CN105899680B - 核酸探针和检测基因组片段的方法 - Google Patents

Abstract

本文尤其提供一种处理核酸样本的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：a)使包含靶片段的样本与核酸探针杂交，所述核酸探针包含：i.头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和所述尾部序列在第一寡核苷酸分子的末端处；以及ii.夹板序列，所述夹板序列依次包含：与所述头部序列互补的上游侧翼序列、与所述靶片段互补的靶标互补序列以及与所述尾部序列互补的下游侧翼序列；从而产生杂交产物，其中所述靶片段的末端可连接地邻近所述第一寡核苷酸分子中的头部序列和尾部序列的末端；以及b)将所述靶片段的末端连接至所述第一寡核苷酸分子的头部序列和尾部序列的末端，从而产生包含所述靶片段以及所述头部序列和尾部序列的环状产物。还提供用于进行所述方法的探针和试剂盒。

Description

核酸探针和检测基因组片段的方法

交叉引用

本申请要求2013年12月2日提交的英国申请号1321191.7的权益，所述申请以引用的方式并入本文。

发明领域

本公开涉及用于检测生物样本中的特定核酸序列的探针，尤其是用于在并行检测多个特定序列的多重方法中使用的探针，并且涉及其中这类探针用于检测核酸的片段的方法。具体地说，本公开涉及靶向来自特定染色体的DNA片段以供下游分析。

背景

人单倍体基因组包含包装在23条染色体中的30亿个碱基对，并且二倍体基因组具有在23对染色体中的60亿个碱基对。现代测序技术的快速性和便利性使得许多诊断问题能够使用个体的整个基因组或样本中的DNA的总量的高通量测序来研究。然而，对于许多DNA诊断应用来说，仅需要研究基因组的子组，从而集中于已知与所研究的特定病症相关的一个或多个区域。

已描述了用于在分析之前降低基因组的复杂性的许多技术。在仅需要分析基因组的单个短区的情况下，这可使用直接PCR来使用任一侧上的已知区域的引物扩增序列来进行。然而，当希望扩增基因组样本的许多区域以供分析时，扩增假象可作为在同一反应混合物中一起执行多个不同扩增的结果出现。

WO2003/044216(Parallele Bioscience,Inc.)和US20090004701A1(MalekFaham)描述了一种多重扩增靶核酸的方法，其中常见寡核苷酸引物被连接至单链核酸片段内部的位点。共同引发位点被附加至多个不同靶序列中的每个以允许其化学计量扩增。

WO2005/111236(Olink AB)也描述了一种通过扩增特定靶序列鉴别人基因组中的序列的方法。所述方法涉及将基因组样本片段化成具有至少一个确定的末端序列的片段。使全部包含引物对基序的选择子构建体(selector construct)与所述片段相接触。在连接之后，使用对与选择子共有的引物对基序具有特异性的引物对并行扩增所选择的靶序列。在WO2005/111236中描述的选择子构建体具有与短寡核苷酸杂交的长寡核苷酸，每个选择子构建体具有与含有靶序列的片段的限定末端序列互补的一个或两个突出末端。使所述选择子与靶片段接触导致所述靶片段在一个或多个选择子的突出末端之间的杂交。在具有两个突出末端的单个选择子的情况下，这种杂交产生环化构建体。在各自具有一个突出端的一对选择子的情况下，这形成线性构建体。含有靶片段的选择子构建体的连接和测序允许测定靶序列。因为选择子构建体仅与含有靶序列的片段的末端部分杂交(或与一个末端部分和一个内部部分杂交)，因此所述方法允许选择在非杂交部分中不同的靶序列，以使得每个选择子分子能够与多种不同的靶序列杂交。然后通过对构建体进行扩增和测序来确定精确靶标的身份。WO2005/111236提议在分析遗传变异性的方法中使用选择子或使用选择子用于DNA拷贝数测量。

GB2492042描述了选择子方法的一种变化形式，其中使片段与包含选择子寡核苷酸和至少一个载体寡核苷酸的部分双链探针相接触。选择子寡核苷酸包含对靶片段具有特异性的两个非相邻区以及包含载体寡核苷酸的至少两个结合位点的非靶标特异性区域。载体寡核苷酸不与靶序列互补，并且包含与选择子寡核苷酸上的载体结合位点互补的核苷酸序列。载体寡核苷酸还包含用于检测/富集的元件。在所述方法中，将探针寡核苷酸的互补部分与靶片段杂交，随后连接载体寡核苷酸和靶标以产生探针-靶标片段杂合体，然后检测所述杂合体。

选择子技术的开发在WO2011/009941(Olink Genomics AB)中进行了描述，其描述将经消化基的因组DNA的片段的一端连接至探针。与涉及结合至靶片段的两个区域并且其中待分离的序列通常由已知序列的两个区域结合的先前选择子探针相比，WO2011/009941中的探针被描述用于在仅存在序列的一个已知区域的情况下使用。WO2011/009941中的探针的一些实施方案包含用于固定至固相的元件。靶核酸片段与探针的连接引起靶片段的稳定捕获并且允许使用高度严格的洗涤步骤来除去未连接片段，从而产生高特异性。

还已知的是锁式探针(padlock probe)。锁式探针是具有在末端处的靶互补序列和在末端之间的非靶互补序列的线性寡核苷酸。当与正确靶DNA序列杂交时，所述探针的两个末端头尾在一起并且可通过DNA连接酶连接。连接由连接接合点处的错配抑制，因此锁式探针的成功连接取决于与靶序列的高度特异性杂交，从而允许所述探针区分高度相似的靶序列并且选择性地锁住其精确靶标。由于双链DNA的螺旋性质，所述环化探针分子链接至靶DNA链。

已知使用滚环复制扩增链接的锁式探针，也称为滚环扩增。滚环复制在US 5,854,033(Lizardi)中进行了描述。滚环复制是使用链置换DNA聚合酶扩增环状核酸分子，从而产生含有扩增序列的串联重复序列的大DNA分子。DNA聚合酶催化在所需情况下进行的持续滚环聚合反应中的引物延伸和链置换。它产生高于单个PCR复制循环和其他扩增技术多个数量级的环化探针序列的扩增，其中每个循环限于靶序列的拷贝数目的加倍。可使用链置换反应的级联来获得另外扩增。

Fredriksson等人(Nucleic Acids Res.35(7):e47 2007)描述“基因收集器(Gene-Collector)”，一种用于使用含有与所需PCR产物的同源引物末端序列互补的相邻序列的收集器探针多重扩增核酸的方法，以使得收集器探针与PCR产物的结合使PCR产物的末端在一起以形成DNA环。然后使用滚环扩增进行通用扩增以产生靶序列的多联体的最终产物。此方法允许选择性地检测多重PCR反应中的正确扩增子，因为正确扩增子的末端序列是同源引物对并且通过收集器探针环化，而组合来自一对的引物与来自引另一对的PCR假象未环化。

发明概述

本公开提供用于分析核酸片段如片段化的基因组DNA的改进的方法和探针。本发明的一些实施方案涉及探针以及其在针对靶单链核酸片段的存在测试样本的方法中的用途。本发明的一些实施方案涉及探针，所述探针包含

靶向寡核苷酸，其含有为靶片段的互补序列的靶标互补序列和与所述靶标互补序列相邻的侧翼序列，以及

具有游离5’或3’端的寡核苷酸序列，

其中所述片段与所述探针之间的杂交使靶片段模板化以用于连接至寡核苷酸序列的游离5’或3’端。

本发明的一些实施方案还涉及沿单链核酸片段的长度杂交且连接至所述片段的各端的探针。所述探针包含具有游离5’端的寡核苷酸序列和具有游离3’端的寡核苷酸序列，用于连接至所述靶片段的各端。然后检测连接产物，从而允许所述限定核酸片段的高度特异性靶向和检测。

根据本发明的一些实施方案的方法可包括将DNA消化成具有限定序列的片段，使所得DNA片段变性为单链片段(靶标)并且将所述靶标与如本文所述的探针混合。所述靶标与所述探针的杂交产生用于连接的模板以将所述靶标特异性地连接至对应探针以产生环状或线性连接产物。所述连接产物然后可例如通过外切核酸酶或固相化学来富集，且任选地通过滚环扩增、PCR或其他DNA扩增方法来扩增。

本发明的一些实施方案的关键优点在于并行分析大量DNA片段。大量DNA片段可被特异性地靶向且选择用于下游分析。这特别适用于母体血流中的无细胞胎儿DNA的无创产前检查(NIPT)，其中对数千个染色体特异性DNA片段进行计数产生非常精确的定量。

一方面，提供一种针对靶核酸的存在测试样本的方法。所述方法通常涉及产生限定靶核酸片段，使所述样本与沿所述靶片段的长度杂交且在所述片段的3’和5’端中提供可连接的接合点的探针相接触，将所述靶片段在所述3’和5’端处连接至所述探针，并且然后检测通过双重连接事件形成的新的核酸分子。

一方面提供一种针对靶核酸的存在测试样本的方法，所述方法包括：

(i)提供片段化核酸的样本

(ii)提供变性条件，在所述变性条件下所述靶片段为单链

(iii)使所述样本与核酸探针相接触，所述核酸探针包含

靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列，以及

分别具有游离的5’端和3’端的头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和尾部序列分别与所述上游侧翼序列和下游侧翼序列互补，

(iv)提供退火条件，在所述条件下所述头部序列和尾部序列与所述侧翼序列杂交，并且所述靶片段(如果存在)与所述靶标互补序列杂交，由此将所述靶片段的末端定位成与所述头部序列的5’端和所述尾部序列的3’端并置

(v)提供用于连接的条件，以使得如果存在靶片段，则将所述靶片段的3’端连接至所述头部序列的5’端以形成第一连接接合点，并且将所述靶片段的5’端连接至所述尾部序列的3’端以形成第二连接接合点，从而产生双重连接的产物，所述产物包含核酸的连续链，所述核酸包含所述头部序列和尾部序列以及所述靶片段，以及

(vi)检测是否存在所述双重连接的产物，

其中检测到所述双重连接的产物指示所述样本中所述靶片段的存在。

与大多数其他DNA选择和检测方法相比，本发明方法在整个核酸片段是预先限定或预先确定——即在所述靶片段的序列提前已知时是特别有用的。在本发明方法的一些实施方式中，所述靶片段是核酸的特异性片段化的产物，而不是如可通过物理方式如剪切或超声处理产生的随机片段化的产物。核酸的特异性片段化可使用限制酶、PCR或其他序列定向片段末端限定来实现。

希望靶向寡核苷酸接触整个靶片段以确保精确靶序列的特异性结合。这与早期方法形成对比，在所述早期方法中，探针被设计成与所述片段的一个端或多个端杂交和/或与内部区域杂交而不沿靶片段的长度结合。确实，与靶片段的有限的结合是许多早期探针中的有意设计特征，因为它允许在片段的序列仅部分已知时靶向且检测所述片段。通过特异性地靶向已知序列的片段——受制于由群体中的不同等位基因产生的轻微序列变异性的可能性，在适用的情况下——本发明方法的探针和方法可允许以非常低的假阳性结果风险精确结合和检测所需靶片段。

所述靶片段的双重连接可进一步有助于所述方法的高特异性。所述探针变得在各端连接至靶序列，即连接至核酸的单链片段的5’端和3’端。因此，通过片段化特异性产生的靶标的末端可通过与头部序列和尾部序列的序列特异性连接来特异性地检测。所述连接的序列特异性性质通过对靶片段与以及头部序列和尾部序列与靶向寡核苷酸的杂交的要求且通过受碱基对错配抑制的DNA连接酶的灵敏度实现。靶片段与靶向寡核苷酸的杂交有助于结合的特异性，但与相对于在靶片段的3′端和5′端处的错配提供最高选择性的连接反应相比，所述杂交通过在靶标的中心部分中的内部错配而最大程度地去稳定化。

所述靶向寡核苷酸用于模板化所述靶片段与所述头部序列和尾部序列的连接。所述头部序列和尾部序列与所述侧翼序列杂交，从而在所述头部序列的5’端与所述尾部序列的3’端之间限定空位。所述靶片段与靶标互补序列在所述空位中杂交，从而将所述靶片段的末端定位成与所述头部序列的5’端和所述尾部序列的3’端并置。优选地，所述靶片段以及所述头部序列和尾部序列与探针退火产生两个完全匹配的可连接的接合点。所述双重连接的产物然后是包含所述头部序列和尾部序列以及所述靶片段的核酸的连续链。

涵盖所述探针的多种可能的设计。例如，用于连接至靶片段的5’端和3’端可由两个单独主链寡核苷酸上的头部序列和尾部序列提供，或由在形成环状以将靶片段定位在5’端与3’端之间的单一主链寡核苷酸的相应末端处的头部序列和尾部序列提供。

在第一种情况(两个单独的主链寡核苷酸)下，所述靶片段与所述两个主链寡核苷酸的连接产生包含在所述头部序列与尾部序列之间的靶片段的核酸的线性链。

在第二种情况(单一环状主链寡核苷酸)下，所述靶片段的连接产生包含在所述头部序列与尾部序列之间的靶序列的核酸的环。

在其他型式中，头部序列和尾部序列中的一个或两个可被提供在所述靶向寡核苷酸本身上，以使得所述靶向寡核苷酸在退火条件下形成环状结构。取决于设计，在这类情况下所述双重连接的产物可以是线性或环状核酸分子。

所述产物的检测依赖于所述靶片段与所述头部序列和尾部序列的成功连接以形成核酸的连续链。一般而言，使用需要两种连接事件都发生以便产生信号的方法来检测所述双重连接的产物。例如，检测可包括跨两个连接接合点扩增(例如，通过PCR或，对于探针的环化实施方案，滚环复制)或捕获在一端处的连续核酸链且检测其另一端。所述靶片段与所述探针通过连接的共价连接形成强键，因此严格的洗涤可用于去除未连接的核酸，其中所述头部序列和尾部序列未共价连接，所述序列与靶向寡核苷酸的相互杂交通过洗涤破坏。

所述方法和所述探针的这些特征实现靶片段的高特异性选择。当所述方法被应用于并行多重检测多个靶片段时，靶核酸的非常精确的检测和定量是可能的。由于其高特异性，本发明的方法可特别适合于小样本中的诊断用途和/或用于检测相对量的不同靶核酸的非常小的差异，例如用于诊断来自母体血液的样本的胎儿染色体的非整倍性，或用于检测来自患者的正常组织的样本中的痕量肿瘤DNA的存在或检测来自感染剂的核酸片段。

具有高特异性靶片段识别使能够使用相对高的探针浓度而不产生假阳性信号，从而提高产率和反应效率。这可在诊断应用中具有高度重要性，在所述诊断应用中，低变异性为重要的，且例如NIPT中通过分析无细胞的DNA、检测无细胞的循环癌症DNA以及检测来自感染剂的DNA，靶标可能以低数目存在。本发明方法的一些实施方案实现短DNA片段的高特异性分析，其在用于分析血液或福尔马林固定的石蜡包埋的DNA中的片段化DNA样无细胞的DNA的应用中具有重要性。

参考图3和图4，本文尤其提供一种处理核酸样本的方法。在一些实施方案中，所述方法可包括：a)使包含靶片段(“DNA靶标”)的样本(例如，已用限制酶消化的样本)与包含以下的核酸探针杂交：i.头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和尾部序列在第一寡核苷酸分子的末端处；以及ii.夹板序列(其中术语“夹板序列”意图指寡核苷酸中当与两种或更多种其他多核苷酸杂交时充当“夹板”以将所述多核苷酸定位成彼此相邻以使得它们可被连接在一起的序列，如在图3和4中所示)。如在图3和图4中所示，在此方法中使用的夹板序列(在一些情况下其被称为“靶向寡核苷酸”)包含与头部序列互补的上游侧翼序列；与靶片段互补的靶标互补序列；以及与尾部序列互补的下游侧翼序列。此杂交步骤产生杂交产物，其中靶片段的末端可连接地邻近第一寡核苷酸分子中的头部序列和尾部序列的末端，其中术语“可连接地邻近”在可连接地彼此邻近的两个序列的背景下意指在两种寡核苷酸之间不存在插入核苷酸并且它们可使用连接酶连接至彼此。所述方法的下一步骤包括b)将所述靶片段的末端连接至所述第一寡核苷酸分子的头部序列和尾部序列的末端，从而产生包含所述靶片段以及所述头部序列和尾部序列的环状产物。所述连接步骤在图1中示出(如在图3和4中所示，虽然所述方法可以多种不同的方式实施，并且如此在所述方法的第一步骤中使用的核酸探针可由一种或两种寡核苷酸组成)。

环化产物提供对于检测的显著优点，因为它们可通过滚环扩增(RCA)进行扩增。RCA在单个分子中产生数百或数千个环化产物的拷贝，从而有效地扩增环化产物并且使其使用例如与所述产物中的基序杂交的标记的寡核苷酸相对易于检测。

如在图1中所示，所述方法还可包括使用与核酸探针中的序列(例如，头部序列、尾部序列或其之间的序列)杂交的引物通过滚环扩增来扩增所述环状产物。在这些实施方案中，所述方法还可包括定量所产生的滚环扩增产物的数目，从而提供所述样本中的所述靶片段的量的估计。在这些实施方案中，所述产物可使用与环状产物中某处的序列互补的引物通过滚环扩增进行扩增以产生多种RCA产物，例如，对应于单一、“克隆的”片段的产物。滚环扩增产物的数目可通过例如以下方式来估计：将RCA产物分布在支持体(载玻片)的表面上，使用标记的寡核苷酸(例如，荧光标记的寡核苷酸)杂交RCA产物且然后通过显微镜(例如荧光显微镜)对所述支持体的区域中的离散信号的数目进行计数。标记可在所述产物已被分布在所述支持体上之前或之后进行，并且因为每种RCA产物包含相同序列的数千个拷贝，所以应当存在标记的寡核苷酸的数千个结合位点，从而增加信号。在多重实施方案(例如，其中对对应于两条不同染色体的RCA产物进行计数)中，对应于一条染色体的RCA产物可用一种荧光团标记，并且对应于另一条染色体的RCA产物可用不同的荧光团标记，从而允许单独地对不同的RCA产物进行计数。

定量来自单独RCA产物的信号是有意义的，因为在许多应用(例如，通过分析无细胞的DNA进行的无创产前诊断)中，对应于特定染色体(例如，染色体21)的片段的数目需要非常准确地且无偏地测定。典型分析方法使用PCR，PCR如所熟知的是非常偏倚性的程序，在于一些序列比其他序列以更高效率地扩增。这使得基于PCR的策略对于许多诊断工作来说是不实际的。

在替代实施方案中且如图1中所示，靶片段可通过PCR扩增且定量。如将是清楚的，被添加至靶片段和/或PCR引物的侧翼序列可与在例如Illumina的可逆终止子方法、Roche的焦磷酸测序方法(454)、Life Technologies的通过连接测序(SOLiD平台)或LifeTechnologies的Ion Torrent平台中使用相容。这类方法的实例描述于以下参考文献中：Margulies等人(Nature 2005 437:376–80)；Ronaghi等人(Analytical Biochemistry1996 242:84–9)；Shendure(Science 2005 309:1728)；Imelfort等人(BriefBioinform.2009 10:609-18)；Fox等人(Methods Mol Biol.2009；553:79-108)；Appleby等人(Methods Mol Biol.2009；513:19-39)以及Morozova(Genomics.2008 92:255-64)，所述参考文献以引用的方式并入以用于所述方法和所述方法的具体步骤，包括所述步骤中的每个的所有起始产物、试剂和最终产物的一般性描述。在这些实施方案中，可对环状产物进行扩增和测序，并且样本中的片段的丰度可通过对对应于所述片段的序列读段(read)的数目进行计数来估计。

在某些实施方案中且如图3中所示，夹板序列可在与头部序列和尾部序列不同的分子中，即“第二”寡核苷酸分子。如此，在所述方法开始时使用的核酸探针可由两种寡核苷酸(“主链”和“靶向”寡核苷酸，如图3中所示)组成。

在其他实施方案中且如图4中所示，夹板序列可在与头部序列和尾部序列相同的分子中，即在“第一”寡核苷酸分子中。如此，在所述方法开始时使用的核酸探针可由单一寡核苷酸组成。

靶标互补序列可具有任何长度，这取决于核酸探针中的靶标互补序列的长度。在一些实施方案中，靶标互补序列的长度是10至100个核苷酸，例如，10至50或10至30个核苷酸。如以下所指出，靶标互补序列包含与靶片段的一个或多个错配(例如，1、2、3、4、5或6个或更多个，达10个或更多个)，并且在某些情况下，靶标互补序列的反向互补序列可与所述靶片段至少80％、至少90％或至少95％相同。

取决于设计，侧翼序列可具有任何长度。在一些实施方案中，侧翼序列的长度是10与40个核苷酸，例如，10与30个核苷酸。

在一些实施方案中，所述样本可包含基因组DNA，例如，来自实际上任何生物体的基因组DNA的片段，所述生物体包括但不限于植物、动物(例如，爬行动物、哺乳动物、昆虫、蠕虫、鱼类等)、组织样本、细菌、真菌(例如，酵母)、噬菌体、病毒、尸体组织、考古/古老样本等。在某些实施方案中，用于所述方法中的基因组DNA可源自哺乳动物，其中在某些实施方案中所述哺乳动物是人。在示例性实施方案中，基因组样本可包含来自哺乳动物细胞的基因组DNA，所述哺乳动物如人、小鼠、大鼠或猴细胞。所述样本可由培养的细胞或临床样本的细胞制成，例如法医样本的组织活检、刮擦或灌洗或细胞(即，在犯罪现场收集的样本的细胞)。在具体实施方案中，核酸样本可从生物样本如细胞、组织、体液和粪便获得。目标体液包括但不限于，血液、血清、血浆、唾液、粘液、痰、脑脊髓液、胸膜液、泪液、乳管液、淋巴液、痰液、脑脊髓液、滑膜液、尿液、羊水以及精液。在具体实施方案中，样本可从受试者，例如人获得。在一些实施方案中，所分析的样本可以是从血液，例如从妊娠女性的血液获得的无细胞DNA的样本。在某些实施方案中，基因组DNA可在片段化之前例如使用全基因组扩增方法进行扩增。

在夹板序列在第二寡核苷酸分子(如图3中示出)的实施方案中，所述第二寡核苷酸可另外包含可用于富集环状产物的捕获部分。在这些实施方案中，所述方法可包括：c)通过结合所述捕获部分将环状产物固定至固相；以及d)洗涤所述固相以除去未连接的核酸和其他反应组分；从而富集所述环状产物。例如，第二寡核苷酸可包含生物素部分，例如生物素或生物素类似物如脱硫生物素、氧化生物素、2’-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等，有或无接头，例如，─LC-生物素、─LC-LC-生物素、─SLC-生物素或─PEGn-生物素，其中n是3-12，并且环状产物可使用偶联至链霉亲和素的基质来富集。生物素结合链霉亲和素的亲和力是至少10^-8M。

对于无创产前检查实施方案中，靶片段可来自人染色体21、13或18。

在一些实施方案中，所述方法包括使样本与一组至少50(例如，至少100、至少200、至少500、至少1,000、至少2,000或至少5,000)个所述探针杂交，其中所述探针靶向在同一染色体(例如，人染色体21、13或18)上的不同片段，并且其中所述方法产生包含靶片段的多种环状产物。所产生的环状产物的数量可通过例如使用RCA扩增它们且对RCA产物的数量进行计数来进行定量，如上所述。

在一些实施方案中，所述方法包括使所述样本与所述组核酸探针中的第一组和第二组杂交，其中所述第一和第二组探针分别靶向所述样本中的第一染色体和所述样本中的第二染色体(即，与片段杂交且连接以产生环状产物，如上所述)；通过滚环扩增(RCA)扩增所述环状产物且比较对应于所述第一染色体的RCA产物的数量与对应于所述第一染色体的RCA产物的数量，从而提供来自所述样本中的染色体的DNA的相对量的估计。

在一些实施方案中，所述方法包括使所述样本与所述组核酸探针中的第一组和第二组杂交，其中所述第一和第二组探针分别靶向所述样本中的染色体的第一区和第二区(即，与片段杂交且连接以产生环状产物，如上所述)；通过滚环扩增(RCA)扩增所述环状产物且比较对应于所述第一染色体区的RCA产物的数量与对应于所述第二染色体区的RCA产物的数量，从而提供来自所述样本中的染色体区的DNA的相对量的估计。例如，此实施方案可用于鉴别例如缺失或复制。

本文还提供组合物，所述组合物包含核酸探针，所述核酸探针包含：i.头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和尾部序列是在第一寡核苷酸分子的相对端处；以及ii.夹板序列，所述夹板序列依次包含：与所述头部序列互补的上游侧翼序列，与人基因组中的靶片段互补的靶标互补序列以及与所述尾部序列互补的下游侧翼序列；其中所述探针被设计成使得当所述第一寡核苷酸、所述夹板序列以及所述靶片段彼此杂交时，所述靶片段的末端可连接地邻近所述第一寡核苷酸分子中的头部序列和尾部序列的末端。在某些实施方案中，所述组合物可包含第一组至少50(例如，至少100、至少200、至少500、至少1,000、至少2,000或至少5,000)个核酸探针，其中所述探针的靶标互补序列与第一人染色体(例如，染色体是21、13或18)的不同靶片段互补。

在某些实施方案中，所述组合物可包含第二组至少50(例如，至少100、至少200、至少500、至少1,000、至少2,000或至少5,000)个所述核酸探针，其中所述第二组探针中所述探针的靶标互补序列与第二人染色体的不同靶片段互补。在一些实施方案中，第一人染色体可以是染色体21并且第二人染色体可以是染色体13或18。在一些情况下，第二人染色体不是染色体21、13或18。

附图简述

熟练技术人员将理解，以下所述附图仅出于说明目的。这些附图并非意图以任何方式来限制本教导的范围。

图1示意性地示出主题方法的一个实施方案，其中形成环状DNA分子且通过RCA或PCR扩增所述环状DNA分子。

图2示意性地示出主题方法的一个实施方案，其中形成线性连接产物且用固相试剂富集所述线性连接产物。

图3示出包含结合至其靶片段的环化主链寡核苷酸的探针。所述探针以两种型式，A和B示出。

图4示出具有结合的靶片段的环化单一寡核苷酸探针。

图5示出由靶向寡核苷酸和环状主链寡核苷酸组成的具有结合的靶片段的环化双环探针。

图6示出由靶向寡核苷酸和线性主链寡核苷酸组成的具有结合的靶片段的线性环状探针。

图7示出包含两种主链寡核苷酸的具有结合的靶片段的线性探针。

图8是示出本文所述的方法的特异性的凝胶的图像。

图9是示出本文所述的方法的精确度的图。

图10图A示出载玻片的表面上的标记的RCA产物的图像；图B示出来自不同染色体的片段的比率可通过对单独RCA产物进行计数来准确地测定的方式。

详述

靶核酸片段

由探针结合的靶片段是核酸的单链片段。在一些实施方案中，本发明的方法结合序列为预先限定的靶片段。包含末端的整个片段的序列可以是已知的。预先限定序列的已知片段可通过核酸的特异性而不是随机片段化产生。特异性片段化方法包括用限制酶消化、PCR(例如，多重PCR)以及其他序列定向片段末端限定方法，包括其他酶、核酶或这类技术的组合。

片段化的一种方法是用限制性内切核酸酶或两种或更多种限制性内切核酸酶的组合消化。因此，片段化核酸的样本可以是限制酶消化产物并且靶片段可以是限制片段。

多种特异性核酸裂解酶是已知的并且任何合适的酶可用于本发明中，包括在特定核酸序列内的预先限定的位置处裂解的酶，或在特定核酸识别序列之后或之前裂解的内切核苷酸以及切口酶。催化核酸如核酶也可用于DNA片段化。所述酶可裂解双链核酸以产生平末端或粘性末端，或可裂解核酸的单链。各种类型的限制酶是已知的，包括I型、II型、III型、IV型以及V型。合适的酶或酶的组合可根据需要被选择用于所述方法中。例如，样本中的核酸(例如10ng的DNA)可在对应相容的限制酶缓冲液中用限制酶(例如，1U)消化。所述反应可在合适的条件下孵育(例如，37℃持续1小时)，接着进行酶失活(例如在80℃下持续20分钟)。

提供片段化核酸的另一种方便的方法是使用引物用于扩增来自所述核酸的特异性线性序列。可使用多重PCR，用多个特异性引物对处理核酸以扩增多个特异性片段。在这种情况下，靶片段的末端对应于所述对引物的序列。

对于许多诊断和其他应用，样本是片段化染色体(例如，人染色体或微生物染色体)的样本。靶片段可以是对生物体的基因组的一条染色体特异的基因组片段。换言之，靶片段可仅在基因组的一条染色体中找到，而未在所述基因组的其他染色体中找到。通常，所述方法将用于人基因组的分析，在所述情况下，靶片段可以是对一条人染色体特异的片段，即在该染色体中发现而未在其他人染色体中发现的片段。例如，所述片段可以是对染色体21特异的。

靶片段可对染色体的一个基因座是特异的。因此，它可在所述染色体基因座中发现，而未在同一染色体的其他基因座或同一基因组的其他染色体中发现。例如，所述片段可对人染色体的一个基因座是特异的。

样本中给定种类的核酸可涵盖一些可变性，例如样本可包含不同个体的染色体，如从含有母体DNA和胎儿DNA的母体血液获得的核酸。在此目标种类可以是特定染色体，但方便的是检测所述染色体的所有拷贝，无论是胎儿还是母体来源的。因此，目标种类可以是一条染色体或染色体基因座，并且靶序列在所述染色体或染色体基因座的母体和胎儿拷贝两者中在所述染色体或基因座中发现。

核酸的样本可以任何合适的方式提供，例如作为来自患者的生物组织或流体的样本。样本可以是血液样本、全血、血浆或血清、组织样本，例如福尔马林固定的石蜡包埋的组织样本，或者可以是从血液或组织中提取的核酸的样本。

样本可以是包含核酸的任何样本。包含在样本中的核酸可以是DNA和/或RNA。所述样本可以是复杂的，例如全基因组DNA或来自全生物体、组织或细胞群体或其级分的cDNA。在此方面，它可以是例如核酸分离程序的直接产物或细胞溶解程序的直接产物，或者它可进一步以某种方式分级分离或纯化，例如它可包含已部分或完全以某种方式分离或以任何方式处理的核酸(例如RNA)以产生cDNA。样本可来自任何真核或原核或病毒来源，例如可以是微生物(例如细菌或真菌)、植物或动物。优选地，样本为人来源，例如，人基因组DNA。所述样本可以是来自动物的组织或血液样本，其中待检测的核酸是微生物的，例如细菌的、病毒的或真菌的。对于与无创产前诊断相关的方法，样本源自孕妇的血液并且包含胎儿DNA。在其他实例中，待检测或定量的核酸是肿瘤相关的DNA。

通常，所述方法可在体外对样本进行。因此，所述方法通常不包括对人或动物身体体内进行的诊断或通过手术或疗法进行的人或动物身体的治疗方法。尽管如此，体外诊断方法的结果仍可用于告知患者的后续治疗。

使靶核酸变性

探针通过单链片段与靶向寡核苷酸的靶标互补序列之间的杂交识别并结合呈单链形式的靶核酸。因此，如果样本中的靶片段不再是单链的，则应提供变性条件以使单链靶片段与其互补核酸链分离。

所述变性条件可以是足够高的温度以便使所述靶片段与其互补序列分离。变性条件可在95℃下孵育合适的时间，例如10分钟。或者可进行化学变性。

互补性

一种针对靶片段的存在测试样本的方法可包括使所述样本与核酸探针相接触，其中所述探针包含

靶向寡核苷酸，其含有为靶片段的互补序列的靶标互补序列和与所述靶标互补序列相邻的侧翼序列，以及

具有游离的5’或3’端的寡核苷酸序列，其中所述寡核苷酸序列与所述侧翼序列互补。

探针的合适浓度可基于样本中的一个或多个靶片段的浓度(或预期浓度)来测定。如在实施例中所说明，探针可以10pM/探针的浓度添加至样本。在使样本与多个探针(例如一组探针)相接触的情况下，单独探针的浓度可以是10pM。优选地，探针以超过待检测或定量的目标核酸物种的预期浓度使用。使用过量探针应确保识别存在于样本中的靶序列的所有拷贝。这使检测的灵敏度最大化。此外，在方法涉及定量的情况下，应确保连接产物或来自一组探针的累积信号的检测与样本中的靶序列的量成比例。

在退火条件下，靶片段(如果存在)与靶向链的靶标互补序列杂交并且寡核苷酸序列与侧翼序列杂交，以使得寡核苷酸序列的游离5’或3’端分别与靶片段的3’或5’端并置。因此，靶向寡核苷酸使靶片段模板化以用于连接至寡核苷酸序列。在双重连接事件中，靶片段的3’端可被连接至头部序列的5’端，并且靶片段的5’端可被连接至尾部序列的3’端。

在根据本发明的探针中，如果靶标互补序列是靶片段的精确互补序列，以使得在它们之间存在完美杂交，则实现对靶片段的最大特异性。然而，这不是在所有情况下必需的，并且可接受较小程度的错配，例如在希望检测片段，而不管存在于样本中的精确等位基因的情况下以允许检测表现出等位基因变异的片段。或者，多个探针可被设计用于变体序列。这能够实现不同等位基因或突变的检测和区分。根据本发明的探针最有利地用于多重方法中，其中大量不同的探针包括于反应中。在所述多个探针内，设想大多数探针将对于其靶片段具有完美互补性，但一些探针可以少量错配结合靶标。

优选地，靶标互补序列与靶片段具有少于5个碱基对错配。在靶片段与靶标互补序列之间可任选地存在一个、两个、三个或四个碱基对错配。错配可以是对应碱基从一个序列缺失的点，以使得互补序列在所述错配点处形成环，或可在非互补核苷酸存在于一个序列中并且因此不与在另一序列的对应位置处的碱基配对的情况下发生。在存在不正确的碱基配对(即A或T与C或G的配对)的情况下，氢键合不会在两个链的碱基之间发生，但是杂交仍将在靶片段与靶向寡核苷酸的靶标互补序列之间发生，这是由于与错配相邻的核苷酸之间的碱基配对。错配可以是摇摆碱基(wobble base)。摇摆碱基通常将对应于靶标互补序列中与靶片段中的已知遗传变异的位置配对的位置。所述探针可通过在摇摆碱基位置的特异性合成循环期间添加一个或数个二脱氧核苷酸来合成。传统寡核苷酸合成通常是这种情况。或者，可产生多个单独的探针，每个探针用于每个遗传变体。如果使用基于微阵列的合成来合成探针，则通常是这种情况。摇摆碱基可对应于密码子之间的单个核苷酸差异，其中不同的密码子编码同一氨基酸。

一般而言，相较于较短的靶标互补序列，用于杂交较长靶片段的较长靶标互补序列可容许更多量的错配。靶标互补序列可例如与靶片段具有至多1/8、1/9或1/10碱基对错配。任何这类错配应被限制于靶标互补序列和靶片段的内部区域，以使得它们不会抑制通过例如限制酶消化进行的连接或序列特异性靶标片段化。因此，优选地在靶片段的各端处的末端6至8个核苷酸、优选地末端10个核苷酸中在靶片段与靶标互补序列之间存在完美互补性。

一般而言，靶片段与靶标互补序列具有相同长度。靶片段的全长因此被靶标互补序列结合。靶片段与靶向寡核苷酸的杂交表示两种核酸分子之间的单一结合事件，从而与结合靶分子的两端或结合靶标的两个不相邻区域的探针形成对比。

靶标互补序列可具有至少10个核苷酸，例如至少15个核苷酸的长度。它可达20、25、30、35或40个核苷酸长。优选的范围包括10–20个核苷酸、10–30个核苷酸以及10–40个核苷酸。这类相对短的靶标互补序列适合用于结合对应较短片段。所述短序列有助于双重连接反应的特异性，因为DNA连接酶是对碱基对错配敏感的，并且将优先地连接完全匹配的序列。在错配存在于结合至双链序列的DNA连接酶的足迹中的情况下，所述序列可能未连接，这提供另外的校对步骤，从而确保在检测靶片段方面优先于不同但类似序列的片段的高特异性。DNA连接酶通常在切口的每侧上具有6至8个碱基的足迹。因此，如果片段是20个碱基，则所述碱基中的12至16个将被连接酶特异性覆盖。

所述探针杂交将尤其区别杂交的序列的中心部分中的错配，而连接将区分在靶片段的末端处的错配。这一起产生高特异性片段检测。

靶向寡核苷酸比靶片段长，因为它包括侧翼序列以及靶标互补序列，并且它还可包含一个或多个定制序列。定制序列不与探针的其他区域或靶片段互补——换言之在退火条件下它不与探针的其他区域(定制序列外部)或靶片段杂交。上游侧翼区域是靶向寡核苷酸中的靶标互补序列的上游或5’。下游侧翼区域是靶向寡核苷酸中的靶标互补序列的下游或3’。因此，靶标互补序列在靶向寡核苷酸内部，并且不包含靶向寡核苷酸的末端，因为它由上游和下游侧翼序列侧接。

由靶片段与靶标互补序列的杂交产生的双链序列可被视为杂合双链序列，因为它是靶标与探针的杂合体。通常，双链序列采用双重螺旋构象，其中靶片段是一条链并且靶向寡核苷酸是双螺旋的另一条链。杂合双链序列由靶向寡核苷酸的上游和下游侧翼序列侧接，其进而与头部序列和尾部序列杂交以产生双链序列。再次，这些通常采用双链核酸的正常双螺旋构象。

上游和下游侧翼序列优选地彼此不同，即优选地具有不同序列。优选头部序列与上游侧翼序列互补，但不与下游侧翼序列互补，并且尾部序列与下游侧翼序列互补，但不与上游侧翼序列互补。这确保头部序列和尾部序列仅分别与上游和下游侧翼序列杂交。

头部序列通常将是与上游侧翼序列相同长度。尾部序列通常将是与下游侧翼序列相同长度。

侧翼序列的正常长度在10与40个核苷酸之间，例如10–20或10–30核苷酸。侧翼序列可以是与彼此相同的长度。一个或两个侧翼序列可以是与靶标互补序列相同长度。上游和/或下游侧翼序列因此可具有至少10个核苷酸，例如至少15个核苷酸的长度。它可达20、25、30、35或40个核苷酸长。

优选地，头部序列是上游序列的互补序列。优选地，尾部序列是下游序列的互补序列。序列的优选匹配对于探针的最佳结合来说是合乎需要的，以使得头部序列和尾部序列被正确定位以用于连接至靶片段。然而，任选地，在头部序列与上游侧翼序列之间和/或在尾部序列与下游侧翼序列之间可存在一个、两个、三个或四个碱基对错配。优选地，存在少于5个碱基对错配。

不同于靶标互补序列，所述探针通常应不与靶片段或可存在于样本中的其他核酸互补。这将避免探针与除靶标以外的核酸的不想要的杂交。因此，如果探针是用于结合人基因组DNA的片段，则所述探针可被设计为使得除靶标互补序列以外的序列不与人基因组DNA互补，以使得所述探针仅与靶片段杂交并且不与样本中的其他核酸杂交。

退火和连接

靶片段在高特异性反应中在两端处连接。因为靶片段通常是核酸的特异性片段化的产物，所以这些末端通常将具有特定预先确定的序列。在连接步骤中，这些末端分别通过与头部序列和尾部序列的序列依赖性连接来特异性地检测。优选地，靶片段与探针的结合产生两个完全匹配的可连接的接合点，一个在靶片段的3’端与头部序列的5’端之间，并且一个在靶片段的5’端与尾部序列的3’端之间。

核酸的5’端连接至核酸的3’端可在两端与互补序列的相邻核苷酸碱基配对时发生。相应末端核苷酸与相邻核苷酸的碱基配对形成在两端之间含有切口的核酸链。两端的连接可通过DNA连接酶催化。提供用于连接的条件因此通常将包括提供DNA连接酶和反应条件，在所述反应条件下DNA连接酶连接两端以形成连续核酸链，从而闭合切口。多种连接酶是可商购的，如Ampligase(Epicentre)，对于其适合的条件是添加1U酶并且在连接酶缓冲液中在55℃下孵育1小时。

靶向寡核苷酸使靶片段模板化用于连接至头部序列和尾部序列，这是由于侧翼序列之间的靶标互补序列的位置所致。在退火条件下在靶片段存在下，所述头部序列和尾部序列与所述侧翼序列杂交，从而在所述头部序列的5’端与所述尾部序列的3’端之间限定空位。靶片段与靶标互补序列在所述空位中杂交。因此，头部序列和尾部序列以及靶片段与靶向寡核苷酸杂交将靶片段的3’端定位成与头部序列的5’端并置，并且将靶片段的5’端定位成与尾部序列的3’端并置。

将两端定位成并置提供用于DNA连接酶的底物以将所述末端连接在一起。优选头部序列的5’端和靶片段的3’端与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交，并且尾部序列的3’端和靶片段的5’端与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交。因此，上游侧翼序列可紧邻靶标互补序列，不具有插入核苷酸。类似地，下游侧翼序列可紧邻靶标互补序列，不具有插入核苷酸。相邻的3’端和5’端可通过DNA连接酶直接连接，从而密封它们之间的切口以形成连续核酸链。

双重连接的产物，即将头部序列和尾部序列连接至靶片段的产物是核酸的连续链。在它不包含切口或空位的意义上它是连续的，因此所述链中的所有核苷酸被共价连接。

所述探针可被设计为使得包含头部序列和尾部序列和靶片段的核酸的连续链是核酸的环。术语环在此是指不具有游离端的为闭合环的链的拓扑结构。

在退火条件下在靶片段存在下，所述头部序列和尾部序列与所述侧翼序列杂交，从而在所述头部序列的5’端与所述尾部序列的3’端之间限定空位。所述靶片段与靶标互补序列在所述空位中杂交，从而将所述靶片段的末端定位成与所述头部序列的5’端和所述尾部序列的3’端并置，并且完成包含靶片段以及头部序列和尾部序列的核酸的环。

形成环的核酸分子的末端并置。所述末端的连接产生包含至少所述头部序列和尾部序列以及所述靶片段的核酸的连续环状链。

形成核酸的环的探针包含其中头部序列和尾部序列被提供在单个核酸分子上的探针。例如，除了靶向寡核苷酸之外，所述探针可包含分别在其5’端、3’端具有头部序列和尾部序列的主链寡核苷酸，其中所述主链寡核苷酸的头部序列和尾部序列在退火条件下反式结合至靶向寡核苷酸的侧翼序列。所述主链寡核苷酸可包含在头部序列与尾部序列之间的定制序列。图3示出这类探针的实施方案。或者，所述主链寡核苷酸的头部序列和尾部序列可以是相邻的，在它们之间不具有定制序列。

在另一个实例中，所述头部序列和尾部序列可在靶向寡核苷酸的末端处并且在退火条件下顺式结合至侧翼序列。所述靶向寡核苷酸可包含在靶向寡核苷酸与头部和/或尾部序列之间的定制序列。图4示出这种探针的实施方案。

形成核酸的环的探针还包括其中头部序列和尾部序列被提供在不同核酸分子上的探针。在这类情况下，在退火条件下形成的核酸的环将包含至少三个核酸分子——靶片段、头部序列和尾部序列。所述核酸分子的末端将全部并置，如先前所指出。在这类情况下需要多于两种连接反应来形成核酸的连续环状链。一个实例是其中尾部序列是靶向寡核苷酸的3’端，并且所述探针包含具有在其5’端的头部序列的主链寡核苷酸。在退火条件下，尾部序列顺式结合至靶向寡核苷酸的下游侧翼序列，并且主链寡核苷酸的头部序列反式结合至靶向寡核苷酸的上游侧翼序列。顺式结合意指结合发生在同一核酸分子上，即核酸的单链形成三维结构，其中不同区域被带至一起且杂交。反式结合意指结合在不同核酸分子之间发生。任选地，主链寡核苷酸包含一对反向重复序列，所述反向重复序列在退火条件下形成发夹结构，从而将主链寡核苷酸的3’端定位成与靶向寡核苷酸的5’端并置。在两端之间存在切口。这种类型的探针在图5中示出。当提供用于连接的条件时，靶向寡核苷酸的5’端被连接至主链寡核苷酸的3’端。双重连接的产物是包含靶向寡核苷酸、靶片段和主链寡核苷酸的核酸的环。或者，在靶向寡核苷酸的5’端与主链寡核苷酸的3’端之间存在空位的情况下，图5中所示的探针将不通过连接环化——而是包含头部序列和尾部序列以及靶片段的核酸的连续链是核酸的线性链。

所述探针或者可以相反取向布置，以使得头部序列在靶向寡核苷酸的5’端，并且所述探针包含具有在其3’端的尾部序列的主链寡核苷酸。在这种情况下，在退火条件下，头部序列顺式结合至靶向寡核苷酸的上游侧翼序列，并且主链寡核苷酸的尾部序列反式结合至靶向寡核苷酸的下游侧翼序列。再次，主链寡核苷酸可包含一对反向重复序列，所述反向重复序列在退火条件下形成发夹结构，以将主链寡核苷酸的5’端定位成与靶向寡核苷酸的3’端并置。所述靶向寡核苷酸的3’端然后连接至所述主链寡核苷酸的5’端，以使得双重连接的产物是包含靶向寡核苷酸、靶片段和主链寡核苷酸的核酸的环。或者，如上所述，所述退火可将主链寡核苷酸的5’端定位在靶向寡核苷酸的3’端附近，但通过一个或多个核苷酸的空位隔开。连接的产物然后将是包含所述头部序列和尾部序列以及所述靶片段的核酸的连续线性链。

所述主链寡核苷酸可包含在反向重复序列之间的定制序列，以使得在退火条件下主链寡核苷酸形成发夹环，如图5中所示。

如所指出，探针可被设计为使得包含头部序列和尾部序列以及靶片段的核酸的连续链是核酸的线性链。在退火条件下在靶片段存在下，所述头部序列和尾部序列与所述侧翼序列杂交，从而在所述头部序列的5’端与所述尾部序列的3’端之间限定空位。所述靶片段与靶标互补序列在所述空位中杂交，从而将所述靶片段的末端定位成与所述头部序列的5’端和所述尾部序列的3’端并置，并且完成包含靶片段以及头部序列和尾部序列的核酸的链。形成所述链的核酸分子的末端并置。术语并置已在其他地方进行了讨论。在待连接的两端之间存在切口。所述末端的连接产生包含至少所述头部序列和尾部序列以及所述靶片段的核酸的连续链。

所述探针可包含具有在其3’端的尾部序列的靶向寡核苷酸以及具有在其5’端的头部序列的线性主链寡核苷酸。在退火条件下，尾部序列顺式结合至靶向寡核苷酸的下游侧翼序列，并且主链寡核苷酸的头部序列反式结合至靶向寡核苷酸的上游侧翼序列。靶向寡核苷酸可包含在下游侧翼序列与尾部序列之间的定制序列，以使得在退火条件下所述靶向寡核苷酸形成发夹环。在退火条件下形成的核酸的线性链包含主链寡核苷酸、靶片段以及靶向寡核苷酸。图6示出这种布置。

所述探针可相等地以反向取向布置，其中头部序列在靶向寡核苷酸的5’端，并且所述探针包含具有在其3’端的尾部序列的主链寡核苷酸。在这种情况下，头部序列顺式结合至靶向寡核苷酸的上游侧翼序列，并且主链寡核苷酸的尾部序列反式结合至靶向寡核苷酸的下游侧翼序列。

形成作为连接的产物的线性核酸链的探针的另一种形式是包含在单独主链寡核苷酸上的头部序列和尾部序列的探针。这种探针可包含含有具有游离5’端的头部序列的主链寡核苷酸；以及含有具有游离3’端的尾部序列的主链寡核苷酸，其中在退火条件下所述头部序列和尾部序列反式结合至靶向寡核苷酸的侧翼序列。一种或两种主链寡核苷酸还可包含定制序列。图7示出这种类型的探针。

优选地，所述探针的呈其未连接形式的寡核苷酸是线性的。因此，优选地，所述靶向寡核苷酸是线性核酸分子。对于包含一种或多种主链寡核苷酸的探针，这些还优选地是线性的。这允许连接的探针与未连接的探针之间的方便区分，其中DNA的环仅作为所述探针的环化实施方案的成功连接的结果形成。线性核酸分子未通过滚环复制扩增。

检测

在提供在其下靶片段(如果存在)连接至探针的条件之后，进行检测步骤以确定这种结合是否已经发生。这指示靶片段是否存在于样本中。因此，产物的检测依赖于所述靶片段与所述头部序列和尾部序列的成功连接以形成核酸的连续链。检测步骤因此通常涉及检测需要两个连接接合点的存在的信号。例如，检测可包括跨两个连接接合点扩增(例如，通过PCR或，用于探针的环化实施方案，滚环复制)或捕获在一端处的连续核酸链且检测其另一端。

任选地，方法可包括在检测之前富集双重连接的产物。产物可通过扩增和/或通过固相化学富集。环状核酸产物可通过用外切核酸酶(例如，λ外切核酸酶)处理样本以消化线性核酸产物来选择性地富集。一般来说，外切核酸酶降解可用于在连接产物被保护免于外切核酸酶降解时富集连接产物。外切核酸酶然后应在涉及聚合的任何后续步骤之前，例如在滚环扩增之前失活(例如通过热量)。如在实施例1中所示，可添加1U外切核酸酶以除去未反应的探针和片段。适合的条件是在对应外切核酸酶缓冲液中在37℃下孵育1小时，接着在80℃下酶失活20分钟。在使用捕获/检测方法的情况下，连接产物可通过经由捕获部分捕获固相上的产物来富集。如在实施例2中所示，含有线性连接产物的溶液可与10ml M-280链霉亲和素涂覆的磁珠(Invitrogen)在200ml最终体积中的Tris–HCl(pH 7.5)、3.5mM EDTA和0.07％Tween-20中混合，并且在室温下孵育15分钟。在孵育之后，使用环形磁铁收集珠粒，并且除去上清液。富集连接产物的其他方式包括特异性地大小选择连接产物。

用于检测双重连接的产物的方便的方式是提供用于扩增的条件且针对扩增产物的存在进行测试。几种扩增方法是可能的，如NASPA、LAMP、T7扩增、PCR或在连续链是环的情况下滚环复制。检测双重连接的产物的步骤可包括提供用于跨核酸的连续链的第一和第二连接接合点扩增的条件，并且检测是否存在扩增产物。连接产物可通过克隆扩增进行扩增。适合的扩增技术包括滚环扩增(参见下文)、桥式PCR(Adessi C等人,Nucleic AcidsRes.2000年10月15日；28(20):E87)、乳液PCR(乳液中的数字PCR由Dressman等人,ProcNatl Acad Sci U S A.2003年7月22日；100(15):8817-22.Epub 2003年7月11日描述)以及数字PCR(Vogelstein&Kinzler,Proc Natl Acad Sci U S A.1999年8月3日；96(16):9236-41)。凝胶中的克隆局部扩增由Mitra&Church,Nucleic Acids Res.1999年12月15日；27(24):e34描述。

在双重连接的产物是核酸的环的情况下，用于检测产物的方便的方式是提供用于滚环复制的条件以及检测是否存在滚环复制的产物。滚环复制的产物依赖于双重连接以提供用于扩增的核酸的环。滚环复制描述于US 5,854,033(Lizardi)和Fire&Xu,Proc NatlAcad Sci U S A.1995May 9；92(10):4641-5中。滚环复制是使用链置换DNA聚合酶扩增环状核酸分子，从而产生含有扩增序列的串联重复序列的大DNA分子。DNA聚合酶催化在所需情况下进行的持续滚环聚合反应中的引物延伸和链置换。它产生高于单个PCR复制循环和其他扩增技术多个数量级的环化探针序列的扩增，其中每个循环限于靶序列的拷贝数目的加倍。可使用链置换反应的级联来获得另外扩增。滚环复制可以是超支化滚环复制。超支化RCA由Lizardi等人,Nat Genet.1998年7月；19(3):225-32描述。用于滚环复制的条件在实施例中说明，例如与1U的phi29聚合酶(New England Biolabs)孵育可添加在对应phi29缓冲液和核苷酸(dNTPs)在37℃下持续1小时。

在滚环复制之后，扩增的探针序列可使用用于核酸的任何常规检测系统如检测荧光标记、酶联检测系统、抗体介导的标记检测和放射性标记的检测来检测和定量。优选地，滚环扩增产物通过标记的检测寡核苷酸与RCA产物中的基序，例如探针的定制序列中的基序的杂交来检测。因为扩增产物与样本中存在的靶序列的量成正比，所以定量测量可靠地表示样本中靶序列的量。这种方法的主要优点是，连接步骤可被操纵以获得等位基因区别，所述DNA复制步骤是恒温的，并且信号是严格定量的，因为扩增反应是线性的并且由高度加工酶催化。在多重测定中，用于DNA聚合酶反应的引物寡核苷酸可以是对于所有探针相同的。

对于其中头部序列和尾部序列在单独核酸分子探针上的探针，可方便地使用捕获/检测方法。双重连接的产物包含在单个核酸分子中的头部序列和尾部序列(连续链)，而未连接的探针没有。因此，双重连接的产物可通过以下方式来特异性地检测：捕获含有头部序列的核酸分子，洗涤以除去未连接的探针核酸，然后检测捕获的级分中尾部序列的存在。或者，双重连接的产物可通过以下方式来特异性地检测：捕获含有尾部序列的核酸分子，洗涤以除去未连接的探针核酸，然后检测捕获的级分中头部序列的存在。检测对连接的探针具有特异性，因为未连接的探针的头部序列和尾部序列仅通过核酸之间的杂交连接，并且通过洗涤而分离，而连接的探针含有连续核酸链中的(即，共价连接的)头部序列和尾部序列。

探针可进行修饰以携带捕获部分。捕获部分可允许附着至固体基质如珠粒。合适的捕获部分是生物素，其与链霉新核素配对，从而允许待在用链霉亲和素涂覆的固体基质上分离修饰的探针核酸。其中探针包含含有头部或尾部序列的主链寡核苷酸，以及分别含有尾部或头部的单独核酸(靶向寡核苷酸或第二主链寡核苷酸)，这些核酸分子中的任一者可携带捕获部分，例如可生物素化。可能方便的是在组合探针与样本之前提供具有捕获部分的探针。或者，捕获部分可在连接步骤之后引入。

在探针中的一种核酸分子携带捕获部分的情况下，另一种核酸分子可携带标记。有可能使用核酸序列本身作为标记，例如以特异性地检测头部序列(其中尾部被捕获)或尾部序列(其中头部被捕获)的存在或检测为待检测的核酸分子独有的定制序列。互补寡核苷酸可用于检测。或者，核酸可携带异源标记如荧光团。异源标记不是核酸本身的一部分。可使用的其他标记包括量子点、生物发光、产生信号的酶级联像酪酰胺信号放大以及放射性部分。所述方法然后可包括检测标记的存在，例如，分别检测荧光、检测量子点、检测生物发光、检测由酶产生的信号或检测放射性。

作为一个实例，检测是否存在双重连接的产物的步骤可包括经由捕获部分将探针的主链寡核苷酸捕获在基质上，洗涤所述基质以除去未连接的探针并且保留包含所述基质和捕获的主链寡核苷酸的捕获部分以及针对所捕获级分中双重连接的产物的存在进行测试。其中，双重连接的产物携带标记，这可包括针对所捕获级分中标记的存在进行测试。所述捕获部分可以是对链霉亲和素基质具有亲和力的生物素分子。其他适合的亲和标签包括对固定的金属离子具有亲和力的聚组氨酸标签，如可用于含组氨酸序列(例如，主链寡核苷酸)的纯化的钴、镍、铜。捕获部分因此可以是待捕获的序列的一部分，例如His标签序列，或者它可以是不是核酸本身的一部分的异源部分。

合适的固体基质是珠粒(例如磁珠)以有助于使用磁铁富集所捕获的产物。所述基质可用捕获部分的结合成员涂覆，例如可用生物素化的探针一起使用的链霉亲和素涂覆的磁珠。

本发明方法的一些实施方案的优点在于，它不依赖于核酸测序，也不依赖于PCR，这将导致偏倚性结果，因为一些序列比其他序列更有效地扩增。但任选地，检测可包括通过对产物进行测序验证所连接的片段的身份的步骤。本发明的优点之一是，通过在双重连接的产物中并入实际靶片段，可对产物进行测序以确认所述探针与正确的靶标反应。这是相较于基于双重连接如US20130172212(Ariosa)的其他方法的优点。

多重反应

多个不同的靶核酸片段可使用多个探针并行检测。例如，片段化染色体的样本可与用于结合染色体的多个片段的一组探针相接触，其中所述组中的每个探针用于结合对所述染色体特异的不同靶片段。所述探针可共有共同定制序列，所述定制序列可用作条形码以鉴别特异性地结合所述染色体的探针。多重反应可包括多重靶向寡核苷酸和一个共同主链寡核苷酸，但还包括几组靶向寡核苷酸，其中每个子组与单独的主链寡核苷酸杂交。

多个探针可用于提供可检测的信号，其中信号的幅值与识别其靶片段的探针的数目成比例。来自所述多个探针的单独信号被转换成单个累积可检测信号，从而通过多重探测扩增单独信号。十个或更多个探针产生十倍或更多的信号放大。所产生的信号取决于在靶标识别时正确地反应的探针，从而使用序列特异性杂交和连接来产生双重连接的特异性产物，从所述产物获得信号。

识别其靶片段的每个探针产生连接产物，并且由每个探针杂交产生的连接产物可以是单独可检测的，以使得单独信号可从每个获得。然而，本发明的优良特征是这些单独信号不需要单独地检测，而是被合并成累积信号并且检测所述累积信号。累积信号是单独信号的组合，并且因此可用于检测和/或定量连接产物，从而表示所研究的核酸种类的存在或量。相较于涉及测序和微阵列的方法，本发明方法的一些实施方式允许探针信号的早期合并，其中单独信号跨一个区域针对多个探针产生，并且然后所述信号在分析中合以表示一个区域。所述信号可在检测之前合并，以使得单独信号不单独映射或查询。这实现更简单的读出格式。

单独信号可从作为探针每个靶片段杂交的结果形成的双重连接的每种产物获得。因此，例如，在一组探针包含识别样本中的目标物种的10个靶片段的10个不同探针的情况下，将存在包含连接接合点的10种连接产物，并且可检测累积信号，所述累积信号是来自10种连接产物的单独信号的组合。当然，在此实例中，分子探针、靶片段和连接产物的实际数目可高于10，因为通常将存在样本中的每个靶片段的多个拷贝并且所述样本将与每个探针的多个拷贝相接触。

通过多重反应信号放大的方法可用于检测样本中的目标核酸种类，例如其中一个核酸种类是复杂核酸样本中的次要或痕量组分。通过多重反应扩增实现可靠检测。这可用于例如出于诊断目的检测样本(如患者样本)中的微生物核酸。样本可用对多种种类的微生物核酸具有特异性的探针进行探测以检测且鉴别存在的那些。这适用于检测传染性疾病的媒介物，如细菌、病毒和真菌。可检测特异性核酸转录物。通过多重反应扩增也可用于定量核酸种类。通过探测两种或更多种类的核酸——一个或多个目标种类和一个或多个参考核酸种类——所述方法实现样本中的两种种类的相对量的定量。当应用于染色体或染色体基因座的检测或定量，例如用于染色体拷贝数检测时所述方法是特别有用的。特定值的一种应用是使用所述方法用于鉴定染色体缺陷，包括用于诊断癌症和先天性非整倍体。具体地描述用于无创产前诊断(NIPT)的用途。

样本中的核酸的种类可通过使样本与根据本发明的一组探针相接触来检测，其中每个探针特异性地识别待检测的核酸种类中的不同靶序列。靶序列对应于所述核酸种类的靶片段。通过每个探针识别每个靶序列产生如本文所述的双重连接的产物。然后能够检测累积信号，这是来自所述产物的信号的组合。信号的检测指示所述样本中所述核酸种类的存在。所述核酸种类可通过定量累积信号以测定信号水平来进行定量，其中所述信号水平与所述样本中核酸种类的量成比例，并且由此测定所述样本中的核酸种类的量。可通过使样本与第一组探针和第二组探针相接触来相对于第二或参考核酸种类定量第一核酸种类，其中所述第一组探针各自特异性地识别所述第一核酸种类内的不同靶序列，并且其中所述第二组探针各自特异性地识别所述第二或参考核酸种类内的不同靶序列。检测第一和第二累积信号，所述第一累积信号是来自由识别其靶序列的第一组探针产生的产物的单独信号的组合，并且第二累积信号是来自由识别其靶序列的第二组探针产生的产物的单独信号的组合。对所述第一和第二信号进行定量以分别测定第一和第二信号水平，这些与所述样本中的第一和第二核酸种类的量成比例。所述样本中的第一和第二核酸种类的相对量因此可通过比较第一和第二信号水平来确定。

例如，累积信号可以是识别其靶序列的探针的克隆扩增和/或标记的产物(例如滚环扩增的产物)的总结列举，或从所有产物发出的荧光信号，其中每种产物发射荧光信号。为了定量多个核酸种类的相对量，不同的信号用于每个种类，例如一组探针的产物可发射相较于另一组探针的产物不同的荧光波长或光谱。

样本中的核酸种类可在一种方法中进行检测，所述方法包括

使所述样本与一组探针相接触，其中每个探针特异性地识别所述待检测的核酸种类内的不同靶序列，

提供变性条件，在所述条件下所述核酸种类中的靶序列为单链，

提供用于退火和连接的条件，在所述条件下所述探针杂交至其靶序列并且产生连接产物，以及

检测累积信号，所述累积信号是来自所有连接产物的单独信号的组合，

其中所述信号的检测指示所述样本中所述核酸种类的存在。

所述样本、靶核酸、方法步骤(例如，变性、退火、连接)以及探针的细节在本文其他地方描述。所述方法可包括：

(i)提供样本，其中所述核酸种类被片段化成靶片段，

(ii)提供变性条件，在所述变性条件下所述靶片段为单链

(iii)使所述样本与一组探针相接触，其中每个探针特异性地识别所述待检测的核酸种类内的不同靶序列，其中所述靶序列是所述靶片段的序列，并且其中每个探针包含

靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列，以及

分别具有游离的5’末端和3’末端的头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和尾部序列分别与所述上游侧翼序列和下游侧翼序列互补，

(iv)提供退火条件，在所述条件下所述头部序列和尾部序列与所述侧翼序列杂交，并且靶片段(如果存在)与所述探针的靶标互补序列杂交，由此将所述靶片段的末端定位成与所述头部序列的5’端和所述尾部序列的3’端并置

(v)提供用于连接的条件，以使得如果存在靶片段，则将所述靶片段的3’端连接至所述头部序列的5’端以形成第一连接接合点，并且将所述靶片段的5’端连接至所述尾部序列的3’端以形成第二连接接合点，从而产生双重连接的产物，所述产物包含核酸的连续链，所述核酸包含所述头部序列和尾部序列以及所述靶片段，以及

(vi)检测累积信号，所述累积信号是来自所有产物的单独信号的组合，

其中所述信号的检测指示所述样本中所述核酸种类的存在。

所述核酸种类可通过一种方法来定量，所述方法包括

(i)提供样本，其中所述核酸种类被片段化成靶片段

(ii)提供变性条件，在所述变性条件下所述靶片段为单链

(iii)使所述样本与一组探针相接触，其中每个探针特异性地识别所述待定量的核酸种类内的不同靶片段，其中每个探针包含

靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列，以及

分别具有游离的5’末端和3’末端的头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和尾部序列分别与所述上游侧翼序列和下游侧翼序列互补，

(iv)提供退火条件，在所述条件下所述头部序列和尾部序列与所述侧翼序列杂交，并且靶片段(如果存在)与所述探针的靶标互补序列杂交，由此将所述靶片段的末端定位成与所述头部序列的5’端和所述尾部序列的3’端并置

(v)提供用于连接的条件，以使得如果存在靶片段，则将所述靶片段的3’端连接至所述头部序列的5’端以形成第一连接接合点，并且将所述靶片段的5’端连接至所述尾部序列的3’端以形成第二连接接合点，从而产生双重连接的产物，所述产物包含核酸的连续链，所述核酸包含所述头部序列和尾部序列以及所述靶片段，

(vi)检测累积信号，所述累积信号是来自所有连接产物的单独信号的组合，以及

(vii)定量所述累积信号以测定信号水平，其中所述信号水平与所述样本中的所述核酸种类的量成比例，以及

由此测定所述样本中的所述核酸种类的量。

所述方法可用于相对于样本中的第二核酸种类定量第一核酸种类。所述方法可包括：

(i)提供样本，其中所述第一和第二核酸种类被片段化成靶片段

(ii)提供变性条件，在所述变性条件下所述靶片段为单链

(iii)使所述样本与第一组探针和第二组探针相接触，其中所述第一组探针特异性地识别所述第一核酸种类的不同靶片段，并且其中所述第二组探针特异性地识别所述第二核酸种类的不同靶片段，其中每个探针包含

靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列，以及

分别具有游离的5’末端和3’末端的头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和尾部序列分别与所述上游侧翼序列和下游侧翼序列互补，

(iv)提供退火条件，在所述条件下所述头部序列和尾部序列与所述侧翼序列杂交，并且靶片段(如果存在)与所述探针的靶标互补序列杂交，由此将所述靶片段的末端定位成与所述头部序列的5’端和所述尾部序列的3’端并置

(v)提供用于连接的条件，以使得如果存在靶片段，则将所述靶片段的3’端连接至所述头部序列的5’端以形成第一连接接合点，并且将所述靶片段的5’端连接至所述尾部序列的3’端以形成第二连接接合点，从而产生双重连接的产物，所述产物包含核酸的连续链，所述核酸包含所述头部序列和尾部序列以及所述靶片段，

(vi)检测第一累积信号，所述第一累积信号是来自由所述第一组探针产生的连接产物的单独信号的组合；并且定量所述第一累积信号以测定第一信号水平，其中所述第一信号水平与所述样本中的所述第一核酸种类的量成比例，

(vii)检测第二累积信号，所述第二累积信号是来自由所述第二组探针产生的连接产物的单独信号的组合；并且定量所述第二累积信号以测定第二信号水平，其中所述第二信号水平与所述样本中的所述第二核酸种类的量成比例，以及

(viii)比较所述第一和第二信号水平，从而测定所述样本中的第一和第二核酸种类的相对量。

一般来说，探针的数目将是针对待检测或定量的每个核酸种类至少十。数目当然是指不同探针的数目，而不是探针的分子的绝对数目。因此，所述核酸将包含至少十种不同的特异性靶序列，并且所述累积信号是至少十个独特探针的单独信号的组合，所述累积信号表示一种核酸种类。高水平的多重可用于相应地获得高水平的信号扩增。例如，至少100、至少1,000、至少10,000或甚至更大数目的探针可用于待检测或定量的每种核酸种类。

所述方法可包括使片段化的染色体的样本与用于结合两条或更多条染色体的多个片段的多组探针相接触，其包括：

用于结合对第一染色体特异的多个靶片段的第一组探针，以及

用于结合对第二染色体特异的多个靶片段的第二组探针，以及任选地

用于结合对一条或多条另外的染色体特异的多个靶片段的一组或多组另外的探针。

一组内的探针可共有定制序列，所述定制序列是所述组共同的并且不同于其他组中的探针的定制序列，从而允许方便地鉴别来自各组的探针。每组探针可包含用于结合对所述染色体特异的多个靶片段的至少500、600、700、800、900或至少1,000个不同的探针。例如，一种方法可分别使用染色体21、13和18中的每种的1,000种不同的靶向寡核苷酸，以及三种不同的主链寡核苷酸，每种用于每个染色体子组。

有可能通过检测针对每组探针的双重连接的产物并且检测所述产物中的定制序列的相对量来测定样本中的两条或更多条染色体的相对量。

使用其中靶向寡核苷酸以及上游和下游寡核苷酸形成环的探针，编码特异性等位基因和或基因座的基序可在高多重中并入定制序列。

数字染色体核型分析和无创产前诊断学

本发明方法的一些实施方案能够提供其中寻求靶DNA的精确定量的领域中的特定优点。这包括多种基于核酸的诊断技术。这样一种领域是分析来自患者的生物样本(例如血液)中的癌症DNA的分析。另一这种领域是通过分析无细胞DNA的无创产前诊断学(NIPT)。

NIPT的一个挑战是必须对大量特异性基因组片段进行计数以便实现诊断异常染色体非整倍体(染色体拷贝数差异)所需的统计置信。由于胎儿DNA与母体DNA混合，构成孕妇血流中遗传物质的4％-30％，观察胎儿DNA中的染色体非整倍性需要非常精确的测量。

本文所述的探针可用于分析母体血液样本中的游离环化胎儿DNA。通过使用针对一条染色体的不同片段的多个探针和针对第二染色体的不同片段的多个探针，所述探针实现以高置信度测定所述样本中的两条染色体的相对数量的不平衡。这允许甚至针对母体DNA的高背景从胎儿DNA诊断染色体非整倍性，如三体性。

本文所描述的探针可用于测试来自孕妇的母体血液样本来检测胎儿核酸以用于诊断染色体异常如三体，从而针对肿瘤DNA测试患者样本以用于诊断或监测患者中肿瘤的存在。其他用途包括针对微生物核酸的存在测试材料的样本，其中检测到所述微生物核酸指示材料被微生物感染，所述微生物可以是感染剂如细菌、病毒或真菌。所述样本可以是来自患者的组织或血液样本。

更一般地，通过使用数百或数千个不同的探针，本发明的方法可通过检测数百或数千个特异性核酸片段来实现高精确度，从而在一系列诊断应用中提供优点。检测来自与特定疾病相关的染色体或染色体基因座的大量DNA片段实现相对于对照染色体或基因座测量所述染色体或基因座的量，以使得能够确信地检测样本中的甚至轻微差异。

通过分析短靶片段，可以高效率分析母体血液中的一大部分高度片段化的无细胞DNA。这是重要的，因为非常少量的无细胞DNA可在母体血液中获得。

一种相对于从个体获得的核酸样本中的第二染色体或染色体基因座定量第一染色体或染色体基因座的方法可包括

(i)提供样本，其中所述第一和第二染色体或染色体基因座被片段化成靶片段

(ii)提供变性条件，在所述变性条件下所述靶片段为单链

(iii)使所述样本与第一组探针和第二组探针相接触，其中所述第一组探针特异性地识别所述第一染色体的不同靶片段，并且其中所述第二组探针特异性地识别所述第二染色体的不同靶片段，其中每个探针包含

靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列，以及

分别具有游离的5’末端和3’末端的头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和尾部序列分别与所述上游侧翼序列和下游侧翼序列互补，

(iv)提供退火条件，在所述条件下所述头部序列和尾部序列与所述侧翼序列杂交，并且靶片段(如果存在)与所述探针的靶标互补序列杂交，由此将所述靶片段的末端定位成与所述头部序列的5’端和所述尾部序列的3’端并置

(v)提供用于连接的条件，以使得如果存在靶片段，则将所述靶片段的3’端连接至所述头部序列的5’端以形成第一连接接合点，并且将所述靶片段的5’端连接至所述尾部序列的3’端以形成第二连接接合点，从而产生双重连接的产物，所述产物包含核酸的连续链，所述核酸包含所述头部序列和尾部序列以及所述靶片段，

(vi)检测第一累积信号，所述第一累积信号是来自由所述第一组探针产生的连接产物的单独信号的组合；并且定量所述第一累积信号以测定第一信号水平，其中所述第一信号水平与所述样本中的所述第一染色体或染色体基因座的量成比例，

(vii)检测第二累积信号，所述第二累积信号是来自由所述第二组探针产生的连接产物的单独信号的组合；并且定量所述第二累积信号以测定第二信号水平，其中所述第二信号水平与所述样本中的所述第二染色体或染色体基因座的量成比例，以及

(viii)比较所述第一和第二信号水平，从而测定所述样本中的第一和第二染色体或染色体基因座的相对量。

所述方法可用于诊断胎儿中的非整倍性(例如三体性)，其中所述核酸样本是从母体血液获得的样本并且包含与母体DNA混合的无细胞胎儿DNA，并且其中所述第一和第二信号水平的不等比例指示非整倍性(例如三体性)。

探针

其他方面包括适合于在本发明方法中使用的探针。探针及其特征的实例已在上文进行了描述。在此描述一些另外特性和实例。

探针核酸优选地是DNA。然而，它可以是另一种核酸，天然存在的或非天然存在的。DNA的标准碱基是A、T、C和G，但探针核酸可任选地包含非标准核苷酸。

一般而言，根据本发明的探针包含靶向寡核苷酸以及头部序列和尾部序列。所述头部序列和尾部序列可以是靶向寡核苷酸的一部分，或者它们中的一者或两者可在不同的核酸分子上。任选地，所述探针包含靶向寡核苷酸、包含头部序列的主链寡核苷酸以及包含尾部序列的主链寡核苷酸。因此，探针可包含呈其非连接形式的一个、两个或三个核酸分子。

所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列。所述头部序列和尾部序列分别具有游离的5’端和3’端，并且分别与所述上游侧翼序列和下游侧翼序列互补。在退火条件下在靶片段存在下，所述头部序列和尾部序列与所述侧翼序列杂交，从而在所述头部序列的5’端与所述尾部序列的3’端之间限定空位，其中所述靶片段与靶标互补序列在所述空位中杂交，由此将所述靶片段的末端定位成与所述头部序列的5’端和所述尾部序列的3’端并置。

所述探针可被设计成使得在所述空位中的靶片段的杂交完成核酸的环，所述环包含靶片段以及头部序列和尾部序列。

所述探针的头部序列和/或尾部序列优选地连接至不与探针的其他区域或与靶片段互补的定制序列。

在所述探针的一些实施方案中，单个核酸分子包含头部序列和尾部序列。

所述头部序列和尾部序列可与靶向寡核苷酸隔开以使得它们反式结合至侧翼序列。例如，所述头部序列和尾部序列可分别在主链寡核苷酸的5’端和3’端。定制序列可包括在主链寡核苷酸的头部序列与尾部序列之间。这种探针的实例在图1和图3中示出。或者，所述主链寡核苷酸的头部序列和尾部序列可以是相邻的，不具有插入核苷酸序列。在这种情况下，靶向寡核苷酸的侧翼序列沿着主链寡核苷酸的全长杂交并且可以使它环化。

所述探针可被设计成使得头部序列是靶向寡核苷酸的5’端和/或尾部序列是靶向寡核苷酸的3’端，以使得所述空位中的靶片段的杂交完成核酸的链，所述核酸包含靶片段、头部序列和尾部序列、靶标互补序列以及侧翼序列。所述头部序列和尾部序列可在靶向寡核苷酸的末端处并且顺式结合至侧翼序列。这种探针的实例在图4中示出。在探针的这种型式中，头部序列和尾部序列以及靶标互补序列全部变得与靶片段环化。定制序列可被定位在寡核苷酸的环中。探针核酸相对较长，但具有将寡核苷酸结构连接成预组装的一个分子并且不需要不同探针核酸分子的杂交的优点。

探针也可被设计成具有主链寡核苷酸，所述主链寡核苷酸是来自靶向寡核苷酸的核酸的单独分子。尾部序列可以是靶向寡核苷酸的3’端，并且头部序列可以是主链寡核苷酸的5’端。或者，头部序列可以是靶向寡核苷酸的5’端，并且尾部序列可以是主链寡核苷酸的3’端。定制序列可被引入靶向寡核苷酸中，例如以在所述头部或尾部序列与侧翼序列之间提供环。使用这种探针方法的一个优点是检测序列可被引入所述环中并且与靶标互补序列缔合，这对于多重方法来说可以是有利的，尤其是利用高重检测方案的更高多重。主链寡核苷酸还可包含定制序列。通过在两种寡核苷酸中提供探针，所述探针核酸分子比单一寡核苷酸型式短，但维持相同的功能。

探针的另一种设计在两种主链寡核苷酸上提供头部和序列尾部序列。因此，所述探针包含

靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列，

包含具有游离5’端的头部序列的主链寡核苷酸，以及

包含具有游离3’端的尾部序列的主链寡核苷酸，

其中所述头部和尾部寡核苷酸序列分别与上游和下游侧翼序列互补。

一种主链寡核苷酸可携带捕获部分，在这种情况下另一主链寡核苷酸用于检测并且可携带异源标记。一种或两种主链寡核苷酸还可包含定制序列。可替代地或另外地，靶向寡核苷酸可包含定制序列。

在退火条件下在靶片段存在下，所述头部序列和尾部序列与所述侧翼序列杂交，从而在所述头部序列的5’端与所述尾部序列的3’端之间限定空位，其中所述靶片段与靶标互补序列在所述空位中杂交，由此将所述靶片段的末端定位成与所述头部序列的5’端和所述尾部序列的3’端并置。所述空位中的靶片段的杂交完成包含所述靶片段以及所述头部和尾部序列的核酸的链。所述链携带所述捕获部分和所述标记，从而允许使用本文其他地方所述的捕获/检测方法进行检测。

试剂盒和探针组

本公开的另一方面是用于结合单链靶核酸片段的探针组，所述探针组包括多个探针，所述探针具有用于结合多个不同靶片段的多个不同的靶标互补序列。

所述探针组可用于结合人染色体的多个片段，其中所述组中的每个探针用于结合对所述染色体特异的不同靶片段。所述探针可全部包含共同定制序列作为靶向寡核苷酸的一部分或作为主链寡核苷酸的一部分。

多组探针可被提供用于结合两种或更多种人染色体的不同片段，其包括：

用于结合对第一染色体特异的多个靶片段的第一组探针，以及

用于结合对第二染色体特异的多个靶片段的第二组探针，以及任选地

用于结合对一条或多条另外的染色体特异的多个靶片段的一组或多组另外的探针。一组内的探针可共有定制序列，所述定制序列是所述组共同的并且不同于其他组中的探针的定制序列。

还可提供试剂盒，所述试剂盒包含在一个或多个容器中的溶液中的多组探针。

用途

本文所述的探针、探针组和试剂盒可用于针对靶核酸片段的存在测试样本。它们可用于在体外鉴别片段化核酸的样本中的限定靶片段的存在。

一方面包括使用探针用于针对靶单链核酸片段的存在测试样本，

其中所述探针包含靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸含有为靶片段的精确互补序列的序列；以及头部和尾部寡核苷酸序列，所述头部和尾部寡核苷酸序列邻近所述靶向寡核苷酸上的靶片段杂交，

其中所述靶片段与所述探针之间的杂交使靶片段模板化用于连接至头部序列和尾部序列。

这类探针及其在测试样本的方法中的用途的实例在本文其它地方更详细地描述。用途包括测试来自孕妇的母体血液样本来检测胎儿核酸以用于诊断染色体异常如三体性，并且针对肿瘤DNA测试患者样本以用于诊断或监测患者中肿瘤的存在。其他用途包括针对微生物核酸的存在测试材料的样本，其中所述微生物核酸的检测指示材料被微生物感染，所述微生物可以是传染剂如细菌、病毒或真菌。所述样本可以是来自患者的组织或血液样本。

实施例

提供以下实施例以便展示且进一步说明本发明的某些实施方案和方面并且不应被解释为限制其范围。

实施例1

适合用于进行图1中所示的方法的方案如下：

1)将10ng的DNA在相应的相容限制酶缓冲液中用1单位的限制酶消化。将反应在37℃下孵育1小时，接着在80℃下酶失活20分钟。2)将DNA片段在95℃下持续10分钟变性为单链片段并且与探针和连接酶混合以形成环。以10pM单独浓度添加探针集合连同1U的Ampligase(Epicentre)并且在55℃下在连接酶缓冲液中孵育1小时。3)添加1U外切核酸酶以除去未反应的探针和片段。将I U的λ外切核酸酶(Epicentre)在37℃下持续1小时添加在相应的外切核酸酶缓冲液中，接着在80℃下酶失活20分钟。4)将剩余的环通过RCA扩增。将1U的phi29聚合酶(New England Biolabs)在37℃下持续1小时添加在相应的phi29缓冲液和核苷酸(dNTP)中。

实施例2

适合用于进行图2中所示的方法的方案如下：

1)将10ng的DNA在相应的相容限制酶缓冲液中用1单位的限制酶消化。将反应在37℃中孵育1小时，接着在80℃下酶失活20分钟。2)将DNA片段在95℃下持续10分钟变性为单链片段并且与探针和连接酶混合以形成线性连接产物。以10pM单独浓度添加探针集合连同1U的Ampligase(Epicentre)并且在55℃下在连接酶缓冲液中孵育1小时。3)将连接产物捕获在磁性链霉亲和素珠粒上。为了除去未反应的探针和片段，将溶液与10ml M-280链霉亲和素涂覆的磁珠(Invitrogen)在200ml最终体积中的Tris–HCl(pH 7.5)、3.5mM EDTA和0.07％Tween-20中混合，并且在室温下孵育15分钟。在孵育之后，使用环形磁铁收集珠粒，并且除去上清液。

实施例3

材料和方法

样本准备：将来自每个受试者的10ml血液收集到无细胞DNA管(Streck,Omaha,NE)中。通过双重离心方案(1600g持续10分钟，接着在第一旋转之后管转移之后16 000g持续10分钟)从血液分离血浆。根据制造商的方案通过Qiagen ccf核酸试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)分离cfDNA。将所得DNA在50ul的缓冲液(Qiagen试剂盒的一部分)中洗脱。

探针和主链设计：本文所述的多重探针技术实现数千个染色体片段的特异性和同时扩增。将探针设计成捕获来自染色体21、18和13中的每种的2500-5000个片段(靶标)。靶标被选择为在基因组中具有独特序列，均匀的AT/GC组成，在靶序列中不包含已知的多态性也不包含CNV，以及18-35bp之间的大小。将靶向来自每条染色体13和18的2500个片段的探针与靶向来自染色体21的片段的5000个探针汇集在一起以产生单个寡核苷酸探针集合。

探针的示例性序列，“N”表示靶标互补序列：ATGTGACCCTTCCGTCTGTTGAGTTAGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGTGCCTTGTCATTCGGGAGCACTAACTGCTG(SEQ ID NO:1)

具有与探针的末端互补的头部序列和尾部序列的主链被设计成包含用于测序和数字计数的序列基序。将两个主链用于在结果部分中概述的实验中；与靶向染色体13和18的探针互补的一个主链：(/5P hos/CGCACACGATTAAGGTCCAGTCACAGGCAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAACGGTCGAGTCGGACAGGTGGCTCCACTAAATAGACGCA)；SEQ ID NO:2，以及靶向染色体21的一个主链：(/5Phos/GGCCTAACTCAACAGACGGAAGGGTCACATAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAACGGTCGAGCAGTTAGTGCTCCCGAATGACAAGGCACGA；SEQ ID NO:3)。

生物化学探针方案：将50ul的纯化cfDNA用55ul总体积中的1x NEB4缓冲液(NewEngland Biolabs)和1x BSA中的5U MseI(New England Biolabs)在37℃下消化30分钟，接着在65℃下热失活20分钟。然后将消化的DNA与连接混合物连同探针和主链一起混合。将55ul的消化的DNA与探针(1pM/探针)、主链(各自60nM)、1x连接缓冲液(Epicentre)、100U的Ampligase(Epicentre)、1mM NAD以及5mM Mg²⁺混合至70ul的总体积。将消化的片段首先在95℃下在5分钟内首先变性为单链DNA，接着在16小时内55℃杂交和连接。然后将连接混合物用外切核酸酶处理以除去任何剩余的线性DNA分子。将连接反应与75ul总体积的20U的ExoI(NEB)和5U的ExoIII(NEB)以及1x BSA tot在37℃下混合持续60分钟，接着在65℃下热失活10分钟。

分析：对于测序分析，将外切核酸酶处理的环用与Illumina测序仪器互补的测序引物扩增并且随后根据制造商方案负载在Illumina Miseq仪器上。

对于数字分析，使外切核酸酶处理的反应经受滚环扩增反应(RCA)以产生所述环的多联体拷贝的离散DNA目标物。将37,5ul的外切核酸酶处理的环与50ul总体积中的4mMDTT、3U的phi29聚合酶(NEB)、0,1uM引物、1mM dNTP混合物(NEB)以及1x BSA混合，并且在37℃下孵育1小时，接着在65℃下热失活10分钟。然后将RCA反应用与主链序列互补的荧光标记的寡核苷酸标记。将50ul的RCA产物与100ul总体积中的0,1％Tween 20(Sigma)、5nM标记的寡核苷酸以及2x SSC(Sigma)混合。将标记的RCA产物最终沉积在涂覆有聚赖氨酸(Sigma)的显微镜载玻片上并且在荧光显微镜中计数。

结果

在Illumina测序和数字计数系统上证明本文所述的探针方法。为了证明探针方法的性能，将具有三体21的DNA样本与不同浓度的从正常血浆样本(3-5ml血浆)提取的DNA混合。然后使样本进行探针方法，并且通过测序进行评价。

对于在图8中所示的结果，使100ng的细胞系DNA经受上述方案。将10,000个探针在集合中混合以特异性地环化来自染色体13、18和21的10,000个对应染色体片段。然后将10,000个所得环用Illumina-对应PCR引物进行扩增且在测序之前在凝胶上进行分析。泳道1对应于DNA梯度，泳道2在消化之后的DNA样本，以及泳道3具有10,000个扩增的片段的PCR产物。

对于图9、12中所示的结果，将正常血浆样本与不同浓度的携带具有三体21的DNA的样本并行分析。提取DNA并且通过10K-plex探针方案进行处理，且最后在Illumina测序仪上测序。使用提供99％特异性的置信区间，基于所估计的正常分布以90％灵敏度检测阳性样本。

为了证明将靶向片段转化成标记的DNA目标物的原理，将具有三体21的10％的DNA添加至20ng正常细胞系DNA中且进行探针方法。将所得到的标记的RCA产物随机沉积在显微镜载玻片上并且计数。将靶向源自染色体21的探针用一种颜色标记并且将靶向源自染色体13和18的片段用参考颜色标记。这些结果在图10中示出。图10的图(A)示出来自显微镜的图像，示出标记的和检测的RCA产物。通过用一种荧光团标记来自染色体13的所有片段并且用第二荧光团标记来自参考染色体的片段，可实现比率测量。图(B)：将20ng的DNA通过10K-plex探针方案进行处理并且转化成标记的RCA-产物。将RCA-产物与携带三体21DNA的10％添加的样本并行分析。将12种正常DNA样本(样本#1-12)与三种阳性样本(样本#13-15)并行分析。

进一步描述

以下条款是说明书的一部分。

1.一种针对靶核酸片段的存在测试样本的方法，所述方法包括：

(i)提供片段化核酸的样本

(ii)提供变性条件，在所述变性条件下所述靶片段为单链

(iii)使所述样本与核酸探针相接触，所述核酸探针包含

靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列，以及

分别具有游离的5’端和3’端的头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和所述尾部序列分别与所述上游侧翼序列和所述下游侧翼序列互补，

(iv)提供退火条件，在所述条件下所述头部序列和所述尾部序列与所述侧翼序列杂交，并且所述靶片段(如果存在)与所述靶标互补序列杂交，由此将所述靶片段的所述末端定位成与所述头部序列的所述5’端和所述尾部序列的所述3’端并置

(v)提供用于连接的条件，以使得如果存在所述靶片段，则将所述靶片段的所述3’端连接至所述头部序列的所述5’端以形成第一连接接合点，并且将所述靶片段的所述5’端连接至所述尾部序列的所述3’端以形成第二连接接合点，从而产生双重连接的产物，所述产物包含核酸的连续链，所述核酸包含所述头部序列和所述尾部序列以及所述靶片段，以及

(vi)检测是否存在所述双重连接的产物，

其中检测到所述双重连接的产物指示所述样本中所述靶片段的存在。

2.根据条款1所述的方法，其中所述片段化核酸的样本是限制酶消化产物并且所述靶片段是限制片段。

3.根据条款1或条款2所述的方法，其中所述头部序列的所述5’端和所述靶片段的所述3’端与所述靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交，并且所述尾部序列的所述3’端和所述靶片段的所述5’端与所述靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交。

4.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述检测所述双重连接的产物的步骤包括提供用于跨所述核酸的连续链的所述第一连接接合点和所述第二连接接合点扩增的条件，并且检测是否存在扩增产物。

5.根据前述条款中任一项所述的方法，其中包含所述头部序列和所述尾部序列以及所述靶片段的所述核酸的连续链是核酸的环。

6.根据条款5所述的方法，其中所述检测所述双重连接的产物的步骤包括提供用于滚环复制的条件并且检测是否存在滚环复制的产物。

7.根据条款6所述的方法，其中所述滚环复制是超支化滚环复制。

8.根据条款5至7中任一项所述的方法，其中所述探针包含在一个核酸分子上的所述头部序列和所述尾部序列。

9.根据条款8所述的方法，其中所述探针包含分别在其5’端、3’端具有所述头部序列和所述尾部序列的主链寡核苷酸，其中所述主链寡核苷酸的所述头部序列和所述尾部序列在所述退火条件下反式结合至所述靶向寡核苷酸的所述侧翼序列。

10.根据条款9所述的方法，其中所述主链寡核苷酸包含在所述头部序列与所述尾部序列之间的定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或与所述靶片段互补。

11.根据条款9所述的方法，其中所述主链寡核苷酸的所述头部序列和所述尾部序列是相邻的。

12.根据条款5至8中任一项所述的方法，其中所述头部序列和所述尾部序列在所述靶向寡核苷酸的末端处并且在所述退火条件下顺式结合至所述侧翼序列。

13.根据条款12所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸包含在所述靶向寡核苷酸与所述头部和/或尾部序列之间的定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或与所述靶片段互补。

14.根据条款1至7中任一项所述的方法，其中所述尾部序列在所述靶向寡核苷酸的所述3’端，并且所述探针包含具有在其5’端的所述头部序列的主链寡核苷酸，

其中在所述退火条件下，所述尾部序列顺式结合至所述靶向寡核苷酸的所述下游侧翼序列，并且所述主链寡核苷酸的所述头部序列反式结合至所述靶向寡核苷酸的所述上游侧翼序列。

15.根据条款14所述的方法，其中所述主链寡核苷酸包含一对反向重复序列，其中

在所述退火条件下，所述反向重复序列形成发夹结构，从而将所述主链寡核苷酸的所述3’端定位成与所述靶向寡核苷酸的所述5’端并置，并且其中

在所述用于连接的条件下，所述靶向寡核苷酸的所述5’端被连接至所述主链寡核苷酸的所述3’端，以使得所述双重连接的产物是包含所述靶向寡核苷酸、所述靶片段和所述主链寡核苷酸的核酸的环。

16.根据条款1至7中任一项所述的方法，其中所述头部序列在所述靶向寡核苷酸的所述5’端，并且所述探针包含具有在其3’端的所述尾部序列的主链寡核苷酸，

其中在所述退火条件下，所述头部序列顺式结合至所述靶向寡核苷酸的所述上游侧翼序列，并且所述主链寡核苷酸的所述尾部序列反式结合至所述靶向寡核苷酸的所述下游侧翼序列。

17.根据条款16所述的方法，其中所述主链寡核苷酸包含一对反向重复序列，其中

在所述退火条件下，所述反向重复序列形成发夹结构，从而将所述主链寡核苷酸的所述5’端定位成与所述靶向寡核苷酸的所述3’端并置，并且其中

在所述用于连接的条件下，所述靶向寡核苷酸的所述3’端被连接至所述主链寡核苷酸的所述5’端，以使得所述双重连接的产物是包含所述靶向寡核苷酸、所述靶片段和所述主链寡核苷酸的核酸的环。

18.根据条款14至17中任一项所述的方法，其中所述主链寡核苷酸包含在所述反向重复序列之间的定制序列，以使得在所述退火条件下所述主链寡核苷酸形成发夹环。

19.根据条款1至4中任一项所述的方法，其中包含所述头部序列和所述尾部序列以及所述靶片段的所述核酸的连续链是核酸的线性链。

20.根据条款19所述的方法，其中所述尾部序列在所述靶向寡核苷酸的所述3’端，并且所述探针包含具有在其5’端的所述头部序列的主链寡核苷酸，

其中在所述退火条件下，所述尾部序列顺式结合至所述靶向寡核苷酸的所述下游侧翼序列，并且所述主链寡核苷酸的所述头部序列反式结合至所述靶向寡核苷酸的所述上游侧翼序列。

21.根据条款14、15或20中任一项所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸包含在所述下游侧翼序列与所述尾部序列之间的定制序列，以使得在所述退火条件下所述靶向寡核苷酸形成发夹环。

22.根据条款19所述的方法，其中所述头部序列在所述靶向寡核苷酸的所述5’端，并且所述探针包含具有在其3’端的所述尾部序列的主链寡核苷酸，

其中在所述退火条件下，所述头部序列顺式结合至所述靶向寡核苷酸的所述上游侧翼序列，并且所述主链寡核苷酸的所述尾部序列反式结合至所述靶向寡核苷酸的所述下游侧翼序列。

23.根据条款16、17或22中任一项所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸包含在所述头部序列与所述上游侧翼序列之间的定制序列，以使得在所述退火条件下所述靶向寡核苷酸形成发夹环。

24.根据条款14至18或20至23中任一项所述的方法，其中所述主链寡核苷酸携带捕获部分。

25.根据条款19所述的方法，其中所述探针包含含有具有游离5’端的头部序列的主链寡核苷酸；以及含有具有游离3’端的尾部序列的主链寡核苷酸，其中在所述退火条件下所述头部序列和所述尾部序列反式结合至所述靶向寡核苷酸的所述侧翼序列。

26.根据条款25所述的方法，其中一个或两个主链寡核苷酸还包含定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或与所述靶片段互补。

27.根据条款25或条款26所述的方法，其中所述主链寡核苷酸中的一个携带捕获部分。

28.根据条款27所述的方法，其中所述另一主链寡核苷酸携带异源标记。

29.根据条款28所述的方法，其中所述标记是荧光团。

30.根据条款24或条款27至29中任一项所述的方法，其中所述检测是否存在所述双重连接的产物的步骤包括经由所述捕获部分将所述主链寡核苷酸捕获在基质上，洗涤所述基质以除去未连接的探针并且保留包含所述基质和捕获的主链寡核苷酸的捕获级分，以及针对所述捕获级分中所述双重连接的产物的存在进行测试。

31.根据条款28或条款29所述的方法，其中所述检测是否存在所述双重连接的产物的步骤包括经由所述捕获部分将所述主链寡核苷酸捕获在基质上，洗涤所述基质以除去未连接的探针并且保留包含所述基质和捕获的主链寡核苷酸的捕获级分，以及针对所述捕获级分中所述标记的存在进行测试。

32.根据条款24或条款27至31中任一项所述的方法，其中所述捕获部分是生物素。

33.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述靶标互补序列具有10至30个核苷酸的长度。

34.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述靶标互补序列与所述靶片段具有少于5个碱基对错配。

35.根据条款34所述的方法，其中所述靶标互补序列是所述靶片段的精确互补序列。

36.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述侧翼序列各自具有10至30个核苷酸的长度。

37.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述上游侧翼序列和所述下游侧翼序列彼此不同。

38.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述头部序列与所述上游侧翼序列具有少于5个碱基对错配，并且所述尾部序列与所述下游侧翼序列具有少于5个碱基对错配。

39.根据条款38所述的方法，其中所述头部序列是所述上游侧翼序列的精确互补序列，并且所述尾部序列是所述下游侧翼序列的精确互补序列。

40.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸是线性的。

41.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述样本是片段化的人染色体的样本，并且所述靶片段是对一条染色体特异的人基因组片段。

42.根据条款41所述的方法，其中所述靶片段对所述人基因组的一个基因座特异。

43.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述探针核酸是DNA。

44.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用多个所述探针并行多重测试多个不同的靶核酸片段。

45.根据条款44所述的方法，其中所述方法包括使片段化染色体的样本与用于结合染色体的多个片段的一组探针相接触，其中所述组中的每个探针用于结合对所述染色体特异的不同靶片段。

46.根据条款45所述的方法，其中所述探针共有共同定制序列。

47.根据条款44所述的方法，其中所述方法包括使片段化染色体的样本与用于结合两条或更条染色体的多个片段的多组探针相接触，其中所述探针组包含：

用于结合对第一染色体特异的多个靶片段的第一组探针，以及

用于结合对第二染色体特异的多个靶片段的第二组探针，以及任选地

用于结合对一条或多条另外的染色体特异的多个靶片段的一组或多组另外的探针。

48.根据条款47所述的方法，其中各组探针包含用于结合对所述染色体特异的多个靶片段的至少500个不同的探针。

49.根据条款47或条款48所述的方法，其中一组内的所述探针共有定制序列，所述定制序列是所述子组共同的并且不同于其他组中的探针的所述定制序列。

50.根据条款49所述的方法，其包括通过检测针对每组探针的所述双重连接的产物并且检测所述产物中的所述定制序列的相对量来测定所述样本中的所述两条或更多条染色体的相对量。

51.根据条款45至50中任一项所述的方法，其中所述一条或多条染色体是人的。

52.一种用于结合单链靶核酸片段的核酸探针，其中所述探针包含

靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列，以及

分别具有游离的5’端和3’端的头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和所述尾部序列分别与所述上游侧翼序列和所述下游侧翼序列互补

以使得在退火条件下在所述靶片段存在下，所述头部序列和所述尾部序列与所述侧翼序列杂交，从而在所述头部序列的所述5’端与所述尾部序列的所述3’端之间限定空位，其中所述靶片段与所述靶标互补序列在所述空位中杂交，由此将所述靶片段的所述末端定位成与所述头部序列的所述5’端和所述尾部序列的所述3’端并置，并且其中

所述空位中的所述靶片段的杂交完成核酸的环，所述环包含所述靶片段以及所述头部序列和所述尾部序列。

53.根据条款52所述的核酸探针，其中所述头部和/或尾部序列被连接至定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或与所述靶片段互补。

54.根据条款52或条款53所述的核酸探针，其中单个核酸分子包含所述头部序列和所述尾部序列。

55.根据条款52或条款53所述的探针，其中所述头部序列和所述尾部序列与所述靶向寡核苷酸隔开，并且反式结合至所述侧翼序列。

56.根据条款55所述的探针，其中所述头部序列和所述尾部序列分别在主链寡核苷酸的5’端和3’端。

57.根据条款56所述的探针，其中所述主链寡核苷酸包含在所述头部序列与所述尾部序列之间的定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或与所述靶片段互补。

58.根据条款56所述的探针，其中所述主链寡核苷酸的所述头部序列和所述尾部序列是相邻的。

59.一种用于结合单链靶核酸片段的核酸探针，其中所述探针包含

靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列，以及

分别具有游离的5’端和3’端的头部序列和尾部序列，其中所述头部寡核苷酸序列和所述尾部寡核苷酸序列分别与所述上游侧翼序列和所述下游侧翼序列互补，

以使得在退火条件下在所述靶片段存在下，所述头部序列和所述尾部序列与所述侧翼序列杂交，从而在所述头部序列的所述5’端与所述尾部序列的所述3’端之间限定空位，其中所述靶片段与所述靶标互补序列在所述空位中杂交，由此将所述靶片段的所述末端定位成与所述头部序列的所述5’端和所述尾部序列的所述3’端并置，并且其中

所述头部序列是所述靶向寡核苷酸的5’端和/或所述尾部序列是所述靶向寡核苷酸的3’端，以使得所述空位中的所述靶片段的杂交完成核酸的链，所述核酸包含所述靶片段、所述头部序列和所述尾部序列、所述靶标互补序列以及所述侧翼序列。

60.根据条款52或条款59所述的探针，其中所述头部序列和所述尾部序列在所述靶向寡核苷酸的末端处，并且反式结合至所述侧翼序列。

61.根据条款52或条款59所述的探针，其中所述尾部序列是所述靶向寡核苷酸的3’端，并且所述头部序列是与所述靶向寡核苷酸隔开的主链寡核苷酸的5’端。

62.根据条款52或条款59所述的探针，其中所述头部序列是所述靶向寡核苷酸的5’端，并且所述尾部序列是与所述靶向寡核苷酸隔开的主链寡核苷酸的3’端。

63.根据条款61或条款62所述的探针，其中所述主链寡核苷酸还包含定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或与所述靶片段互补。

64.一种用于结合单链靶核酸片段的核酸探针，其中所述探针包含

靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列，以使得所述靶向寡核苷酸与所述靶片段之间的杂交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列，

包含具有游离5’端的头部序列的主链寡核苷酸，以及

包含具有游离3’端的尾部序列的主链寡核苷酸，

其中所述头部寡核苷酸序列和所述尾部寡核苷酸序列分别与所述上游侧翼序列和所述下游侧翼序列互补，并且其中

一种主链寡核苷酸携带捕获部分并且另一主链寡核苷酸携带异源标记，

以使得在退火条件下在所述靶片段存在下，所述头部序列和所述尾部序列与所述侧翼序列杂交，从而在所述头部序列的所述5’端与所述尾部序列的所述3’端之间限定空位，其中所述靶片段与所述靶标互补序列在所述空位中杂交，由此将所述靶片段的所述末端定位成与所述头部序列的所述5’端和所述尾部序列的所述3’端并置，并且其中

所述空位中的所述靶片段的杂交完成包含所述靶片段以及所述头部序列和所述尾部序列的核酸的链，其中所述链携带所述捕获部分和所述标记。

65.根据条款64所述的探针，其中所述捕获部分是生物素。

66.根据条款64或条款65所述的探针，其中所述标记是荧光团。

67.根据条款64至66中任一项所述的探针，其中一个或两个主链寡核苷酸还包含定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或与所述靶片段互补。

68.根据条款52至67中任一项所述的探针，其中所述靶向寡核苷酸还包含定制序列，所述定制序列不与所述探针的其他区域或与所述靶片段互补。

69.根据前述条款中任一项所述的探针，其中所述靶标互补序列具有10至30个核苷酸的长度。

70.根据前述条款中任一项所述的探针，其中所述靶标互补序列与所述靶片段具有少于5个碱基对错配。

71.根据条款70所述的探针，其中所述靶标互补序列是所述靶片段的精确互补序列。

72.根据条款52至71中任一项所述的探针，其中所述侧翼序列各自具有10至30个核苷酸的长度。

73.根据条款52至72中任一项所述的探针，其中所述靶向寡核苷酸的所述上游侧翼序列和所述下游侧翼序列彼此不同。

74.根据条款52至73中任一项所述的探针，其中所述头部序列与所述上游侧翼序列具有少于5个碱基对错配，并且所述尾部序列与所述下游侧翼序列具有少于5个碱基对错配。

75.根据条款74所述的探针，其中所述头部序列和所述尾部序列是所述侧翼序列的确切互补序列。

76.根据条款52至75中任一项所述的探针，其中所述靶向寡核苷酸是线性的。

77.根据条款52至76中任一项所述的探针，其中所述靶片段是限制性内切核酸酶片段。

78.根据条款52至77中任一项所述的探针，其中所述靶片段是人基因组片段。

79.根据条款78所述的探针，其中所述靶片段是对一条染色体特异的人基因组片段。

80.根据条款79所述的探针，其中所述靶片段对所述人基因组的一个基因座特异。

81.根据条款52至80中任一项所述的探针，其中所述探针核酸是DNA。

82.一组用于结合单链靶核酸片段的探针，其包括根据条款52至81中任一项所述的多个探针，所述探针具有用于结合多个不同靶片段的多个不同的靶标互补序列。

83.根据条款82所述的一组探针，其用于结合人染色体的多个片段，其中所述组中的每个探针用于结合对所述染色体特异的不同靶片段。

84.根据条款83所述的一组探针，其中所述探针共有共同定制序列。

85.用于结合两条或更多条人染色体的不同片段的多组探针，其包括：

用于结合对第一染色体特异的多个靶片段的第一组探针，以及

用于结合对第二染色体特异的多个靶片段的第二组探针，以及任选地

用于结合对一条或多条另外的染色体特异的多个靶片段的一组或多组另外的探针。

86.根据条款85所述的多组探针，其中一组内的所述探针共有定制序列，所述定制序列是所述组共同的并且不同于其他组中的探针的所述定制序列。

87.一种试剂盒，其包括在一个或多个容器中的溶液中的根据条款82至86中任一项所述的一组或多组探针。

88.根据条款52至81中任一项所述的探针、根据条款82至86中任一项所述的一组探针或根据条款87所述的试剂盒的用途，其用于针对靶核酸片段的存在测试样本。

89.一种探针用于针对靶单链核酸片段的存在测试样本的用途，

其中所述探针包含靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸含有为所述靶片段的确切互补序列的序列；以及头部寡核苷酸序列和尾部寡核苷酸序列，所述头部寡核苷酸序列和所述尾部寡核苷酸序列邻近所述靶向寡核苷酸上的所述靶片段杂交，

其中所述靶片段与所述探针之间的杂交使所述靶片段模板化用于连接至所述头部序列和所述尾部序列。

90.根据条款89所述的用途，其中所述探针是如条款52至81中任一项中所定义。

一个实施方案提供一种处理核酸样本的方法，所述方法包括：a)使包含靶片段的样本与核酸探针杂交，所述核酸探针包含：i.头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和所述尾部序列是在第一寡核苷酸分子的末端处；以及ii.夹板序列，所述夹板序列依次包含：与所述头部序列互补的上游侧翼序列，与所述靶片段互补的靶标互补序列以及与所述尾部序列互补的下游侧翼序列；从而产生杂交产物，其中所述靶片段的末端可连接地邻近所述第一寡核苷酸分子中的头部序列和尾部序列的末端；以及b)将所述靶片段的末端连接至所述第一寡核苷酸分子的头部序列和尾部序列的末端，从而产生包含所述靶片段以及所述头部序列和尾部序列的环状产物。

在任何实施方案中，所述方法还可包括使用与所述第一寡核苷酸分子或所述夹板序列杂交的引物通过滚环扩增来扩增所述环状产物。在这些实施方案中，所述方法还可包括定量所产生的滚环扩增产物的数目，从而提供所述样本中的所述靶片段的量的估计。

在一些实施方案中，所述夹板序列可在所述第一寡核苷酸分子中。

在一些实施方案中，所述夹板序列可在第二寡核苷酸分子中。

在任何实施方案中，所述靶标互补序列的长度可以是10至30个核苷酸。

在任何实施方案中，所述靶标互补序列可包含与所述靶片段的一个或多个错配。

在任何实施方案中，所述侧翼序列的长度可以是10与40个核苷酸。

在任何实施方案中，所述样本可用限制酶消化。

在任何实施方案中，所述样本可包含基因组DNA，例如人基因组DNA。在这些实施方案中，所述样本可包含从血液分离的无细胞DNA。例如，在任何实施方案中，所述样本可包含从孕妇的血流分离的无细胞DNA。

在一些实施方案中，所述夹板序列可在包含捕获部分例如生物素部分的第二寡核苷酸分子中。在这些实施方案中，所述方法可包括：c)通过结合所述捕获部分将所述环状产物固定至固相；以及

d)洗涤所述固相以除去未连接的核酸和其他反应组分，从而富集所述环状产物。

在任何实施方案中，所述靶片段可来自染色体21、13或18。

在一些实施方案中，所述方法可包括将所述样本与一组至少50个所述探针杂交，其中所述探针靶向同一染色体上的不同片段，并且其中所述方法产生包含所述靶片段的多种环状产物。

在这些实施方案中，所述方法可包括将所述样本与所述探针组中的第一组和第二组杂交，其中所述第一组和第二组分别靶向第一染色体和第二染色体；通过滚环扩增(RCA)扩增所述环状产物并且比较对应于所述第一染色体的RCA产物的数目与对应于所述第一染色体的RCA产物的数目。

在这些实施方案中，所述方法可包括将所述样本与所述探针组中的第一组和第二组杂交，其中所述第一组和第二组分别靶向染色体上的第一区域和第二区域；通过滚环扩增(RCA)扩增所述环状产物并且比较对应于所述第一区域的RCA产物的数目与对应于所述第二区域的RCA产物的数目。

本文还提供一种包含核酸探针的组合物，如上所述。在一些实施方案中，所述核酸探针可包含：i.头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和尾部序列是在第一寡核苷酸分子的相对端处；以及ii.夹板序列，所述夹板序列依次包含：与所述头部序列互补的上游侧翼序列，与人基因组中的靶片段互补的靶标互补序列以及与所述尾部序列互补的下游侧翼序列；其中所述探针被设计成使得当所述第一寡核苷酸、所述夹板序列以及所述靶片段彼此杂交时，所述靶片段的末端可连接地邻近所述第一寡核苷酸分子中的头部序列和尾部序列的末端。

在任何组合物实施方案中，所述组合物可包含第一组至少50个核酸探针，其中所述探针的靶标互补序列与第一人染色体的不同靶片段互补，例如人染色体是21、13或18。在这些实施方案中，所述组合物可任选地包含第二组至少50个所述核酸探针，其中所述第二组的探针的靶标互补序列与第二人染色体的不同靶片段互补，例如染色体13或18(如果第一染色体是染色体21)。

Claims (42)

1.一种用于结合单链靶核酸片段的核酸探针，其中所述靶片段是限制性内切核酸酶片段并且所述探针包含

靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段长并且包含内部靶标互补序列、上游侧翼序列和下游侧翼序列，以使得所述内部靶标互补序列与所述靶片段之间的杂交形成位于上游侧翼序列与下游侧翼序列之间的双链序列，以及

分别具有游离的5’端和3’端的头部序列和尾部序列，其中所述头部序列和所述尾部序列分别与所述上游侧翼序列和所述下游侧翼序列互补，其中所述头部序列和所述尾部序列在与所述上游侧翼序列和下游侧翼序列不同的核酸分子中；

以使得在退火条件下在所述靶片段存在下，所述头部序列和所述尾部序列分别与所述上游侧翼序列和下游侧翼序列杂交，从而在所述头部序列的所述5’端与所述尾部序列的所述3’端之间限定空位，其中所述靶片段与所述内部靶标互补序列在所述空位中杂交，由此将所述靶片段的所述末端定位成与所述头部序列的所述5’端和所述尾部序列的所述3’端并置，并且其中：

所述空位中的所述靶片段的杂交完成核酸的环，所述环包含所述靶片段、所述头部序列和所述尾部序列。

2.根据权利要求1所述的探针，其中所述靶片段来自人基因组。

3.根据权利要求1所述的探针，其中所述靶片段来自人染色体21。

4.根据权利要求1所述的探针，其中所述靶标互补序列具有至少10个核苷酸的长度。

5.根据权利要求1所述的探针，其中所述头部序列或尾部序列至少之一被连接至定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或与所述靶片段互补。

6.根据权利要求1所述的探针，其中单个核酸分子包含所述头部序列和所述尾部序列。

7.根据权利要求1所述的探针，其中所述头部序列和所述尾部序列分别位于主链寡核苷酸的5’端和3’端。

8.根据权利要求7所述的探针，其中所述主链寡核苷酸包含在所述头部序列与所述尾部序列之间的定制序列，其中所述定制序列不与所述探针的其他区域或与所述靶片段互补。

9.根据权利要求8所述的探针，其中所述主链寡核苷酸的所述头部序列和所述尾部序列是相邻的。

10.根据权利要求1所述的探针，其中所述靶标互补序列的长度在10-40个核苷酸的范围内。

11.根据权利要求1所述的探针，其中所述侧翼序列各自独立地具有10-40个核苷酸的长度。

12.根据权利要求1所述的探针，其中所述头部序列的5’端和靶片段的3’端与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交，并且所述尾部序列的3’端和靶片段的5’端与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交。

13.根据权利要求1所述的探针，其中：

所述头部序列的5’端和靶片段的3’端不与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交；和/或

所述尾部序列的3’端和靶片段的5’端不与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交。

14.根据权利要求1所述的探针，其中：

上游侧翼序列紧邻靶标互补序列，不具有插入核苷酸；和/或，

下游侧翼序列紧邻靶标互补序列，不具有插入核苷酸。

15.根据权利要求1所述的探针，其中：

上游侧翼序列不紧邻靶标互补序列；和/或，

下游侧翼序列不紧邻靶标互补序列。

16.探针组，其包括多个根据权利要求1-15中任一项所述的探针，所述探针具有与不同靶片段杂交的不同的靶标互补序列。

17.根据权利要求16所述的探针组，其中不同的靶标互补序列分别与人染色体21中的不同序列杂交。

18.根据权利要求16所述的探针组，其中所述探针组包含至少500个所述探针。

19.组合物，其包含：

a)权利要求1-15中任一项所述的核酸探针；和

b)包含权利要求1-15中任一项所述的靶片段的变性的核酸样本。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述样本是已经被限制性核酸内切酶消化的变性的无细胞DNA。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述无细胞DNA来自妊娠女性的血流。

22.根据权利要求19所述的组合物，其进一步包含DNA连接酶。

23.一种针对靶核酸片段的存在测试样本的方法，所述方法包括：

(i)使权利要求1-15中任一项的探针与包含所述靶片段的变性的核酸样本杂交；

(ii)提供用于连接的条件，以使得将所述靶片段的3’端连接至权利要求1-15中任一项的探针的头部序列的5’端，并且将所述靶片段的5’端连接至权利要求1-15中任一项的尾部序列的3’端以形成环状连接产物；以及

(iii)检测是否存在所述环状连接产物，

其中检测到所述环状连接产物指示所述样本中所述靶片段的存在，

其中所述方法不用于诊断目的。

24.根据权利要求23所述的方法，其中检测是否存在所述环状连接产物的步骤包括提供用于滚环复制的条件并且检测是否存在滚环复制的产物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中滚环复制的产物通过与标记的寡核苷酸杂交进行检测。

26.根据权利要求23所述的方法，其中所述靶片段来自人基因组，并且所述变性的核酸样本是变性的人DNA。

27.根据权利要求23所述的方法，其中所述靶片段来自人基因组，并且所述变性的核酸样本是已经被限制性核酸内切酶消化的变性的无细胞DNA。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述靶片段来自人染色体21。

29.根据权利要求23所述的方法，其中，在步骤(i)的产物中：

所述头部序列的5’端和靶片段的3’端不与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交；和/或

所述尾部序列的3’端和靶片段的5’端不与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交。

30.根据权利要求23所述的方法，其中，在步骤(i)的产物中：

所述头部序列的5’端和靶片段的3’端与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交；和/或

所述尾部序列的3’端和靶片段的5’端与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交。

31.根据权利要求23所述的方法，其中，在步骤(i)的产物中：

上游侧翼序列不紧邻靶标互补序列；和/或，

下游侧翼序列不紧邻靶标互补序列。

32.根据权利要求23所述的方法，其中，在步骤(i)的产物中：

上游侧翼序列紧邻靶标互补序列；和/或，

下游侧翼序列紧邻靶标互补序列。

33.权利要求1-15中任一项的探针在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于针对靶核酸片段的存在测试样本的方法，所述方法包括：

(i)使权利要求1-15中任一项的探针与包含所述靶片段的变性的核酸样本杂交；

(ii)提供用于连接的条件，以使得将所述靶片段的3’端连接至权利要求1-15中任一项的探针的头部序列的5’端，并且将所述靶片段的5’端连接至权利要求1-15中任一项的尾部序列的3’端以形成环状连接产物；以及

(iii)检测是否存在所述环状连接产物，

其中检测到所述环状连接产物指示所述样本中所述靶片段的存在。

34.根据权利要求33所述的用途，其中检测是否存在所述环状连接产物的步骤包括提供用于滚环复制的条件并且检测是否存在滚环复制的产物。

35.根据权利要求34所述的用途，其中滚环复制的产物通过与标记的寡核苷酸杂交进行检测。

36.根据权利要求33所述的用途，其中所述靶片段来自人基因组，并且所述变性的核酸样本是变性的人DNA。

37.根据权利要求33所述的用途，其中所述靶片段来自人基因组，并且所述变性的核酸样本是已经被限制性核酸内切酶消化的变性的无细胞DNA。

38.根据权利要求37所述的用途，其中所述靶片段来自人染色体21。

39.根据权利要求33所述的用途，其中，在步骤(i)的产物中：

所述头部序列的5’端和靶片段的3’端不与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交；和/或

所述尾部序列的3’端和靶片段的5’端不与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交。

40.根据权利要求33所述的用途，其中，在步骤(i)的产物中：

所述头部序列的5’端和靶片段的3’端与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交；和/或

所述尾部序列的3’端和靶片段的5’端与靶向寡核苷酸的相邻核苷酸杂交。

41.根据权利要求33所述的用途，其中，在步骤(i)的产物中：

上游侧翼序列不紧邻靶标互补序列；和/或，

下游侧翼序列不紧邻靶标互补序列。

42.根据权利要求33所述的用途，其中，在步骤(i)的产物中：

上游侧翼序列紧邻靶标互补序列；和/或，

下游侧翼序列紧邻靶标互补序列。