すグラフである。母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプの比較について、３５個中０個のＳＮＰｓ座位がホモ－ヘテロで不一致となる確率は１であり、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプの比較について、３５個中０個のＳＮＰｓ座位がホモ－ヘテロで不一致となる確率は０．０１以下である。したがって、母子判別の精度は９９％以上である。

　本発明において、範囲を特定できる数値等について「～」を用いてその範囲を表した場合は、その範囲には「～」の左右の数値等を含む。例えば、数値ａおよび数値ｂ（ただし、ａ≠ｂとする。）について「ａ～ｂ」と表した場合は、その範囲にはａおよびｂを含む。また、例えば、ｋ（ただし、ｋはｋ≧３を満たす整数とする。）個の元からなる順列ａ_１，ａ_２，・・・，ａ_ｋにについて「ａ_ｉ～ａ_ｊ」（ただし、ｉおよびｊは、１≦ｉ≦ｋ、１≦ｊ≦ｋ、かつ、ｉ≠ｊを満たす整数とする。）と表した場合は、その範囲にはａ_ｉおよびａ_ｊを含む。

　本発明において、以下の略語はそれぞれ以下の意味を表す。
　ＰＣＲ　：　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼ連鎖反応）
　ＤＮＡ　：　Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（デオキシリボ核酸）
　ＳＮＰｓ　：　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（一塩基多型）
　ＣＶ　：　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ（変動係数）

　また、本発明においては、０^０＝１と定義する。

　また、感度、特異度、陽性適中率および陰性適中率は以下の意味である。
　感度　疾患あり（有病）のうち検査陽性となる割合をいう。図３に示すａ／（ａ＋ｃ）である。
　特異度　疾患なしのうち検査陰性となる割合をいう。図３に示すｄ／（ｂ＋ｄ）である。
　陽性適中率　検査陽性のうち疾患あり（有病）の割合をいう。図３に示すａ／（ａ＋ｂ）である。また、感度および有病率が与えられれば、陽性適中率＝感度×有病率／（感度×有病率＋（１－有病率）（１－特異度））として求めることもできる。
　陰性適中率　検査陰性のうち疾患なしの割合をいう。図３に示すｄ／（ｃ＋ｄ）である。また、特異度および有病率が与えられれば、陰性適中率＝特異度×（１－有病率）／（特異度×（１－有病率）＋有病率×（１－感度））として求めることもできる。

［必要なローカス数を決定する方法］
　本発明の「必要なローカス数を決定する方法」は、以下の工程を備える、単一細胞からの染色体数定量のために必要なローカス数を決定する方法である。図１および図２を適宜参照しながら説明する。

〈実験結果入力工程Ｓ１１〉
　複数回の反復試行により取得された実験結果である、対象染色体上のローカス数ｎおよび対象染色体の配列リード数の変動係数ｘが入力手段（キーボード）１４を介して入力され、記憶手段（メモリ）１２に記憶される工程である（図２のＳ１１）。
　なお、本工程では、ハードウェアに対する入力手段として、入力補助手段１５を用いることも可能である。

《対象染色体》
　対象染色体は、染色体数を定量しようとする染色体である。対象染色体は、常染色体および性染色体のいずれであってもよいが、例えば、２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体などが挙げられる。
　２１番染色体の定量は、例えば、２１番染色体のトリソミーを検出するために行われる。２１番染色体のトリソミーが原因となる疾患としては、ダウン症候群が挙げられる。
　１８番染色体の定量は、例えば、１８番染色体のトリソミーを検出するために行われる。１８番染色体のトリソミーが原因となる疾患としては、エドワーズ症候群が挙げられる。
　１３番染色体の定量は、例えば、１３番染色体のトリソミーを検出するために行われる。１３番染色体のトリソミーが原因となる疾患としては、パトウ症候群が挙げられる。
　Ｘ染色体の定量は、例えば、Ｘ染色体の過剰を検出するために行われる。Ｘ染色体の過剰が原因となる疾患としては、例えば、クラインフェルター症候群などが挙げられる。
　Ｙ染色体の定量は、例えば、Ｙ染色体の過剰を検出するために行われる。Ｙ染色体の過剰が原因となる疾患としては、例えば、ＸＹＹ症候群などが挙げられる。

《ローカス》
　ローカスは遺伝子座または座位であり、遺伝子領域に限定されず、遺伝子に該当しないような塩基配列または遺伝マーカーの位置も含む。
　また、ローカスの数、すなわちローカス数は、特に限定されないが、必要ローカス数を決定するための実験結果を提供するために行う試行であることを考慮して適宜設定される。

《配列リード数》
　配列リード数は、対象染色体上のローカスをマルチプレックスＰＣＲにより増幅し、増幅産物を次世代シークエンサーによりシークエンシングして得られる、対象染色体あたりのシークエンスリードの数である。すなわち、対象染色体上のローカスをマルチプレックスＰＣＲにより増幅して得られるＰＣＲ産物をシークエンシングして得られる、ローカスあたりのシークエンスリードの数の総和である。なお、後述するように、ローカスあたりのシークエンスリードの数の総和に代えて、ローカスあたりの平均的なシークエンスリードの数を配列リード数として用いてもよい。

《反復試行》
　反復試行の回数は特に限定されるものではないが、必要ローカス数を決定するための実験結果を得るために行われるものであることを考慮して、その回数が設定される。例えば、反復回数としては、好ましくは３回以上１００回以下であり、より好ましくは５回以上５０回以下であり、さらに好ましくは１０回以上３０回以下である。
　１回あたりの試行としては、例えば、妊婦の末梢血を採取し、採取した末梢血から有核赤血球細胞を単離し、単離した有核赤血球細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、マルチプレックスＰＣＲを行って、得られたＰＣＲ増幅産物を次世代シークエンサーを用いて配列リード数を得る。
　複数回の試行により得た対象染色体の配列リード数から、対象染色体の配列リード数の平均値μ、分散σ^２、および変動係数ＣＶ＝σ／μ等を求めることができる。

〈実験結果換算工程Ｓ１３〉
　本発明の必要なローカス数の決定方法は、さらに、実験結果換算工程を含んでもよい。
　実験結果換算工程は、演算手段が、記憶手段から、上記対象染色体上のローカス数ｎおよび上記対象染色体上のローカスあたりの配列リード数の変動係数ｘ’を読み出し、下記式によって、対象染色体の配列リード数の変動係数ｘを算出し、記憶手段に記憶する工程である（図２のＳ１３）。
　ｘ＝ｘ’／ＳＱＲＴ（ｎ）
ただし、ＳＱＲＴ（ｎ）は、ｎの平方根を表す。
　上記実験結果入力工程において、上記対象染色体の配列リード数の変動係数ｘに代えて、上記対象染色体上のローカスあたりの配列リード数の変動係数ｘ’が入力され、記憶手段（メモリ）１２に記憶された場合、実験結果換算工程を、上記実験結果入力工程の後、かつ、上記必要ローカス数決定工程の前に、行うことが好ましい。

〈目標性能入力工程Ｓ１２〉
　目標性能である、対象染色体の配列リード数の変動係数ｙが入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される工程である（図２のＳ１２）。
　なお、変動係数ｙに代えて、感度Ｓｅ_Ｔ、特異度Ｓｐ_Ｔ、陽性適中率ＰＰＶ_Ｔ、または陰性適中率ＮＰＶ_Ｔを入力してもよい。その場合には、感度Ｓｅ_Ｔ、特異度Ｓｐ_Ｔ、陽性適中率ＰＰＶ_Ｔ、または陰性適中率ＮＰＶ_Ｔを、目標とする変動係数ｙに換算する目標性能換算工程を、目標性能入力工程の後、かつ、必要ローカス数決定工程の前に行う。
　なお、入力補助手段として補助入力手段（マウス）１５を用いることも可能である。

〈目標性能換算工程Ｓ１４〉
　本発明の必要なローカス数の決定方法は、さらに、目標性能換算工程を含んでもよい。
　目標性能換算工程は、演算手段が、記憶手段から、感度Ｓｅ_Ｔ、特異度Ｓｐ_Ｔ、陽性適中率ＰＰＶ_Ｔ、または陰性適中率ＮＰＶ_Ｔを読み出し、目標とする、対象染色体の配列リード数の変動係数ｙに換算し、記憶手段に記憶する工程である（図２のＳ１４）。
　上記目標性能入力工程において、変動係数ｙに代えて、感度Ｓｅ_Ｔ、特異度Ｓｐ_Ｔ、陽性適中率ＰＰＶ_Ｔ、または陰性適中率ＮＰＶ_Ｔが入力され、記憶手段に記憶された場合、目標性能換算工程を、上記目標性能入力工程の後、かつ、上記必要ローカス数決定工程の前に、行うことが好ましい。

　目標性能換算の具体的な方法について説明する。
（１）感度Ｓｅ_Ｔが読み出された場合
　正規分布に従う、染色体異数性がある細胞群を仮定すると、この細胞群において染色体異数性ありと判定される細胞の割合が感度であるから、これに目標とする感度Ｓｅ_Ｔを代入して、そのときの変動係数を目標とする変動係数ｙとする。
（２）特異度Ｓｐ_Ｔが読み出された場合
　正規分布に従う、染色体異数性がない細胞群を仮定すると、この細胞群において染色体異数性なしと判定される細胞の割合が特異度であるから、これに目標とする特異度Ｓｐ_Ｔを代入して、そのときの変動係数を目標とする変動係数ｙとする。
（３）陽性適中率ＰＰＶ_Ｔが読み出された場合
　予め与えられた有病率および下記式１を用いて、陽性適中率を感度および特異度に変換し、さらに、上記感度Ｓｅ_Ｔが読み出された場合および上記特異度Ｓｐ_Ｔが読み出された場合に従って、感度および特異度を、目標とする変動係数ｙに換算する。
　式１：　陽性適中率＝感度×有病率／（感度×有病率＋（１－有病率）（１－特異度））
（４）陰性適中率ＮＰＶ_Ｔが読み出された場合
　予め与えられた有病率および下記式２を用いて、陰性適中率を特異度および感度に変換し、さらに、上記感度Ｓｅ_Ｔが読み出された場合および上記特異度Ｓｐ_Ｔが読み出された場合に従って、特異度および感度を、目標とする変動係数ｙに換算する。
　式２：　陰性適中率＝特異度×（１－有病率）／（特異度×（１－有病率）＋有病率×（１－感度））

　より詳細には以下に説明するとおりである。
　染色体異数性がない細胞群Ｄ１（以下「正常細胞群Ｄ１」という場合がある。）および染色体異数性がある細胞群Ｄ２（以下「異常細胞群Ｄ２」という場合がある。）を考える。
　正常細胞群Ｄ１の検査値Ｘは正規分布Ｎ（μ_１，σ_１ ^２）に従い、異常細胞群Ｄ２の検査値Ｘは正規分布Ｎ（μ_２，σ_２ ^２）に従うものとする。
　すると、Ｎ（μ_１，σ_１ ^２）は、以下の確率密度関数ｆ_１（ｘ）を持つ確率分布として与えられる。
　ｆ_１（ｘ）＝１／ｓｑｒｔ（２πσ_１ ^２）・ｅｐｘ（－（ｘ－μ_１）^２／２σ_１ ^２）
　また、Ｎ（μ_２，σ_２ ^２）は、以下の確率密度関数ｆ_２（ｘ）を持つ確率分布として与えられる。
　ｆ_２（ｘ）＝１／ｓｑｒｔ（２πσ_２ ^２）・ｅｐｘ（－（ｘ－μ_２）^２／２σ_２ ^２）
　ただし、ｓｑｒｔ（ｚ）は、ｚの平方根を表し、ｅｘｐ（ｚ）はｅ^ｚを表す。ここで、ｅは自然対数の底（ネイピア数）である。

　ここで、正常細胞群Ｄ１の変動係数ＣＶ_１は、および異常細胞群Ｄ２の変動係数ＣＶ_２は、それぞれ、
　ＣＶ_１＝σ_１／μ_１
　ＣＶ_２＝σ_２／μ_２
である。

（検査値Ｘが閾値ｃを超えれば（Ｘ＞ｃならば）染色体異数性あり、閾値ｃ以下であれば（Ｘ≦ｃならば）染色体異数性なしと判定する場合）
　感度は異常細胞群Ｄ２のうち、検査値Ｘが閾値ｃを超える細胞の割合であり、下記式で表される。

　したがって、目標とする感度Ｓｅ_Ｔをｓｅｎｓ（ｃ）の式に代入して得られるσ_２／μ_２が、目標特異度Ｓｐ_Ｔを換算して得られる目標とする変動係数ｙである。

　また、特異度は正常細胞群Ｄ１のうち、検査値Ｘが閾値ｃ以下の細胞の割合であり、下記式で表される。

　したがって、目標とする感度Ｓｅ_Ｔをｓｐｅｃ（ｃ）の式に代入して得られるσ_１／μ_１が、目標感度Ｓｅ_Ｔを換算して得られる目標とする変動係数ｙである。

　さらに、以下の式から、予め与えられた有病率を用いて、陽性適中率を感度に、陰性適中率を特異度に、それぞれ変換し、さらに変動係数に換算することにより、目標とする変動係数ｙを得ることができる。
　陽性適中率＝感度×有病率／（感度×有病率＋（１－有病率）（１－特異度））
陰性適中率＝特異度×（１－有病率）／（特異度×（１－有病率）＋有病率×（１－感度））

　なお、閾値ｃとしては、例えば、ｆ_１（ｃ）＝ｆ_２（ｃ）となるｃを採用することができるが、これに限定されるものではない。

（検査値Ｘが閾値ｃ未満であれば（Ｘ＜ｃならば）染色体異数性あり、閾値ｃ異常であれば（Ｘ≧ｃならば）染色体異数性なしと判定する場合）
　感度は異常細胞群Ｄ２のうち、検査値Ｘが閾値ｃ未満となる細胞の割合であり、下記式で表される。

〈必要ローカス数決定工程Ｓ１５〉
　演算手段（ＣＰＵ）１１が、記憶手段（メモリ）１２から、ローカス数ｎ、変動係数ｘ、および変動係数ｙを読み出し、実験結果であるローカス数ｎおよび変動係数ｙならびに目標性能である変動係数ｙから、変動係数がｙ以下となるために必要なローカス数Ｎを算出し、記憶手段（メモリ）１２に記憶する工程である（図２のＳ１５）。

　必要ローカス数決定工程において、演算手段１１が、記憶手段１２から、ローカス数ｎ、変動係数ｘ、および変動係数ｙを読み出し、下記式
　Ｎ＝ｆ（ｎ，ｘ，ｙ）＝ｃｅｉｌｉｎｇ（ｚ）
　ｚ＝ｋ×ｎ×（ｘ／ｙ）^２、好ましくはｚ＝ｎ×（ｘ／ｙ）^２
によって、必要なローカス数Ｎを算出することが好ましい。
　ただし、ｃｅｉｌｉｎｇ（ｚ）は実数ｚに対してｚ以上の最小の整数を表し、ｋは予め定められた１．０以上１．５以下の係数である。

〈結果表示工程Ｓ１６〉
　演算手段（ＣＰＵ）１１が、記憶手段（メモリ）１２から、染色体数定量のために必要なローカス数Ｎを読み出し、表示手段（モニタ）１６に表示する工程である（図２のＳ１６）。
　さらに、入力手段（キーボード）１４または補助入力手段（マウス）１５からの指令により、出力手段（プリンタ）１７から出力してもよい。

［必要なローカス数を決定する装置］
　次に、本発明の必要なローカス数を決定する方法を実行する装置について、図１を参照しながら説明する。
　本発明の必要なローカス数を決定する方法を実行する装置は、演算手段（ＣＰＵ）１１、記憶手段（メモリ）１２、補助記憶手段（ストレージ）１３、入力手段（キーボード）１４、および表示手段（モニタ）１６を備える。さらに、補助入力手段（マウス）１５、および出力手段（プリンタ）１７等を備えていてもよい。
　それぞれの手段について説明する。
　入力手段（キーボード）１４は、装置に指示およびデータ等を入力する手段であり、実験結果および目標性能を入力するために用いられる。
　補助入力手段（マウス）１５は、入力手段（キーボード）１４に代えて、またはそれとともに、用いられる。
　演算手段（ＣＰＵ）１１は、演算処理を行う手段であり、各手段の制御、データの書込み、および読込み等の処理の他、必要なローカス数Ｎを算出するために用いられる。
　記憶手段（メモリ）１２は、演算手段（ＣＰＵ）１１の演算処理の結果を記憶したり、入力手段（キーボード）１４からの入力を記憶したりするために用いられる。
　補助記憶手段（ストレージ）１３は、オペレーティングシステム、必要なローカス数を決定するためのプログラムなどを保存するストレージである。その一部を記憶手段を拡張するために用いることもできる。
　表示手段（ディスプレイ）１６は、ユーザーとのインターフェイスの一つである。必要なローカス数を算出した後、表示するために用いられる。
　出力手段（プリンタ）１７は、演算手段（ＣＰＵ）１１からの指示により、表示手段（ディスプレイ）１６に表示した情報を印刷するために用いられる。

［必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法］
　本発明の「必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法」は、以下の工程を備える、妊婦から単離した胎児由来が疑われる単一細胞が胎児由来であるか、または妊婦である母親由来であるかを、ＳＮＰｓジェノタイピングを用いて判定する際に必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法である。

〈実験結果入力工程Ｓ２１〉
　ｍを２以上の整数として、ｍ個のＳＮＰｓ座位を解析する先行実験により得られた、ｍ個のＳＮＰｓの平均の変異頻度νおよびアレルドロップアウト率Θ％が入力手段（キーボード）１４を介して入力され、記憶手段（メモリ）１２に記憶される工程である（図４のＳ２１）。
　なお、本工程では、ハードウェアに対する入力手段として、入力補助手段（マウス）１５を用いることも可能である。

《ＳＮＰｓ座位の個数》
　上記ｍは２以上の整数であれば特に限定されないが、先行実験として行われるものであることを考慮して、その個数が設定される。例えば、ＳＮＰｓ座位の個数としては、好ましくは１０個以上であり、より好ましくは１５個以上であり、さらに好ましくは２０個以上である。

《変異頻度》
　変異頻度νは０≦ν≦１である。本発明においては、好ましくは０．３５＜ν＜０．６５であり、より好ましくは０．４０＜ν＜０．６０であり、さらに好ましくは０．４５＜ν＜０．５５である。

《アレルドロップアウト率》
　アレルドロップアウト率（以下「ＡＤＯ（ａｌｌｅｌｉｃ　ｄｒｏｐｏｕｔ）率」という場合がある。）Θ％は、通常、０％≦Θ％≦１００％である。ＡＤＯ率は低いほどよい。

〈目標性能入力工程Ｓ２２〉
　目標精度Ψ％が入力手段（キーボード）１４を介して入力され、記憶手段（メモリ）１２に記憶される工程である（図４のＳ２２）。

《目標精度》
　目標精度Ψ％は特に限定されないが、好ましくは９５．０％以上、より好ましくは９９．０％以上、さらに好ましくは９９．９％以上である。

〈必要ＳＮＰｓ座位数決定工程Ｓ２５〉
　演算手段（ＣＰＵ）１１が記憶手段（メモリ）１２から、ＳＮＰｓ座位の個数ｍ、変異頻度ν、アレルドロップアウト率Θ％、および目標精度Ψ％を読み出し、
　アレルドロップアウト率Θ％である場合の、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプがホモ－ヘテロで不一致となるＳＮＰｓ座位の数がｍ個中０個である確率τを求め、
　アレルドロップアウト率Θ％である場合の、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプがホモ－ヘテロで不一致となるＳＮＰｓ座位の数がｍ個中０個である確率υ＝１を求め、
　Φ＝１００×（υ－τ）を計算し、
　ｍを１個ずつ増加してゆき、Φ≧Ψとなる最小のｍを求め、必要なＳＮＰｓ座位数Ｍとして記憶手段（メモリ）１２に記憶する工程である（図４のＳ２５）。

　必要ＳＮＰｓ座位数決定工程においては、演算手段が記憶手段から変異頻度ν、アレルドロップアウト率Θ％、および目標精度Ψ％を読み出し、下記式
　Ｍ＝ｈ（ν，θ，ψ）＝ｃｅｉｌｉｎｇ（χ）
　χ＝κｌｏｇ（１－ψ）／ｌｏｇ（１－ξ）
　ξ＝ν（１－ν）（１－θ）
　ψ＝Ψ／１００
　θ＝Θ／１００
によって、必要なＳＮＰｓ座位数Ｍを算出することが好ましい。
　ただし、ｃｅｉｌｉｎｇ（χ）は実数χに対してχ以上の最小の整数を表し、κは予め定められた１．０以上１．５以下の係数である。

〈結果表示工程Ｓ２６〉
　演算手段（ＣＰＵ）１１が、記憶手段（メモリ）１２から、妊婦から単離した胎児由来が疑われる単一細胞が胎児由来であるか、または妊婦である母親由来であるかを、ＳＮＰｓジェノタイピングを用いて判定する際に必要なＳＮＰｓ座位数を読み出し、表示手段（モニタ）に表示する工程である（図４のＳ２６）。
　さらに、入力手段（キーボード）１４または補助入力手段（マウス）１５からの指令により、出力手段（プリンタ）１７から出力してもよい。

〈必要ＳＮＰｓ座位数決定工程における必要ＳＮＰｓ座位数の算出方法の詳細な説明〉
　以下では、先行実験で解析を行ったＳＮＰｓ座位数をｍ個（ｍ≧２０、ｍは整数）、そのｍ個のＳＮＰｓの変異頻度をν（０≦ν≦１）、アレルドロップアウト率（ａｌｌｅｌｉｃ　ｄｒｏｐｏｕｔ　ｒａｔｅ）をθ（０≦θ≦１）、および目標精度をψ（０＜ψ≦１）とする。

《母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプとの比較》
（アレルドロップアウト率０％である場合）
　変異頻度νであるＳＮＰｓ座位について、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプが、
（１）ホモ－ホモで一致する確率　　　　ｐ_１１＝１－３ν（１－ν）；
（２）ヘテロ－ヘテロで一致する確率　　ｐ_１２＝ν（１－ν）；
（３）ヘテロ－ホモで不一致となる確率　ｐ_１３＝ν（１－ν）；
（４）ホモ－ヘテロで不一致となる確率　ｐ_１４＝ν（１－ν）；および
（５）ホモ－ホモで不一致となる確率　　ｐ_１５＝０；
である。

　したがって、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプとを比較した際に、χ個中ｋ個のＳＮＰｓ座位がホモ－ヘテロで不一致となる確率Ｐ_１４は、
　Ｐ_１４＝_χＣ_ｋ・ｐ_１４ ^ｋ・（１－ｐ_１４）^χ－ｋ
である。
　ＳＮＰｓ座位の個数を確率変数Ｘで表すとき、確率変数Ｘはパラメータχ、ｐ_１４の二項分布Ｂ（χ，ｐ_１４）に従う。

（アレルドロップアウト率Θ％である場合）
　アレルドロップアウト率がΘ％（Θ＝１００×θ）である場合、図５に示すように、真のジェノタイプがヘテロ（●○）である場合、みかけのジェノタイプは、（１００－Θ）％がヘテロ（●○）となり、Θ％がホモ（●●および○○）となる。アレルドロップアウトに染色体に依存した偏りが無ければ、ホモ（●●）とホモ（○○）は、いずれもΘ／２％となる。

　したがって、アレルドロップアウト率Θ％を考慮に入れると、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプが、ホモ－ヘテロで不一致となる確率ｑ_１４は、
　ｑ_１４＝ν（１－ν）（１－θ）
となる。ただし、θ＝Θ／１００である。

　母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプとを比較した際に、χ個中ｋ個のＳＮＰｓ座位がホモ－ヘテロで不一致となる確率Ｑ_１４は、
　Ｑ_１４＝_χＣ_ｋ・ｑ_１４ ^ｋ・（１－ｑ_１４）^χ－ｋ
である。

　ｋ＝０、すなわち、χ個中０個のＳＮＰｓ座位がホモ－ヘテロで不一致となる確率Ｑ_１４｜_ｋ＝０は、
　Ｑ_１４｜_ｋ＝０＝_χＣ_０・ｑ_１４ ^０・（１－ｑ_１４）^χ＝（１－ｑ_１４）^χ＝（１－ξ）^χ＝τ（χ）
　ｑ１４＝ξ＝ν（１－ν）（１－θ）
である。

《母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプとの比較》
（アレルドロップアウト率０％である場合）
　変異頻度νであるＳＮＰｓ座位について、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプが、
（１）ホモ－ホモで一致する確率ｐ_２１＝ν^２＋（１－ν）^２；
（２）ヘテロ－ヘテロで一致する確率ｐ_２２＝２ν（１－ν）；
（３）ヘテロ－ホモで不一致となる確率ｐ_２３＝０；
（４）母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプが、ホモ－ヘテロで不一致となる確率ｐ_２４＝０；および、
（５）母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプが、ホモ－ホモで不一致となる確率ｐ_２５＝０
である。

　したがって、母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプとを比較した際に、χ個中ｋ個のＳＮＰｓ座位がホモ－ヘテロで一致する確率Ｐ_２４は、
　Ｐ_２４＝_χＣ_ｋ・ｐ_２４ ^ｋ・（１－ｐ_２４）^χ－ｋ
である。
　ＳＮＰｓ座位の個数を確率変数Ｘで表すとき、確率変数Ｘはパラメータχ、ｐ_２４の二項分布Ｂ（χ，ｐ_２４）に従う。

　なお、ｐ_２４＝０であるから、上記Ｐ_２４は、
　Ｐ_２４＝_χＣ_ｋ・０^ｋ・１^χ－ｋ＝_χＣ_ｋ・０^ｋ
となる。

　母親の真のジェノタイプがホモである場合、アレルドロップアウトによって母親細胞のみかけのジェノタイプがヘテロとなることはないので、母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプが、ホモ－ヘテロで不一致となる確率ｑ_２４は、
　ｑ_２４＝０
である。

　母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプとを比較した際に、χ個中ｋ個のＳＮＰｓ座位がホモ－ヘテロで不一致となる確率Ｑ_２４は、
　Ｑ_２４＝_χＣ_ｋ・ｑ_１４ ^ｋ・（１－ｑ_２４）^χ－ｋ
である。

　ｋ＝０、すなわち、χ個中０個のＳＮＰｓ座位がホモ－ヘテロで不一致となる確率Ｑ_２４｜_ｋ＝０は、
　Ｑ_２４｜_ｋ＝０＝_χＣ_０・ｑ_２４ ^０・（１－ｑ_２４）^χ＝ｑ_２４ ^０＝０^０＝１＝υ（χ）
である。
∵０^０＝１と定義した。
　これより、母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプが、ｍ個中０個のＳＮＰｓ座位でホモ－ヘテロで不一致となる確率は１となる。

　母子判別の精度Ψ（χ）は、
　Ψ（χ）＝１００×（υ（χ）－τ（χ））＝１００×（１－τ（χ））＝（１－（１－ξ）^χ）
　ξ＝ν（１－ν）（１－θ）
である。

　目標精度Ψ％（Ψ＝１００×ψ）として、目標精度を与えるＳＮＰｓ座位数χは、上記式から、
　ψ＝１－（１－ξ）^χ
であるから、
　ｌｏｇ（１－ξ）^χ＝ｌｏｇ（１－ψ）より、
　χ＝ｌｏｇ（１－ψ）／ｌｏｇ（１－ξ）
となる。
　なお、χには、係数κ（１．０≦κ≦１．５）を掛けてもよい。
　必要なＳＮＰｓ座位数Ｍは、
　Ｍ＝ｃｅｉｌｉｎｇ（χ）
によって求めることができる。

［必要なＳＮＰｓ数を決定する装置］
　次に、本発明の必要なＳＮＰｓ数を決定する方法を実行する装置について、図１を参照しながら説明する。
　本発明の必要なＳＮＰｓ数を決定する方法を実行する装置は、演算手段（ＣＰＵ）１１、記憶手段（メモリ）１２、補助記憶手段（ストレージ）１３、入力手段（キーボード）１４、および表示手段（モニタ）１６を備える。さらに、補助入力手段（マウス）１５、および出力手段（プリンタ）１７等を備えていてもよい。
　それぞれの手段について説明する。
　入力手段（キーボード）１４は、装置に指示およびデータ等を入力する手段であり、実験結果および目標性能を入力するために用いられる。
　補助入力手段（マウス）１５は、入力手段（キーボード）１４に代えて、またはそれとともに、用いられる。
　演算手段（ＣＰＵ）１１は、演算処理を行う手段であり、各手段の制御、データの書込み、および読込み等の処理の他、必要なＳＮＰｓ座位数を算出するために用いられる。
　記憶手段（メモリ）１２は、演算手段（ＣＰＵ）１１の演算処理の結果を記憶したり、入力手段（キーボード）１４からの入力を記憶したりするために用いられる。
　補助記憶手段（ストレージ）１３は、オペレーティングシステム、必要なＳＮＰｓ座位数を決定するためのプログラムなどを保存するストレージである。その一部を記憶手段を拡張するために用いることもできる。
　表示手段（ディスプレイ）１６は、ユーザーとのインターフェイスの一つである。必要なＳＮＰｓ数を算出した後、表示するために用いられる。
　出力手段（プリンタ）１７は、演算手段（ＣＰＵ）１１からの指示により、表示手段（ディスプレイ）１６に表示した情報を印刷するために用いられる。

［マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計］
　必要ローカス数または必要ＳＮＰｓ座位数を決定した後、以下に説明する方法により、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーを設計してもよい。なお、以下では、領域をローカスまたはＳＮＰｓ座位と読み替える。

〈目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第１の態様〉
　本発明において、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第１の態様は、以下の工程を含む。なお、以下の説明では、適宜図６を参照する。

（ａ）目的領域から対象領域を選択する、対象領域選択工程（図６のＳ１０１）。
（ｂ）上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程（図６のＳ１０２）。
（ｃ）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程（図６のＳ１０３）。
（ｄ）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜工程（図６のＳ１０４）。
（ｅ）上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程（図６のＳ１０５）。
（ｆ）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜工程（図６のＳ１０６）。
（ｇ）上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程（図６のＳ１０７）。

　ただし、上記（ａ）工程～上記（ｇ）工程のうち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程の両工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行った後、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行ってもよいし、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行ってもよいし、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行ってもよい。

　上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程を行った後、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程を行う場合には、上記（ｅ）工程および上記（ｃ）工程は、それぞれ、下記（ｅ’）工程および下記（ｃ’）工程とすることが好ましい。

（ｅ’）上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント工程。

（ｃ’）上記第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント工程。

　また、上記（ｃ）工程および上記（ｄ）工程と、上記（ｅ）工程および上記（ｆ）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ）工程は、下記（ｅ’）工程とすることが好ましい。

　さらにプライマーを設計する場合は、プライマー候補の塩基配列が作成されていれば、（ｃ）ローカルアラインメント工程（図６のＳ１０３）から、作成されていなければ、（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程（図６のＳ１０２）または（ａ）対象領域選択工程（図６のＳ１０１）から、プライマーを設計する（図６のＳ１０８、Ｓ１０９、およびＳ１１０）。

〈目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第２の態様〉
　本発明において、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第２の態様は、以下の工程を含む。なお、以下の説明では、適宜図７を参照する。

（ａ_１）目的領域から第１の対象領域を選択する、対象領域選択第１工程（図７のＳ２０１）。
（ｂ_１）上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第１工程（図７のＳ２０２）。
（ｃ_１）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程（図７のＳ２０３）。
（ｄ_１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第１工程（図７のＳ２０４）。
（ｅ_１）上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程（図７のＳ２０５）。
（ｆ_１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第１工程（図７のＳ２０６）。
（ｇ_１）上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第１工程（図７のＳ２０７）。

　ただし、上記（ａ_１）工程～上記（ｇ_１）工程のうち、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程の両工程と、上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程を行った後、上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程を行った後、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程と、上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程とを、並行して行ってもよい。

　上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程を行った後、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程を行う場合には、上記（ｅ_１）工程および上記（ｃ_１）工程は、それぞれ、下記（ｅ_１’）工程および下記（ｃ_１’）工程とすることが好ましい。

（ｅ_１’）上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第１工程。

（ｃ_１’）上記第二段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第１工程。

　また、上記（ｃ_１）工程および上記（ｄ_１）工程と、上記（ｅ_１）工程および上記（ｆ_１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ_１）工程は、下記（ｅ_１’）工程とすることが好ましい。

（ａ_２）目的領域から上記第１の対象領域とは異なる第２の対象領域を選択する、対象領域選択第２工程（図７のＳ２１１）。
（ｂ_２）上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成第２工程（図７のＳ２１２）。
（ｃ_２）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程（図７のＳ２１３）。
（ｄ_２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第一段階選抜第２工程（図７のＳ２１４）。
（ｅ_２）上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程（図７のＳ２１５）。
（ｆ_２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第二段階選抜第２工程（図７のＳ２１６）。
（ｇ_２）上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用第２工程（図７のＳ２１７）。

　ただし、上記（ａ_２）工程～上記（ｇ_２）工程のうち、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程の両工程と、上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程を行った後、上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程を行った後、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程と、上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程とを、並行して行ってもよい。

　上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程を行った後、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程を行う場合には、上記（ｅ_２）工程および上記（ｃ_２）工程は、それぞれ、下記（ｅ_２’）工程および下記（ｃ_２’）工程とすることが好ましい。

（ｅ_２’）上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、グローバルアラインメント第２工程。

（ｃ_２’）上記第二段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、ローカルアラインメント第２工程。

　また、上記（ｃ_２）工程および上記（ｄ_２）工程と、上記（ｅ_２）工程および上記（ｆ_２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ_２）工程は、下記（ｅ_２’）工程とすることが好ましい。

　さらにプライマーを設計する場合は、（ａ_２）対象領域選択第２工程（図７のＳ２１１）から（ｇ_２）プライマー採用第２工程（図７のＳ２１７）までを繰り返す（図７のＳ２０８）。すなわち、３つ以上の目的領域を含む場合であって、当該３つ以上の目的領域からまだ選択されていない第３以降の対象領域に対してプライマーを設計するときは、当該第３以降の対象領域について、上記（ａ_２）工程～上記（ｇ_２）工程までの各工程を繰り返す。

〈目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第３の態様〉
　目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第３の態様は、以下の工程を含む。なお、以下の説明では、適宜図８を参照する。

（ａ－０）目的領域から複数の対象領域を選択する、対象領域複数選択工程（図８のＳ３０１）。
（ｂ－０）上記複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列複数作成工程（図８のＳ３０２）。

（ｃ－１）上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち１つを第１の対象領域とし、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程（図８のＳ３０３）。
（ｄ－１）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第１の第一段階選抜工程（図８のＳ３０４）。
（ｅ－１）上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程（図８のＳ３０５）。
（ｆ－１）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第１の第二段階選抜工程（図８のＳ３０６）。
（ｇ－１）上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程（図８のＳ３０７）。

　ただし、上記（ｃ－１）工程～上記（ｇ－１）工程のうち、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程の両工程と、上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程を行った後、上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程を行ってもよいし、上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程を行った後、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程を行ってもよいし、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程と、上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程とを、並行して行ってもよい。

　上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程を行った後、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程を行う場合には、上記（ｅ－１）工程および上記（ｃ－１）工程は、それぞれ、下記（ｅ’－１）工程および下記（ｃ’－１）工程とすることが好ましい。

（ｅ’－１）上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち１つを第１の対象領域とし、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程。

（ｃ’－１）上記第１の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める、第１のローカルアラインメント工程。

　また、上記（ｃ－１）工程および上記（ｄ－１）工程と、上記（ｅ－１）工程および上記（ｆ－１）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ－１）工程は、下記（ｅ’－１）工程とすることが好ましい。

（ｃ－２）上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち、上記第１の対象領域を除く１つを第２の対象領域とし、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程（図８のＳ３１３）。
（ｄ－２）上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う、第２の第一段階選抜工程（図８のＳ３１４）。
（ｅ－２）上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程（図８のＳ３１５）。
（ｆ－２）上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う、第２の第二段階選抜工程（図８のＳ３１６）。
（ｇ－２）上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程（図８のＳ３１７）。

　ただし、上記（ｃ－２）工程～上記（ｇ－２）工程のうち、上記（ｃ－２）工程および上記（ｄ－２）工程の両工程と、上記（ｅ－２）工程および上記（ｆ－２）工程の両工程とは、任意の順序または同時であってもよい。すなわち、上記（ｃ－２）工程および上記（ｄ－２）工程を行った後、上記（ｅ－２）工程および上記（ｆ－２）工程を行ってもよいし、上記（ｅ－２）工程および上記（ｆ－２）工程を行った後、上記（ｃ－２）工程および上記（ｄ－２）工程を行ってもよいし、上記（ｃ－２）工程および上記（ｄ－２）工程と、上記（ｅ－２）工程および上記（ｆ－２）工程とを、並行して行ってもよい。

　上記（ｅ－２）工程および上記（ｆ－２）工程を行った後、上記（ｃ－２）工程および上記（ｄ－２）工程を行う場合には、上記（ｅ－２）工程および上記（ｃ－２）工程は、それぞれ、下記（ｅ’－２）工程および下記（ｃ’－２）工程とすることが好ましい。

（ｅ’－２）上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち、上記第１の対象領域を除く１つを第２の対象領域とし、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程。

（ｃ’－２）上記第２の第二段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める、第２のローカルアラインメント工程。

　また、上記（ｃ－２）工程および上記（ｄ－２）工程と、上記（ｅ－２）工程および上記（ｆ－２）工程とを、並行して行う場合には、上記（ｅ－２）工程は、下記（ｅ’－２）工程とすることが好ましい。

　さらに、上記少なくとも１つの目的領域が３つ以上の目的領域を含み、上記対象領域複数選択工程において３つ以上の対象領域を選択し、かつ、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において上記３つ以上の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成した場合であって、上記対象領域複数選択工程において選択した複数の対象領域のうち、上記第１および第２の対象領域を除く１つを第３の対象領域とし、上記第３以降の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列を採用するときは、上記第３以降の対象領域について、上記第２のローカルアラインメント工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を繰り返す。

〈各工程の説明〉
　目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法の第１～第３の態様について、適宜、図６～図８を参照しながら、各工程を説明する。

《対象領域選択工程》
　本明細書において、対象領域選択工程Ｓ１０１（図６）、対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１（図７）、ならびに対象領域複数選択工程Ｓ３０１（図８）を総称して、単に「対象領域選択工程」という場合がある。

（第１の態様：　対象領域選択工程Ｓ１０１）
　図６において「対象領域選択」（Ｓ１０１）として示す。
　第１の態様において、（ａ）対象領域選択工程は、目的領域から対象領域を選択する工程である。選択の方法は特に限定されないが、例えば、目的領域にプライマー設計の優先順位が付けられている場合は、その優先順位が示す順序に従って、目的領域からプライマーを設計する対象領域を選択する。

（第２の態様：　対象領域選択第１工程Ｓ２０１および対象領域選択第２工程Ｓ２１１）
　図７において、「対象領域選択第１」（Ｓ２０１）および「対象領域選択第２」（Ｓ２１１）として示す。
　第２の態様において、（ａ_１）対象領域選択第１工程は、目的領域から第１の対象領域を選択する工程であり、（ａ_２）対象領域選択第２工程は、まだ対象領域として選択されていない目的領域から第２の対象領域を選択する工程である。選択の方法は特に限定されないが、例えば、目的領域にプライマー設計の優先順位が付けられている場合は、その優先順位が示す順序に従って、目的領域からプライマーを設計する対象領域を選択する。

（第３の態様：　対象領域複数選択工程Ｓ３０１）
　図８において、「対象領域複数選択」（Ｓ３０１）として示す。
　第３の態様において、（ａ－０）対象領域複数選択工程は、目的領域から複数の対象領域を選択する工程である。選択の方法は特に限定されないが、例えば、目的領域にプライマー設計の優先順位が付けられている場合は、その優先順位が示す順序に従って、目的領域からプライマーを設計する対象領域を複数選択する。

《プライマー候補塩基配列作成工程》
　本明細書において、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２（図６）、プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２（図７）、ならびにプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２（図８）を総称して、単に「プライマー候補塩基配列作成工程」という場合がある。

（第１の態様：　プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２）
　図６において「プライマー候補塩基配列作成」（Ｓ１０２）として示す。
　第１の態様において、（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程は、対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。

（第２の態様：　プライマー候補塩基配列作成第１工程Ｓ２０２およびプライマー候補塩基配列作成第２工程Ｓ２１２）
　図７において「プライマー候補塩基配列作成第１」（Ｓ２０２）および「プライマー候補塩基配列作成第２」（Ｓ２１２）として示す。
　第２の態様において、（ｂ_１）プライマー候補塩基配列作成第１工程は、第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第１の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程であり、（ｂ_２）プライマー候補塩基配列作成第２工程は、第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記第２の対象領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
　第２の態様では１つの対象領域について、プライマー候補の塩基配列の作成、プライマー候補の選抜、およびプライマーの採用を行い、次の１つの対象領域について、同様の工程を繰り返す。

（第３の態様：　プライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２）
　図８において「プライマー候補塩基配列複数作成」（Ｓ３０２）として示す。
　第３の態様において、（ｂ－０）プライマー候補塩基配列複数作成工程は、複数の対象領域のそれぞれをＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ上における上記複数の対象領域のそれぞれの両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する。
　第３の態様では、複数の対象領域のすべてについて、プライマー候補の塩基配列を作成し、以降の工程で選抜および採用を繰り返す。

（近傍領域）
　対象領域の両端のそれぞれの近傍領域とは、対象領域の５’端から外側の領域、および対象領域の３’端から外側の領域を総称していう。対象領域の内側は近傍領域には含まない。
　近傍領域の長さは特に限定されないが、ＰＣＲによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するＤＮＡフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および／またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。ＰＣＲにおいて用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは２０～５００塩基程度、より好ましくは２０～３００塩基程度、さらに好ましくは２０～２００塩基程度、いっそう好ましくは５０～２００塩基程度である。

（プライマーの設計パラメータ）
　また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの長さ、ＧＣ含量（全核酸塩基中のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の合計モル百分率をいう。）、融解温度（２本鎖ＤＮＡの５０％が解離して１本鎖ＤＮＡになる温度をいう。また、Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅに由来し、「Ｔｍ値」という場合もある。単位は「℃」である。）、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。

・プライマーの長さ
　プライマーの長さ（ヌクレオチド数）は、特に限定されないが、好ましくは１５ｍｅｒ～４５ｍｅｒ、より好ましくは２０ｍｅｒ～４５ｍｅｒ、さらに好ましくは２０ｍｅｒ～３０ｍｅｒである。プライマーの長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。

・プライマーのＧＣ含量
　プライマーのＧＣ含量は、特に限定されないが、好ましくは４０モル％～６０モル％、より好ましくは４５モル％～５５モル％である。ＧＣ含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。

・プライマーのＴｍ値
　プライマーのＴｍ値は、特に限定されないが、好ましくは５０℃～６５℃の範囲内、より好ましくは５５℃～６５℃の範囲内である。
　プライマーのＴｍ値の差は、プライマーペアおよびプライマーセットにおいて、好ましくは５℃以下、より好ましくは３℃以下とする。
　Ｔｍ値は、ＯＬＩＧＯ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）、または、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ－ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）等のソフトウエアを用いて計算することができる。
　また、プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの数（それぞれ、ｎＡ、ｎＴ、ｎＧおよびｎＣとする）から、下記式によって計算により求めることもできる。
　Ｔｍ値（℃）＝２（ｎＡ＋ｎＴ）＋４（ｎＣ＋ｎＧ）
　Ｔｍ値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってＴｍ値を算出することができる。

・プライマーの塩基の偏り
　プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にＧＣリッチな配列および部分的にＡＴリッチな配列を避けることが望ましい。
　また、Ｔおよび／またはＣの連続（ポリピリミジン）、ならびにＡおよび／またはＧの連続（ポリプリン）も避けることが望ましい。

・プライマーの３’末端
　さらに、３’末端塩基配列が、ＧＣリッチな配列またはＡＴリッチな配列を避けることが好ましい。３’末端塩基はＧまたはＣが好ましいが、これらに限定はされない。

《特異性チェック工程》
　「プライマー候補塩基配列作成工程」において作成した各プライマー候補の塩基配列の染色体ＤＮＡに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい（図示せず）。
　特異性のチェックは、染色体ＤＮＡの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメント・スコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムＤＮＡに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、染色体ＤＮＡの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが１本鎖ＤＮＡであるのに対して、染色体ＤＮＡは２本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。

　また、プライマー候補の塩基配列をクエリー配列として、ゲノムＤＮＡ塩基配列データベースに対して相同性検索をしてもよい。相同性検索ツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool：ブラスト）（Altschul, S. A.、外4名、“Basic Local Alignment Search Tool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215巻、ｐ．403-410）およびＦＡＳＴＡ（ファストエー）（Pearson, W. R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1988年、4月、第85巻、ｐ．2444-2448）等が挙げられる。相同性検索を行った結果として、ローカルアラインメントを得ることができる。

　スコア、およびローカルアラインメント・スコアの閾値は、いずれも、特に限定されず、プライマー候補の塩基配列の長さ、および／またはＰＣＲ条件等によって、適宜設定することができる。相同性検索ツールを使用する場合には、その相同性検索ツールの既定値を使ってもよい。
　例えば、スコアとして、マッチ（相補塩基）＝＋１、ミスマッチ（非相補塩基）＝－１、インデル（挿入および／または欠失）＝－３を採用し、閾値を＋１５に設定すること等が考えられる。

　プライマー候補の塩基配列が染色体ＤＮＡ上の想定外の位置の塩基配列と相補性を有し、特異性が低い場合には、その塩基配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った際に、対象領域ではなくアーティファクトを増幅する場合があるため、除外する。

《ローカルアラインメント工程》
　本明細書において、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３（図６）、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３（図７）、ならびに第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３（図８）を総称して、単に「ローカルアラインメント工程」という場合がある。

（第１の態様：　ローカルアラインメント工程Ｓ１０３）
　図６において「ローカルアラインメント」（Ｓ１０３）として示す。
　第１の態様において、（ｃ）ローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。

（第２の態様：　ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３およびローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３）
　図７において「ローカルアラインメント第１」（Ｓ２０３）および「ローカルアラインメント第２」（Ｓ２１３）として示す。
　第２の態様において、（ｃ_１）ローカルアラインメント第１工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第１工程において作成されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ_２）ローカルアラインメント第２工程は、上記プライマー候補塩基配列作成第２工程において作成されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程である。

（第３の態様：　第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３および第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３）
　図８において「第１のローカルアラインメント」（Ｓ３０３）および「第２のローカルアラインメント」（Ｓ３１３）として示す。
　第３の態様において、（ｃ－１）第１のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行ってローカルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｃ－２）第２のローカルアラインメント工程は、上記プライマー候補塩基配列複数作成工程において作成されたプライマー候補の塩基配列のうち、第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列に対して、その比較する部分配列が上記２つの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメント・スコアを求める工程である。

（ローカルアラインメントの方法）
　ローカルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
　組合せの総数は、ローカルアラインメントを行う塩基配列の総数をｐ個として、重複を許して選択した場合は、「_ｐＨ_２＝_ｐ＋１Ｃ_２＝（ｐ＋１）！／２（ｐ－１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「_ｐＣ_２＝ｐ（ｐ－１）／２」通りである。

　ローカルアラインメントは、部分配列に対して行うアラインメントであり、相補性の高い部分を局所的に調べることができる。
　ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の３’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにした。
　さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の３’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の３’末端から始まり他方の配列の３’末端で終わるアラインメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにする態様が好ましい。
　なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
　また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
　アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「－」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。

　例えば、以下の表２に示す配列番号１および２の塩基配列について、ローカルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。

　配列番号１および２の塩基配列から、表３に示すドット行列（ドットマトリクス）を作成する。具体的には、配列番号１の塩基配列を左から右へ、５’から３’の向きで並べ、配列番号２の塩基配列を下から上へ、５’から３’の向きで並べ、塩基が相補的であるグリッドに「・」を記入して、表３に示すドットマトリクスを得る。

　表３に示すドットマトリクスから、以下の表４に示す、部分配列のアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得る（表３の斜線部分参照）。なお、表４中、マッチを「｜」で、ミスマッチを「：」で、それぞれ示す。

　この（ペアワイズ）アラインメントには、マッチが２か所あり、ミスマッチが４か所ある。インデル（ギャップ）はない。
　したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくローカルアラインメント・スコアは、（＋１）×９＋（－１）×８＋（－１）×０＝＋１となる。

　なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。

《第一段階選抜工程》
　本明細書において、第一段階選抜工程Ｓ１０４（図６）、第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４（図７）、ならびに第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４（図８）を総称して、単に「第一段階選抜工程」という場合がある。

（第１の態様：　第一段階選抜工程Ｓ１０４）
　図６において「第一段階選抜」（Ｓ１０４）として示す。
　第１の態様において、（ｄ）第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。

（第２の態様：　第一段階選抜第１工程Ｓ２０４および第一段階選抜第２工程Ｓ２１４）
　図７において、「第一段階選抜第１」（Ｓ２０４）および「第一段階選抜第２」（Ｓ２１４）として示す。
　第２の態様において、（ｄ_１）第一段階選抜第１工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ_２）第一段階選抜第２工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。

（第３の態様：　第１の第一段階選抜工程Ｓ３０４および第２の第一段階選抜工程Ｓ３１４）
　図８において、「第１の第一段階選抜」（Ｓ３０４）および「第２の第一段階選抜」（Ｓ３１４）として示す。
　第３の態様において、（ｄ－１）第１の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程であり、（ｄ－２）第２の第一段階選抜工程は、上記ローカルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第一段階の選抜を行う工程である。

（第１段階選抜の方法）
　ローカルアラインメント・スコアの閾値（「第１の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
　ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
　一方、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
　第１の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第１の閾値を設定してもよい。

　ここで、上記「ローカルアラインメント工程」に示した例において、第１の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
　上の例では、ローカルアラインメント・スコアは「＋１」であり、第１の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。

　なお、本工程は、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３、ローカルアラインメント第１工程Ｓ２０３、ローカルアラインメント第２工程Ｓ２１３、第１のローカルアラインメント工程Ｓ３０３、または第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３においてローカルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。

《グローバルアラインメント工程》
　本明細書において、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５（図６）、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５（図７）、ならびに第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５（図８）を総称して、単に「グローバルアラインメント工程」という場合がある。

（第１の態様：　グローバルアラインメント工程Ｓ１０５）
　図６において「グローバルアラインメント」（Ｓ１０５）として示す。
　第１の態様において、（ｅ）グローバルアラインメント工程は、上記第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。

（第２の態様：　グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５およびグローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５）
　図７において「グローバルアラインメント第１」（Ｓ２０５）および「グローバルアラインメント第２」（Ｓ２１５）として示す。
　第２の態様において、（ｅ_１）グローバルアラインメント第１工程は、上記第一段階選抜第１工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ_２）グローバルアラインメント第２工程は、上記第一段階選抜第２工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程である。

（第３の態様：　第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５および第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５）
　図８において「第１のグローバルアラインメント」（Ｓ３０５）および「第２のグローバルアラインメント」（Ｓ３１５）として示す。
　第３の態様において、（ｅ－１）第１のグローバルアラインメント工程は、上記第１の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択するすべての組合せについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行ってグローバルアラインメント・スコアを求める工程であり、（ｅ－２）第２のグローバルアラインメント工程は、上記第２の第一段階選抜工程において選抜されたプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列から２つのプライマー候補の塩基配列を選択する組合せおよび１つのプライマー候補の塩基配列および１つの既に採用されたプライマーの塩基配列を選択する組合せのすべてについて、上記組合せに含まれる２つの塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列に対して、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメント・スコアを求める工程である。

（グローバルアラインメントの方法）
　グローバルアラインメント・スコアは、「プライマー候補塩基配列作成工程」で作成したプライマー候補の全部（「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」を先に行った場合において、ローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であるプライマー候補の組合せがあるときは、その組合せに含まれるプライマー候補の全部。）および既に採用したプライマーの全部（既に採用したプライマーが存在する場合に限る。）からなる群から２つのプライマーを取り出して、３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、求める。

　グローバルアラインメントを行う塩基配列の組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマー・ダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
　組合せの総数は、グローバルアラインメントを行う塩基配列の総数をｘ個として、重複を許して選択した場合は、「_ｘＨ_２＝_ｘ＋１Ｃ_２＝（ｘ＋１）！／２（ｘ－１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「_ｘＣ_２＝ｘ（ｘ－１）／２」通りである。

　グローバルアラインメントは、「配列全体」に対して行うアラインメントであり、配列全体の相補性を調べることができる。
　ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
　なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
　また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
　アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表１のようにスコアを設定してもよい。なお、表１中「－」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。

　例えば、以下の表５に示す配列番号１および２の塩基配列について、それぞれの３’末端の３塩基（大文字部分。）についてグローバルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアは表１に示すとおりとする。

　スコアが最大となるように、配列番号１の塩基配列の３’末端の３塩基（大文字箇所）および配列番号２の３’末端の３塩基（大文字箇所）の塩基配列についてグローバルアラインメントを行うと、以下の表６に示すアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得ることができる。なお、表６中、ミスマッチを「：」で示す。

　この（ペアワイズ）アラインメントには、ミスマッチが３か所あり、マッチおよびインデル（ギャップ）はいずれもない。
　したがって、この（ペアワイズ）アラインメントに基づくグローバルアラインメント・スコアは、（＋１）×０＋（－１）×３＋（－１）×０＝－３となる。

　なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。

《第二段階選抜工程》
　本明細書において、第二段階選抜工程Ｓ１０６（図６）、第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６（図７）、ならびに第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１６（図８）を総称して、単に「第二段階選抜工程」という場合がある。
（第１の態様：　第二段階選抜工程Ｓ１０６）
　図６において「第二段階選抜」（Ｓ１０６）として示す。
　第１の態様において、（ｆ）第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。

（第２の態様：　第二段階選抜第１工程Ｓ２０６および第二段階選抜第２工程Ｓ２１６）
　図７において「第二段階選抜第１」（Ｓ２０６）および「第二段階選抜第２」（Ｓ２１６）として示す。
　第２の態様において、（ｆ_１）第二段階選抜第１工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ_２）第二段階選抜第２工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。

（第３の態様：　第１の第二段階選抜工程Ｓ３０６および第２の第二段階選抜工程Ｓ３１３６）
　図８において「第１の第二段階選抜」（Ｓ３０６）および「第２の第二段階選抜」（Ｓ３１６）として示す。
　第３の態様において、（ｆ－１）第１の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程であり、（ｆ－２）第２の第二段階選抜工程は、上記グローバルアラインメント・スコアに基づいて、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第二段階の選抜を行う工程である。

（第二段階選抜の方法）
　グローバルアラインメント・スコアの閾値（「第２の閾値」ともいう。）を予め設定しておく。
　グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。
　一方、グローバルアラインメント・スコアが第２の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列の組合せはダイマー形成性が高いと判断し、その組合せについては以降の工程を行わない。
　第２の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第２の閾値を設定してもよい。

　なお、プライマーの３’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることによって、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアを第２の閾値未満とすることができる。

　ここで、上記「グローバルアラインメント工程」に示した例において、第２の閾値を「＋３」に設定した場合を考える。
　上の例では、グローバルアラインメント・スコアは「－３」であり、第２の閾値である「＋３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列の組合せはプライマー・ダイマー形成性が低いと判断することができる。

　なお、本工程は、グローバルアラインメント工程Ｓ１０５、グローバルアラインメント第１工程Ｓ２０５、グローバルアラインメント第２工程Ｓ２１５、第１のグローバルアラインメント工程Ｓ３０５、または第２のグローバルアラインメント工程Ｓ３１５においてグローバルアラインメント・スコアを算出したすべての組合せに対して行う。

　また、計算量を低減させるため、「グローバルアラインメント工程」および「第２段階選抜工程」の両工程を先に実施して、「第２段階選抜工程」を通過したプライマーの塩基配列の組合せに対して、「ローカルアラインメント工程」および「第１段階選抜工程」の両工程を実施することが好ましい。特に、対象領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。

　これは、「グローバルアラインメント工程」では「予め設定した配列長」という短い長さの塩基配列についてグローバルアラインメントを行うので、３’末端を含むという条件下で塩基配列全体から相補性が高い部分配列を見つけるローカルアラインメント・スコアよりも計算量が少なく、高速に処理できるからである。なお、通常知られているアルゴリズムでは、同じ長さの配列に対するアラインメントであれば、ローカルアラインメントよりもグローバルアラインメントの方が高速であることが知られている。

《増幅配列長チェック工程》
　「第１段階選抜工程」および「第２段階選抜工程」においてプライマー・ダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列の組合せに対して、染色体ＤＮＡ上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい（図示せず）。
　塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列の組合せは、対象領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等のＰＣＲ条件によって、適宜設定することができる。例えば、１００～２００塩基（対）の範囲内、１２０～１８０塩基（対）の範囲内、１４０～１８０塩基（対）の範囲内、１４０～１６０塩基（対）の範囲内、１６０～１８０塩基（対）の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。

《プライマー採用工程》
　本明細書において、プライマー採用工程Ｓ１０７（図６）、プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７（図７）、ならびに第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７（図８）を総称して、単に「プライマー採用工程」という場合がある。

（第１の態様：　プライマー採用工程Ｓ１０７）
　図６において「プライマー採用」（Ｓ１０７）として示す。
　第１の態様において、（ｇ）プライマー採用工程は、上記第一段階選抜工程および上記第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。

（第２の態様：　プライマー採用第１工程Ｓ２０７およびプライマー採用第２工程Ｓ２１７）
　図７において「プライマー採用第１」（Ｓ２０７）および「プライマー採用第２」（Ｓ２１７）として示す。
　第２の態様において、（ｇ_１）プライマー採用第１工程は、上記第一段階選抜第１工程および上記第二段階選抜第１工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ_２）プライマー採用第２工程は、上記第一段階選抜第２工程および上記第二段階選抜第２工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。

（第３の態様：　第１のプライマー採用工程Ｓ３０７および第２のプライマー採用工程Ｓ３１７）
　図８において「第１のプライマー採用」（Ｓ３０７）および「第２のプライマー採用」（Ｓ３１７）として示す。
　第３の態様において、（ｇ－１）第１のプライマー採用工程は、上記第１の第一段階選抜工程および上記第１の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程であり、（ｇ－２）第２のプライマー採用工程は、上記第２の第一段階選抜工程および上記第２の第二段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の対象領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。

（プライマー採用の方法）
　プライマー採用工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメント・スコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメント・スコアが第２の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。

　例えば、表７に示す配列番号１および２の塩基配列について、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することを考える。

　既に記載したように、ローカルアラインメント・スコアは「＋１」であるから、第１の閾値である「＋３」未満であり、また、グローバルアラインメント・スコアは「－３」であるから、第２の閾値である「＋３」未満である。
　したがって、配列番号１で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号２で示されるプライマー候補の塩基配列を、対象領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。

《他の目的領域のプライマー設計》
　１つの目的領域に対してプライマーを採用した後、さらに他の目的領域に対してプライマーを設計してもよい。
　第１の態様においては、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、他の目的領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていれば、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３から行う。他の目的領域に対するプライマー候補の塩基配列が作成されていなければ、対象領域選択工程Ｓ１０１において目的領域が選択されていなかったので、対象領域選択工程Ｓ１０１において他の目的領域を選択し、プライマー候補塩基配列作成工程Ｓ１０２において、その目的領域に対するプライマー候補の塩基配列を作成した後、ローカルアラインメント工程Ｓ１０３以降を行う。
　第２の態様においては、対象領域選択第２工程Ｓ２１１において第１の目的領域以外の目的領域を選択するところからから繰り返す。
　第３の態様において、既に対象領域複数選択工程Ｓ３０１において選択した目的領域に対するプライマー候補の塩基配列がプライマー候補塩基配列複数作成工程Ｓ３０２において作成されているため、第２のローカルアラインメント工程Ｓ３１３から繰り返す。

《プライマー等の設計における特徴点》
　本発明のマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーの設計方法における、目的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーの設計方法における特徴点は、概していえば、複数の特定の対象領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、対象領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得ることにある。
　プライマーの塩基配列の相補性の確認における特徴点は、ローカルアラインメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマーの塩基配列の端部に対して、グローバルアラインメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点にある。
　さらに、プライマー候補の塩基配列を作成する際のＴｍ値として、目標値および実績値から算出したＴｍ値範囲を用いることによって、より安定した目的領域のＰＣＲ増幅が可能となる。

　以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
　単一細胞を用いて確定的診断レベル（感度９９．９%、特異度９９．９９９％程度）の精度で１３番染色体、１８番染色体、および２１番染異数性の検査を実施することを考える。
　先行実験として、３０ローカスを対象にマルチプレックスＰＣＲによる増幅を行い、増幅産物を次世代シークエンサーを用いてシークエンシングして、対象染色体の配列リード数を計測したところ、増幅の総合ＣＶ（対象染色体の配列リード数の変動係数）は約３０％であった。
　感度９９．９％、特異度９９．９９９％を達成するには、増幅の総合ＣＶ（対象染色体の配列リード数の変動係数）を、６．５％程度にする必要がある。
　そのために必要なローカス数Ｎは、
　Ｎ＝ｋ×ｃｅｉｌｉｎｇ（ｚ）
　ｚ＝先行実験でのローカス数×（先行実験での増幅の総合ＣＶ／目標ＣＶ）^２
により得ることができる。ただし、ｃｅｉｌｉｎｇ（ｚ）は実数ｚに対してｚ以上の最小の整数を表し、ｋは予め定められた係数を表す。
　すなわち、本実施例では、
　先行実験でのローカス数＝２０
　先行実験での総合ＣＶ＝３０％
　目標ＣＶ＝６．５％
　ローカス数を増加したことによるローカスあたりの配列リード数の変動係数の劣化は生じないものとして、係数ｋ＝１．０であるから、
　ｚ＝１．０×３０×（３０／６．５）^２≒６３９．０５
であり、
　必要ローカス数Ｎ＝ｃｅｉｌｉｎｇ（ｚ）＝６４０
となる。
　必要ローカス数を上回る６４７ローカスを対象に、マルチプレックスＰＣＲによる増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物をシークエンシングし、対象染色体の配列リード数を計測し、増幅の総合ＣＶを算出したところ、６．５％以下となり、感度９９．９％、特異度９９．９９９％で度確定的診断が可能であることが示された。
　本実施例ではローカス数を増加したことによる１ローカスあたりの配列リード数の変動係数の劣化は生じないものとして係数ｋ＝１．０としたが、１ローカスあたりの配列リード数の変動係数の劣化が生じる場合は、係数ｋを、例えば、ｋ＝１．１として、
　ｚ＝１．１×３０×（３０／６．５）^２≒７０２．９６
　必要ローカス数Ｎ＝ｃｅｉｌｉｎｇ（ｚ）＝７０３
としてもよい。

［実施例２］
（前提条件）
　妊婦末梢血から単離された細胞が、母親由来であるか胎児由来であるかを、９９％の精度で判定することを考える。
　母親のＳＮＰ型は別途口腔等から大量に細胞を採取し、ＡＤＯ等の単一細胞特融のノイズの影響を受けずに確定させることができるものとする。
　また、母親と父親は近親関係にないものとする。

（先行実験）
　先行実験として、ＳＮＰｓ２０座位でのマルチプレックスＰＣＲにより母子判別性を確認した。
　上記ＳＮＰｓ２０座位の平均的な変異頻度をｐとする。ただし、０＜ｐ＜１とする。
　このとき、親子で異なるジェノタイプを有する確率は２ｐｑ（ｐ^２＋ｐｑ＋ｑ^２）となる。ここで、ｑ＝１－ｐである。
　すなわち、この２０座位の全てにおいて母子のＳＮＰ型が一致する確率は約０．８％となるため、９９％以上の確率で母子を判別できるはずである。

　アレルドロップアウト率が０％である場合、母親の真のジェノタイプと末梢血から単離された胎児細胞のジェノタイプが、ホモ一致する確率、ヘテロ一致する確率、ヘテロ－ホモとなる確率、ホモ－ヘテロとなる確率、およびホモ不一致となる確率は、ＳＮＰｓの平均的な変異頻度をｐとすると、それぞれ、１－３ｐ（１－ｐ）、ｐ（１－ｐ）、ｐ（１－ｐ）、ｐ（１－ｐ）、および０となる。

　また、同様に、アレルドロップアウト率が０％である場合、母親の真のジェノタイプと末梢血から単離された母親細胞のジェノタイプが、ホモ一致する確率、ヘテロ一致する確率、へテロホモとなる確率、ホモ－へテロとなる確率、およびホモ不一致となる確率は、ＳＮＰｓの平均的な変異頻度をｐとすると、それぞれ、ｐ^２＋（１－ｐ）^２、２ｐ（１－ｐ）、０、０、および０となる。

　したがって、２０座位のＳＮＰｓの平均変異頻度を０．４５９６とすると、二項分布により、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプが、２０個中ｋ個のＳＮＰｓが、ホモ一致する個数、ヘテロ一致する個数、ヘテロ－ホモ不一致となる個数、ホモ－ヘテロで不一致となる個数、およびホモで不一致となる個数の分布は、それぞれ、図９に示すとおりとなる。

　同様にして、２０座位のＳＮＰｓの平均変異頻度を０．４５９６とすると、二項分布により、母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプが、２０個中、ホモ一致する個数、ヘテロ一致する個数、ヘテロ－ホモ不一致となる個数、ホモ－ヘテロで不一致となる個数、およびホモで不一致となる個数の分布は、それぞれ、図１０に示すとおりとなる。

　ところが、先行実験の結果、ＡＤＯ率（allelic dropout rate）が５０％であることが判明した。
　ＡＤＯ（allelic dropout）が５０％の確率で生じるため、真のジェノタイプがヘテロである座位のジェノタイプが、５０％の確率で、みかけ上ホモと判定されてしまうことになる。

　したがって、ＡＤＯ率が５０％であるとき、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプが、２０個中、ホモ一致する個数、ヘテロ一致する個数、ヘテロ－ホモ不一致となる個数、ホモ－ヘテロで不一致となる個数、およびホモで不一致となる個数の分布は、図１１に示すとおりに修正される。

　同様に、ＡＤＯ率が５０％であるとき、母親の真のジェノタイプと母親細胞のジェノタイプが、２０個中、ホモ一致する個数、ヘテロ一致する個数、ヘテロ－ホモ不一致となる個数、ホモ－ヘテロで不一致となる個数、およびホモで不一致となる個数の分布は、図１２に示すとおりに修正される。

　図１１および図１２からホモ－ヘテロとなる個数の分布を抜き出して重ねると、図１３に示すとおりとなる。
　母親細胞ではホモ－ヘテロとなることはないので、母子判別の精度は図１３において、図１１からのグラフと図１２からのグラフとが交わる面積に等しく、この場合は、約９３％で母子細胞を判別することができる。

　ＳＮＰｓ数を増加させると、胎児細胞の分布はグラフの右側に移動していくため、母子判別の精度が向上する。

　図１４に示すとおり、ＳＮＰｓ座位数を３５個としたときには、胎児細胞のグラフと母親細胞のグラフの重なりが０．０１を下回り、判別精度が９９％を超えるようになる。

　なお、以下の式
　Ψ（％）＝１００×｛１－（１－ξ）^χ｝（％）
　ξ＝ν（１－ν）（１００－Θ）／１００
（ただし、χ＝ＳＮＰｓ座位数、ν＝変異頻度、Θ＝ＡＤＯ率（％）である。）
にあてはめてみると、
　変異頻度０．４５９６、ＡＤＯ率＝５０％、およびＳＮＰｓ座位数２０個であるときの精度は、
　ξ＝０．４５９６×（１－０．４５９６）×（１００－５０）÷１００＝０．１２４２
　Ψ（％）＝１００×｛１－（１－０．１２４２）^２０｝≒９３％
より、約９３％となる。
　また、変異頻度０．４５９６、ＡＤＯ率＝５０％、およびＳＮＰｓ座位数３５個であるときの精度は、
　Ψ（％）＝１００×｛１－（１－０．１２４２）^３５｝≒９９％
より、約９９％となる。

　１１　演算手段（ＣＰＵ）
　１２　記憶手段（メモリ）
　１３　補助記憶手段（ストレージ）
　１４　入力手段（キーボード）
　１５　補助入力手段（マウス）
　１６　表示手段（モニタ）
　１７　出力手段（プリンタ）

Claims

　単一細胞からの染色体数定量のために必要なローカス数を決定する方法であって、
　複数回の反復試行により取得された実験結果である、対象染色体上のローカス数ｎおよび対象染色体の配列リード数の変動係数ｘが入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される実験結果入力工程と、
　目標性能である、対象染色体の配列リード数の変動係数ｙが入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される目標性能入力工程と、
　演算手段が、記憶手段から、ローカス数ｎ、変動係数ｘ、および変動係数ｙを読み出し、実験結果であるローカス数ｎおよび変動係数ｘならびに目標性能である変動係数ｙから、変動係数ｘがｙ以下となるために必要なローカス数Ｎを算出し、記憶手段に記憶する、必要ローカス数決定工程と、
　演算手段が、記憶手段から、染色体数定量のために必要なローカス数Ｎを読み出し、表示手段に表示する、結果表示工程と
を含む、必要なローカス数を決定する方法。
　前記実験結果入力工程において、前記対象染色体の配列リード数の変動係数ｘに代えて、前記対象染色体上のローカスあたりの配列リード数の変動係数ｘ’が入力され、記憶手段に記憶された場合において、
　前記実験結果入力工程の後、かつ、前記必要ローカス数決定工程の前に、さらに、
　演算手段が、記憶手段から、前記対象染色体上のローカス数ｎおよび前記対象染色体上のローカスあたりの配列リード数の変動係数ｘ’を読み出し、下記式
　ｘ＝ｘ’／ＳＱＲＴ（ｎ）
によって、対象染色体の配列リード数の変動係数ｘを算出し、記憶手段に記憶する、実験結果換算工程
を含む、請求項１に記載の方法。
　ただし、ＳＱＲＴ（ｎ）は、ｎの平方根を表す。
　前記目標性能入力工程において、変動係数ｙに代えて、感度Ｓｅ_Ｔ、特異度Ｓｐ_Ｔ、陽性適中率ＰＰＶ_Ｔ、または陰性適中率ＮＰＶ_Ｔが入力され、記憶手段に記憶された場合において、
　前記目標性能入力工程の後、かつ、前記必要ローカス数決定工程の前に、さらに、
　演算手段が、記憶手段から、感度Ｓｅ_Ｔ、特異度Ｓｐ_Ｔ、陽性適中率ＰＰＶ_Ｔ、または陰性適中率ＮＰＶ_Ｔを読み出し、目標とする、対象染色体の配列リード数の変動係数ｙに換算し、記憶手段に記憶する、目標性能換算工程
を含む、請求項１または２に記載の方法。
　前記目標性能換算工程において、
　感度Ｓｅ_Ｔが読み出された場合、正規分布に従う、染色体異数性がある細胞群を仮定すると、この細胞群において染色体異数性ありと判定される細胞の割合が感度であるから、これに目標とする感度Ｓｅ_Ｔを代入して、そのときの変動係数を目標とする変動係数ｙとする、
　特異度Ｓｐ_Ｔが読み出された場合、正規分布に従う、染色体異数性がない細胞群を仮定すると、この細胞群において染色体異数性なしと判定される細胞の割合が特異度であるから、これに目標とする特異度Ｓｐ_Ｔを代入して、そのときの変動係数を目標とする変動係数ｙとする、
　陽性適中率ＰＰＶ_Ｔが読み出された場合、予め与えられた有病率および下記式１を用いて、陽性適中率を感度および特異度に変換し、さらに、前記感度Ｓｅ_Ｔが読み出された場合および前記特異度Ｓｐ_Ｔが読み出された場合に従って、感度および特異度を、目標とする変動係数ｙに換算する、または、
　陰性適中率ＮＰＶ_Ｔが読み出された場合、予め与えられた有病率および下記式２を用いて、陰性適中率を特異度および感度に変換し、さらに、前記感度Ｓｅ_Ｔが読み出された場合および前記特異度Ｓｐ_Ｔが読み出された場合に従って、特異度および感度を、目標とする変動係数ｙに換算する、
請求項３に記載の方法。
　式１：　陽性適中率＝感度×有病率／（感度×有病率＋（１－有病率）（１－特異度））
　式２：　陰性適中率＝特異度×（１－有病率）／（特異度×（１－有病率）＋有病率×（１－感度））
　前記必要ローカス数決定工程において、演算手段が、記憶手段から、ローカス数ｎ、変動係数ｘ、および変動係数ｙを読み出し、下記式
　Ｎ＝ｆ（ｎ，ｘ，ｙ）＝ｃｅｉｌｉｎｇ（ｚ）
　ｚ＝ｋ×ｎ×（ｘ／ｙ）^２
によって、必要なローカス数Ｎを算出する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
　ただし、ｃｅｉｌｉｎｇ（ｚ）は実数ｚに対してｚ以上の最小の整数を表し、ｋは予め定められた１．０以上１．５以下の係数である。
　ｚ＝ｎ×（ｘ／ｙ）^２
である、請求項５に記載の方法。
　妊婦から単離した胎児由来が疑われる単一細胞が胎児由来であるか、または妊婦である母親由来であるかを、ＳＮＰｓジェノタイピングを用いて判定する際に必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法であって、
　ｍを２以上の整数として、ｍ個のＳＮＰｓ座位を解析する先行実験により得られた、ｍ個のＳＮＰｓの平均の変異頻度νおよびアレルドロップアウト率Θ％が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される実験結果入力工程と、
　目標精度Ψ％が入力手段を介して入力され、記憶手段に記憶される目標性能入力工程と、
　演算手段が記憶手段から、ＳＮＰｓ座位の個数ｍ、変異頻度ν、アレルドロップアウト率Θ％、および目標精度Ψ％を読み出し、
　アレルドロップアウト率Θ％である場合の、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプがホモ－ヘテロで不一致となるＳＮＰｓ座位の数がｍ個中０個である確率τを求め、
　アレルドロップアウト率Θ％である場合の、母親の真のジェノタイプと胎児細胞のジェノタイプがホモ－ヘテロで不一致となるＳＮＰｓ座位の数がｍ個中０個である確率υ＝１を求め、
　Φ＝１００×（υ－τ）を計算し、
　ｍを１ずつ増加して行き、Φ≧Ψとなる最小の整数ｍを算出し、必要なＳＮＰｓ座位数Ｍとして記憶手段に記憶する、必要ＳＮＰｓ座位数決定工程と、
　演算手段が、記憶手段から、妊婦から単離した胎児由来が疑われる単一細胞が胎児由来であるか、または妊婦である母親由来であるかを、ＳＮＰｓジェノタイピングを用いて判定する際に必要なＳＮＰｓ座位数Ｍを読み出し、表示手段に表示する、結果表示工程と
を含む、必要なＳＮＰｓ座位数を決定する方法。
　前記必要ＳＮＰｓ座位数決定工程において、演算手段が記憶手段から変異頻度ν、アレルドロップアウト率Θ％、および目標精度Ψ％を読み出し、下記式
　Ｍ＝ｈ（ν，θ，ψ）＝ｃｅｉｌｉｎｇ（χ）
　χ＝κｌｏｇ（１－ψ）／ｌｏｇ（１－ξ）
　ξ＝ν（１－ν）（１－θ）
　ψ＝Ψ／１００
　θ＝Θ／１００
によって、必要なＳＮＰｓ座位数Ｍを算出する、請求項７に記載の方法。
　ただし、ｃｅｉｌｉｎｇ（χ）は実数χに対してχ以上の最小の整数を表し、κは予め定められた１．０以上１．５以下の係数である。
　χ＝ｌｏｇ（１－ψ）／ｌｏｇ（１－ξ）
である、請求項８に記載の方法。